CN113249440B - 基于纳米孔测序平台的组织样本宏基因组建库和检测方法 - Google Patents

基于纳米孔测序平台的组织样本宏基因组建库和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于纳米孔测序平台的组织样本宏基因组建库和检测方法。本发明测试不同破碎管对组织以及病原体的破碎效果，发现Lysing Matrix A管可替代常规的组织研磨加Proteinase K消化过程做到组织匀浆，最终选用Lysing Matrix A管进行组织破碎匀浆后，选用Lysing Matrix E管进行病原体破壁，压缩了组织样本的后续宏基因组快速建库和测序时间，满足了临床对于感染样本检测的需求，适于推广应用。

Description

基于纳米孔测序平台的组织样本宏基因组建库和检测方法
技术领域
本发明涉及基因测序领域，特别是涉及一种基于纳米孔测序平台的组织样本宏基因组建库和检测方法。
背景技术
感染性疾病是造成人类疾病和死亡的重要原因，一直备受临床关注。新型冠状病毒肺炎的全世界范围大流行，给世界经济和人类健康带来严峻挑战，让病原的精准快速检测成为关注的热点。多种病原体(细菌、真菌、病毒等)均可以引起感染，病原微生物诊断的准确性、敏感性和诊断速度决定着临床病原诊断效能。传统临床微生物实验室鉴定病原体的主要方法是涂片镜检和培养，结合质谱、免疫和分子等技术，但其存在局限性，每类检测均只针对特定病原体类型，难以同时对常见的细菌、真菌和病毒等病原体做到快速区分；难培养、罕见及新型病原体的检测能力有限，无法精准用药导致抗菌药物耐药问题愈发严重。
宏基因组测序技术可以在一次检测中全面、无偏向性地检出样本中的微生物组成，发现罕见和新型病原体，为临床决策提供更全面精确的参考。但是现有的基于二代测序技术的宏基因组分析耗时长、读长短、拼接错误率高，这限制了其在临床快检中应用的可行性。三代测序技术PacBio在测序读长方面有了很大提高，但其缺点在于建库流程较为复杂，而且同二代测序一样存在测序周期长的缺点，一轮测序结束，需要几十个小时完成数据下机，加上后续分析时间，很难满足病原微生物的快速鉴定。
近年来发展起来的纳米孔测序技术则恰好可以弥补其他测序平台的劣势，其测序片段长度长、测序时间短、数据实时产生、设备小巧便携的特点，具有提高病原微生物检测的准确性、缩短报告周期(TURN-AROUND TIME，TAT)的特点，并适合医院及现场检测，契合临床感染诊断的需求场景，有希望成为下一代的感染诊断技术。
在宏基因组的研究领域，对于组织样本的采集，《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》建议尽可能采集病灶边缘或病变与正常交界处组织，但是实际情况组织获取困难，样本量非常少，且组织样本的宿主核酸量极高，病原体reads被检测到的数量非常少。所以，组织样本是否充分破碎对后续实验的成功与否有着重要影响。
组织处理的常规流程(比如
Figure BDA0003109897460000021
组织基因组DNA提取等一些成熟的商业化试剂盒)用研磨杵将组织彻底研磨(如组织较难彻底研磨，可选用电动或玻璃匀浆器)，再加入Proteinase K混匀后，在56℃或者65℃放置，直至组织溶解。不同组织裂解时间不同，通常需65℃孵育2小时左右或者难消化的组织甚至需要56℃过夜孵育。
组织处理的常规流程在实际操作过程中存在以下几点问题：
1.步骤比较复杂。一般常规的组织处理操作流程，在组织中加入PBS，盖紧EP管盖，来回颠倒EP管4～5次，吸弃液体。重复上述步骤两次后，再次加入PBS研磨，然后再加入Proteinase K孵育。2.手动研磨组织困难。一般常规的组织处理需要使用高温灭菌后的无菌研磨杵将组织充分研磨至米糊状，需要花费数小时不等，人工研磨很困难，且也不能满足商业化多样本快速处理要求。3.可能影响建库成功率和病原检出率。如果样本处理过程中手动研磨不均匀，容易导致后续宿主去处不干净，影响组织样本建库成功率以及病原检出率。4.操作时间过长，不能满足感染样本对时效性的需求。手动研磨组织因样本情况不同差异比较大，通常需要数小时不等。此外，常规的组织处理过程在研磨后还需要加入Proteinase K，再置于65℃金属浴震荡孵育2小时或者56℃震荡孵育过夜，消化至无可见块状组织。
