ES2255293T3 - Metodos y reactivos para preservar arn en muestras de celulas y tejidos. - Google Patents
Metodos y reactivos para preservar arn en muestras de celulas y tejidos.Info
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Abstract
Uso de un medio de conservación de ARN que comprende una sal constituida por sulfato de amonio o sulfato de cesio a una concentración desde 40g/ml hasta la concentración de saturación de la sal para conservar ARN en una muestra.
Description
Métodos y reactivos para preservar ARN en
muestras de células y tejidos.
La presente invención se refiere al campo de la
biología molecular y proporciona un método y reactivo nuevos para
conservar y proteger de la degradación al ácido ribonucleico (ARN)
contenido en muestras de tejidos o células antes de aislar el
ARN.
Obtener ARN intacto, de alta calidad es la
primera etapa y a menudo la más crítica para realizar muchos
experimentos fundamentales en biología molecular. El ARN intacto es
necesario para el análisis cuantitativo y cualitativo de la
expresión del ARN por hibridización Northern blot, ensayos de
protección de la nucleasa y RT-PCR.
Se han publicado muchos informes que describen
métodos para aislar ARN intacto a partir de células o tejidos
frescos (o congelados rápidamente). La mayor parte de estas técnicas
utiliza un paso rápido de rotura celular en el cual el tejido se
dispersa en una poderosa disolución de desnaturalización de las
proteínas que contiene un agente caotrópico (por ejemplo, sal de
litio o guanidinio). Esta rápida rotura de la membrana celular e
inactivación de la ribonucleasa endógena es crítica para evitar que
el ARN se degrade.
Para obtener ARN de alta calidad es necesario
minimizar la actividad de la ARNasa liberada durante la lisis
celular y evitar la degradación del ARN a partir de otras fuentes.
Esto se logra normalmente usando métodos de aislamiento que rompen
los tejidos e inactivan o inhiben simultáneamente las ARNasas. Para
especímenes con ribonucleasa endógena baja, los protocolos de
aislamiento usan comúnmente tampones que contienen detergentes para
solubilizar membranas, e inhibidores de la ARNasa tales como el
inhibidor de la ribonucleasa de la placenta o complejos
vanadilo-ribonucleósido. El aislamiento de ARN a
partir de muestras más difíciles tales como tejidos intactos o
células con alto contenido en ribonucleasa endógena, requiere un
enfoque más agresivo. En estos casos, el tejido o las células se
homogenizan rápidamente en un potente desnaturalizante de las
proteínas (normalmente isotiocianato de guanidinio), para inactivar
irreversiblemente las nucleasas y solubilizar las membranas
celulares. Si una muestra de tejido no puede homogenizarse
inmediatamente, debe ser congelada rápidamente por inmersión en
nitrógeno líquido, y almacenada a -80ºC. Las muestras congeladas de
esta manera nunca deben descongelarse antes de aislar el ARN o la
ARNasa liberada durante la lisis celular que se produce durante el
congelamiento degradará rápidamente el ARN. El tejido debe
sumergirse en un baño de nitrógeno líquido y molerse hasta formar
un polvo fino usando un mortero y mano de mortero. Una vez
pulverizado, el tejido todavía congelado se homogeniza en un tampón
para la extracción de ARN. En el laboratorio, el rápido
congelamiento de las muestras con el fin de postergar la extracción
del ARN tiene el inconveniente de aumentar sustancialmente el
tiempo de procesamiento manual. Procesar varias muestras con
nitrógeno líquido y mortero y mano de mortero es extremadamente
laborioso.
El congelamiento rápido es aun menos conveniente
fuera del entorno del laboratorio, pero todavía es considerado
necesario por los que trabajan en el campo. Los científicos que
recogen especímenes en el campo para el análisis no tienen acceso a
homogenizadores de alta velocidad. Están forzados a llevar una
provisión de nitrógeno líquido o hielo seco lo suficientemente
grande como para almacenar muestras hasta que puedan ser
transferidas a un congelador a temperaturas ultra bajas.
Similarmente, el ARN extraído de muestras de biopsias humanas
usualmente se degrada parcialmente o mayormente porque los
patólogos no congelan rutinariamente de forma rápida los especímenes
para conservar el ARN.
Ha habido intentos de aislar el ARN de muestras
de archivo que no habían sido preparadas por la metodología de
congelamiento rápido. Por ejemplo, Esser et al., 1995
reivindican el aislamiento de ARN de longitud completa a partir de
células fijadas con ácido acético 5%, etanol 95%, con inhibidores de
la ARNasa. Sin embargo, en esta publicación, las células aisladas
en suspensión se fijaron con una disolución de ácido acético/etanol
a -20ºC y luego se mantuvieron a 4ºC durante un tiempo relativamente
corto. Desafortunadamente, el estudio realizado por el Inventor
mostró que la solución de etanol 95%/ácido acético 5% de Esser et
al., no alcanza los patrones de calidad requeridos por la
presente invención. El ARN recuperado tanto a partir de muestras de
tejido como de células de bazo en suspensión mantenidas a 4ºC
durante 20 horas estaba parcialmente degradado, mientras que el ARN
aislado de tejidos almacenados a temperatura ambiente estaba
completamente degradado. Los experimentos de los que informan Esser
et al. muestran que el método resulta en una pérdida de ARN,
debido a pérdidas causadas por el etanol en las células. Usando ese
método, se pierde el 70% del ARN inmediatamente durante la
fijación, y después de una hora, el 80% del ARN ha desaparecido.
Además, en un ensayo en el que se almacenaron muestras de tejido y
células de bazo en la disolución de etanol 95%/ácido acético 5%
durante la noche a 25ºC, el ARN tanto de las muestras de tejido
como de las células estaba completamente degradado. Los datos se
muestran en la Fig.1.
El uso de ARN intacto, de alta pureza es
fundamental para realizar diversos ensayos de biología molecular y
experimentos tales como la hibridización Northern blot, ensayos de
protección de la nucleasa, RT-PCR y diagnósticos
médicos. La inestabilidad intrínseca del ARN y la presencia de
ARNasas en las muestras hace que aislar ARN intacto sea un
procedimiento difícil. Además, el aislamiento y la valoración de
muestras que contienen ARN es típicamente tedioso y consume mucho
tiempo. La contaminación de un laboratorio de biología molecular con
ARNasas debido a errores humanos puede tener resultados
catastróficos. Por lo tanto, existe una necesidad progresiva de
desarrollar técnicas mejoradas, para hacer que los métodos de
aislamiento y valoración del ARN sean más sensibles, más
específicos, más rápidos, más fáciles de usar y menos susceptibles
al error humano y a la manipulación. Por lo tanto, en muchos casos
sería ventajoso, usar en las instalaciones de investigación un
protocolo de conservación de ARN automatizado. Por ejemplo, la
presente invención, podría combinarse con técnicas rápidas de
valoración del ARN o dispositivos integrados de diagnóstico de
ácidos nucleicos (Patente de EE.UU. 5.726.012, Patente de EE.UU.
5.922.591, incorporadas como referencias) para un análisis y
conservación del ARN automatizado y eficiente.
La Patente de EE.UU. 5.256.571 informa de una
disolución para la conservación de células que comprende un alcohol
miscible en agua en una cantidad suficiente como para fijar las
células de mamífero, un agente antiapelmazante y un agente
tamponante. Al menos una publicación, Dimulescu et al.,
informa del uso aparente de este fijador para conservar células de
cáncer cervical y linfocitos de la sangre del cordón antes de aislar
el ARN.
Un gran cantidad de literatura sugiere que las
combinaciones de etanol y acetona son los mejores fijadores
conocidos para recuperaciones futuras de ácidos nucleicos a partir
de tejidos archivados. Sin embargo, a la vista de los estudios de
los inventores, tal mezcla de etanol/acetona no proporciona todas
las características deseadas en un medio de conservación del ARN.
Las mezclas no protegen el ARN a temperatura ambiente, no permiten
conservar el ARN en muestras sólidas, de múltiples células y también
son inflamables, lo que hace que intrínsecamente sean menos
atractivas como un reactivo de uso general.
Existe alguna técnica relacionada periféricamente
que enfoca los aspectos de preservación o recuperación del ARN a
partir de muestras de tejido conservado o fijado. Estos informes
incluyen numerosas evaluaciones sobre la conveniencia de los
fijadores histológicos para maximizar la señal obtenida por
hibridización in situ para detectar (no recuperar) ARN en
muestras de tejidos (por ejemplo las Patentes de EE.UU. Nos.
