ES2708205T3 - Método de purificación de ácidos nucleicos - Google Patents

Abstract

Un método de purificación de ácidos polinucleicos, comprendiendo el método: (a) absorción de los ácidos polinucleicos en un filtro encajado en un recipiente; (b) lavado del filtro con una primera solución de lavado con fluido inmiscible; y (c) elución de los ácidos polinucleicos del filtro usando (i) una solución de elución con base acuosa y (ii) una solución de empuje con fluido inmiscible, en donde se obtiene una solución de ácidos polinucleicos purificados.

Description

DESCRIPCION

Metodo de purificacion de acidos nucleicos

Campo de la invencion

La invencion se refiere a metodos para purificar acidos nucleicos tales como ADN o ARN, que incluyen la purificacion de tales acidos nucleicos a partir de muestras clmicas u otros tipos de muestras de sangre, celulas o tejidos.

Antecedentes de la invencion

Las tecnicas de biologfa molecular que emplean muestras de ADN y ARN se basan a menudo en la obtencion de muestras purificadas de los acidos nucleicos. Existen numerosas fuentes de ADN o ARN, tales como tejidos, celulas, sangre entera, plasma, suero, extractos, que se pueden obtener a partir de un organismo (p. ej., humano, animal, planta, bacteria, virus, etc.), ademas de tejidos o cultivos celulares desarrollados o mantenidos en un laboratorio. El uso adicional del ADN o ARN generalmente requiere aislar el ADN o ARN de los otros componentes en la fuente de la muestra, de modo que los acidos polinucleicos esten libres de otras enzimas celulares, protemas, compuestos y/o restos. El aislamiento del ADN o a Rn de estos otros materiales permite el procesamiento posterior de los acidos polinucleicos mediante, por ejemplo, PCR, RT-PCR, TMA, LAMP, LCR, secuenciacion, analisis de hibridacion de acidos nucleicos o cualquiera de las numerosas tecnicas conocidas en la tecnica basadas en reacciones enzimaticas o reacciones de hibridacion que usan acidos nucleicos.

Una de las tecnicas mas tempranas para aislar ADN o ARN fue lisar una muestra de celula o tejido usando, por ejemplo, proteinasa K, anadir un volumen igual de una solucion de fenol/cloroformo al lisado para extraer materiales de acido no nucleico (p. ej., protemas, organulos, etc.), y eliminar la fase acuosa que contiene los acidos nucleicos para su uso posterior. Normalmente, los acidos nucleicos se recuperan de la fase acuosa por precipitacion con etanol o isopropanol. Las modificaciones de la tecnica incluyen anadir aun mas a la fase organica una pequena cantidad de alcohol isoairnlico para ayudar a desactivar las RNasas y/o anadir un agente caotropico tal como tiocianato de guanidinio para ayudar en la desnaturalizacion de protemas y en la inactivacion de enzimas. Si bien la extraccion con fenol/cloroformo se considera el "metodo de referenda" para la purificacion de acidos nucleicos mediante la eliminacion de materiales que no son acidos nucleicos debido a la alta pureza y a la alta recuperacion que proporciona, el metodo presenta inconvenientes, tales como ser laborioso, diffcil de automatizar, y requiere el uso de disolventes organicos peligrosos.

Posteriormente, se han desarrollado tecnicas basadas en la absorcion de acidos nucleicos en una fase solida, el lavado de materiales no deseados, y la elucion de acidos nucleicos como se describe en los documentos WO 2012/028737 A1, US 7067287 B1, WO 95/06652 A1, WO 01/62976 A1. La fase solida consiste a menudo en partmulas de sflice, pero tambien se usan otros materiales tales como fibras de vidrio, perlas o polvo, hidroxiapatita, resinas de intercambio anionico y diatomeas. Los acidos polinucleicos se unen a la fase solida en presencia de sales caotropicas, los materiales no unidos se lavan usando soluciones que contienen alcohol y, finalmente, los acidos polinucleicos se eluyen de la fase solida usando una solucion de baja fuerza ionica para obtener los acidos polinucleicos en forma sustancialmente pura.

Varias compares ofrecen kits para purificar ADN y ARN que presentan el uso de un material en fase solida. Los kits proporcionan generalmente el material de fase solida en forma de una columna, una membrana o como un recubrimiento sobre partmulas paramagneticas. Cuando se usan partmulas paramagneticas, se usa un iman para secuestrar las partmulas, mientras que los tampones de lavado o elucion se eliminan segun lo descrito por Scott M. Berry y col. ("One-Step purification of nucleic acid for gene expression analysis via Immiscible Filtration Assisted by Surface Tension (IFAsT)", Lab Chip, 2011, 11, 1747-1753), asf como por Sur Kunal y col. ("Immiscible Phase Nucleic Acid Purification Eliminates PCR Inhibitors with a Single Pass of Paramagnetic Particles through a Hydrophobic Liquid", J Mol Diagn. 2010 Sep; 12(5): 620-628). Sin embargo, las partmulas paramagneticas son relativamente caras, y la manipulacion de las partmulas aumenta los costos de automatizacion. Cuando se usan columnas o membranas como la fase solida, los tampones de lavado y elucion se extraen bien mediante centrifugacion o bien aplicando un vado. Las columnas y las membranas deben disenarse y procesarse de manera tal que las soluciones de lavado sean efectivas para pasar por todo el volumen vado. La retencion de lfquido en la fase solida, o de manera similar, el lavado inadecuado del espacio vado en la fase solida significa que las impurezas, inhibidores u otros compuestos que interfieran con o contaminan el producto de acido nucleico no se eliminaran. La centrifugacion se usa a menudo para intentar eliminar el lfquido de manera uniforme, pero los sistemas automatizados son necesariamente mas grandes, mas complejos y costosos. En general, los metodos que han intentado mejorar la tecnica aun experimentan uno o mas de los siguientes problemas: (1) bajos rendimientos de producto de acido nucleico, (2) mayores volumenes de residuos de solucion de lavado; (3) soluciones de productos de acido nucleico que son mas diluidas de lo que es deseable; (4) los inhibidores de la PCR permanecen; y (5) largo tiempo de procesamiento.

Por ende, aun se desea un metodo basado en etapas simples de manejo de lfquidos que sean faciles de automatizar.

Los inventores observaron que el uso de filtros de microfibras de vidrio como material en fase solida para la purificacion de acidos nucleicos no produce un producto suficientemente puro para usar en el procesamiento posterior basado en enzimas usando protocolos estandar. Por ejemplo, una muestra de celulas se trato con un tampon de lisis y el lisado se paso a traves del filtro de microfibra de vidrio por presion para unir los acidos nucleicos (ADN y ARN) a las fibras de vidrio. El filtro se lavo acto seguido dos veces con etanol acuoso a presion, y el acido nucleico se eluyo usando agua sin nucleasa. Los intentos posteriores de realizar PCR usando el material obtenido como objetivo dieron como resultado reacciones de amplificacion fallidas. La presencia de inhibidores en el material obtenido se confirmo mediante el uso de reacciones de control.

Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad de metodos de purificacion de acido nucleico que sean compatibles con filtros de tamano de poros gruesos y/o mas grandes y/o variados a fin de lograr rendimientos totales rapidos elevados, rendimientos de pureza elevada de muestras de acido nucleico, asf como metodos que son susceptibles de automatizacion en un sistema compacto, pero que procesan volumenes de muestra de aproximadamente 1 ml o mas mientras disminuyen los costos operativos.

Compendio de la invencion

Se proporcionan metodos para purificar acidos polinucleicos que emplean filtros como una fase solida y una operacion impulsada por presion. Una primera realizacion comprende (1) adsorber acidos polinucleicos en un filtro, (2) lavar el filtro con una solucion de lavado con fluido inmiscible y (3) eluir los acidos polinucleicos del filtro usando (i) una solucion de elucion con base acuosa y (ii) una solucion de empuje de fluido inmiscible.

Una segunda realizacion comprende despues de la etapa (1) y antes de la etapa (2), lavar el filtro con una solucion de lavado a base de alcohol.

Una tercera realizacion comprende despues de la etapa (1) y antes de la etapa (2), lavar el filtro con una solucion de lavado con fluido inmiscible y luego lavar el filtro con una solucion de lavado a base de alcohol.

Otras realizaciones incluyen lavar el filtro con dos o mas composiciones diferentes de soluciones de lavado a base de alcohol, y/o dos o mas composiciones diferentes de soluciones de lavado con fluido inmiscible.

En otra realizacion, la etapa de elucion se realiza colocando la solucion de elucion con base acuosa en el lado de entrada del filtro, colocando una solucion de lavado con fluido inmiscible encima o detras de la solucion de elucion con base acuosa, y pasando las dos soluciones por el filtro para obtener una solucion de acidos polinucleicos purificados en la fase acuosa.

