CN115747204A - 一种镜检分枝杆菌阳性样本dna提取纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种镜检分枝杆菌阳性样本DNA提取纯化方法，属于生物技术领域，所述方法包括如下步骤：采集镜检分枝杆菌阳性样本并进行高温灭活，对灭火的样本使用无菌盐水清洗人源DNA，使用MolYsis Basic5试剂盒去除人源DNA，使用机械对细胞进行破碎处理，使用乙醇对破碎后的样品进行沉淀，用AMPure XP磁珠纯化DNA，对得到的上清液进行DNA质检。本发明能够对镜检阳性临床标本直接进行DNA提取纯化，提取质量好，提取成功高，经实践表明提取纯化后可用于全基因组测序检测，简化操作流程，缩短操作时间。

Description

一种镜检分枝杆菌阳性样本DNA提取纯化方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种镜检分枝杆菌阳性样本DNA提取纯化方法。

背景技术

DNA分离纯化是分子生物学实验中非常重要的操作，核酸的质量直接关系到后续操作能否顺利进行。生物学、法医学和基因组学的发展，强化了对从各种生物检材中获得核酸的复杂方法的需求。例如，脱氧核糖核酸提供了广泛的关于遗传起源和遗传多态性信息。这些信息可用于法医遗传学鉴定实践。

镜检分枝杆菌阳性样本通常存在细菌量不足、成分复杂、不易裂解等问题，全基因组测序等检测在细菌分离培养之后才进行NDA提取纯化，其结果往往滞后数周，高质量DNA提取纯化操作过程，目前尚缺乏统一的标准，临床标本直接提取纯化的报道较少，且提取质量较差，成功率不高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种镜检分枝杆菌阳性样本DNA提取纯化方法，解决现有的技术问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种镜检分枝杆菌阳性样本DNA提取纯化方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1：采集镜检分枝杆菌阳性样本并进行高温灭活；

步骤2：对灭火的样本使用无菌盐水清洗人源DNA；

步骤3：使用MolYsis Basic5试剂盒去除人源DNA；

步骤4：使用机械对细胞进行破碎处理；

步骤5：使用乙醇对破碎后的样品进行沉淀；

步骤6：用AMPure XP磁珠纯化DNA；

步骤7：对步骤6中得到的上清液进行DNA质检。

进一步地，步骤1的具体过程为：样本为抗酸染色阳性的痰、肺泡灌洗液或者腹水，体积为2ml，样本为新鲜采集或4℃保存不超过1周时间，高温灭活的温度为95℃，时间为30min。

进一步地，步骤2的具体过程为，对高温灭活后的样本进行离心处理，离心机13000rpm，时间为15min，然后弃掉上清，加1ml无菌盐水，并吹打重悬沉淀，然后在使用离心机13000rpm离心处理，时间为15min，弃掉上清液。

进一步地，步骤3的具体过程为，向步骤2中得到的沉淀中加1ml buffer SU，并吹打重悬沉淀，加250μl buffer CM，斡旋混匀，室温孵育5min，加250μl buffer DB和10μlMolDNase B，立刻涡旋震荡10s，室温孵育15min，然后在进行离心，13000rpm，15min，弃掉上清，加1ml buffer RS，并反复吹打，使沉淀完全重悬，离心13000rpm，10min，弃掉上清液加700μl蒸馏水，并吹打重悬。

进一步地，步骤4的具体过程为：将700μl的样本加入一个2ml的裂解介质管中，涡旋震荡，震荡3次，每次40s，离心，13000rpm，10min，取440-460μl的上清至新的1.5ml管中。

进一步地，步骤5的具体过程为：加45μl的醋酸钠，加5μl的GlycoBlue co-precipitant试剂，加1ml的冰无水乙醇，斡旋震荡10s，-20℃孵育30min至1h，离心，13,000rpm，15min，弃上清液，加1ml 70％乙醇溶液，孵育1min，弃掉上清液，同时防止弃掉沉淀，室温静置5-10min，使乙醇挥发，加50μl事先预热的TE缓冲液，斡旋震荡两到三次，使沉淀溶解，取45μl上层溶液至96孔板中。