5.196.182 y 5.260.048). Otros informes detallan métodos para
recuperar ARN fragmentado a partir de tejidos fijados para análisis
molecular limitado por PCR^{TM} (Koopman et al., Foss
et al., Stanta et al., Houze et al.). Para
recuperar este ARN fragmentado, las muestras se tratan típicamente
con proteinasa K para degradar los componentes estructurales del
tejido, después se extrae el ARN con una solución basada en
guanidinio. El ARN recuperado a partir de tejido fijado es de una
calidad extremadamente pobre, con un tamaño promedio de
aproximadamente 200 bases (Stanta 1991). Esto se debe probablemente
a varios factores que incluyen la acción de la ARNasa endógena y al
entrecruzamiento del ARN en la matriz intracelular durante la
fijación. Dado que el ARN está mayormente degradado, no se puede
utilizar en los análisis Northern o en los ensayos de protección de
la nucleasa. Se puede usar en RT-PCR, pero sólo
para la amplificación de fragmentos muy pequeños.
Se conoce el uso de sulfato de amonio para
precipitar proteínas en una disolución, pero el uso de sulfato de
amonio para conservar ARN no se conoce en la técnica, según el
conocimiento del inventor. Dos informes describen el uso de sulfato
de amonio para investigar el plegamiento y la actividad de la
ribonucleasa A de mamíferos (Allewell et al. y Lin et
al.). Allewell et al. investigaron los efectos del
sulfato de amonio sobre el plegamiento y la actividad de la ARNasa
A. A pH 5,5, la actividad de la ribonucleasa A se suprime a
aproximadamente un 10% del nivel de los controles no tratados en un
amplio rango de concentraciones de sulfato de amonio. Esta
supresión de actividad era esperada por los autores. Parece deberse
a una desnaturalización de la proteína inducida por la sal.
Desafortunadamente, incluso un 10% de actividad de la ARNasa
degradaría sustancialmente el ARN de una muestra a lo largo del
tiempo. Por lo tanto, esta inhibición no es suficiente como para
proteger el ARN en muchas aplicaciones. Cuando el sulfato de amonio
está a pH 7,0, la actividad de la ARNasa A se suprime a bajas
concentraciones como era de esperar, pero inesperadamente aumenta al
110% del nivel del control no tratado a concentraciones más altas
(3M). Los autores teorizan que la combinación de pH neutro y altas
concentraciones de sales fuerzan un replegamiento de la proteína en
una configuración alternativa, altamente activa. Sin embargo, el
grupo de Allewell et al. estaba examinando la actividad de la
ARNasa pura en disolución, no en una muestra celular que contuviera
muchas ARNasas.
En vista de lo anterior, existe una necesidad de
métodos y reactivos que permitan preservar y recuperar ARN de alta
calidad, intacto a partir de muestras de tejidos almacenadas a
temperatura ambiente o una temperatura cercana a ésta.
La presente invención se refiere a un método y
reactivos nuevos para conservar el ARN en fragmentos de tejidos a
temperaturas superiores al punto de congelación de los conservantes
durante períodos largos de tiempo, que incluye de días a meses,
antes de aislar el ARN. No existen informes previos que divulguen un
reactivo o método similar al que se describe en esta aplicación.
Este avance disminuye la necesidad de o bien procesar inmediatamente
las muestras para extraer el ARN, o la restricción de solamente
aislar tejido en los sitios que tienen un suministro de nitrógeno
líquido o hielo seco.
La presente invención se refiere a métodos para
conservar ARN que comprenden: (1) obtener una muestra que contiene
ARN; y (2) tratar la muestra con un medio de conservación de ARN que
infiltra la muestra, y protege el ARN de las nucleasas. En una
realización preferida, el medio de conservación de ARN produce la
precipitación del ARN en la muestra junto con las proteínas
celulares de la muestra. Se cree que esta coprecipitación del ARN y
las proteínas celulares genera un ARN inaccesible a las nucleasas
por medios físicos, mientras que la acción del medio de
conservación del ARN inactiva o inhibe simultáneamente la acción de
las nucleasas.
El medio de conservación del ARN comprende una
sal, a una concentración desde 40 g/100 ml hasta la concentración
de saturación de la sal, que precipita el ARN en la muestra junto
con las proteínas celulares. La sal es sulfato de amonio o sulfato
de cesio. En las realizaciones comerciales preferidas actualmente,
la sal es sulfato de amonio.
Específicamente, se pueden usar concentraciones
de sal de 40, 55, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110,
120, 130, 140 ó 150 mg/ml, y la concentración pueden estar en un
rango definido entre cualquier par de estas concentraciones.
Por supuesto, durante el uso, puede producirse
alguna dilución de la concentración de sales debido a, por ejemplo,
que la muestra contenga líquidos. Por lo tanto, estas
concentraciones de sales pueden ser mayores que las concentraciones
finales de sal obtenidas en algunos usos. Además, con respecto a la
presente invención se contempla que se puedan usar concentraciones
de sal superiores a la concentración de saturación . En tales
realizaciones, puede haber sal que no está disuelta en el medio de
conservación del ARN. Esto no deberá afectar la capacidad de
conservación de ARN de los medios. De hecho, los medios que tienen
más que una concentración de saturación de una sal pueden ser de
alguna utilidad en aplicaciones en las que los medios se adicionan
a una muestra líquida. En tales casos, durante la adición a la
muestra líquida, la sal que no está disuelta antes de la adición,
puede disolverse debido al aumento de volumen del líquido. Por lo
tanto, la concentración final de una sal puede estar a un nivel
superior al que sería posible si se usara un medio de conservación
que contuviera una concentración de sal a nivel de saturación o
menor a éste.
En una realización comercial preferida, la sal es
sulfato de amonio en una concentración de 70 g/100 ml.
La presente invención no se limita al uso de
sulfato de amonio, y el sulfato de cesio también será útil para la
protección del ARN en muestras de tejidos y muestras de células,
debido a las siguientes razones. La solubilidad de las proteínas
individuales depende de forma importante del pH y de la
concentración de sales del medio acuoso. Virtualmente todas las
proteínas son insolubles en agua pura. A medida que la fuerza iónica
del medio aumenta, las proteínas se vuelven más solubles. Esto se
conoce como "salting in" de proteínas. Por encima de cierta
fuerza iónica, la solubilidad de la proteína disminuye. Las
condiciones precisas en las que esto sucede son únicas para cada
combinación proteína/sal. De hecho, a algunas concentraciones
salinas, una proteína puede ser completamente insoluble mientras
que otra está en su solubilidad máxima. Este fenómeno se conoce
como "salting out". Se cree que los presentes medios de
protección del ARN funcionan debido al efecto "salting out" de
altos niveles de sal. La teoría es que el "salting out" de las
proteínas presentes en las células de muestras de tejidos o
muestras de células es lo que lleva a la formación de complejos
ARN/proteína protectores del ARN. La importancia del fenómeno
"salting out" en esta aplicación se incrementa varias veces.
Primero, esto destaca que la eficacia de la protección del ARN por
precipitación de proteínas usando altas concentraciones de sal es
compleja y que ciertas combinaciones de fuerza iónica
(concentraciones salinas) y pH pueden hacer que una sal particular
sea mucho más eficaz en una formulación que a un pH o concentración
diferente. Segundo, proporciona un fundamento científico firme al
mecanismo básico de acción de los reactivos de esta aplicación, y
proporciona una guía en la búsqueda de compuestos adicionales de
protección del ARN dentro del alcance de la invención. Con el fin
de determinar si otra sal o supuesto compuesto protector del ARN
funcionará en los métodos y reactivos de la invención, simplemente
es necesario obtener esa sal o compuesto y probarlo del modo
descrito en los ejemplos. Siguiendo las enseñanzas de los ejemplos,
una persona con conocimientos puede elucidar fácilmente si una
sustancia candidata es realmente un compuesto protector del ARN.
Tercero, en base a la teoría de que la precipitación de las
proteínas intracelulares es la clave para proteger el ARN in
situ, esto explica por qué el alcohol y la acetona (agentes que
también pueden precipitar proteínas, aunque por un mecanismo
diferente), son parcialmente activos en la protección del ARN en
tejidos, aunque no protegen tanto como es necesario para la mayoría
de las aplicaciones.
En algunas realizaciones, los medios de
conservación del ARN comprenderán una combinación de dos sales que
precipitan el ARN en la mezcla junto con la proteína celular.