Los metodos de las diversas realizaciones se pueden usar para purificar cualquier tipo de acido polinucleico, tal como ADN, ARN y/o mezclas de ADN y ARN. Los acidos polinucleicos pueden ser de origen natural (por ejemplo, extrafdos de cualquier tipo de celula) o sinteticos.

Tambien se proporciona un sistema que comprende una fase solida y un recipiente con un fondo poroso que puede retener la fase solida dentro del recipiente, medios de administracion de lfquido para administrar al menos una solucion de lavado inmiscible, una solucion de elucion con base acuosa y una solucion de empuje de fluido inmiscible, en la fase solida en el recipiente, que puede realizar los metodos de la invencion. El sistema puede comprender ademas una fuente de presion que puede proporcionar un cabezal de presion para impulsar cualquiera de las soluciones a traves de la fase solida en el recipiente. El sistema tambien puede comprender ademas una fuente de vacfo que puede inducir el flujo de cualquiera de las soluciones a traves de la fase solida en el recipiente. En otra realizacion, el sistema puede comprender ademas una centnfuga capaz de proporcionar una fuerza centnfuga para impulsar cualquiera de las soluciones a traves de la fase solida en el recipiente.

En algunas realizaciones, el aparato para realizar el metodo tiene un compartimento y un filtro para procesar una sola muestra, mientras que en otras realizaciones se proporcionan conjuntos de multiples compartimentos y filtros para el procesamiento de multiples muestras, que en algunos casos se pueden llevar a cabo de forma paralela. Como ejemplo de procesamiento de muestras multiples, se pueden usar placas de microtitulacion de pocillos multiples con fondo de pocillos porosos como recipiente, y se puede colocar un filtro en cada pocillo. Se puede incorporar un aparato para el procesamiento de muestras individuales o muestras multiples en el sistema para realizar los metodos de forma manual, semiautomatica o automatica.

Estos y otros objetos y caractensticas de la invencion resultaran mas evidentes tras la lectura de la siguiente descripcion detallada de la invencion junto con los dibujos anexos.

Breve descripcion de los dibujos

La Fig. 1 muestra una realizacion de un aparato util para realizar realizaciones del metodo de purificacion.

La Fig. 2A-2B muestra la curva de crecimiento para el analisis de RT-PCR en tiempo real de las muestras de acidos nucleicos purificados obtenidas segun una realizacion de la invencion descrita en el Ejemplo 3 (referencia).

La Fig. 3A-3B muestra la curva de fusion para el producto del analisis de RT-PCR en tiempo real de las muestras de acidos nucleicos purificados obtenidas segun una realizacion de la invencion descrita en el Ejemplo 3 (referencia). La Fig. 4A-4B muestra los resultados de un analisis electroforetico del producto de PCR obtenido de las muestras preparadas segun una realizacion de la invencion descrita en el Ejemplo 3 (referencia).

La Fig. 5 muestra la curva de crecimiento para el analisis de PCR en tiempo real de las muestras de acidos nucleicos purificados obtenidas segun una realizacion de la invencion descrita en el Ejemplo 5 (referencia).

La Fig. 6 muestra la curva de fusion para el producto del analisis de PCR en tiempo real de las muestras de acidos nucleicos purificados obtenidas segun una realizacion de la invencion descrita en el Ejemplo 5 (referencia).

La Fig. 7 muestra los resultados de un analisis electroforetico del producto de PCR obtenido de las muestras preparadas segun una realizacion de la invencion descrita en el Ejemplo 5 (referencia).

Descripcion detallada

El ADN o ARN de interes incluye el ADN o ARN de todos los organismos, tales como humanos, otros mamfferos, otros animales, plantas, bacterias, virus o cualquier otra forma de vida, viva o muerta. El ADN o ARN en algunas realizaciones son acidos polinucleicos de origen natural, y los metodos pueden usarse como parte de un protocolo para extraer los acidos polinucleicos de su fuente natural dentro de una celula, o para purificar los acidos polinucleicos de un lisado. La fuente puede ser una muestra clmica, y los acidos polinucleicos se estan analizando como parte de un ensayo de diagnostico. Los acidos polinucleicos de origen natural se pueden derivar de cualquier tipo de muestra, tal como un cultivo celular, una muestra de tejido, una muestra de sangre y similares. El ADN o ARN en otras realizaciones puede ser el producto de una reaccion biologica molecular. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una muestra de ADN puede derivarse de una fuente de ADN natural, tal como por amplificacion del ADN genomico, o una fuente de ARN natural, tal como ADNc producido a partir de un producto de transcripcion de ARN.

Los acidos polinucleicos de ADN o ARN pueden ser de cualquier longitud, y el metodo puede aplicarse a una combinacion de longitudes. Normalmente, los acidos nucleicos pueden ser tan pequenos como 40 bases, y pueden ser tan largos como aproximadamente 50 kilobases. Los acidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, o cualquier otra forma multicatenaria. En algunas realizaciones, tanto el ADN como el ARN pueden, en conjunto, ser objeto del metodo de purificacion. En otras realizaciones, las condiciones de lavado y elucion estan optimizadas para la purificacion de ADN o ARN.

En los metodos, el ADN y/o el ARN se adsorben en una fase solida, otros materiales se eliminan por lavado, y luego el ADN y/o el ARN se eluyen de la fase solida. Para lavar las impurezas de los acidos nucleicos absorbidos, la fase solida se lava con una solucion de lavado con fluido inmiscible como se describe la presente memoria. El lavado con un fluido inmiscible se puede realizar una o dos o mas veces, y tambien se pueden realizar otros lavados, como se describe a continuacion. Se pueden realizar multiples lavados con un fluido inmiscible de forma consecutiva y/o pueden surgir lavados con otras soluciones.

La fase solida tambien se puede denominar como filtro. En algunas realizaciones, la fase solida es un material a base de vidrio, tal como vidrio de borosilicato. En algunas realizaciones, el filtro de vidrio de borosilicato esta exento de aglomerantes. Por ejemplo, el filtro puede ser una microfibra exenta de aglomerantes de vidrio de borosilicato, que puede tener la forma de un filtro de cualquier aspecto. El espesor del filtro puede estar en el intervalo de 50 a 3.000 pm, y las realizaciones ejemplares incluyen 100 pm, 250 pm, 500 pm, 675 pm, 1.000 pm o 2.000 pm. El espesor particular puede depender del fabricante. Ademas, los filtros se pueden apilar para aumentar el espesor total de la fase solida. Los filtros de apilamiento se pueden usar, por ejemplo, para aumentar la capacidad de union del dispositivo. El filtro de microfibras puede formarse de tal manera que la estructura permita la retencion de partmulas en el intervalo de 0,5 a 3,0 pm, y las realizaciones ejemplares incluyen tamanos de 0,7 pm, 1,0 pm, 1,5 pm, 2,0 pm o 2,7 pm. De nuevo, el tamano de partmulas particular retenido puede depender del fabricante. Un filtro puede tener multiples capas, que contienen mas de un tamano de poro, o, cuando mas de un filtro se apila en un recipiente, los filtros individuales pueden tener el mismo tamano de poro o tamanos diferentes. En una realizacion, el filtro tiene las propiedades de un filtro exento de aglomerantes de microfibra de vidrio Whatman, calidad GF/B (675 pm de espesor, mdice de retencion de partmulas de 1,0 pm). En otras realizaciones, el filtro tiene las propiedades de un filtro de microfibra Whatman, calidad GF/A (260 pm de espesor, mdice de retencion de partmulas de 1,6 pm), GF/C (260 pm de espesor, mdice de retencion de partmulas de 1,2 pm), GF/D (675 pm de espesor, mdice de retencion de partmulas 2,7 pm, o GF/F (420 pm de espesor, mdice de retencion de partmulas de 0,7 pm).

Solucion de lavado con fluido inmiscible. Se usa una solucion de lavado con fluido inmiscible para lavar el filtro, al menos una vez, despues de que el material de acido nucleico se haya adsorbido en el filtro. La solucion de lavado con fluidos inmiscible comprende un fluido que, por separado y aparte de cuando se practican los metodos de la invencion, (i) cuando se pone en contacto con agua forma una fase sustancialmente separada del agua, y en realizaciones preferidas forma un menisco entre el fluido y el agua. En realizaciones preferidas, el fluido tambien (ii) tiene una gravedad espedfica inferior a la del agua, (iii) no interfiere sustancialmente con o inhibe las reacciones enzimaticas que participan en el acido nucleico que es el objeto del metodo de purificacion, y (iv) es qmmicamente compatible con los componentes del aparato del sistema de purificacion, tal como el filtro y el recipiente que aloja el filtro.