进一步地，步骤6的具体过程为：加81μl的珠子至45μl步骤5得到的DNA溶液中，盖紧后重分斡旋30s，室温孵育10min，孵育期间旋转，将碟子置于磁力架上3min，用移液枪吸取上清，避免吸到珠子，将碟子从磁力架拿开，加200μl的80％乙醇溶液，孵育1min后，用移液枪吸取乙醇并弃掉，重复上一步骤(步骤e)，第二次清洗后，室温干燥5-10min，加26μlbuffer TE，并反复吹打30至40次，使珠子完全重悬，将碟子置于磁力架上3min，取25μl上清至一个新的管子中，避免取到珠子。

进一步地，步骤7的具体过程为：对DNA的浓度进行检测，然后冻存-80℃的环境中。

本发明由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：

本发明能够对镜检阳性临床标本直接进行DNA提取纯化，提取质量好，提取成功高，经实践表明提取纯化后可用于全基因组测序检测，简化操作流程，缩短操作时间。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。

一种镜检分枝杆菌阳性样本DNA提取纯化方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1：样本采集及高温灭活

1.抗酸染色阳性的痰/肺泡灌洗液/腹水样本2ml(可多收集，但不低于1.5ml)，样本为新鲜采集或4℃保存不超过1周时间。

2.高温灭活，95℃，30min。

步骤2：无菌盐水清洗人源DNA

1.高温灭活后的样本离心，13,000rpm，15min。

2.小心弃掉上清。

3.加1ml无菌盐水，并吹打重悬沉淀。

4.离心，13,000rpm，15min。

5.小心弃掉上清。

步骤3：使用MolYsis Basic5试剂盒去除人源DNA

1.向沉淀中加1ml buffer SU，并吹打重悬沉淀。

2.加250μl buffer CM，斡旋混匀。

3.室温孵育5min。

4.加250μl buffer DB和10μl MolDNase B(不能事先混合)，立刻涡旋震荡10s。

5.室温孵育15min。

6.离心，13,000rpm，15min。

7.小心弃掉上清。

8.加1ml buffer RS，并反复吹打，使沉淀完全重悬。

9.离心，13,000rpm，10min。

10.小心弃掉上清。

11.加700μl蒸馏水，并吹打重悬。

步骤4：机械细胞破碎

1.将700μl的样本加入一个2ml的裂解介质管中(lysing matrix B tube，MBBiomedicals，USA)

2.涡旋震荡(或使用FastPrep-24组织匀浆机，6.0m/s)，震荡3次，每次40s。

3.离心，13,000rpm，10min。

4.取450μl左右的上清至新的1.5ml管中。

步骤5：乙醇沉淀

1.加45μl(1/10体积)的醋酸钠(3M)。

2.加5μl(1/100体积)的GlycoBlue co-precipitant试剂(LffeTechnologies，USA)。

3.加1ml(两倍体积)的冰无水乙醇，斡旋震荡10s。

4.-20℃孵育30min至1h。

5.离心，13,000rpm，15min，弃上清。

6.加1ml 70％乙醇溶液，孵育1min，尽可能的弃掉上清，同时防止弃掉沉淀。

7.室温静置5-10min，使乙醇挥发(避免过分干燥沉淀)。

8.加50μl事先预热的TE缓冲液(Tris-EDTA，pH 8.0)，斡旋震荡两到三次，使沉淀尽量溶解。(有可能最后依旧有沉淀残留)

9.取45μl上层溶液至96孔板中。

步骤6：用AMPure XP磁珠纯化DNA

1.加81μl(1.8倍体积)的珠子至45μl的DNA溶液中。

2.盖紧后重分斡旋30s。

3.室温孵育10min，期间短暂的旋转。

4.将碟子置于磁力架上3min，用移液枪小心吸取上清，避免吸到珠子。

5.将碟子从磁力架拿开，加200μl的80％乙醇溶液，孵育1min后，用移液枪吸取乙醇并弃掉。

7.第二次清洗后，室温干燥5-10min。

8.加26μl buffer TE，并反复吹打30至40次，使珠子完全重悬。

9.将碟子置于磁力架上3min。

10.取25μl上清至一个新的管子中，避免取到珠子。

步骤7：DNA质检

1.DNA浓度检测：

2.DNA保存：-80℃冻存。

对25例镜检分枝杆菌阳性样本进行了试验，25例提取纯化后样品浓度均大于40ng/μL，总量均大于8μg。能够满足全基因组测序最低30ng/μL的样本浓度要求。该方法用于临床标本直接DNA提取纯化，提取成功率和质量高，相对于培养后再提取纯化，极大的缩短了全基因组测序的前期处理时间，提高工作效率，有较大的使用价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种镜检分枝杆菌阳性样本DNA提取纯化方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