El medio de conservación del ARN además puede
comprender etanol, metanol, acetona, ácido tricloroacético,
1-propanol, 2-propanol,
polietilenglicol o ácido acético. Estos componentes potenciales
adicionales de protección pueden precipitar proteínas en células
conservadas y de este modo proteger el ARN. Sin embargo, estos
componentes adicionales potenciales no son sales. Se anticipa que
en algunas realizaciones, se usarán estos disolventes orgánicos en
combinación con una concentración de sal para obtener uno de los
medios de conservación de ARN tal como son descritos en la presente
memoria.
En algunas realizaciones, el medio de
conservación de ARN comprende una sal tal como sulfato de amonio,
sulfato de cesio, metanol, ácido tricloroacético,
1-propanol, 2-propanol,
polietilenglicol o ácido acético. Además, el medio de conservación
de ARN puede comprender un quelante de cationes divalentes, por
ejemplo EDTA.
Típicamente, el medio de conservación del ARN
comprende un tampón de modo de poder mantener un pH constante. Por
ejemplo, el tampón puede ser citrato de sodio, acetato de sodio,
citrato de potasio o acetato de potasio. En una realización
comercial preferida actualmente, el tampón es acetato de sodio.
Típicamente, el medio de conservación de ARN tiene un pH entre 4 y
8. En realizaciones comerciales preferidas actualmente, el pH es
5,2.
La muestra conservada en medios de conservación
de ARN puede ser una cualquiera de varios tipos de muestras. Por
ejemplo, la muestra puede ser una suspensión de células, tales como
aspirados de médula ósea, leucocitos, esperma, sangre, suero,
plasma, bacterias, células de cultivos tisulares, o algas.
Alternativamente, la muestra puede ser un tejido sólido, por
ejemplo, la muestra de tejido es de cerebro, corazón, hígado, bazo,
timo, riñón, testículo, ovario, tumores, tejido de biopsias, brotes
de plantas, raíces, u hojas. En algunos casos, la muestra puede
comprender un organismo completo. Por ejemplo, el organismo puede
ser un pez, insecto, renacuajo, coral o embrión. En algunos
protocolos, será beneficioso mantener un organismo o mezcla en el
medio de conservación de ARN durante la disección. Por ejemplo,
podría ser beneficioso diseccionar un organismo en el medio de
conservación del ARN cuando la muestra comprende un organismo que
es un patógeno dentro de una mezcla de tejido u otro organismo. De
esta manera, el ARN del patógeno puede conservarse. Además, se
conserva el ARN de la muestra de tejido u otro organismo.
En muchos métodos preferidos, la practica de la
invención comprende además la etapa de aislar el ARN conservado.
Una de las ventajas de los presentes medios de conservación del ARN
es que el ARN se puede aislar del tejido a una temperatura superior
que la permitida en las técnicas anteriores. Por ejemplo, el ARN
puede aislarse a una temperatura que es superior a -20ºC. De hecho,
el ARN puede aislarse a temperatura ambiente.
En algunos casos, la muestra puede almacenarse en
el medio de conservación de ARN antes de aislar el ARN. Por
ejemplo, el tejido se almacena no congelado desde -20ºC hasta 45ºC.
Debido al contenido de sales de algunos medios de conservación de
ARN, las mezclas no se congelan a -20ºC. En las realizaciones
preferidas la muestra puede almacenarse a una temperatura superior
a 0ºC.
En otras realizaciones de la presente invención,
un método de conservar el ARN comprenderá obtener una mezcla que
contiene ARN, proveer una sal y mezclar la muestra y la sal en un
líquido para formar una composición de conservación de ARN que
infiltra la muestra y protege el ARN de las nucleasas. En una
realización, la muestra está comprendida en el líquido antes de
mezclar la muestra con la sal. En otra realización, la sal está en
una forma sólida antes de mezclar la muestra y el líquido. En aun
otra realización, la sal está comprendida en el líquido antes de
mezclar la muestra con la sal.
En una realización de la invención, la muestra
son células sanguíneas y el líquido es suero sanguíneo. En otra
realización la muestra es orina. En otras realizaciones, el líquido
es agua. En aun otras realizaciones, el líquido es un tampón.
En algunas realizaciones, las composiciones de
conservación de ARN comprenden obtener una muestra que contiene
ARN, proveer una sal y mezclar la muestra y la sal en un líquido. El
líquido puede ser un componente de la muestra, o puede ser
adicionado a la muestra y la sal. La sal está típicamente presente
en una concentración suficiente para precipitar el ARN en la
muestra junto con la proteína celular. En algunos casos, será
suficiente adicionar una sal muy concentrada o una sal saturada a
una muestra líquida. Adicionar sal que puede resultar en una
concentración de sal mayor que la concentración de saturación a la
muestra líquida final tiene las ventajas de permitir alcanzar
rápidamente concentraciones de conservación del ARN y evitar la
necesidad de considerar cuidadosamente la cantidad de sal necesaria
para alcanzar una concentración específica en una muestra dada.
Además, cualquier sal que no se disuelva, no afectará las
propiedades de conservación del ARN de la composición.
En otra realización, la composición de
conservación del ARN comprende un quelante de cationes divalentes.
En aun otras realizaciones, la composición de conservación de ARN
comprende un tampón, en el que dicho tampón tiene un pH entre 4 y
8.
Los componentes sólidos de la presente invención
(es decir, sales, tampones y protectores) pueden preparase para
generar las concentraciones finales deseadas de componente en
disolución cuando se los adiciona a una muestra acuosa. Los
componentes sólidos pueden además proveerse como polvos,
comprimidos, píldoras u otras formulaciones adecuadas que
proporcionan las propiedades deseadas de una composición de
conservación del ARN. Los componentes sólidos pueden ser
adicionados directamente a una muestra, adicionados a una mezcla
muestra/líquido, o estar presentes en un recipiente de recogida
antes de recoger una muestra o mezcla muestra/líquido. En la
formulación de polvos, comprimidos y píldoras también se considera
la adición de excipientes y agentes de carga tales como manitol,
lactosa, almidón, celulosa, y similares, para proporcionar las
características sólidas deseadas (es decir, mejor solubilidad,
estabilidad durante el almacenamiento, dispersión de partículas).
Los componentes sólidos de la presente invención se pueden
adicionar antes de la recogida de la muestra, después de la
recogida de la muestra o cualquier combinación de éstas.
En una realización de la invención, se pueden
cargar alícuotas medidas previamente de una composición de
conservación del ARN sólida o líquida en recipientes de recogida de
muestras y se puede adicionar un volumen apropiado de una muestra
que contiene ARN. Entonces se agitará el recipiente de recogida,
disolviendo cualquier componente sólido de la composición de
conservación de ARN, minimizando la exposición del operador a una
muestra de ARN. Por ejemplo, una composición de conservación de ARN
sólida podría ser cualquiera de las sales descritas previamente. De
este modo, en realizaciones particulares de la invención, se
contempla la estabilización del ARN en un espécimen biológico tal
como sangre y orina como se describió anteriormente.
En un ejemplo, se puede suministrar un vial para
recoger un espécimen tal como orina o sangre con alícuotas medidas
previamente de una composición de conservación de ARN.
Inmediatamente después de recoger dicho espécimen, se podría agitar
el vial, mezclando el espécimen que contiene el ARN (es decir,
muestra) con la composición de conservación de ARN. Un vial de
recogida de sangre en vacío que comprende una aguja que se proyecta
por fuera, se contempla para nosotros en la presente invención
(Patente de EE.UU. 5.090.420, incorporada específicamente aquí por
referencia a su totalidad) para la rápida recogida y mezcla de
muestras que contienen ARN. En una realización, se contempla la
conservación automatizada de ARN. Los métodos automatizados de
conservación de ARN serán menos tediosos, rápidos, fáciles de usar
y menos susceptibles al error humano y la manipulación.
También se contemplan kits de recogida de
especímenes clínicos adaptados para ser enviados por correo (Patente
de EE.UU. 5.921.396, incorporada específicamente aquí por
referencia a su totalidad) para usar con alícuotas medidas
previamente de composiciones de conservación de ARN de la presente
invención. Las muestras que contienen ARN podrán ser recogidas (por
ejemplo, fuera de instalaciones del laboratorio) y mezcladas con
alícuotas medidas previamente de una composición de conservación
del ARN provista en viales, conservando el ARN para su envío a un
lugar de análisis de ARN adecuado.