La solucion de lavado con fluido inmiscible, cuando se coloca en el lado de entrada del filtro y luego se mueve a traves del filtro, funciona para empujar a traves del espacio vado del filtro, en la direccion del flujo, la solucion que ocupaba el espacio vado. En particular, la solucion de lavado con fluido inmiscible funciona para empujar a traves de cualquier solucion acuosa o solucion de lavado a base de alcohol que ocupaba el espacio vado en el filtro. En otro aspecto, la solucion de lavado con fluido inmiscible funciona para eliminar o reducir sustancialmente la cantidad de inhibidores de enzimas mantenidos en el filtro que de otro modo se eluina con los materiales de acido nucleico. En otro aspecto, la solucion de lavado con fluido inmiscible funciona para eliminar o reducir sustancialmente la cantidad de componentes de las muestras que podnan interferir con los metodos para detectar los materiales de acido nucleico. Por ejemplo, la bilirrubina, p. ej., en muestras de suero, puede eliminarse o reducirse lavandose con una solucion de lavado con fluido inmiscible.

En algunas realizaciones, el fluido inmiscible es un polfmero hidrofobo. El polfmero puede ser un polfmero inorganico, y una realizacion preferida es aceite de silicona (tambien conocido como fluido de silicona). En algunas realizaciones, el polfmero puede ser un polfmero organico, tal como aceite mineral, aceite de parafina, tapon de vapor (Qiagen Inc., Valencia, CA), aceite para bebes o aceite blanco. El polfmero puede ser un producto natural, sintetico o semisintetico. Otros ejemplos incluyen aceites de pescado o aceites vegetales derivados de, p. ej., soja, oliva, cacahuete, mafz o canola. La solucion de lavado con fluido inmiscible puede comprender mas de un tipo de polfmeros hidrofobos. En algunas realizaciones, el fluido inmiscible es un compuesto organico no polimerico. En algunas realizaciones, la solucion de lavado con fluido inmiscible puede comprender un polfmero y un compuesto organico no polimerico. En algunas realizaciones preferidas, el fluido inmiscible tiene una viscosidad en el intervalo de 1 a 20 cSt, y en algunas realizaciones preferidas la viscosidad esta en el intervalo de 1 a 10 cSt.

Ademas de cumplir con los cuatro criterios (i)-(iv) enumerados anteriormente para el fluido inmiscible, un compuesto no polimerico tambien debe ser ffsicamente compatible con cualquier procesamiento aguas abajo que participe en los acidos nucleicos purificados. Por ejemplo, si los acidos nucleicos se incuban a una temperatura alta o se calientan a una temperatura alta, entonces si el fluido inmiscible permanece presente en la muestra, debe tener una presion de vapor y un punto de ebullicion que no interfiera con el proceso. Es decir, el punto de ebullicion debena ser adecuadamente superior a la temperatura del proceso, y/o la presion de vapor debena ser adecuadamente baja a la temperatura del proceso, de modo que la volatilidad o la expansion del volumen no interfieran con el proceso. Por ejemplo, si los acidos nucleicos purificados se van a usar en una reaccion termociclada que tiene una etapa de desnaturalizacion, p. ej., a 95 °C, entonces el punto de ebullicion de cualquier fluido inmiscible debe ser suficientemente mayor que esta temperatura.

La gravedad espedfica del fluido inmiscible es generalmente inferior a la del agua. Por consiguiente, la solucion de lavado tendera a permanecer por encima de cualquier solucion acuosa dentro del filtro cuando la solucion de lavado con fluido inmiscible se coloca sobre el filtro durante la ejecucion del metodo. De esta manera, la solucion de lavado con fluido inmiscible se puede mover a traves del material del filtro y empujar a traves de la solucion acuosa que se habfa mantenido en los huecos del filtro.

Una funcion de la solucion de lavado con fluido inmiscible es reducir o eliminar sustancias que interfieren con o inhiben reacciones enzimaticas. En algunas realizaciones del metodo de purificacion, parte de la solucion de lavado con fluido inmiscible puede permanecer en el producto eluido. Cuando la solucion de lavado con fluido inmiscible permanece en el producto, el eluato y el fluido inmiscible se pueden usar juntos en una reaccion posterior, donde el fluido inmiscible puede, al tener una menor gravedad espedfica que el agua, subir al lfmite superior de la muestra. En una realizacion, el fluido inmiscible puede funcionar como una barrera de vapor.

En algunas realizaciones del metodo de purificacion, se puede evitar que la solucion de lavado con fluido inmiscible se recoja con el producto eluido. En otras, la solucion de lavado con fluido inmiscible se puede eliminar del producto eluido al separar las fases, la extraccion y otras tecnicas qmmicas o ffsicas. Ya sea que la solucion de lavado con fluido inmiscible permanezca en el producto eluido o no, la solucion de lavado con fluido inmiscible en sf misma tambien debe considerarse por su compatibilidad con cualquier reaccion enzimatica corriente abajo.

Los fluidos inmiscibles candidatos estan disponibles en numerosas calidades y se pueden preparar polfmeros similares a partir de varias fuentes, por lo que la compatibilidad del fluido inmiscible y la solucion de lavado con fluido inmiscible con cualquier reaccion aguas abajo prevista debe confirmarse al seleccionar el fluido o al formular la solucion. Por ejemplo, si el material de acido nucleico purificado se va a usar en una reaccion de PCR, entonces el lfquido y la solucion de lavado se pueden anadir directamente a una muestra y se puede determinar el efecto inhibitorio, si lo hubiera.

Los expertos en la tecnica estan familiarizados con la necesidad y los metodos para confirmar la compatibilidad de un reactivo en una reaccion enzimatica. Los fluidos inmiscibles y las soluciones de lavado con fluidos inmiscibles adecuados para usar en los metodos de purificacion descritos en la presente son aquellos que no interfieren sustancialmente con o inhiben las reacciones aguas abajo, incluidas las reacciones enzimaticas, que usan el producto purificado. Por ejemplo, los fluidos de solucion de lavado preferidos no interfieren con o inhiben sustancialmente las reacciones de amplificacion de acidos nucleicos. Las reacciones de amplificacion ejemplares incluyen PCR, RT-PCR, TMA, LAMP, LCR y similares. Para interferir con o inhibir sustancialmente una reaccion significa que la cantidad y el tipo de producto producido son diferentes de la cantidad y el tipo de producto producido en ausencia del (de los) fluidos(s) inmiscible(s) o de la solucion de lavado con fluido inmiscible. No es necesario que el(los) fluido(s) inmiscible(s) o la solucion de lavado con fluido inmiscible no tenga(n) efecto en la reaccion posterior, solo que cualquier efecto que pueda haber estado dentro de un nivel tolerable para la aplicacion prevista.

El fluido inmiscible y la solucion de lavado tambien deben ser qmmicamente compatibles con el aparato usado para realizar los metodos de purificacion. Por ejemplo, los fluidos inmiscibles y las soluciones de lavado no deben disolver, lixiviar ni deformar los componentes del aparato. El aparato incluye al menos un filtro y un recipiente que aloja el filtro.

Solucion de lavado a base de alcohol. En algunas realizaciones, se usa una solucion de lavado a base de alcohol para lavar la fase solida. En algunas realizaciones, se usan dos o mas tipos de solucion de lavado a base de alcohol. La solucion de lavado a base de alcohol comprende un alcanol inferior, tal como un alcanol C1-C4. El grupo alquilo puede ser una cadena lineal o ramificada, y puede contener uno o mas grupos hidroxilo. Los ejemplos incluyen metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol y terc-butanol. Otros ejemplos incluyen etilenglicol, propilenglicol, glicerol y otros polioles. En realizaciones preferidas, el alcohol es etanol. Mas de un tipo de alcohol puede estar presente en la solucion de lavado.

La solucion de lavado a base de alcohol puede comprender aproximadamente 5 % hasta 100 % de alcohol. En algunas realizaciones preferidas, la solucion de lavado a base de alcohol comprende 10 a 70 % de alcohol, y en otras realizaciones preferidas, 20 a 50 % de alcohol. Cuando la solucion de lavado no tiene un 100 % de alcohol, otro componente lfquido puede ser agua. En algunas realizaciones, la solucion de lavado a base de alcohol es 24 % de etanol en agua, o 50 % de etanol en agua, o 70 % de etanol en agua, o 100 % de etanol. En algunas realizaciones, la solucion puede contener ademas una o mas sales, tampones, tensioactivos no ionicos y/o ionicos, polfmeros hidrofilos, conservantes y/o agentes antimicrobianos. Cualquier componente de este tipo puede incluirse siempre que no cause una perdida sustancial de acidos nucleicos adsorbidos de la fase solida o interfiera con cualquier procesamiento aguas abajo de los acidos nucleicos una vez que se eluyan de la fase solida. En general, cualquiera de estos componentes debe ser compatible con los acidos nucleicos y su uso aguas abajo adicional, incluidas las reacciones enzimaticas dirigidas a los acidos nucleicos.