综上，常规的组织样本处理流程，不能满足感染样本对于时效性的迫切要求，尤其对于危重症患者而言时间就是生命。可见，针对感染组织样本急需一种更高效、便捷的宏基因组鉴定方法。有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
针对上述常规的组织样本处理流程存在的问题，本发明需要解决的核心目的是寻求一种能够快速破碎组织但对病原体基本无破壁效果的方法，从而进行后续去除宿主和提取感染的病原体核酸，进一步进行后续宏基因组建库和病原体检测。本发明在对基于不同的破碎管测试过程中非常惊奇的发现Lysing Matrix A管可替代常规的组织研磨加Proteinase K消化过程做到组织匀浆，能极大的缩短组织样本的破碎处理时间，且该管对病原体基本无破壁效果，从而压缩了组织样本整个宏基因组快速建库和测序时间，满足了临床对于感染样本检测的要求，适于临床商业推广应用。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
本发明首先提供一种组织样本处理方法，所述方法包括：
步骤1)组织样本破碎，所述破碎采用Lysing Matrix A管进行破碎；
步骤2)组织样本病原体破壁，所述组织样本病原体破壁采用Proteinase K消化后再加入Lysing Matrix E管处理。
进一步的，所述步骤1)组织样本破碎具体步骤为取组织样本和PBS加至MP的Lysing Matrix A管；6-8m/s震荡30-40s，运行1-3次，离心处理；
优选的，所述组织样本选用3-5mm*3-5mm组织样本，6m/s震荡40s设置1次；
在一些具体的实施方式中，所述步骤1)为：
(1)将3mm*5mm约50mg大小组织样本和700μLPBS加至MP的Lysing Matrix A管中；
(2)置于FastPrep-24TM 5G上；
(3)6m/s震荡优选40s，运行1次；
(4)轻轻离心，将管壁上液体离下去，将破碎管中的样本全部吸出转移到新的1.5mL无菌离心管进入下一步样本前处理步骤。
进一步的，所述步骤2)组织样本病原体破壁具体步骤为向沉淀样本中加入ZymoBIOMICSTM Lysis Solution和Proteinase K；震荡孵育后转移至Lysing Matrix E管；6-8m/s，30-40s运行1次；离心转移备用；
优选的，所述Proteinase K为Oryzogen的Proteinase K；
更优选的，所述震荡孵育后转移至Lysing Matrix E管；6m/s，40s运行1次。
在一些具体的实施方式中，所述步骤2)为：
(1)向沉淀中加入700μL Lysis Solution和35μLProteinase K；
(2)65℃，900rpm，震荡孵育10min；
(3)将液体转移至Lysing Matrix E管；
(4)在FastPrep-24TM 5G仪器上设置破碎参数：6m/s，40s运行1次；
(5)14000g离心10min，吸取500μL上清到一支新的2ml离心管内。
更进一步的，所述步骤2)样本病原体破壁前可进一步包括组织样本的去宿主步骤；优选的，所述去宿主采用常规去宿主试剂盒进行宿主去除，比如基于诺唯赞的
Figure BDA0003109897460000031
Host Removal and Microbiome DNA Isolation Kit方法：
(1)破碎后吸出的样本，14000g离心5min；
(2)弃掉上清用200μL溶液SL重悬沉淀；
(3)加入40μL溶液1％DH，加入200μL溶液SS，用枪吹打混匀；
(4)加入1～10μL溶液XX，立即混匀，37℃、1000rpm孵育10min；
(5)加1000μL溶液SL，用枪吹打混匀，12000g离心3min；
(6)弃上清，沉淀进入核酸提取步骤。
本发明还提供一种组织样本宏基因组核酸提取方法，所述方法上述组织样本处理方法，并进一步包括常规核酸提取步骤。
本发明还提供一种组织样本宏基因组建库方法，其特征在于，所述所述方法包括上述述组织样本宏基因组核酸提取方法，并进一步包括基于提取核酸进行常规建库步骤。
进一步的，本发明所述的组织样本宏基因组建库方法是基于纳米孔测序平台的组织样本宏基因组建库方法。
本发明还提供一种组织样本宏基因组核酸提取试剂盒或组织样本宏基因组建库试剂盒，所述试剂盒中包括Lysing Matrix A管、Lysing Matrix E管和Proteinase K。
进一步的，所述试剂盒中还包括常规核酸提取试剂或常规文库构建试剂。