Alternativamente, una composición de conservación
del ARN puede comprimirse para formar un comprimido o píldora y se
puede almacenar a granel. Los comprimidos serán una composición
conveniente para almacenar y podrán adicionarse en la cantidad
correcta a una muestra de cualquier tamaño en cualquier tipo de
envase. Por lo tanto, en otros tipos de realizaciones de la
presente invención, se contemplan componentes de conservación del
ARN en forma de comprimidos o píldoras para la recogida de muestras
en el campo a partir de fuentes tales como depósitos de agua,
plantas de aguas residuales o la industria láctea. En algunas
instancias, los medios de conservación de ARN comprenden
concentraciones finales de sal predeterminadas o sales
sobresaturadas que pueden ser suministradas como envases. Los
envases de sal sobresaturada o de sal de conservación del ARN serán
especialmente útiles en estudios de campo, ya que puede haber
espacio o recursos limitados para el equipo analítico. Por ejemplo,
los envases pueden suministrarse como alícuotas previamente medidas
y envasadas para una muestra de 1mL, 5 mL, 10 mL. Por supuesto, se
puede proveer cualquier tamaño de envase, para contener diversas
cantidades de sal como un polvo anhidro, un polvo hidratado, o como
un polvo y líquido, envasados individualmente o una combinación de
los mismos. Por lo tanto, para conservar el ARN en una muestra, uno
tendría simplemente que adicionar el contenido del envase a una
muestra y mezclar.
Algunas ventajas de usar una composición de
conservación de ARN de componentes sólidos serían el ahorro por
peso en el almacenamiento y transporte, que los vertidos de
componentes sólidos son menos probables y ahorros
por el menor volumen (es decir, conservar muestras con reactivos secos minimizará el volumen final de la
muestra).
por el menor volumen (es decir, conservar muestras con reactivos secos minimizará el volumen final de la
muestra).
En otras realizaciones de la invención, las
composiciones de conservación del ARN comprenden además aislar el
ARN conservado, en las que el ARN se aísla a una temperatura que es
mayor que -20ºC. En otras realizaciones, la muestra se almacena
antes de aislar el ARN, en las que la muestra se almacena a
temperaturas mayores que 0ºC.
La investigación del inventor indica que sulfato
de amonio 3M a pH 7,0 es completamente eficaz para conservar el ARN
intacto en muestras de tejido intacto a todas las temperaturas
excepto las extremas (37ºC-42ºC). Se propone que
durante la aplicación a la muestra, el sulfato de amonio se difunde
dentro del tejido y las células y produce la precipitación de las
proteínas celulares (probablemente junto con el ARN que está
íntimamente asociado a muchas proteínas diferentes in vivo)
en complejos protegidos. Además, la ARNasa, que está localizada en
las vesículas citoplasmáticas, también puede precipitar y volverse
inaccesible al ARN celular.
Se cree que el modo de acción de la invención
reivindicada y el modo de acción de la mezcla de Allewell et
al. son diferentes. Si el modo de acción de las soluciones de la
inventiva fuera el mismo que el que describieron Allewell et
al. uno esperaría que el ARN aislado a partir de tejidos
almacenados en los tampones de la inventiva estuviera degradado.
Allewell et al. informan que a pH 5 la ARNasa es más activa
que lo normal. Por lo tanto, si RNAlater™ actuase por el
mismo mecanismo, uno esperaría un aumento de la actividad de la
ARNasa. Obviamente, esto limitará la capacidad de conservar el ARN
de los medios de conservación de ARN. En base a la observación de
que tal degradación no se produce, la presente invención funciona
por un mecanismo diferente al descrito por Allewell et
al.
El término "RNAlater™" es una marca
registrada de Ambion, Inc., para ciertas formulaciones comerciales
de medios de conservación del ARN tal como se divulgan en la
presente memoria. En general, el término "RNAlater™" se
emplea para denotar la formulación divulgada en el Ejemplo 2, que
está compuesta de citrato de sodio 25 mM, EDTA 10 mM, 70 g de
sulfato de amonio/100 ml de solución, pH 5,2. Este reactivo funciona
infiltrando rápidamente las células con una alta concentración de
sulfato de amonio, produciendo una precipitación masiva de las
proteínas celulares, la estructura celular permanece intacta. La
ventaja de esto es que las células pueden conservarse y aun ser
identificadas histológicamente.
Siguiendo la práctica de patentes bien
establecida desde hace tiempo, las palabras "un" y "una"
cuando se usan en conjunción con la palabra "comprende" en las
reivindicaciones o especificación, denota uno o más.
Los siguientes dibujos forman parte de la
presente especificación y se incluyen para demostrar mejor ciertos
aspectos de la presente invención. La invención puede comprenderse
mejor por referencia a uno o más de esos dibujos en combinación con
la descripción detallada de las realizaciones tal como se presentan
en la presente memoria.
Fig.1
ARN aislado de hígado de ratón aislado almacenado
durante la noche a 4ºC (carriles 1-5) o 37ºC
(carriles 6-10). Carriles 1 y 6, almacenamiento en
etanol. Carriles 2 y 7, almacenamiento en etanol acidificado pH 4.0.
Carriles 3 y 8, almacenamiento en acetona. Carriles 4 y 9,
almacenamiento en acetona acidificada pH 4.0. Carriles 5 y 10,
almacenamiento en RNAlater™.
Fig.2
Muestras frescas de hígado (carriles 1 y 2),
testículo (carriles 3 y 4), y bazo (carriles 5 y 6) de ratón se
colocaron en RNAlater™ (carriles 2, 4, y 6) (Citrato de sodio
25 mM, EDTA 10 mM, 70 gm de Sulfato de Amonio/100 ml de solución,
pH 5.0), en una disolución de extracción de ARN basada en
isotiocianato de guanidinio 4 molar (GITC) (carriles 1, 3, y 5) a
4ºC durante 12 horas. Se extrajo el ARN y se analizó por
electroforesis de geles. Solamente se observó ARN intacto en
carriles correspondientes a tejidos conservados en RNAlater™
(carriles 2, 4 y 6).
Fig.
3
Se colocaron fragmentos de hígado de ratón
recientemente obtenidos en RNAlater™ con diversas cantidades
de sulfato de amonio. Las muestras contenían 0, 10%, 20%, 30%, 40%,
50% ó 70% de sulfato de amonio (carriles 1-7
respectivamente). Después de incubar a 4ºC durante 24 horas, se
extrajo el ARN de la muestra y se analizó por electroforesis
desnaturalizante en geles de agarosa.
Fig.
4
Se evaluaron los efectos del pH y el sulfato de
amonio a temperaturas extremas. Se almacenó hígado fresco de ratón
a temperatura ambiente o 37ºC durante 24 horas en 4 formulaciones de
la disolución RNAlater™. Carril 1: pH 7,0, sulfato de amonio
70 g/100 ml, Carril 2: pH 5,0, sulfato de amonio 55 g/100 ml, Carril
3: la formulación original de RNAlater™ (que contenía
sulfato de amonio 55 g/100 ml a pH 7,0), Carril 4: pH 5,0,
concentración de sulfato de amonio 70 g/100 ml.
Fig.
5
Figura 5A y 5B: Se incubaron muestras frescas de
hígado en 5 tampones durante 3 días a 25ºC (Fig. 5A) y 37ºC (Fig.
5B), carril 1; RNAlater™ con carbonato de amonio, carril 2;
con cloruro de amonio, carril 3; con sulfato de potasio, carril 4;
con sulfato de magnesio, carril 5; sulfato de amonio. Fig. 5C:
Hígado fresco incubado durante la noche a 4ºC en RNAlater™
que contiene: carril 1, cloruro de cesio; carril 2, sulfato de
cesio; carril 3, sulfato de amonio.
Fig.
6
Se colocó cerebro, corazón, riñón, hígado y bazo
fresco de ratón (carriles 1-5) en la disolución
RNAlater™ y se almacenó a 4ºC. Después de incubar durante
una semana (Fig. 6A), 2 semanas (Fig. 6B), y 4 semanas (Fig. 6C),
se extrajo el ARN de las muestras de tejidos y se analizaron por
electroforesis desnaturalizante en geles de agarosa.
Fig.
7
Se colocó en la disolución RNAlater™
cerebro, corazón, riñón, hígado y bazo fresco de ratón (carriles
1-5) y se almacenó a 25ºC (temperatura ambiente).
Después de incubar durante dos semanas (Fig. 7B) o cuatro semanas
(Fig. 7C), se extrajo el ARN de las muestras de tejido y se analizó
por electroforesis desnaturalizante en geles de
agarosa.
agarosa.
Fig.
8
Se colocó hígado, riñón y bazo fresco de ratón en
la disolución RNAlater™ y se almacenó a 37ºC. Después de
incubar durante tres días, se extrajo el ARN de las muestras de
tejido y se analizó por electroforesis desnaturalizante en geles de
agarosa.
\newpage
Fig.