En esta solucion de lavado, asf como en las otras soluciones de lavado y otros reactivos usados cuando se procesan los acidos nucleicos, el agua usada en la solucion es generalmente agua destilada, y generalmente no contiene DNasa y/o RNasa, segun las necesidades y finalidad de realizar el metodo.

Los ejemplos preferidos de sales incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio y acetato de sodio, potasio o amonio, y ejemplos preferidos de tampones incluyen Tris-HCl, HEPES y otros tampones de Good. La concentracion de sal es normalmente de 10 a 200 mM. La concentracion de tampon es normalmente de 10 a 500 mM, preferiblemente de 20 a 200 mM, y el pH es de 6 a 11, preferiblemente de 7 a 10. Los ejemplos preferidos de tensioactivos no ionicos incluyen polisorbato 80 (un nombre comercial es Tween 80®), otros polisorbatos, Nonidet P-40®, Triton X-100® y similares. Los tensioactivos no ionicos estan presentes normalmente en una concentracion de 1 a 10 %, preferiblemente de 1 a 5 %. Los ejemplos preferidos de polfmeros hidrofilos incluyen polietilenglicol, tal como PEG 8000. Los ejemplos preferidos de conservantes incluyen azida sodica, ProClin 150, ProClin 200 y ProClin 300. Los conservantes estan normalmente presentes en una concentracion de 0,1 a 10 %. Estos ejemplos de sales, tampones, tensioactivos y conservantes no tienen por objeto ser exclusivos, sino representativos, y los sustitutos pueden ser encontrados facilmente por un experto en la tecnica.

En algunas realizaciones, la solucion de lavado a base de alcohol es etanol al 50 % en solucion acuosa de NaCl 100 mM, o etanol al 50 % en Tris-HCl 10 mM, solucion acuosa de NaCl 100 mM, o etanol al 50 % en Solucion acuosa de Tris-HCI 10 mM. En algunas realizaciones, la solucion de lavado a base de alcohol es etanol al 24 % en una solucion acuosa tamponada a pH 7,5, o etanol al 24 % en una solucion acuosa de HEPES 25 mM (pH 7,5), o etanol al 24 % en HEPES 25 mM (pH 7,5), solucion acuosa de NaCl 30 mM. En algunas realizaciones, la solucion de lavado a base de alcohol comprende ademas un 8,5 % (p/v) de PEG 8000, y/o comprende ademas un 0,1 % (v/v) de ProClin 300. Estos ejemplos no tienen por objeto ser exclusivos, sino meramente ejemplares de los tipos de soluciones de lavado a base de alcohol que se pueden usar. Un experto en la tecnica apreciana que se pueden usar muchas soluciones, que vanan en la eleccion de componentes, concentraciones, pH y similares, descritas en la presente memoria.

Solucion de elucion. Se usa una solucion de elucion con base acuosa para eluir los acidos nucleicos adsorbidos de la fase solida. La solucion de elucion comprende una solucion acuosa, y puede componerse de hasta 100 % de agua. En algunas realizaciones, la solucion de elucion contiene ademas una sal y/o un tampon. Los ejemplos preferidos de sales incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio y acetato de sodio, potasio o amonio, y los ejemplos preferidos de tampones incluyen Tris-HCl, HEPES y otros tampones de Good. La concentracion de sal es normalmente de hasta 50 mM. La concentracion del tampon es normalmente de 10 a 500 mM, preferiblemente de 20 a 200 mM, y el pH es de 6 a 11, preferiblemente de 7 a 10. Estos ejemplos de sales y tampones no tienen por ejemplo ser exclusivos, sino representativos, y los sustitutos pueden ser facilmente encontrados por un experto en la tecnica. El agua usada en la solucion de elucion es generalmente agua destilada y generalmente no contiene DNasa y/o RNasa, segun las necesidades y el proposito de realizar el metodo. En una realizacion, una solucion de elucion para eluir el ADN es Tris-HCl 10 mM (pH 9,0). En una realizacion, una solucion de elucion para eluir ARN es agua destilada. En algunas realizaciones, se usan soluciones acuosas de baja fuerza ionica, por ejemplo, menos de 50 mM. Los expertos en la tecnica pueden probar la idoneidad de una solucion de elucion evaluando el rendimiento del material de acido nucleico liberado de la fase solida. En general, el rendimiento del material liberado de la fase solida es alto, y puede ser de al menos el 80 %, o al menos del 90 %, o puede ser casi cuantitativo. Los rendimientos mas bajos pueden ser aceptables, siempre que la cantidad liberada sea adecuada para los objetivos de la solicitud.

Solucion de empuje de fluido inmiscible. Se utiliza una solucion de empuje de fluido inmiscible para ayudar a mover la solucion de elucion a traves del filtro. La solucion de empuje de fluido inmiscible comprende un fluido que, separado y aparte de cuando se practican los metodos de la invencion, (i) cuando se pone en contacto con agua forma una fase sustancialmente separada del agua, y en realizaciones preferidas forma un menisco entre el fluido y el lfquido. agua. En realizaciones preferidas, el fluido tambien (ii) tiene una gravedad espedfica menor que la del agua, (iii) no interfiere sustancialmente ni inhibe las reacciones enzimaticas que involucran el acido nucleico que es el objeto del metodo de purificacion, y (iv) es qmmicamente compatible con los componentes del aparato del sistema de purificacion, como el filtro y el recipiente que aloja el filtro.

La solucion de empuje de fluido inmiscible, cuando se coloca en el lado de entrada del filtro y luego se mueve a traves del filtro, funciona para empujar a traves del espacio vado del filtro, en la direccion del flujo, la solucion de elucion con base acuosa que ocupo el espacio vado. La solucion de elucion se puede recoger de manera eficiente mediante el uso de una solucion de empuje de fluido inmiscible en la etapa de elucion, como se describe a continuacion.

La solucion de empuje de fluido inmiscible puede ser un polfmero hidrofobo o un compuesto organico no polimerico, o combinaciones de los mismos, como se describe anteriormente para la solucion de lavado con fluido inmiscible. En algunas realizaciones preferidas, el fluido inmiscible tiene una viscosidad en el intervalo de 1 a 300 cSt, en algunas realizaciones preferidas el intervalo es de 10 a 100 cSt, y en otras realizaciones preferidas el intervalo es de 20 a 50 cSt. Las otras propiedades y consideraciones para seleccionar una solucion de empuje de fluido inmiscible son las mismas que las descritas anteriormente para la solucion de lavado con fluido inmiscible.

En los metodos de purificacion descritos en la presente memoria, un material de acido nucleico se adsorbe en una fase solida, otros materiales se lavan usando una solucion de lavado a base de fluido inmiscible en agua, y luego el material de acido nucleico se eluye de la fase solida.

La fase solida, generalmente un filtro, se monta en un recipiente configurado de tal manera que la solucion agregada a un compartimento en el recipiente puede hacerse pasar a traves del filtro. El recipiente puede ser circular, cuadrado o poliedrico en seccion transversal. El recipiente puede comprender una unidad independiente o parte de un sistema cerrado o parcialmente cerrado en el que los materiales se administran directamente en el lado de entrada del filtro por medio de tubos u otros medios de administracion. En la Fig. 1 se muestra un ejemplo de una realizacion independiente. Se proporciona un recipiente 100 que tiene una primera apertura 130 y una segunda apertura 150, y un soporte poroso 110 que abarca la seccion transversal del recipiente. Un primer compartimento 140 en el recipiente 100 existe en el espacio definido por las paredes del recipiente, el soporte poroso 110 y la primera apertura 130. Por conveniencia, el volumen del primer compartimento 140 puede configurarse para acomodar el volumen tfpico de una solucion de lavado y una solucion de elucion a usar en el metodo. No obstante, tambien se contemplan las aplicaciones en serie del material de acido nucleico y los lavados en serie. El compartimento no tiene que ser dimensionado para acomodar la solucion de mayor volumen que se usara. En algunas realizaciones, el primer compartimento 140 puede acomodar 50 pl a 1.000 pl o mas de solucion, o puede acomodar al menos hasta 200 pl, o al menos hasta 400 pl, o al menos hasta 600 pl, o al menos hasta 800 pl de solucion. Un volumen tfpico del primer compartimento 140 que es conveniente para procesar una muestra de ensayo de diagnostico in vitro puede estar en el intervalo de 50-1.000 pl o mas. En otras realizaciones, el recipiente puede configurarse para un flujo continuo de solucion de lavado. En este caso, el volumen de la solucion de lavado esta determinado por el caudal y el tiempo.

