CN112899270A - 肺泡灌洗病原微生物宏基因组去除宿主化核酸提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种肺泡灌洗病原微生物宏基因组去除宿主化核酸提取方法，包括如下步骤：S1、差异裂解去宿主：取样离心弃上清，重悬于PBS溶液中，加入皂素溶液孵育后加入无菌水再次孵育；加入NaCl震荡均匀后离心弃上清，重新悬浮于PBS溶液中；S2、去除宿主DNA：向S1中所得溶液中加入PMA溶液，经历黑暗孵育以及光照孵育；S3、微生物菌体破壁：采用研磨珠以及溶菌酶对S2中得到的溶液进行破壁处理；S4、核酸提取：对S3得到的溶液进行DNA提取，并检测质量。本发明通过使用叠氮溴化丙锭(PMA)。当暴露在可见光下时，PMA分子的叠氮基被光解裂解，并发生C‑H插入反应，与DNA形成共价键，可有效地从下游分析中消除任何暴露的DNA。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其涉及一种肺泡灌洗病原微生物宏基因组去除宿主化核酸提取方法。
背景技术
全面检测、无偏好性的宏基因组二代测序(mNGS)在传染病诊断方面具有强大的优势，因为不需要特殊探针和靶向引物，从而有助于快速检测病原体。随着成本和时间的持续减少，mNGS越来越多地用于临床诊断。然而，由于宿主DNA的高背景大大降低了病原体的序列覆盖率，在大多数临床标本中，人类DNA污染仍然是mNGS中病原体检测的主要挑战。先前对急性下呼吸道感染患者鼻咽抽吸物进行的宏基因组学研究表明，高达95％的原始NGS读数是人类DNA。可使用商用试剂盒和已发布的方法(包括差异裂解，去除人类DNA和微生物DNA富集方法)进行去宿主处理，但它们在复杂的呼吸道样本中表现不佳，需要更好的方法。
当前去除宿主DNA的方法可分为两大类：在DNA提取之前起作用的方法和在提取后作用于DNA的方法。第一种方法通常遵循两步过程：第一步是选择性裂解哺乳动物细胞；第二步通过酶去除暴露的DNA，仅留下完整的微生物细胞用于下游分析。虽然成本较低，但对样本要求较高，会引起提取得到的微生物样本量不足等问题。第二种方法主要有两种形式的处理方法：一种方法是针对甲基化核苷酸，但这种方法不适用于具有与宿主相似的甲基化模式的真核微生物；另一种方法是利用CRISPR/Cas9针对宿主特异性序列进行基于杂交的缺失，这种方法已经成功地应用于高度重复的rRNA序列，但不容易适应基因组规模的序列耗尽。
因此急需提供一种应用于呼吸道样本，兼容性好，提取效果好、效率高，成本低的病原微生物宏基因组去宿主化核酸提取方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，本发明提出了肺泡灌洗液病原微生物宏基因组去宿主化核酸提取方法，对临床标本进行预处理，以选择性地消耗人类DNA，同时将对病原体DNA的影响降至最低。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种肺泡灌洗病原微生物宏基因组去除宿主化核酸提取方法，包括如下步骤：
S1、差异裂解去宿主：取样离心弃上清，重悬于PBS溶液中，加入皂素溶液孵育后加入无菌水再次孵育；加入NaCl震荡均匀后离心弃上清，重新悬浮于PBS溶液中；
S2、去除宿主DNA：向S1中所得溶液中加入PMA溶液，经历黑暗孵育以及光照孵育；
S3、微生物菌体破壁：采用研磨珠以及溶菌酶对S2中得到的溶液进行破壁处理；
S4、核酸提取：对S3得到的溶液进行DNA提取，并检测质量。
进一步地，所述S1中差异裂解去宿主具体包括如下步骤：
S11、将肺泡灌洗液样品(400μL)以10,000g离心5min，去掉上清液，并将沉淀重新悬浮在200μLPBS中；
S12、加入5％皂苷溶液，震荡混匀并在室温下孵育10min；
S13、孵育后，添加300μL无菌水，并在室温下继续孵育30s，然后添加10μL 5MNaCl，振荡混匀；
S14、10,000g离心5min，除去上清液，然后将沉淀重悬于200μl PBS中。
进一步地，所述皂苷溶液的最终浓度为2.5％。
进一步地，所述S2中去除宿主DNA具体包括如下步骤：
S21、向溶液中添加叠氮溴化丙锭，并将样品短暂涡旋，然后在黑暗中于室温条件下孵育10min；
S22、孵育后，将溶液于冰上水平放置30min，并距离标准台式荧光灯<20cm。在此期间，每5min短暂离心并旋转一次。
进一步地，所述叠氮溴化丙锭的最终浓度为10μM。
进一步地，所述S3中微生物菌体破壁具体包括如下步骤：
S31、将溶液以5000g离心15min，弃上清液；
S32、将沉淀重悬于400μl PBS中，并添加250mg破壁珠、10uL 20mg/ml溶菌酶；
S33、振荡混匀，37℃下孵育15min。
进一步地，所述S4中采用商用核酸抽提试剂盒进行DNA抽提及纯化。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：在差异裂解去宿主环节，采用皂苷和NaCl差异性裂解宿主细胞；去除宿主DNA环节，没有使用酶去消化暴露的DNA，而是使用叠氮溴化丙锭(PMA)。当暴露在可见光下时，PMA分子的叠氮基被光解裂解，并发生C-H插入反应，与DNA形成共价键，可有效地从下游分析中消除任何暴露的DNA；微生物菌体破壁环节，采用物理(玻璃珠机械破壁法)和化学(溶菌酶破壁法)联合破壁法，实施细菌、真菌等细胞壁破壁；最后，采用商用核酸抽提试剂盒进行DNA的抽提和纯化。
具体实施方式