本发明还提供一种Lysing Matrix A管和Lysing Matrix E管在组织样本宏基因组建库中的应用。
上述所述组织，包括但不限于肺、肝、脑、肾、脾等组织。
本发明有益的技术效果：
(1)本发明所述A管可替代常规的组织研磨加Proteinase K消化，将组织样本处理时间由之前的大于2h缩短至6min左右，极大的缩短了组织样本的破碎处理时间。流程简化，操作简便，避免引入不必要的污染，满足了商业化多样本快速处理需求，在时间节约上具有预料不到效果。
(2)本发明采用Proteinase K和E管一起有效处理样本中可能存在结核/曲霉/革兰氏阳性菌，提高病原菌破壁效果。
(3)本发明通过对试剂的综合优化，显著降低单样本鉴定成本。
(4)本发明基于纳米测序孔平台，创造性地将A管和E管结合起来使用，巧妙地解决了组织样本常规流程处理复杂、耗时长，难以满足感染样本快速且迫切需求，压缩了组织样本的宏基因组快速建库和测序时间，满足了临床对于感染样本检测的要求，适于推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1本发明的实验流程图；
图2不同A管提取次数的效果比较；
图3优化前处理方法对比传统流程效果；
图4不同品牌Proteinase K的核酸提取效果；
图5不同酶消化方法对结核分枝杆菌(TB)检出影响；
图6基于纳米孔测序平台测序结果；
图7纳米孔测序平台检出细菌鉴定的覆盖图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，并且所述实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
部分术语定义
除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
本发明所述的组织样本处理方法，所述方法包括：
步骤1)组织样本破碎，所述破碎采用Lysing Matrix A管进行破碎；
步骤2)组织样本病原体破壁，所述组织样本病原体破壁采用Proteinase K消化后再加入Lysing Matrix E管处理。
在一些实施方式中，组织样本破碎管选择的原则是选出破碎组织最好，且对病原体破壁效果最差的破碎管用来进行组织破碎匀浆。
在一些具体实施方式中，组织样本破碎可选用3mm*5mm绿豆大小约50mg组织(样本太少对应的病原量少，可能影响病原检出；样本太多宿主核酸过多，后续宿主处理不干净，也影响病原量检出)。
在一些具体实施方式中，组织样本破碎，临床样本难以获取，可选择猪肺、鸡肝做为模拟组织进行后续条件的摸索。
在一些具体实施方式中，组织样本破碎选择Lysing Matrix A管(简称A管)、Lysing Matrix E管(简称E管)、Lysing Matrix M管(简称M管)、Lysing Matrix Z管(简称Z管)4种破碎管进行SPIKE-IN组织测试，选择模拟组织猪肺分别SPIKE-IN鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii，简称AB)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans，简称CN)和结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，简称TB)，分别进行去宿主和不去宿主处理，提取核酸，qPCR评价不同类型破碎管组织测试结果。对组织的破碎效果排序，A管>Z管>M管>E管，优选A管进行后续组织破碎。
在一些具体实施方式中，组织样本破碎选择A管、E管、M管、Z管4种破碎管进行SPIKE-IN鲍曼不动杆菌(AB)、新型隐球菌(CN)和结核分枝杆菌(TB)三种纯菌，只做核酸提取，qPCR评价不同类型破碎管对菌的破壁效果。对菌的破碎效果排序E管>Z管>M管>A管，优选E管进行组织破碎后病原菌的破碎。
在一些具体实施方式中，组织样本破碎选择FastPrep-24TM 5G上6m/s震荡40s设置1次、2次、3次的A管破碎次数，比较不同破碎次数对核酸提取效果的影响，优选6m/s震荡40s设置1次。
因此在一些具体实施方式中，所述步骤1)组织样本破碎具体步骤为取组织样本和PBS加至MP的A管中；6-8m/s震荡30-40s，运行1-3次，离心处理；优选的，所述组织样本选用3-5mm*3-5mm组织样本，6m/s震荡40s设置1次；