步骤1：采集镜检分枝杆菌阳性样本并进行高温灭活；

步骤2：对灭火的样本使用无菌盐水清洗人源DNA；

步骤3：使用MolYsis Basic5试剂盒去除人源DNA；

步骤4：使用机械对细胞进行破碎处理；

步骤5：使用乙醇对破碎后的样品进行沉淀；

步骤6：用AMPure XP磁珠纯化DNA；

步骤7：对步骤6中得到的上清液进行DNA质检。

2.根据权利要求1所述的一种镜检分枝杆菌阳性样本DNA提取纯化方法，其特征在于：步骤1的具体过程为：样本为抗酸染色阳性的痰、肺泡灌洗液或者腹水，体积为2ml，样本为新鲜采集或4℃保存不超过1周时间，高温灭活的温度为95℃，时间为30min。

3.根据权利要求1所述的一种镜检分枝杆菌阳性样本DNA提取纯化方法，其特征在于：步骤2的具体过程为，对高温灭活后的样本进行离心处理，离心机13000rpm，时间为15min，然后弃掉上清，加1ml无菌盐水，并吹打重悬沉淀，然后在使用离心机13000rpm离心处理，时间为15min，弃掉上清液。

4.根据权利要求1所述的一种镜检分枝杆菌阳性样本DNA提取纯化方法，其特征在于：步骤3的具体过程为，向步骤2中得到的沉淀中加1ml buffer SU，并吹打重悬沉淀，加250μlbuffer CM，斡旋混匀，室温孵育5min，加250μl buffer DB和10μl MolDNase B，立刻涡旋震荡10s，室温孵育15min，然后在进行离心，13000rpm，15min，弃掉上清，加1ml buffer RS，并反复吹打，使沉淀完全重悬，离心13000rpm，10min，弃掉上清液加700μl蒸馏水，并吹打重悬。

5.根据权利要求1所述的一种镜检分枝杆菌阳性样本DNA提取纯化方法，其特征在于：步骤4的具体过程为：将700μl的样本加入一个2ml的裂解介质管中，涡旋震荡，震荡3次，每次40s，离心，13000rpm，10min，取440-460μl的上清至新的1.5ml管中。

6.根据权利要求1所述的一种镜检分枝杆菌阳性样本DNA提取纯化方法，其特征在于：步骤5的具体过程为：加45μl的醋酸钠，加5μl的GlycoBlue co-precipitant试剂，加1ml的冰无水乙醇，斡旋震荡10s，-20℃孵育30min至1h，离心，13,000rpm，15min，弃上清液，加1ml70％乙醇溶液，孵育1min，弃掉上清液，同时防止弃掉沉淀，室温静置5-10min，使乙醇挥发，加50μl事先预热的TE缓冲液，斡旋震荡两到三次，使沉淀溶解，取45μl上层溶液至96孔板中。

7.根据权利要求1所述的一种镜检分枝杆菌阳性样本DNA提取纯化方法，其特征在于：步骤6的具体过程为：加81μl的珠子至45μl步骤5得到的DNA溶液中，盖紧后重分斡旋30s，室温孵育10min，孵育期间旋转，将碟子置于磁力架上3min，用移液枪吸取上清，避免吸到珠子，将碟子从磁力架拿开，加200μl的80％乙醇溶液，孵育1min后，用移液枪吸取乙醇并弃掉，重复上一步骤(步骤e)，第二次清洗后，室温干燥5-10min，加26μl buffer TE，并反复吹打30至40次，使珠子完全重悬，将碟子置于磁力架上3min，取25μl上清至一个新的管子中，避免取到珠子。

8.根据权利要求1所述的一种镜检分枝杆菌阳性样本DNA提取纯化方法，其特征在于：步骤7的具体过程为：对DNA的浓度进行检测，然后冻存-80℃的环境中。