9
En los carriles 1-3 hay hígado,
corazón y riñón, ToTally RNA™, en los carriles 4-6,
RNAqueous™. Se colocaron muestras frescas de hígado (carriles 1 y
4), corazón (carriles 2 y 5), y riñón (carriles 3 y 6) de ratón en
RNAlater™ y se almacenaron durante la noche a 4ºC. El ARN se
aisló de muestras del mismo tamaño usando o bien el kit ToTally
RNA™ de Ambion (carriles 1-3) o el kit RNAqueous™ de
Ambion (Carriles 4-6). Carril 1 - marcador de peso
molecular.
La presente invención se refiere al campo de la
biología molecular y proporciona nuevos métodos y reactivos para
conservar y proteger de la degradación al ácido ribonucleico (ARN)
contenido en muestras que contienen ARN antes del aislamiento del
ARN. Sorprendentemente, esto se consigue sin almacenar a
temperaturas ultra-bajas o romper las muestras. Por
ejemplo, se puede colocar el tejido aislado de una biopsia humana en
un medio de conservación de ARN y almacenarlo refrigerado durante
un largo período de tiempo, hasta que el investigador tenga tiempo
de extraer el ARN para el análisis.
Los siguientes ejemplos ilustran la utilidad de
la presente invención. Todos los ejemplos usan tejidos frescos de
animales o plantas, células vivas en suspensión u otras muestras que
contienen ARN. Los métodos y composiciones se aplican a la
conservación de ARN en una amplia variedad de especies bacterianas,
plantas y animales, incluidos humanos. Las muestras de ARN
recuperadas en estos experimentos se analizan por electroforesis en
geles de formaldehído/agarosa, teñidos con bromuro de etidio, e
iluminación con luz ultravioleta de 300 nm, como se describe en
Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Maniatis, et al).
Los ejemplos se incluyen para demostrar las
realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la técnica
deberán apreciar que las técnicas divulgadas en los ejemplos que
siguen representan técnicas descubiertas por el inventor para que
funcionen bien dentro de la práctica de la invención, y por lo tanto
puede considerarse que constituyen modos preferidos para su
práctica.
Ejemplo
1
El Inventor realiza rutinariamente análisis de
ARN diseñados para evaluar si tales muestras están intactas. Este
criterio se usó en los ejemplos que siguen para determinar
objetivamente la calidad del ARN recuperado de tejidos conservados
en RNAlater™, otros medios de conservación de ARN de la
inventiva, u otras soluciones.
El ARN se analiza por electroforesis en geles de
agarosa formaldehído usando el protocolo básico descrito en
"Molecular Cloning, a Laboratory Manual" (Maniatis, Fritsch,
Sambrook, eds. Cold Spring Harbor Press). Con el fin de visualizar
el ARN se adicionó bromuro de etidio en el gel, para teñido por
intercalado. El bromuro de etidio, cuando se intercala en el ácido
nucleico, emite luz fluorescente bajo la luz ultravioleta,
permitiendo visualizar el ácido nucleico. El ARN intacto aparece
como una estela (smear) de ARNm heterogéneo (desde 0,5 kilobases
hasta ~10 kilobases), con dos bandas muy prominentes, discretas, (el
ARN ribosómico 28S y 18S), superpuesto sobre una estela (smear) de
fondo en una proporción de 2:1. Deberá haber muy poca evidencia de
bandas discretas de tamaño intermedio entre el ARN 18S y 28S. El ARN
parcialmente degradado se caracteriza por una pérdida de ARN de
alto peso molecular heterogéneo, múltiples productos más pequeños de
rotura del ARN ribosómico, y una desviación de la proporción 2:1
del 28S frente al 18S (el 28S es más sensible a la degradación). El
ARN gravemente degradado tendrá proporciones 28S:18S inferiores a
1:1, y mostrará una estela (smear) de ARN ribosómico degradado
desde ~2 kilobases hasta <0,1 kilobases.
"Parcialmente degradado", tal como se usa en
esta especificación significa que la proporción entre el ARNr
28S:18S es aberrante y puede ser tan baja como 1:1, pero las bandas
de ARNr todavía se distinguen.
"Mayormente degradado" tal como se usa en
esta especificación significa que la proporción entre 28S:18S es
inferior a 1:1. El 28S pueden ser escasamente visible, pero todavía
hay ácido nucleico en una estela (smear) que se extiende desde la
posición aproximada del ARNr 28S hacia abajo.
"Completamente degradado" y
"degradado", tal como se usa en esta especificación significa
que el único ARN presente está en una estela (smear) de bajo peso
molecular por debajo de la posición normal del ARNr 18S.
Ejemplo
2
La descripción de este ejemplo proporciona una
manera en la que se puede preparar el RNAlater™. Primero, se
deben obtener o preparar las siguientes disoluciones madre y
reactivos: EDTA disódico dihidrato 0,5 M (18,61 g/100 ml, ajustar
el pH a 8,0 con NaOH mientras se agita); sal citrato trisódico,
dihidrato 1M (29,4 g/100 ml, con agitación hasta disolución);
Sulfato de amonio, en polvo; agua estéril.
En un vaso de precipitados, combinar 40 ml de
EDTA 0,5 M, 25 ml de citrato de sodio 1 M, 700 g de sulfato de
amonio y 935 ml de agua destilada estéril, mezclar en un agitador de
placa caliente a calor bajo hasta que el sulfato de amonio se
disuelva completamente. Dejar enfriar, ajustar el pH de la
disolución a pH 5,2 usando H_{2}SO_{4} 1 M. Transferir a un
frasco con tapa a rosca y almacenar a temperatura ambiente o
refrigerado.
Ejemplo
3
Las muestras de tejido que se van a conservar en
RNAlater™ u otros medios de conservación de ARN de la
inventiva deben ser separadas de la fuente tan rápido como sea
posible y colocadas en RNAlater™ u otro medios de
conservación de ARN de la inventiva. Algunas muestras de tejido
pueden tener una membrana protectora u otra barrera que impedirá
una rápida infusión del RNAlater™ u otros medios de
conservación de ARN de la inventiva, tal como un recubrimiento
ceroso sobre una hoja o la cápsula de un riñón o testículo. Estas
barreras protectoras deberán romperse para permitir la rápida
infiltración del RNAlater™ u otros medios de conservación de
ARN de la inventiva en la muestra. Además, las muestras grandes
deberán diseccionarse en fragmentos más pequeños para maximizar la
difusión. Como una guía general, el grosor de la muestra se limitará
a 0,5 cm en al menos dos dimensiones. Las muestras que consisten en
células en suspensión se deberán concentrar a un volumen pequeño
centrifugando suavemente a una fuerza-g suficiente
como para concentrar las células sin dañarlas, resuspenderlas en un
volumen mínimo del sobrenadante eliminado, y luego mezclarlas con 5
volúmenes de RNAlater™ u otros medios de conservación de ARN
de la inventiva (v/v). Si la concentración no es posible, la
suspensión celular deberá diluirse en 10 volúmenes de
RNAlater™ u otros medios de conservación de ARN de la
inventiva. Alternativamente, se puede usar cualquier otro volumen
de líquido, medio esencial o cantidad de una composición sólida de
conservación del ARN que resulte en la conservación del ARN. Dado
que el tampón no destruirá las células, la concentración por
centrifugación puede realizarse más tarde.
Las muestras que se almacenarán durante una
semana o menos pueden almacenarse a temperatura ambiente (25ºC).
Para una estabilidad más larga, las muestras deberán almacenarse
refrigeradas. Para almacenar en archivo permanente (meses - años),
las muestras pueden almacenarse en un congelador estándar (-20ºC).
Para aislar ARN a partir de muestras tratadas, las muestras de
tejido deben transferirse directamente a un tampón de extracción de
tejidos. Las células en suspensión deben concentrarse por
centrifugación, luego suspenderse en un tampón de centrifugación y
procesarse.
Ejemplo
4
Se colocaron muestras frescas de hígado,
testículo y bazo de ratón (\sim0,5 cm^{3}) en RNAlater™ o
en una solución de extracción de ARN a base de isotiocianato de
guanidinio (GITC) 4 M, o agua a 4ºC durante 12 horas. Esta
disolución de guanidinio es un tampón típico de extracción de ARN (y
se encuentra en los kits ToTally RNA™ y RNAqueous™ de Ambion,
disponibles comercialmente). GITC es un poderoso agente caotrópico
usado o bien solo o en conjunción con otros agentes en virtualmente
todos los protocolos de aislamiento de ARN. Después de una
incubación durante la noche, se extrajo el ARN a partir de muestras
de tejido y se lo analizó por electroforesis desnaturalizante en
geles de agarosa. Solamente se observó ARN intacto en los carriles
correspondientes a los tejidos conservados en RNAlater™. El
ARN extraído de muestras conservadas en GITC estaba sumamente
degradado. Por lo tanto, GITC no conserva el ARN en muestras de
tejido intacto. Los tejidos animales almacenados en agua o tampones
biológicos tales como solución salina normal no producen ARN
detectable después de una incubación idéntica durante la noche. Los
datos se muestran en la Fig. 2.