在一些更具体的实施方式中，所述步骤1)为：
(1)将3mm*5mm约50mg绿豆大小组织样本和700μLPBS加至MP的A管中；
(2)置于FastPrep-24TM 5G上；
(3)6m/s震荡优选40s，优选运行1次；
(4)轻轻离心，将管壁上液体离下去，将破碎管中的样本全部吸出转移到新的1.5mL无菌离心管进入下一步样本前处理步骤。
进一步的，所述步骤2)组织样本破壁具体步骤为向沉淀样本中加入ZymoBIOMICSTMLysis Solution和Proteinase K；震荡孵育后转移至MP的E管；
在一些具体实施方式中，组织样本核酸提取中Proteinase K的选择，测试3种不同品牌(分别为Qiagen/Tiangen/Oryzogen，单次成本为66元/19元/2.7元)的Proteinase K对核酸提取效果的影响，Qiagen、Tiangen和Oryzogen三种品牌的Proteinase K在结核分枝杆菌(TB)的检出上无明显差异，优选成本远低的Oryzogen的Proteinase K。
在一些具体实施方式中，组织样本破碎Proteinase K破碎前消化与破碎后消化对结核分枝杆菌(TB)检出的影响，破碎前消化与破碎后消化无差别，考虑整体流程操作性，优选Proteinase K破碎后核酸提取前消化使用。
因此，在一些具体的实施方式中，步骤2)为采用Oryzogen的Proteinase K，6-8m/s，30-40s运行1次；离心转移备用；
在一些更具体的实施方式中，所述步骤2)为：
(1)向沉淀中加入700μL ZymoBIOMICSTM Lysis Solution和35μLProteinase K；
(2)65℃，900rpm，震荡孵育10min；
(3)将液体转移至E管；
(4)在FastPrep-24TM 5G仪器上设置破碎参数：6m/s，40s运行1次；
(5)14000g离心10min，吸取500μL上清到一支新的2ml离心管内。
更进一步的，所述步骤2)样本病原体破壁前可进一步包括组织样本的去宿主步骤；优选的，所述去宿主采用常规去宿主试剂盒进行宿主去除，比如基于诺唯赞的
Figure BDA0003109897460000081
Host Removal and Microbiome DNA Isolation Kit方法：
(1)破碎后吸出的样本，14000g离心5min；
(2)弃掉上清用200μL溶液SL重悬沉淀；
(3)加入40μL溶液1％DH，加入200μL溶液SS，用枪吹打混匀；
(4)加入1～10μL溶液XX，立即混匀，37℃、1000rpm孵育10min；
(5)加1000μL溶液SL，用枪吹打混匀，12000g离心3min；
(6)弃上清，沉淀进入核酸提取步骤。
本发明还提供一种组织样本宏基因组核酸提取方法，所述方法上述组织样本处理方法，并进一步包括常规核酸提取步骤。
本发明还提供一种组织样本宏基因组建库方法，其特征在于，所述所述方法包括上述述组织样本宏基因组核酸提取方法，并进一步包括基于提取核酸进行常规建库步骤。
进一步的，本发明所述的组织样本宏基因组建库方法是基于纳米孔测序平台的组织样本宏基因组建库方法。
本发明还提供一种组织样本宏基因组核酸提取试剂盒或组织样本宏基因组建库试剂盒，所述试剂盒中包括Lysing Matrix A管、Lysing Matrix E管和Proteinase K。
进一步的，所述试剂盒中还包括常规核酸提取试剂或常规文库构建试剂。
在一些具体实施方式中，组织样本破碎后不同酶消化方法对结核分枝杆菌(TB)检出的影响，Proteinase K单独使用与Proteinase K&Zymolyase&Chitinase三种酶同时使用效果相似，优选Proteinase K单独使用。
在一些方面，本发明所述的宏基因组鉴定方法可应用于包括但不限于临床研究和科学研究等领域。
以下描述仅是为了帮助理解本发明而提供。这些描述不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
下述实施例和实验例涉及的仪器包括：生物安全柜、震荡金属浴、移液器、离心机、打断破碎仪、超净台、PCR仪、磁力架、GridION、Qubit 4.0、冰箱、核酸自动提取工作站等。
涉及的试剂包括：MP Biomedicalstm Lysing Matrix A(简称A管)、MPBiomedicalstm Lysing Matrix E(简称E管)、MP Biomedicalstm Lysing Matrix M(简称M管)、MP Biomedicalstm Lysing Matrix Z(简称Z管)、诺唯赞的宿主去除和微生物组DNA分离试剂盒(