容易理解，根据本发明的技术方案，在不变更本发明实质精神下，本领域的一般技术人员可以提出可相互替换的多种结构方式以及实现方式。因此，以下具体实施方式仅是对本发明的技术方案的示例性说明，而不应当视为本发明的全部或者视为对本发明技术方案的限定或限制。
一种肺泡灌洗液病原微生物宏基因组去宿主化核酸提取方法，包括如下步骤：
1.差异裂解去宿主
(1)取1个肺泡灌洗液样本，做三个平行实验。分别取400μL以10,000g离心5min，然后去掉上清液，并将沉淀重新悬浮在200μL PBS中。
(2)加入200μlL5％皂苷溶液至终浓度为2.5％，充分震荡混合并在室温下孵育10min以促进宿主细胞裂解。
(3)孵育后，添加300μL无菌水，并在室温下继续孵育30s，然后添加10μL 5M NaCl裂解受损的宿主细胞。
(4)接下来将样品以6,000g离心5min，除去上清液，然后将沉淀重新重悬于200μLPBS中。
2.去除宿主DNA
(1)向上述溶液中分别添加10μL的0.2mM PMA溶液，使其终浓度为10μM。并将样品短暂涡旋，然后在黑暗中于室温条件下孵育10min。
(2)孵育后，将溶液于冰上水平放置30min，并距离标准台式荧光灯<20cm。在此期间，每5min短暂离心并旋转一次。
3.微生物菌体破壁
(1)将溶液以5000g离心15min，弃上清液。
(2)将沉淀重悬于400μl PBS中，并分别添加250mg破壁珠、10uL 20mg/ml溶菌酶。充分振荡混匀，37℃下孵育15min。
4.核酸提取
采用通用型DNA提取试剂盒QIAamp DNA Mini kit进行DNA抽提和纯化，并进行平行试验。
5.核酸质量检测
采用Qubit dsDNA HS kit测定提取的DNA浓度及纯度。
对照例
对对应的原始样品不做去宿主处理，分别取400μL直接进行样本破壁和核酸提取。
核酸质量检测结果如下表1所示：
表1 DNA提取量(ng/μL)对比
| 实施例 | 对照例 | |
| 样品1 | 6.1 | 25.6 |
| 样品2 | 4.9 | 23.4 |
| 样品3 | 5.2 | 25.1 |
将实施例和对照例样品抽提出的DNA进行NGS检测，使用商业试剂盒进行建库，在华大测序仪进行测序，评估样本中微生物的检出reads。结果如表2所示：
表2：病原微生物序列占比(％)与病原微生物检出数目对比
从表1的检测结果可以看出，样本去宿主后，抽提浓度大幅度降低，可以判断大量的宿主核酸被去除。从表2中得出，样本去宿主后，病原微生物序列占比及检出数目均显著高于对照例。本发明差异裂解去宿主方法可显著减少背景人类DNA并提高NGS检测病原体的敏感性。
本发明的技术范围不仅仅局限于上述说明中的内容，本领域技术人员可以在不脱离本发明技术思想的前提下，对上述实施例进行多种变形和修改，而这些变形和修改均应当属于本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种肺泡灌洗病原微生物宏基因组去除宿主化核酸提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、差异裂解去宿主：取样离心弃上清，重悬于PBS溶液中，加入皂素溶液孵育后加入无菌水再次孵育；加入NaCl震荡均匀后离心弃上清，重新悬浮于PBS溶液中；
S2、去除宿主DNA：向S1中所得溶液中加入PMA溶液，经历黑暗孵育以及光照孵育；
S3、微生物菌体破壁：采用研磨珠以及溶菌酶对S2中得到的溶液进行破壁处理；
S4、核酸提取：对S3得到的溶液进行DNA提取，并检测质量。
2.根据权利要求1所述的肺泡灌洗病原微生物宏基因组去除宿主化核酸提取方法，其特征在于，所述S1中差异裂解去宿主具体包括如下步骤：
S11、将肺泡灌洗液样品(400μL)以10,000g离心5min，去掉上清液，并将沉淀重新悬浮在200μLPBS中；
S12、加入5％皂苷溶液，震荡混匀并在室温下孵育10min；
S13、孵育后，添加300μL无菌水，并在室温下继续孵育30s，然后添加10μL 5M NaCl，振荡混匀；
S14、10,000g离心5min，除去上清液，然后将沉淀重悬于200μl PBS中。
3.根据权利要求1所述的肺泡灌洗病原微生物宏基因组去除宿主化核酸提取方法，其特征在于，所述皂苷溶液的最终浓度为2.5％。
4.根据权利要求1所述的肺泡灌洗病原微生物宏基因组去除宿主化核酸提取方法，其特征在于，所述S2中去除宿主DNA具体包括如下步骤：
S21、向溶液中添加叠氮溴化丙锭，并将样品短暂涡旋，然后在黑暗中于室温条件下孵育10min；
S22、孵育后，将溶液于冰上水平放置30min，并距离标准台式荧光灯<20cm。在此期间，每5min短暂离心并旋转一次。
5.根据权利要求1所述的肺泡灌洗病原微生物宏基因组去除宿主化核酸提取方法，其特征在于，所述叠氮溴化丙锭的最终浓度为10μM。
6.根据权利要求1所述的肺泡灌洗病原微生物宏基因组去除宿主化核酸提取方法，其特征在于，所述S3中微生物菌体破壁具体包括如下步骤：
S31、将溶液以5000g离心15min，弃上清液；
S32、将沉淀重悬于400μl PBS中，并添加250mg破壁珠、10uL 20mg/ml溶菌酶；
S33、振荡混匀，37℃下孵育15min。
7.根据权利要求1所述的肺泡灌洗病原微生物宏基因组去除宿主化核酸提取方法，其特征在于，所述S4中采用商用核酸抽提试剂盒进行DNA抽提及纯化。