Ejemplo
5
Se colocó hígado de ratón recién aislado en
diversos medios que supuestamente conservan el ARN con varias
concentraciones de sulfato de amonio. Las muestras contenían 0, 10%,
20%, 30%, 40%, 50% o 70% de sulfato de amonio. Después de la
incubación a 4ºC durante 24 horas, se extrajo el ARN de la muestra y
se lo analizó por electroforesis desnaturalizante en geles de
agarosa.
En la muestra que no contenía sulfato de amonio,
lo único que se observó fue una estela (smear) de bajo peso
molecular. No se observó ninguna banda específica de ARN ribosómico.
A una concentración de sulfato de amonio de 10%, se observó ligera
evidencia de bandas de ARNr. A sulfato de amonio 20%, la banda 18S
es más evidente, y hay una estela (smear) de ARNr 28S degradado que
se extiende por debajo de la posición prevista para el ARNr 28S. No
se observa una banda específica para el 28S. A sulfato de amonio
30%, tanto la banda de ARNr 28S como de 18S son visibles, sin
embargo existe una degradación extensa (en base a la proporción
aberrante de 28S:18S y a las numerosas bandas más pequeñas
observadas). La muestra con sulfato de amonio 40% aparece casi
intacta y el rendimiento es 10 veces mayor que con el 30%. Mientras
que estos experimentos sugieren un requerimiento mínimo de
30-40% de sulfato de amonio para la protección del
ARN en tejidos, la concentración eficaz dependerá del tipo de
tejido, del tamaño del fragmento de tejido, de la temperatura de
almacenamiento y del período de almacenamiento.
En condiciones más severas de incubación, es
necesaria una concentración más alta de sulfato de amonio para la
conservación del ARN. Por ejemplo para la conservación del ARN en
muestras de tejido a 25ºC se necesitan 55 g/100 ml, como se
describe en el Ejemplo 6 para una máxima protección en muestras de
tejido a 37ºC parecen ser necesarios 70 g/100 ml. Además, si las
muestras se almacenan en 55 g o menos de sulfato de amonio a 37
grados durante 24 horas, al menos algunos estudios producen ARN
parcialmente degradado como puede deducirse de una proporción 1:1
de ARNr 28S:18S. Los datos se muestran en la Fig. 3.
Ejemplo
6
Se evaluó el efecto del pH y el sulfato de amonio
a temperaturas extremas. Se colocó hígado fresco de ratón en 4
formulaciones de los medios de conservación del ARN en estudio y se
almacenó a temperatura ambiente, o 37ºC, durante 24 horas. El ARN
se extrajo de las muestras de tejido y se analizó por electroforesis
desnaturalizante en geles de agarosa. La formulación que contenía
55 g/100 ml de sulfato de amonio a pH 7,0 fue eficaz a temperatura
ambiente, pero no protegió completamente el ARN a 37ºC. Una
combinación de pH bajo (5,0) y una concentración de sulfato de
amonio más alta (70 g/100 ml) fue mucho más eficaz a altas
temperaturas que la formulación original y proporcionó ARN intacto
después de 3 días a 37ºC. Ninguna modificación por sí sola (pH bajo
o una concentración más alta de sulfato de amonio) mejoró
apreciablemente la estabilidad del ARN por encima de la
proporcionada por la formulación original. Los datos se muestran en
la Fig. 4.
Ejemplo
7
Se produjeron cuatro formulaciones adicionales de
medios de conservación de ARN para su estudio. El sulfato de amonio
se reemplaza por cantidades de saturación de carbonato de amonio,
cloruro de amonio, sulfato de potasio o sulfato de magnesio. Se
incubaron muestras frescas de hígado en estos tampones durante 3
días a 25ºC y 37ºC. El ARN se extrajo y analizó por electroforesis
desnaturalizante en geles de agarosa. Solamente el control de
sulfato de amonio evitó que el ARN se degradara. La máxima
protección parece necesitar altas concentraciones de ambos iones,
el sulfato y el amonio. El sulfato de amonio es probablemente la más
eficaz de las sales estudiadas porque es mucho más soluble en agua
que estas otras sales, permitiendo formulaciones con un contenido
salino muy alto. Esta hipótesis fue desafiada evaluando dos sales
(más caras): sulfato de cesio (que es muy soluble - saturación a
362 g/100 ml) y cloruro de cesio (70 g/100 ml). Estas sales fueron
sustitutos (en masas iguales) del sulfato de amonio en la solución
descrita en el Ejemplo 2 y las muestras de hígado se procesaron
como se indicó anteriormente. El sulfato de cesio y el cloruro de
cesio ofrecieron protección parcial al ARN del hígado a 4ºC.
Considerados conjuntamente, los datos sugieren que de las sales
estudiadas, el sulfato de amonio tiene mayor capacidad para proteger
el ARN de la degradación en tejidos intactos. Sin embargo, la
protección parcial que los inventores ven con altas concentraciones
de otra sal sugieren un mecanismo de acción compartido, con grados
variables de eficiencia. Los datos se muestran en la Fig. 5.
Ejemplo
8
Se colocaron muestras frescas de cerebro,
corazón, riñón, hígado y bazo de ratón en solución de
RNAlater™, preparadas como se explicó en el Ejemplo 2, y
almacenadas a 4ºC. Después de incubar durante una semana, 2 semanas
y cuatro semanas, el ARN se extrajo de las muestras de tejido y se
analizó por electroforesis desnaturalizante en geles de agarosa.
Todas las muestras de ARN estaban intactas. Se colocaron muestras
frescas de cerebro, riñón, hígado y bazo de ratón en 10 volúmenes
de RNAlater™ y se almacenaron a 4ºC. Después de incubar
durante una semana, dos semanas y cuatro semanas, se extrajeron y
procesaron fragmentos de peso equivalente de tejido. Cada muestra
de tejido se colocó en una solución lítica de isotiocianato de
guanidinio, se homogenizó y se aisló usando el kit RNAqueous™ de
Ambion (como se describe en el Ejemplo 20). Se determinó la
concentración de ARN midiendo la absorbancia a una D.O._{260}. El
ARN se analizó por electroforesis en geles de
formaldehído-agarosa como se describe en el
\hbox{Ejemplo 1.}
Las muestras de ARN fueron consideradas
"intactas" en base a la presencia de bandas ribosómicas de ARN
limpias, definidas en una proporción 2:1 de 28S:18S. Además, la
calidad total fue juzgada por una estela (smear) de fondo de ARN
heterogéneo y la falta de productos visibles de rotura de ARN
ribosómico. Los datos se muestran en la Fig. 6.
Ejemplo
9
Se colocaron muestras frescas de cerebro,
corazón, riñón, hígado y bazo de ratón en la solución de
RNAlater™ y se almacenaron a 25ºC (temperatura ambiente).
Después de incubar durante dos o cuatro semanas, se extrajo el ARN
de muestras de tejido y se analizó por electroforesis
desnaturalizante en geles de agarosa como se describió
anteriormente. El ARN recuperado después de dos semanas estaba
intacto. El ARN recuperado después de una mes de incubación todavía
estaba intacto en un \sim50% a juzgar por la apariencia de las
bandas ribosómicas 18S y 28S. Los datos se muestran en la Fig.
7.
Ejemplo
10
Se colocaron muestras frescas de hígado, riñón y
bazo de ratón en la disolución de RNAlater™ y se almacenaron
a 37ºC. Después de incubar durante tres días, se extrajo el ARN de
las muestras de tejido y se analizó por electroforesis
desnaturalizante en geles de agarosa, como se describió
anteriormente. El ARN aislado estaba intacto. El ARN aislado
después de una semana \sim 10 días está parcialmente degradado
(intacto \sim50%). Este ARN todavía es un sustrato adecuado para
los Ensayos de Protección de la Nucleasa o RT-PCR
(Reacción en cadena de la polimerasa-Transcriptasa
inversa), siendo ambos procedimientos conocidos por los expertos en
la técnica. Los datos se muestran en la Fig. 8.