Figure BDA0003109897460000092
Host Removal and Microbiome DNA Isolation Kit)、Oryzogen的Proteinase K(货号：HYC031R01)、Zymolyase酶、Chitinase酶、PBS、核酸提取试剂盒、Universal End preparation ModuLe、Universal Adapter Ligation ModuLe、
Figure BDA0003109897460000091
GXL DNA Polymerase、ONT建库试剂盒、AMPure XP纯化磁珠、QubitTM检测试剂盒、ONT测序芯片等。
本发明的具体实验流程如图1所示。
实验例：基于纳米孔测序平台的组织样本宏基因组建库和检测方法的具体步骤如下：
一、组织破碎：
(1)将3mm*5mm约50mg绿豆大小组织样本和700μLPBS加至MP的A管中；
(2)置于FastPrep-24TM 5G上；
(3)6m/s震荡优选40s，优选运行1次；
(4)轻轻离心，将管壁上液体离下去，将破碎管中的样本全部吸出转移到新的1.5mL无菌离心管进入下一步样本前处理步骤。
二、样本前处理(宿主去除和微生物组DNA分离)：
(1)破碎后吸出的样本，14000g离心5min；
(2)弃掉上清用200μL溶液SL重悬沉淀；
(3)加入40μL溶液1％DH，加入200μL溶液SS，用枪吹打混匀；
(4)加入1～10μL溶液XX，立即混匀，37℃、1000rpm孵育10min；
(5)加1000μL溶液SL，用枪吹打混匀，12000g离心3min；
(6)弃上清，沉淀进入核酸提取步骤。
三、提取核酸：
(1)向沉淀中加入700μL ZymoBIOMICSTM Lysis Solution和35μLProteinase K；
(2)65℃，900rpm，震荡孵育10min；
(3)将液体转移至E管；
(4)在FastPrep-24TM 5G仪器上设置破碎参数：6m/s，40s运行1次；
(5)14000g离心10min，吸取500μL上清到一支新的2ml离心管内；
(6)向2mL离心管中的加入500μL样本体积的2倍体积的Viral DNA/RNA Buffer，涡旋混匀；
(7)分批次将上清转移至Zymo-SpinTM IIC-XL Column中，每次至多转移750μL样本，分批次转移上清时10000rpm/min离心1min，离心后弃置收集管中的废液；
(8)上清转移完成后，将Zymo-SpinTM IIC-XL Column放置于新的收集管中，向Zymo-SpinTM IIC-XL Column上加入500μL的Viral Wash Buffer，10000rpm/min离心30s，弃收集管中废液；
(9)重复步骤一次；
(10)向Zymo-SpinTM IIC-XL Column上加入500μL的无水乙醇，14000rpm/min离心1min，弃废液；
(11)将Zymo-SpinTM IIC-XL Column转移到新的洁净的1.5mL离心管中；
(12)往Zymo-SpinTM IIC-XL Column的滤膜中间加入75μLNuclease-Free Water，盖上盖子，孵育2min，14000rpm/min离心1min，得到样本核酸提取液。
四、文库构建
(一)DNA片段的末端修复
1.在PCR管中加入末修体系：
组分 体积
样本核酸 50ng
End prep Mix4(Vazyme) 15μL
Nuclease-Free Water 补至60μL
2.混匀离心后，进行PCR反应：
温度 时间
20℃ 10min
65℃ 10min
(二)接头连接
1.反应结束后，向PCR管中加入接头连接体系：
组分 体积
上一步末端修复反应产物 60μL
Rapid Ligation Buffer 2(Vazyme) 25μL
Rapid DNA Ligase(Vazyme) 5μL
BCA 10μL
混匀20℃孵育15～30min。
2.纯化
(1)加入0.4×AMPure XP beads室温旋转混匀孵育5min，离心弃上清；(2)80％酒精洗2次beads；
(3)加入Nuclease-free water，室温孵育2min。