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| CN (1) | CN112899270A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113322304A (zh) * | 2021-06-19 | 2021-08-31 | 江苏先声医学诊断有限公司 | 一种应用于二代感染宏基因组检测的临床样本处理方法 |
| CN113502321A (zh) * | 2021-08-11 | 2021-10-15 | 南京诺因生物科技有限公司 | 脑脊液病原微生物宏基因组核酸扩增方法 |
| CN113684252A (zh) * | 2021-09-03 | 2021-11-23 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种血液样本中病原菌dna的制备方法和基于此方法的临床病原菌感染诊断试剂盒 |
| CN114621949A (zh) * | 2022-01-21 | 2022-06-14 | 中国农业大学 | 一种组织微生物基因组去宿主化提取方法 |
| CN115521875A (zh) * | 2022-09-29 | 2022-12-27 | 广州金域医学检验中心有限公司 | 一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法及其应用 |
| CN115806971A (zh) * | 2022-11-22 | 2023-03-17 | 北京金匙医学检验实验室有限公司 | 一种血液样本病原体微生物宏基因组的去宿主方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110199021A (zh) * | 2016-12-14 | 2019-09-03 | 东安格利亚大学企业有限公司 | 用于消除核酸的方法 |
| CN111471677A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-07-31 | 上海珈湘生物科技有限公司 | 痰液病原微生物宏基因组去宿主化提取系统及方法 |
| CN111621496A (zh) * | 2020-05-06 | 2020-09-04 | 南京世和基因生物技术股份有限公司 | 一种痰液宏基因组去宿主化提取试剂盒 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110199021A (zh) * | 2016-12-14 | 2019-09-03 | 东安格利亚大学企业有限公司 | 用于消除核酸的方法 |
| CN111471677A (zh) * | 2020-03-25 | 2020-07-31 | 上海珈湘生物科技有限公司 | 痰液病原微生物宏基因组去宿主化提取系统及方法 |
| CN111621496A (zh) * | 2020-05-06 | 2020-09-04 | 南京世和基因生物技术股份有限公司 | 一种痰液宏基因组去宿主化提取试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CLARISSE A. MAROTZ ET AL.: "Improving saliva shotgun metagenomics by chemical host DNA depletion", 《MICROBIOME》 * |
| 张士军 等: "叠氮溴化丙锭结合荧光定量PCR测定布鲁氏菌活菌数方法的建立", 《中国预防兽医学报》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113322304A (zh) * | 2021-06-19 | 2021-08-31 | 江苏先声医学诊断有限公司 | 一种应用于二代感染宏基因组检测的临床样本处理方法 |
| CN113502321A (zh) * | 2021-08-11 | 2021-10-15 | 南京诺因生物科技有限公司 | 脑脊液病原微生物宏基因组核酸扩增方法 |
| CN113684252A (zh) * | 2021-09-03 | 2021-11-23 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种血液样本中病原菌dna的制备方法和基于此方法的临床病原菌感染诊断试剂盒 |
| CN114621949A (zh) * | 2022-01-21 | 2022-06-14 | 中国农业大学 | 一种组织微生物基因组去宿主化提取方法 |
| CN115521875A (zh) * | 2022-09-29 | 2022-12-27 | 广州金域医学检验中心有限公司 | 一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法及其应用 |
| CN115521875B (zh) * | 2022-09-29 | 2024-06-04 | 广州金域医学检验中心有限公司 | 一种提高mNGS细菌与真菌检出率的去宿主方法及其应用 |
| CN115806971A (zh) * | 2022-11-22 | 2023-03-17 | 北京金匙医学检验实验室有限公司 | 一种血液样本病原体微生物宏基因组的去宿主方法 |
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