Ejemplo
11
El Inventor estudió la eficacia del
RNAlater™ en la conservación de ARN en corazón e hígado de
Xenopus, hígado de peces de colores, escarabajo entero, Drosophila
entera, E.Coli, tabaco y alfalfa. Cada uno fue colocado en
solución de RNAlater™ y almacenado a 4ºC. Después de
incubarlo durante 24 horas, se extrajo el ARN de las muestras y se
analizó por electroforesis desnaturalizante en geles de agarosa como
se describió en el Ejemplo 1. Todos los ARNs estaban intactos. Esto
demuestra la eficacia del RNAlater™ como reactivo general
útil para tejidos de diversos organismos.
Ejemplo
12
Se incubaron muestras frescas de hígado, riñón y
bazo de ratón en RNAlater™ durante 24 horas a 25ºC ó 37ºC.
Se extrajo el ARN, se resolvió por electroforesis desnaturalizante
en geles de agarosa, se transfirió a una membrana de nylon cargada
positivamente (Brightstar Plus™, Ambion, Austin, Texas) y se
hibridizó con una sonda marcada radiactivamente de ARN antisentido
para la \beta Actina de acuerdo con las recomendaciones de los
fabricantes (Northern Max™ Kit, Ambion, Austin, Texas). La señal
discreta que corresponde a la trascripción de la \beta Actina de
1,8 kilobases detectada en todas las muestras indica que el ARN
mensajero de todas las muestras estaba completamente intacto y
disponible para hibridización por análisis Northern.
Ejemplo
13
Se usó ARN preparado a partir de hígado, bazo,
riñón y testículo de ratón almacenado en RNAlater™ durante
24 horas a 37ºC como molde para RT-PCR con dos pares
de cebadores PCR™ para genes expresados constitutivamente (genes
housekeeping para la ciclofilina y RIG/S15) en una amplificación por
RT-PCR Multiplex. En todos los casos se obtuvieron
los productos esperados (ciclofilina-216 bp,
RIG/S15-324 bp). Por lo tanto, el ARN recuperado es
apropiado para el análisis por RT-PCR.
Ejemplo
14
Existe una tendencia creciente de análisis
genético de muestras clínicas humanas por RT-PCR.
Estas muestras clínicas incluyen tumores sólidos, células aisladas,
suero, orina, sangre o heces. Frecuentemente se analizan biopsias
de tumores sólidos para ver la expresión de genes indicadores
específicos como el p53, cuya expresión aberrante juega un rol
fundamental en diversos cánceres. Los leucocitos aislados a partir
de sangre normal o leucémica se analizan frecuentemente para ver la
expresión de los genes de las interleucinas. Frecuentemente se
analizan orina, sangre, suero, plasma y heces para detectar la
presencia de organismos patogénicos. En un uso anticipado, es
posible usar RNAlater™ u otros medios de conservación de ARN
de la inventiva como tampón de transporte para especímenes de
pacientes aislados en instalaciones clínicas. El ARN de estas
muestras estaría entonces protegido hasta que las muestras pudieran
transferirse a unas instalaciones de laboratorio en las que el ARN
se extraería para su análisis. En un uso anticipado, se puede usar
RNAlater™ u otros medios de conservación de ARN de la
inventiva para estabilizar ARN vírico normalmente inestable (tal
como el del VIH) en productos sanguíneos para su diagnóstico
posterior.
posterior.
\newpage
Ejemplo
15
Los biólogos de campo de todo el mundo hacen
frente al problema común de cómo conservar muestras recogidas en el
campo para su posterior análisis en el laboratorio. A menudo la
investigación de la expresión del ARN simplemente se evita debido a
dificultades logísticas relacionadas con el mantenimiento de
especímenes congelados en hielo seco o nitrógeno líquido. En un uso
anticipado, se pueden usar RNAlater™ u otros medios de
conservación de ARN de la inventiva como un tampón de transporte
para especímenes aislados en el campo por científicos que necesitan
conservar las muestras hasta más tarde hasta volver más tarde al
ámbito del laboratorio. Un importante beneficio del
RNAlater™ u otros medios de conservación de ARN de la
inventiva es que los especímenes pequeños (tales como
microorganismos) permaneces intactos. Por lo tanto, especímenes
complejos tales como una población de microorganismos aislados de
muestras de agua puede ser conservados en masa, seleccionados por
clasificación en el laboratorio, para después analizar la expresión
génica.
Ejemplo
16
Los biólogos deben realizar frecuentemente
complicadas disecciones con el fin de aislar un espécimen para el
análisis de ARN. A menudo retrasos de tiempo implican que el ARN
aislado de la muestra será de calidad pobre. Los biólogos de
Biología del Desarrollo que estudian el desarrollo embrionario
temprano en ratón deben realizar meticulosas disecciones para
aislar embriones tempranos de la decidua del útero. En otro ejemplo,
los neuroanatomistas deben realizar complicadas disecciones para
extraer partes específicas del cerebro para el análisis del ARN. En
un uso anticipado, el RNAlater™ u otros medios de
conservación de ARN de la inventiva serán un medio de conservación
muy eficaz. Sumergir una muestra en RNAlater™ u otros medios
de conservación de ARN de la inventiva protegerán al ARN durante la
disección, preservando al mismo tiempo la integridad de la muestra
(otros reactivos, tales como el guanidinio producirán lisis celular
extensa y comprometerán la disección). El uso de RNAlater™ u
otros medios de conservación de ARN de la inventiva facilitará una
disección prolongada de una muestra sin miedo a que el ARN de la
muestra se degrade.
Ejemplo
17
El análisis de los ácidos nucleicos para detectar
y clasificar organismos patogénicos es una tecnología que crece
rápidamente. En un uso anticipado, se pueden usar RNAlater™ u
otros medios de conservación de ARN de la inventiva como un tampón
de transporte para especímenes recogidos por inspectores sanitarios
en el campo. Colocar las muestras en RNAlater™ u otros
medios de conservación de ARN de la inventiva conservará el ARN en
las muestras. Las muestras podrían ser analizadas después usando
tecnología de ácidos nucleicos para detectar la presencia de
organismos patogénicos. Por ejemplo, un inspector del Departamento
de Agricultura de los EE.UU. podría recoger muestras de carne de un
matadero y colocarlas en RNAlater™ u otros medios de
conservación de ARN de la inventiva. El ARN de los organismos
patogénicos presentes en la superficie de la muestra se conservará
intacto. Se puede extraer más tarde la carne de la muestra, los
patógenos se recuperan a partir de RNAlater™ u otros medios
de conservación de ARN de la inventiva y el ARN se aísla para el
análisis. Una característica importante del RNAlater™ u
otros medios de conservación de ARN de la inventiva es que es
bactericida pero no provoca la lisis celular. Por lo tanto, el
título de organismos patogénicos no cambiará durante el
almacenamiento de las muestras ni tergiversará los números
aparentes, y las muestras también pueden ser analizadas
microscópicamente para buscar información adicional.
Ejemplo
18
Miles de especímenes se almacenan y envían cada
año en hielo seco a laboratorios centrales que realizan el análisis
del ARN para detectar patógenos. En un uso anticipado, el
RNAlater™ u otros medios de conservación de ARN de la
inventiva pueden usarse como tampón de envío, conservando el ARN de
organismos infecciosos, causantes de enfermedades. El
RNAlater™ u otros medios de conservación de ARN de la
inventiva permitirán enviar las muestras a temperatura ambiente o
cercana a la ambiente sin temor a la degradación del ARN. Una
organización que se beneficiará tanto de la protección extra que el
RNAlater™ u otros medios de conservación de ARN de la
inventiva producirían, como de los importantes ahorros en gastos de
envío, es el Centro para el Control de Enfermedades (CDC), que
recibe muchas muestras animales para estudio patogénico.
Ejemplo
19
La Clasificación de Células Activadas por
Fluorescencia (CCAF) es un método en el cual las células en
suspensión pueden separarse en base a diferencias en los marcadores
celulares de superficie. Anticipamos el uso de RNAlater™ u
otros medios de conservación de ARN de la inventiva como disolución
para la suspensión de células que serán procesadas en un equipo de
CCAF. De este modo, el ARN de las células se conservará. Una vez que
las células han sido clasificadas, se puede aislar el ARN intacto
para el análisis.