(三)PCR扩增
1.配制PCR反应mix：
组分 体积
5×PS GXL Buffer(Takara) 10μL
DNA template 32.5μL
BP 1μL
dNTP Mix 4μL
PrimeSTAR GXL 2μL
Nuclease-free water 补至50μL
2.涡旋混匀，置于PCR仪上设置好反应程序；
Figure BDA0003109897460000111
3.Qubit检测。
(四)纯化和混库
1.加0.5×AMPure XP beads室温旋转混匀孵育5min，离心后弃上清；
2. 80％酒精洗2次beads；
3.加入Nuclease-free water，室温旋转混匀孵育2min后Qubit测浓度；
4.混库：根据纯化后的样本浓度，按照数据产出要求成比例混库，混库总量在900～1800ng
(五)加接头
1.加入0.5×beads室温旋转混匀孵育5min，离心后弃上清；
2.80％酒精洗2次beads；
3.10mM Tris-HCl(50mM NaCl)pH 8.0洗脱液洗脱，离心后Qubit检测；
4.加入1μL RAP，室温反应5min。
(六)按照标准纳米孔测序上机流程上机测序。
以下结合具体的实施例来证明本发明所产生的技术效果。
实施例1不同类型破碎管的选择
1.不同类型破碎管组织测试
实验流程称取50mg的猪肺放入每个A管、E管、M管、Z管4种破碎管中，并向破碎管中加入500μl PBS。向每个装有猪肺的破碎管中加入鲍曼不动杆菌(AB)、新型隐球菌(CN)和结核分枝杆菌(TB)标准品菌株。在FastPrep-24TM 5G仪器上设置破碎参数，进行后续的样本去宿主/不去宿主，提取核酸，qPCR测试不同类型破碎管组织测试结果。
备注：E管因破碎完肉眼观察有明显的大颗粒组织残留，放弃进入后续比对流程。
表1不同类型破碎管组织qPCR结果
Figure BDA0003109897460000121
Figure BDA0003109897460000131
注：ΔCt值＝去宿主Ct值－不去宿主Ct值。该实验共重复3次，结果相同。
2.不同类型破碎管纯菌测试
实验流程每个A管、E管、M管、Z管4种破碎管中，加入鲍曼不动杆菌(AB)、新型隐球菌(CN)和结核分枝杆菌(TB)标准品菌株。在FastPrep-24TM 5G仪器上设置破碎参数，进行后续直接提提取核酸，qPCR测试不同类型破碎管纯菌测试结果。
表2不同类型破碎管纯菌提取qPCR结果。
Figure BDA0003109897460000132
注：ΔCt值＝去宿主Ct值－不去宿主Ct值。
综上，(1)从组织破碎角度考虑。肉眼观察A管破碎组织效果最好，匀浆均匀，无大颗粒组织残留；M管和Z管破碎效果次之，偶尔可见较大颗粒组织残留；E管破碎完肉眼观察有明显的大颗粒组织残留，放弃进入后续比对流程。表1中A管和M管病原体ΔCt<1.5，对病原体破壁效果差，Z管中TBΔCt>1.5，对病原体有一定的破壁效果。按对组织的破碎效果排序，A管>Z管>M管，综合考虑选择A管破碎组织。
(2)从病原体破壁效果角度考虑。表2中，A管、M管和Z管的AB菌的ΔCt<1.5，A管、M管和Z管的CN菌和TB菌的ΔCt>2，对病原体有一定的破壁效果，E管的所有菌ΔCt>2，说明E管和Z管均对病原体有破壁效果最好。按对菌的破壁效果排序，E管>Z管>M管>A管，综合考虑虑选择E管对病原体进行破壁。
实施例2 A管对组织破壁次数的选择：
目的：测试时间优化流程的方法中，破碎参数6m/s，40s运行(1次、2次、3次)对核酸提取效果的影响。
方案：设置1次、2次、3次的A管破碎次数的实验组，比较不同破碎次数对核酸提取效果的影响。
模拟样本：鸡肝组织样本中SPIKE IN结核分枝杆菌(TB)标准品。
如图2所示，破壁次数增加对于结核分枝杆菌(TB)无明显变化，综合考虑缩短报告周期TAT，优选破碎参数6m/s，40s运行1次。
实施例3 A管组织破碎参数6m/s，40s运行1次和常规流程结果以及时间对比
目的：组织样本前处理原流程(大于2小时6min)缩短的替代方案
实验方案：
Figure BDA0003109897460000141
实验结果如图3，综上，优化流程组织A管破碎1次可替代原流程组织手动研磨加Proteinase K消化过程做到组织匀浆，并且不影响结核分枝杆菌(TB)提取效果，qPC R无显著差异，可缩短至少2h实验周期。
实施例4 Proteinase K可替换为国产试剂，不影响检出效果