Se proporciona un filtro 120 dentro del primer compartimento 140 y descansa sobre un soporte poroso 110, que proporciona soporte mecanico y determina la ubicacion del filtro 120. El filtro 120 se extiende esencialmente a toda la seccion transversal del recipiente. El area de filtro activo del filtro 120 no necesita ocupar toda el area de la seccion transversal. Sin embargo, la forma y la estructura del filtro 120 deben llenar efectivamente el area de la seccion transversal de tal manera que las soluciones colocadas en el compartimento 140 tengan que pasar a traves del filtro 120 para salir del recipiente 100 a traves de la segunda apertura 150.

En general, se usa un gradiente de presion para forzar que las soluciones colocadas en el compartimento 140 pasen a traves del filtro 120. Se puede aplicar una presion positiva a traves de la primera apertura 130 al compartimento 140. En otras realizaciones, se puede aplicar una presion negativa a traves de la segunda apertura 150 para extraer la solucion a traves del filtro 120. En algunas realizaciones, el aparato puede prever la aplicacion de una presion positiva en el lado de entrada o una presion negativa en el lado de salida del recipiente. En algunos casos, el procedimiento para pasar un lfquido a traves del filtro puede incluir aplicar a traves de la primera apertura 130 una presion positiva, luego una presion negativa y luego una presion positiva, en donde al menos parte del Ifquido se movena, luego volvena a pasar, y acto seguido por el filtro.

La cantidad de presion necesaria para impulsar las soluciones a traves del filtro depende de muchos factores, tales como el tamano de los poros y el volumen de vado del filtro, la viscosidad de la solucion y el tiempo de residencia deseado de la solucion en el filtro mientras se pasa. Los expertos en la tecnica pueden determinar facilmente intervalos operativos utiles de la presion dependiendo de estos factores. En algunas realizaciones, se usa la misma presion operativa en todas las etapas (p. ej., adsorcion, lavado, elucion). En algunas realizaciones, la presion aplicada a cada solucion se adapta a las propiedades y/o al fin de cada solucion. Por ejemplo, se puede usar un diferencial de presion mas alto para pasar soluciones de mayor viscosidad a traves del filtro. Y, el diferencial de presion se puede usar para ajustar el tiempo durante el cual la solucion contacta con el filtro. Por ejemplo, el tiempo para la etapa de adsorcion puede ajustarse para permitir un tiempo suficiente para que los materiales de acido nucleico se adsorban en la fase solida. El tiempo depende generalmente del tamano de los poros, el volumen de vado, la viscosidad de la solucion, el tamano de los acidos nucleicos y similares, y se puede optimizar facilmente para un filtro en particular. La presion y, por lo tanto, el tiempo para cada lavado se pueden optimizar facilmente en funcion del rendimiento del material purificado obtenido, en vista de los requisitos de tiempo para el proceso, particularmente cuando el proceso es automatizado. Normalmente, en los metodos se usa una presion en el intervalo de hasta 300 kPa. En algunas realizaciones, se puede permitir que una solucion pase a traves del filtro bajo la fuerza de la gravedad y la accion capilar sin aplicar activamente un diferencial de presion.

En algunas realizaciones, el material de acido nucleico es parte de una solucion, que puede ser, por ejemplo, un lisado celular, un lisado de tejido, una muestra clmica procesada para poner a disposicion el material de acido nucleico relevante, u otra solucion de reaccion. La solucion contiene, ademas, en algunas realizaciones, agentes para fomentar la adsorcion de material de acido nucleico en la fase solida, tales como tampones de pH, sales, agentes desnaturalizantes y/o caotropos, como son bien conocidos en la tecnica. Normalmente, la concentracion del material de acido nucleico en la solucion es de 1 a 10.000 copias/1 nl. Normalmente, la masa de material de acido nucleico purificado de la solucion es de 1 fg a 50 |jg.

Para adsorber el material de acido nucleico en el filtro, la solucion que contiene el material de acido nucleico se agrega al primer compartimento 140, y luego se pasa a traves del filtro aplicando un gradiente de presion. Dependiendo del volumen de la solucion y del volumen del primer compartimento 140, el proceso puede necesitar repetirse una o mas veces para procesar todo el material de acido nucleico. El caudal de la solucion de muestra generalmente se optimiza para permitir un tiempo suficiente para que los acidos nucleicos entren en contacto y se unan al material del filtro para maximizar la adsorcion de los acidos nucleicos.

Una vez que el material de acido nucleico ha sido adsorbido, el filtro se lava. El filtro se lava con una solucion de lavado con fluido inmiscible. El volumen de la solucion de lavado se coloca en el primer compartimento 140, y se aplica un gradiente de presion para forzar la solucion de lavado a traves del filtro. El filtro se puede lavar una o mas veces con la solucion de lavado con fluido inmiscible.

En otra realizacion, despues de la adsorcion, el filtro se lava primero con una solucion de lavado a base de alcohol y luego se lava con una solucion de lavado con fluido inmiscible. Se debe desarrollar cualquier protocolo que use una etapa de lavado con alcohol para asegurar que el alcohol no este presente en el eluato final si el alcohol inhibiera o interfiriera con cualquier proceso posterior que involucre a los acidos nucleicos. Por ejemplo, se reconoce que el alcohol es un inhibidor de la transcriptasa inversa y la polimerasa, y puede ser preferible que la etapa de lavado entre el lavado con alcohol y la elucion sean suficientes para eliminar el alcohol del sistema. El volumen de cada tipo de lavado vana independientemente. En algunas realizaciones, se pueden necesitar uno o mas lotes para alcanzar el volumen deseado de solucion de lavado con alcohol y solucion de lavado con fluido inmiscible.

En otra realizacion, despues de la adsorcion, el filtro se lava primero con una solucion de lavado con fluido inmiscible, luego con una solucion de lavado a base de alcohol, y luego nuevamente con una solucion de lavado con fluido inmiscible. El volumen de cada tipo de lavado vana independientemente. En algunas realizaciones, se pueden necesitar uno o mas lotes para alcanzar el volumen deseado de solucion de lavado.

Una vez completada la(s) etapa(s) de lavado, el material de acido nucleico se eluye del filtro en una etapa de elucion. Para eluir el material, se agrega un volumen de solucion de elucion al primer compartimento 140, se aplica un gradiente de presion y se recoge el material eluido cuando sale por la segunda apertura 150. En algunas realizaciones, se permite que la solucion de elucion entre en contacto con el filtro durante varios segundos, o decenas de segundos, o un minuto o mas, tal como cinco o diez minutos o mas, antes de que se aplique el gradiente de presion. En algunas realizaciones, el volumen de solucion de elucion usado es de aproximadamente 20-60 jl. Se puede usar un volumen mayor si una muestra de acido nucleico mas diluida es aceptable. En algunas realizaciones, por ejemplo, como se describe en los ejemplos, el volumen de solucion de elucion es de 30-50 jl. Despues de pasar la solucion de elucion, se agrega una solucion de empuje de fluido inmiscible al primer compartimento 140 y se pasa a traves del filtro para empujar a traves de cualquier solucion de elucion residual y se recoge. Este uso de una solucion de empuje de fluido inmiscible para empujar a traves de la solucion de elucion residual es util en realizaciones en las que se debe maximizar la cantidad de acido nucleico purificado recogida. Por ejemplo, si el volumen de la solucion de elucion es de 50 jl, y 10 j l del eluato es suficiente para las siguientes etapas de procesamiento, entonces puede que no sea necesaria una solucion de empuje de fluido inmiscible, pero si un volumen mayor, p. ej., 25 pL, del eluido es deseable, as ^pues, una solucion de empuje de fluido inmiscible puede ser beneficiosa.

En otras realizaciones de la etapa de elucion, para eluir el material, se agrega un volumen de solucion de elucion al primer compartimento 140, luego se coloca un volumen de solucion de empuje de fluido inmiscible encima de la solucion de elucion, y luego se aplica un gradiente de presion. La solucion de empuje de fluido inmiscible adicional ayuda a forzar la solucion de elucion con base acuosa a traves del filtro y evita la retencion de la solucion de elucion residual en el filtro. El volumen de la solucion de empuje de fluido inmiscible es de 0,5 a 2 veces, preferiblemente de 1 a 1,5 veces el volumen de la solucion de elucion.

En una realizacion del metodo para purificar ADN o ARN, una solucion que contiene el ADN o ARN se pasa a traves de un filtro de microfibra de vidrio para adsorber el ADN o ARN en las microfibras, el filtro se lava con un volumen de una solucion de lavado de fluido inmiscible (p. ej., aceite de silicona) y luego una solucion de elucion (p. ej., agua) se pasa a traves del filtro para eluir el ADN o ARN en un tubo de recogida. Tambien se usa una solucion de empuje de fluido inmiscible en la etapa de elucion segun cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente.