实验目的：测试3种不同品牌的Proteinase K对核酸提取效果的影响
实验方案：
Figure BDA0003109897460000142
综上，结果如图4所示，Qiagen、Tiangen和Oryzogen三种品牌的Proteinase K在结核分枝杆菌(TB)的检出上无明显差异，优选成本远低的国产试剂Oryzogen的Prot einaseK(货号：HYC031R01)。
实施例5不同酶消化方法对结核分枝杆菌(TB)检出的影响
实验目的：测试不同的酶消化方法对结核分枝杆菌(TB)检出的影响
实验方案：
Figure BDA0003109897460000151
实验结果如图5所示，Proteinase K单独使用与Proteinase K&Zymolyase&Chitinase三种酶同时使用效果相似。破碎前消化与破碎后消化对TB菌检出无差别。不过综合考虑全流程操作简便性，在组织样本破碎后，病原体破壁前加入Proteinase K。
实施例6临床组织样本基于纳米孔测序平台宏基因组建库
基于上述确立的处理流程，对一份有临床培养结果的组织样本进行处理，按照基于纳米孔测序平台的组织样本宏基因组建库全流程上机测试，测试结果如下表。
Figure BDA0003109897460000152
纳米孔测序平台具体测序结果展示如图6"纳米孔测序平台检出细菌鉴定覆盖图如图7。可见，本发明可以快速的检出感染病原，且与临床结果相吻合，压缩了组织样本的基于纳米孔测序平台宏基因组快速建库和测序时间，满足了临床对于感染组织样本时效性的迫切检测的需求。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (6)

1.一种用于纳米孔测序平台的组织样本宏基因组建库的组织样本处理方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤1）组织样本破碎；所述破碎采用MP的Lysing Matrix A管进行破碎；
步骤2）组织样本病原体破壁；所述组织样本病原体破壁采用Proteinase K消化后再加入Lysing Matrix E管处理；
所述步骤1）组织样本破碎具体步骤为：取组织样本和PBS加至Lysing Matrix A管；6-8m/s震荡30-40s，运行1-3次，离心处理；
所述步骤2）组织样本病原体破壁具体步骤为：向沉淀样本中加入裂解液和ProteinaseK；震荡孵育后转移至Lysing Matrix E管；6-8m/s，30-40s 运行1-3次；离心转移备用。
2.权利要求1所述的组织样本处理方法，其特征在于，所述步骤1）中的震荡为6m/s震荡40s，设置1次。
3.权利要求1-2任一所述的组织样本处理方法，其特征在于，所述步骤2）中；所述Proteinase K为Oryzogen的Proteinase K; 所述震荡孵育后转移至Lysing Matrix E管；6m/s，40s 运行1次。
4.权利要求1-3任一所述组织样本处理方法，其特征在于，步骤2）样本病原体破壁前进一步包括组织样本的去宿主步骤；所述去宿主采用常规去宿主试剂盒进行宿主去除。
5.一种组织样本宏基因组核酸提取方法，其特征在于，所述方法包括权利要求1-4任一所述组织样本处理方法，并进一步包括常规核酸提取步骤。
6.一种组织样本宏基因组建库方法，其特征在于，所述方法包括权利要求5所述组织样本宏基因组核酸提取方法，并进一步包括基于提取核酸进行常规建库步骤。
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https://www.bio-equip.com/showarticle.asp?id=453104413;中国生物器材网;《https://www.bio-equip.com/showarticle.asp?id=453104413》;20190102;全文 *
Lung microbiota associations with clinical features of COPD in the SPIROMICS cohort;K Opron等;《npj Biofilms and Microbiomes》;20210205(第14期);参见第6页右栏方法部分、参见第7页左栏方法部分 *

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