Una realizacion de un metodo de purificacion de ADN comprende pasar una solucion que contiene el ADN a traves de un filtro de microfibra de vidrio para adsorber el ADN en las microfibras, lavar el filtro con una solucion de lavado a base de alcohol (p. ej., etanol al 50 % en Tris 10 mM)/solucion de NaCl 100 mM), lavar el filtro con una solucion de lavado con fluido inmiscible (p. ej., aceite de silicona) y luego eluir el ADN adsorbido con una solucion de elucion (p. ej., solucion de Tris 10 mM (pH 9,0)) en un tubo de recogida. Tambien se usa una solucion de empuje de fluido inmiscible en la etapa de elucion segun cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente.

Una realizacion de un metodo de purificacion de ARN comprende pasar una solucion que contiene el ARN a traves de un filtro de microfibra de vidrio para adsorber el ARN en las microfibras, lavar el filtro con una solucion de lavado con fluido inmiscible (p. ej., aceite de silicona), lavar el filtro con una solucion de lavado a base de alcohol (p. ej., etanol al 50 % en Tris 10 mM/solucion de NaCl 100 mM), lavar el filtro con una solucion de lavado con fluido inmiscible (p. ej., aceite de silicona) y luego eluir el ARN adsorbido con una solucion de elucion ( p. ej., agua sin RNasa) en un tubo de recogida. Tambien se usa una solucion de empuje de fluido inmiscible en la etapa de elucion segun cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente.

Las diversas soluciones se pueden proporcionar en conjunto, en su totalidad o en parte, como un kit, para la comodidad de un usuario. El kit comprende una solucion de lavado con fluido inmiscible, una solucion de elucion y una solucion de empuje de fluido inmiscible. En otra realizacion preferida, el kit comprende una solucion de lavado de fluido inmiscible, una solucion de lavado a base de alcohol, una solucion de elucion con base acuosa y una solucion de empuje con fluido inmiscible. En otra realizacion preferida, el kit comprende una solucion de lavado con fluido inmiscible, una solucion de lavado a base de alcohol, una solucion de elucion y una solucion de empuje de fluido inmiscible. En algunas realizaciones, el mismo reactivo se puede usar como solucion de lavado con fluido inmiscible y como solucion de empuje de fluido inmiscible. Los reactivos pueden proporcionarse en un volumen suficiente para realizar de 1 a 25 operaciones de purificacion para un sistema y tipo de recipiente dados. Los volumenes mas grandes tambien se contemplan, y pueden ser deseables cuando los metodos son realizados por un equipo automatizado.

En algunas realizaciones, se puede proporcionar un reactivo como una solucion concentrada, por ejemplo, como una solucion 10x, para ser diluida antes de su uso. En algunas realizaciones, se puede proporcionar un reactivo como los componentes solidos, por ejemplo, como un polvo liofilizado, para reconstitute agregando el(los) componente(s) lfquido(s) para la solucion antes del uso. El componente lfquido para diluir o reconstituir una solucion tambien se puede proporcionar en el kit. Normalmente, el lfquido para dilucion o reconstitucion es agua, que tiene una pureza adecuada para la aplicacion, como se describio anteriormente.

El kit puede comprender ademas un documento con instrucciones para usar los reactivos segun los metodos de la invencion.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, el kit puede comprender ademas un recipiente equipado con un filtro.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Dispositivo de filtro.

Se preparo un dispositivo de filtro colocando un filtro de microfibra de vidrio Whatman, calidad GF/B (Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) en la parte superior de una estructura acanalada de soporte en un cartucho cilmdrico de polipropileno. El filtro Whatman se corto para ser un poco mas grande que el diametro interno (6,0 mm) del cartucho y se ajusto a presion contra la estructura de soporte.

Ejemplo 2. (referencia) Purificacion del ARN del VIH a partir de plasma humano.

En este ejemplo, se analizaron diez fluidos inmiscibles para su uso como una solucion de lavado inmiscible para la purificacion de ARN a partir de plasma humano.

El plasma humano negativo para VIH se enriquecio con plasma humano positivo para VIH (Acrometrix OptiQual HIV-1 High Control) para proporcionar muestras de plasma humano que contienen 1.000 partfculas de VIH por 1 ml. Se preparo un tampon de lisis de tioglicerol K4 inmediatamente antes del uso agregando 220 j l de 1 -tioglicerol (10 |jl/ml) a 21,8 ml de tampon de lisis K4 (tiocianato de guanidinio 4 M, acetato de potasio 770 mM, 0,78 % (p/v) N-lauril sarcosina, Bis-Tris 0,05 M (pH 6,4)).

Las muestras (1,0 ml) se dividieron en partes alfcuotas en tubos de 5 ml, y a estas se anadieron 1,8 ml de tampon de lisis K4 tratado con tioglicerol, y la solucion se mezclo mediante agitacion con vortex. Se anadio ARN portador (5 j l de 10 mg/ml de poliA (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)) y la solucion se mezclo mediante agitacion con vortex. Despues de incubar la solucion de muestra a 56 °C durante 10 minutos, se anadio isopropanol absoluto (1,9 ml) y la solucion se mezclo mediante agitacion con vortex.

La solucion se transfirio en porciones de 700 j l a un dispositivo de filtro preparado segun el Ejemplo 1. Cada porcion de la solucion se paso a traves del filtro aplicando presion (-40 kPa) al lfquido sobre el filtro, y el proceso se repitio hasta que toda la muestra se paso a traves del filtro para adsorber el ARN en el filtro.

Luego, cada filtro se lavo con una de las soluciones de lavado con fluido inmiscible que se muestran en la siguiente Tabla agregando 300 j l de la solucion de lavado a la parte superior del filtro y aplicando presion sobre la solucion para pasarla a traves del filtro.

Tabla 1.

El filtro se lavo luego con una solucion de lavado a base de alcohol. Se anadio una solucion acuosa de etanol (70 % de etanol, 700 jl) sobre el filtro y se paso a traves del filtro aplicando presion, y este proceso de lavado se repitio una vez mas.

El filtro se lavo de nuevo usando la misma solucion de lavado con fluido inmiscible, en la misma cantidad. Despues de este segundo lavado con la solucion de lavado con fluido inmiscible, el cartucho se coloco sobre un nuevo tubo de centnfuga de 0,5 ml. Se anadio una solucion de elucion de agua (50 jl) sobre el filtro, se dejo en contacto con el filtro durante 30 segundos y luego se paso a traves del filtro presionando el espacio sobre el agua para eluir los acidos nucleicos adsorbidos en el tubo nuevo.

Tambien se prepararon dos tipos de controles con fines comparativos. Primero, el plasma humano negativo para VIH se proceso como una muestra sin aumentar el plasma con VIH (sin control objetivo), y en segundo lugar, las muestras positivas para VIH se procesaron sin incluir lavados con una solucion de lavado inmiscible (sin control de lavado inmiscible).

Ejemplo 3. (referencia) Analisis de muestras de VIH por RT-PCR.

Los cebadores para detectar el ARN del VIH se sintetizaron con las siguientes secuencias y se usaron en una reaccion de RT-PCR de una sola etapa:

SEQ ID NO: 1 (cebador directo) 5'-AGTTGGAGACATCAAGCAGCCATGCAAAT

SEQ ID NO: 2 (cebador inverso) 5'-TGATATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT.

El cebador directo ceba la formacion de ADNc en funcion de la diana del ARN del VIH, y los cebadores directos e inversos funcionan como un par de cebadores para amplificar un producto de ADN basado en la cadena de ADNc. El producto de ADN esperado es de 155 pb.

Se preparo una solucion de premezcla del cebador, que contiene: 1x SensiFAST™ SYBR No-ROX One-Step mix (Bioline USA, Taunton, MA), 0,6 pM de cebador directo, 0,346 pM de cebador inverso, 10 U/pl de inhibidor de RNAsa, y 0,25 pl de solucion de transcriptasa inversa por 25 pl de muestra. Las soluciones de reaccion de RT-PCR se prepararon combinando la solucion de premezcla de cebador (15 pl) con una muestra (10 pl) purificada segun el Ejemplo 2. Cada muestra se analizo por ^rT-PCR por duplicado. La cantidad teorica de VIH en el analisis de RT-PCR es de 200 copias/muestra.

El analisis de RT-PCR se realizo en un SmartCycler® SC1000-1 (Sunnyvale, CA) de la siguiente manera.

Etapa RT: 45 °C durante 900 s, y 95 °C durante 120 s;

Etapa PCR: 40 ciclos de 95 °C durante 5 s, 61 °C durante 5 s y 72 °C durante 10 s.

Se midio una curva de fusion durante una rampa de temperatura de 0,2 ° C/s de 60 °C hasta 95 °C despues de que se completara el termociclado.

El producto de RT-PCR de cada muestra tambien se analizo por electroforesis usando el Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).

La Fig. 2A-2B muestra la curva de crecimiento y la Fig. 3A-3B muestra el grafico del pico de fusion medido en el SmartCycler® para la amplificacion por RT-PCR de las diez muestras (purificadas por lavado con las diez soluciones de lavado inmiscibles diferentes) y los dos controles.

Como se muestra, las diez muestras (analizadas por duplicado) produjeron cada una el producto esperado. Se observo que el umbral del ciclo (Ct) para cada muestra era de aproximadamente 32 (vease la Tabla 2) para ocho de las muestras. El valor de Ct similar para los diversos lavados indica que cada solucion de lavado inmiscible fue similarmente eficaz en eliminar los inhibidores de la PCR, y el protocolo de purificacion en su conjunto fue capaz de administrar cantidades similares de diana de ARN purificado. Dos muestras (aceite de soja y aceite de oliva) mostraron valores mas altos de Ct, lo que sugiere que estos fluidos causan cierta inhibicion. Si este grado de inhibicion es sustancial depende de las necesidades y los objetivos de la aplicacion. El control de "lavado no inmiscible" fue negativo; no se observo ningun producto de amplificacion, lo que indica que los inhibidores de la PCR no se eliminaron adecuadamente al adsorber los acidos nucleicos en el filtro, al lavar con una solucion de lavado con alcohol y al eluir con agua. El control "sin objetivo" fue negativo, lo que indica la ausencia de contaminacion.

Tabla 2.

Las curvas de fusion mostradas en la Fig. 3A-3B muestran un pico a aproximadamente 83-84 °C para las diez muestras, mientras que los dos controles no tienen pico, lo que indica que las muestras contienen un producto de amplificacion de doble cadena, mientras que las reacciones de control no lo hacen.

La Fig. 4A-4B muestra los electroferogramas para las mismas muestras y controles. El pico a aproximadamente 58 segundos corresponde al producto de amplificacion de 155 pb, y los picos a aproximadamente 41 segundos y 110 segundos son marcadores de tamano molecular. La similitud de los resultados confirma que la reaccion de RT-PCR produjo de manera reproducible el producto de amplificacion esperado sin otras reacciones de amplificacion no espedficas en las muestras purificadas.

Ejemplo 4 (referencia). Purificacion del ADN de VHB a partir de plasma humano.

En este ejemplo, se compararon cuatro volumenes diferentes de solucion de lavado con fluido inmiscible para purificar ADN de plasma humano junto con reactivos de un kit comercial, el kit de sangre completa S QuickGene DNA (Fujifilm Corp.) para la preparacion de la muestra de ADN.

El plasma humano negativo para VHB se enriquecio con plasma humano positivo para VHB (Acrometrix OptiQual HBV High Positive Control) para proporcionar muestras de plasma humano que contienen 28.150 partfculas de VHB por 1 ml.

Se coloco la solucion de proteasa QuickGene DB-S (EDB) (150 jl) en el fondo de un tubo conico de 5 ml, y luego la muestra enriquecida con VHB (1,0 ml) se dividio en partes alfcuotas en el tubo. Se anadio tampon de lisis QuickGene DB-S (LDB) (1,25 ml) a cada tubo, y la mezcla se mezclo inmediatamente con una pipeta, se agito en vortex y se incubo a 56 °C durante 2 minutos. Se anadio etanol absoluto (1,25 ml) y la solucion se mezclo mediante agitacion con vortex.

La solucion se transfirio en porciones de 600 j l a un dispositivo de filtro preparado segun el Ejemplo 1. Cada porcion de la solucion se paso a traves del filtro aplicando presion (~40 kPa) al lfquido sobre el filtro, y el proceso se repitio hasta que toda la muestra se paso a traves del filtro, para adsorber el ADN en el mismo.

Cada filtro con ADN adsorbido se lavo luego tres veces con tampon de lavado a base de alcohol QuickGene DB-S (WDB) (750 jl). Luego, cada filtro se lavo una vez con una solucion de lavado con fluido inmiscible, fluido de silicona (5 cSt), agregando 50 jl, 100 jl, 300 j l o 750 j l de la solucion de lavado a la parte superior del filtro y aplicando una presion superior a la solucion para pasarlo por el filtro.

Despues de este lavado con la solucion de lavado con fluido inmiscible, el cartucho se coloco sobre un tubo de centnfuga limpio de 0,5 ml. Se anadio tampon de elucion de QuickGene DB-S (50 j l) en la parte superior del filtro, se dejo en contacto con el filtro durante 30 segundos y luego se paso a traves del filtro presionando el espacio sobre la solucion para eluir los acidos nucleicos adsorbidos en el tubo limpio.

Tambien se prepararon dos tipos de controles con fines comparativos. Primero, el plasma humano negativo para VHB se proceso como una muestra sin enriquecer el plasma con VHB (control sin objetivo), y en segundo lugar, las muestras positivas para VHB se procesaron y se adsorbieron en el filtro, pero el filtro no se lavo con la solucion de lavado con fluido inmiscible (control "lavado con fluido no inmiscible").

Ejemplo 5. (referencia) Analisis de muestras de VHB por PCR.

Los cebadores para detectar el ADN del VHB se sintetizaron con las siguientes secuencias y se usaron en una reaccion de PCR:

SEQ ID NO: 3 (cebador directo) 5'-GACCACCAAATGCCCCTAT

SEQ ID NO: 4 (cebador inverso) 5'-TGAGATCTTCTGCGACG.

Los cebadores directos e inversos funcionan como un par de cebadores para amplificar una secuencia de 132 pb de la diana del ADN del VHB.

Se preparo una solucion de premezcla de cebador que contema: 1x SensiFAST™ SYBR No-ROX kit (Bioline USA, Taunton, MA), 0,4 jM de cebador directo y 0,4 jM de cebador inverso por 25 j l de muestra. Las soluciones de reaccion de PCR se prepararon combinando la solucion de premezcla de cebador (15 jl) con una muestra (10 jl) purificada segun el Ejemplo 4. Cada muestra se analizo por PCR por duplicado. La cantidad teorica de VHB en el analisis de RT-PCR es de 5.630 copias/muestra.

El analisis de PCR se realizo en un SmartCycler® SC1000-1 (Cepheid, Sunnyvale, CA) de la siguiente manera: Desnaturalizacion inicial: 95 °C durante 120 s;

Etapa de PCR: 40 ciclos de 95 °C durante 5 s, 57 °C durante 10 s y 72 °C durante 15 s.

Se midio una curva de fusion durante una rampa de temperatura de 0,2 °C/s de 60 °C a 98 °C despues de que se completara el termociclado.

El producto de PCR de cada muestra tambien se analizo por electroforesis usando el Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).

La Fig. 5 muestra la curva de crecimiento y la Fig. 6 muestra el grafico del pico de fusion medido en el SmartCycler® para la amplificacion por PCR de las cuatro muestras (purificadas por lavado con cuatro volumenes diferentes de solucion de lavado con fluido inmiscible) y los dos controles.

Como se muestra, las cuatro muestras (analizadas por duplicado) produjeron cada una el producto esperado. Se observo que el umbral de ciclo (Ct) para cada muestra era de aproximadamente 26 (vease la Tabla 2) para las cuatro muestras. El valor de Ct similar para los diversos lavados indica que cada solucion de lavado inmiscible fue similarmente eficiente en la eliminacion de los inhibidores de la PCR, y el protocolo de purificacion en su conjunto fue capaz de administrar cantidades similares de diana de ADN purificado. La temperatura de fusion del producto de amplificacion muestra un ligero aumento al aumentar el volumen de lavado con fluido inmiscible.

Cuando la muestra de ADN adsorbido no se lava con la solucion de lavado con fluido inmiscible, sin embargo, no se obtiene ningun producto de amplificacion. El control de "lavado de fluido no inmiscible" fue negativo, lo que indica que los inhibidores de la PCR no se eliminaron adecuadamente mediante el protocolo estandar de adsorcion de los acidos nucleicos en el filtro, al lavarse con la solucion de lavado comercial y luego al eluirse con el tampon de elucion. Uno de los controles "sin objetivo" mostro una pequena cantidad de un producto de amplificacion no espedfico, pero, por lo demas, los controles negativos fueron negativos.

Tabla 3.

La Fig. 7 muestra los electroferogramas para las mismas muestras y controles. El pico a aproximadamente 58 segundos corresponde al producto de amplificacion de 132 pb. La similitud de los resultados confirma que la reaccion de PCR produjo de manera reproducible el producto de amplificacion esperado sin reacciones de amplificacion no espedficas en las muestras purificadas.

Ejemplo 6. Eficiencia de la recogida de ADN genomico.

(1) Extraccion de ADNg de BCG de Mycobacterium bovis.

Se recogieron colonias de BCG de Mycobacterium bovis (Sociedad Japonesa de Bacteriologfa) incubadas en medio Ogawa (S) al 2 % (Kyokuto Pharmaceutical Industries) durante 28 dfas, se suspendieron en agua esterilizada y se trataron en autoclave (121 °C durante 20 minutos). A continuacion, el ADN se purifico usando el kit de purificacion de extraccion de punta genomica de ADN de Qiagen. El numero de copias se determino midiendo la absorbancia optica del ADNg purificado obtenido.

(2) Metodo de purificacion de acido nucleico por cartucho de purificacion de acido nucleico.

Se prepararon muestras que conteman el ADNg de BCG de Micobacterium bovis (numero de copias de 3 x 103) y 2 |jg de ADN de esperma de salmon (SIGMA) en 900 j l de solucion acuosa de alcohol isopropflico al 40 % que contema clorhidrato de guanidina 1,7 M (Wako Pure Chemical). La muestra se transfirio a un dispositivo de filtro preparado segun el Ejemplo 1 y se paso a traves del filtro (6 kPa) para adsorber el ADN en el filtro.

El filtro se lavo primero pasando a traves del filtro 700 j l de una primera solucion de lavado que consiste en una solucion acuosa de etanol al 50 % que contiene Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) (Wako Pure Chemical), cloruro de sodio 150 mM (Wako) y 1 % de Tween 80 (Wako).

El filtro se lavo luego con 700 j l de una segunda solucion de lavado que consistfa en una solucion acuosa de etanol al 50 % que contema Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) (Wako Pure Chemical) y cloruro de sodio 150 mM (Wako Pure Chemical). A continuacion, se pasaron 300 j l de una primera solucion de lavado con fluido inmiscible que consistfa en aceite de silicona (viscosidad: 5 cs) (Shin-Etsu Chemical) a traves del filtro aplicando una presion (~25-100 kPa) sobre la solucion de lavado.

Para eluir el ADN, primero se anadieron 30 j l de solucion de elucion Tris-HCl 10 mM (pH 8,0) (Wako Pure Chemical) al cartucho y se dejo que entrara en contacto con el filtro de microfibra de vidrio durante uno a cinco minutos, y luego a se anadieron 30 pl de una solucion de empuje de fluido inmiscible que consiste en aceite de silicona (viscosidad: 50 cs, Shin-Etsu Chemical) sobre el tampon de elucion. La solucion de elucion y la solucion de empuje de fluido inmiscible se pasaron a traves del filtro aplicando una presion (~25-100 kPa) sobre las soluciones.

(3) Volumen de rendimiento de la muestra eluida

El metodo de purificacion del cartucho descrito en la seccion (2) de este Ejemplo se realizo para ocho muestras, y se midio el volumen de la muestra recogida por elucion. Como comparacion, el metodo de purificacion de la seccion (2) tambien se realizo omitiendo la solucion de empuje de fluido inmiscible. Los resultados se presentan en la Tabla 4. Tabla 4

Como se muestra en la Tabla 4, el volumen de eluyente recogido es bajo y vana (de 5 a 10 pl) cuando se omite en el protocolo la solucion de empuje de fluido inmiscible. Como lo ilustran los datos, usando solo una solucion de elucion con base acuosa al igual que en el metodo comparativo, no se obtuvo la cantidad deseada de eluyente, al menos 12,5 pl, para implementar la medicion cuantitativa descrita en la seccion (4) a continuacion. El uso de las soluciones de lavado de fluido inmiscible proporciona al menos tres beneficios. El volumen recogido cumple con los requisitos de volumen de las etapas analfticas posteriores, los volumenes eluidos son mas consistentes, lo que ayuda en la automatizacion y el analisis de datos, y la cantidad de acido nucleico en la muestra inicial se puede determinar con mayor precision porque el volumen eluido es mas casi cuantitativo.

(4) Analisis cuantitativo de muestras eluidas por PCR en tiempo real.

Se prepararon cuatro muestras (900 pl) que conteman 3 x 103 copias de ADNg de BCG de Micobacterium bovis y se purificaron segun el protocolo de las secciones (1) y (2) de este Ejemplo, y la cantidad de ADN en el eluyente fue medida por PCR en tiempo real usando el SmartCycler® II (Cepheid).

Los cebadores para detectar la secuencia de insercion IS6110 en M. bovis se sintetizaron con las siguientes secuencias:

SEQ ID NO: 5 (cebador directo) 5-TGGGTAGCAGACCTCACCTAT

SEQ ID N°: 6 (cebador inverso) 5-AACGTCTTTCAGGTCGAGTACG

SEQ ID NO: 7 (sonda) 5 'FAM-TGGCCATCGTGGAAGCGACCCGC-TAMRAFAM es el colorante fluorescente fluorescema y TAMRA es el colorante fluorescente tetrametilrodamina. Los cebadores directo e inverso funcionan como un par de cebadores para amplificar una secuencia de 192 pb de la diana IS6110.

Las soluciones de reaccion de PCR se prepararon con (concentracion final): 1x tampon Taq (TaKaRa), MgCh 3 mM (TaKaRa), dNTP 400 mM (TaKaRa), 1 unidad de TaKaRa Ex HS polimerasa, 500 nM de cebador directo, 500 nM de cebador inverso, y 280 nM de oligo sonda.

El analisis de PCR se realizo en un SmartCycler® II (Cepheid, Sunnyvale, CA) de la siguiente manera:

Desnaturalizacion inicial: 97 °C durante 60 s;

Etapa de PCR: 40 ciclos de 97 °C durante 6 s, 61 °C durante 6 s y 72 °C durante 6 s.

La fluorescencia generada por el colorante liberado de la oligo sonda se midio para cada una de las cuatro muestras. Los valores de Ct determinados en el SmartCycler® II se muestran en la Tabla 5. El rendimiento del ADNg obtenido en el eluyente en el protocolo de purificacion tambien se determino mediante la calibracion del resultado cuantitativo contra una muestra de control preparada con la misma concentracion de ADNg (3 x 103 copias/900 pl) pero no fueron sometidas al protocolo de purificacion de la seccion (3). Los valores de Ct para las muestras de control duplicadas fueron 28,44 y 28,92. El promedio, Ct = 28,68, se toma para representar el rendimiento del 100 %. Como lo demuestra el rendimiento calculado de ADN, esencialmente todo el ADNg se adsorbio y luego se libero en el proceso de purificacion.

Tabla 5

Claims (13)

REIVINDICACIONESSe reivindica:

1. Un metodo de purificacion de acidos polinucleicos, comprendiendo el metodo:

(a) absorcion de los acidos polinucleicos en un filtro encajado en un recipiente;

(b) lavado del filtro con una primera solucion de lavado con fluido inmiscible; y

(c) elucion de los acidos polinucleicos del filtro usando (i) una solucion de elucion con base acuosa y (ii) una solucion de empuje con fluido inmiscible,

en donde se obtiene una solucion de acidos polinucleicos purificados.

2. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende, ademas:

despues de la etapa (a) y antes de la etapa (b), lavado del filtro con una solucion de lavado a base de alcohol.

3. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende, ademas:

despues de la etapa (a) y antes de la etapa (b), lavado del filtro con una segunda solucion de lavado con fluido inmiscible y acto seguido lavado del filtro con una solucion de lavado a base de alcohol.

4. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, en donde los acidos polinucleicos son ADN y/o ARN.

5. El metodo de la reivindicacion 1, en donde el filtro es un filtro de microfibra de vidrio.

6. El metodo de la reivindicacion 2, en donde la primera solucion de lavado con fluido inmiscible comprende un fluido que (i) cuando se pone en contacto con agua forma una fase sustancialmente separada del agua; y (ii) tiene una gravedad espedfica inferior a la del agua.

7. El metodo de la reivindicacion 6, en donde la gravedad espedfica de la primera solucion de lavado con fluido inmiscible es inferior a la de la solucion de lavado a base de alcohol usada en el metodo.

8. El metodo de la reivindicacion 2, en donde la solucion de lavado a base de alcohol comprende etanol y agua.

9. El metodo de la reivindicacion 8, en donde la solucion de lavado a base de alcohol comprende ademas una sal y/o un tampon.

10. El metodo de la reivindicacion 8, en donde la solucion de lavado a base de alcohol comprende ademas un polfmero hidrofilo.

11. El metodo de la reivindicacion 10, en donde el polfmero hidrofilo es un polfmero de polietilenglicol.

12. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la solucion de elucion con base acuosa comprende un tampon.

13. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la solucion de elucion con base acuosa comprende agua sin DNasa/RNasa.