Ejemplo
20
Con la llegada de la metodología
RT-PCR para identificar especies bacterianas, existe
una necesidad creciente de métodos para aislar bacterias del suelo
lejos del suelo para el aislamiento posterior del ARN. Sin embargo,
el ARN de las bacterias es extremadamente lábil y se degrada
rápidamente durante el protocolo de aislamiento. Un uso anticipado
de RNAlater™ u otros medios de conservación de ARN de la
inventiva es un primer paso para aislar el ARN de las bacterias del
suelo. Se puede dispersar en suelo en RNAlater™ u otros
medios de conservación de ARN de la inventiva, protegiendo
instantáneamente el ARN que está dentro de la bacteria, pero
conservando intacta la bacteria. Después se puede eliminar de forma
segura el suelo por centrifugación a baja velocidad, después se
puede recuperar la bacteria por centrifugación a una velocidad más
alta. El RNAlater™ u otros medios de conservación de ARN de
la inventiva evitarán que el ARN se degrade durante el procedimiento
de aislamiento.
Ejemplo
21
Se han evaluado diversos métodos para aislar ARN
a partir de muestras de tejido respecto a su conveniencia para
tejidos conservados en medios de conservación de ARN. Varios de
tales métodos pueden llevarse a cabo con kits disponibles en
Ambion. Por supuesto, los kits de Ambion no son necesarios para el
aislamiento de ARN a partir de tejidos conservados en medios de
conservación de ARN, y el uso de otras metodologías o kits para
aislar ARN a partir de tejidos y células conservados en medios de
conservación de ARN está cubierto por esta especificación. Por
ejemplo, cualquiera de los métodos para aislar ARN, tal como los de
Boom et al. (unión selectiva y retención de ácidos nucleicos
a una matriz de vidrio - Qiaprep™, Qiagen, Inc.), Chomsczynski et
al. (Trizol™, MRC), Macfarlane et al. (Castrimox 14™,
Iowa Biotecnology, Inc.), Bugos et al. (Guanidinio:Cloruro
de Litio), o Auffray et al. (LiCl.:extracción de urea), o
kits para la práctica de tales métodos, se pueden usar en este
sentido.
Los ejemplos específicos que siguen describen el
uso de kits de Ambion para aislar ARN de muestras de tejidos o
células conservadas en RNAlater™ u otros medios de
conservación de ARN de la inventiva. Se contempla que Ambion puede
elegir vender un kit combinado para la conservación de ARN en
muestras de tejidos o células, seguido del aislamiento posterior
del ARN de estas muestras.
Ejemplo
22
El kit para ARN Totally™ de Ambion es un método
de Gaunidinio/Fenol ácido para preparar ARN celular.
Con el fin de demostrar la utilidad de combinar
RNAlater™ u otros medios de conservación de ARN de la
inventiva y la conservación de muestras de tejido con el
procedimiento ToTally RNA™, se retiraron muestras de tejido
almacenado en RNAlater™ y se homogenizaron en 10 volúmenes de
una disolución lítica de isotiocianato de guanidinio consistente en
hidrocloruro de guanidinio 4M, sarcosina 0,5%, citrato de sodio 25
mM, 2-mercaptoetanol 0,1 M. Las proteínas se
eliminan por una extracción con igual volumen de fenol:cloroformo
(1:1), seguido de una centrifugación para separar la fase acuosa y
orgánica. La fase acuosa se recupera y extrae una segunda vez con
fenol a pH 4,7. Esta segunda extracción particiona cualquier
proteína remanente hacia la fase orgánica y el pH bajo fuerza
cualquier ADN hacia la fase orgánica. El ARN permanece en la fase
acuosa. La fase acuosa se recupera por centrifugación. El ARN se
recupera de la fase acuosa por precipitación con acetato de sodio
0,3M y 2,5 volúmenes de etanol. Los resultados se muestran en la
Fig. 9.
Ejemplo
23
El kit RNAqueous™ de Ambion es un método de lisis
que contiene guanidinio para aislar ARN que no requiere solventes
orgánicos. En cambio, se basa en la absorción selectiva del ARN a un
filtro de fibra de vidrio.
Con el fin de demostrar la utilidad de combinar
RNAqueous™ con RNAlater™ u otros medios de conservación de
ARN de la inventiva, las muestras de tejido se extrajeron del
almacenamiento en RNAlater™, se transfirieron directamente a
la disolución lítica de isotiocianato de guanidinio proporcionada en
RNAqueous™ y se homogenizaron. El homogenato se aplicó a un filtro
de fibra de vidrio y se lavó con diversos tampones, que eliminan
proteínas y ADN. El ARN puro se eluyó después del filtro con agua.
La combinación de RNAlater™ u otros medios de conservación
de ARN de la inventiva y RNAqueous™ tiene la ventaja que durante el
procedimiento no se usan reactivos orgánicos cáusticos o
carcinógenos (fenol, cloroformo, etanol, ácido acético, etc.) Las
muestras frescas o las muestras conservadas RNAlater™ se
homogenizaron en 10 volúmenes de una disolución consistente en
hidrocloruro de guanidinio 4M, sarcosina 1%, citrato de sodio 25
mM, 2-mercaptoetanol 0,1 M, Triton
X-100 2%. El homogenato se diluye 2X y se pasa por
un filtro de fibra de vidrio. En estas condiciones, los ácidos
nucleicos se unen al filtro y se lavan las proteínas. Varios
lavados secuenciales con una concentración alta de sal y etanol
lavan diferencialmente el ADN, dejando el ARN unido al filtro. El
ARN se recupera posteriormente eluyendo con agua caliente. Los
resultados se muestran en la Fig. 9.
Ejemplo
24
Los componentes sólidos de la composición
preferida de conservación de ARN pueden disolverse directamente en
una muestra líquida para ser estabilizados, ser adicionados a una
mezcla muestra/líquido, ser adicionados a una muestra que se ha
colocado en un líquido o presente en un recipiente de recogida antes
de recoger una muestra o mezcla muestra /líquido.
Los componentes sólidos pueden mezclarse en un
mezclador para productos secos en la composición adecuada tal que
cuando se adicionan a una mezcla acuosa y se disuelven, la
concentración preferida de la sal, tampón y quelante se obtiene en
disolución. Las alícuotas medidas previamente de los componentes
secos en polvo se pueden cargar en recipientes para recogida de
muestras, y se adicionará un volumen apropiado de muestra. Luego se
agitará el recipiente de recogida, disolviendo los componentes de
RNAlater en la disolución. Esto minimizará la exposición del
operador a la muestra, y será un método preferido para estabilizar
ácidos nucleicos en especímenes biológicos tales como sangre y
orina. Alternativamente, los componentes sólidos se pueden comprimir
para formar comprimidos y almacenar a granel. Los comprimidos serán
un formato conveniente para almacenar y pueden ser adicionados en
la cantidad correcta a una muestra de cualquier tamaño y cualquier
tipo de recipiente. Éste será un método preferido para una recogida
de campo de muestras líquidas de fuentes tales como reservorios de
agua o plantas de depuración de aguas residuales o en la industria
láctea. Las ventajas primarias de usar un reactivo de conservación
del ARN en el modo seco será un ahorro en el peso durante el
almacenamiento y el transporte, los derrames de componentes sólidos
son menos probables, y los ahorros de volumen en la conservación de
tales muestras líquidas con reactivos secos minimizarán el volumen
final de la muestra.
Patente de EE.UU. Nº 5.922.591
Patente de EE.UU. Nº 5.921.396
Patente de EE.UU. Nº 5.726.012
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Claims (25)
1. Uso de un medio de conservación de ARN que
comprende una sal constituida por sulfato de amonio o sulfato de
cesio a una concentración desde 40 g/ml hasta la concentración de
saturación de la sal para conservar ARN en una muestra.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que la sal es sulfato de amonio.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 a 2,
en el que la sal está a una concentración de 50 g/100 ml.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 a 3,
en el que la sal está a una concentración de 60 g/100 ml.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 a 4,
en el que la sal está a una concentración de 70 g/100 ml.
6. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a
5, en el que el medio de conservación de ARN comprende un
disolvente orgánico.
7. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a
6, en el que el medio de conservación de ARN comprende un quelante
de cationes divalentes.
8. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a
7, en el que el medio de conservación de ARN comprende un
tampón.
9. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a
8, en el que el medio de conservación de ARN tiene un pH entre 4 y
8.
10. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1
a 9, en el que la muestra es una suspensión de células.
11. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1
a 9, en el que la muestra es una muestra de tejido sólido.
12. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1
a 9, en el que la muestra es una muestra de sangre.
13. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1
a 9, en el que la muestra es una muestra de agua.
14. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1
a 9, en el que la muestra comprende un organismo entero.
15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14,
en el que el organismo es un patógeno dentro de una muestra de
tejido u otro organismo.
16. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1
a 15, en el que se aísla el ARN conservado.
17. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1
a 16, en el que el ARN se aísla a una temperatura que es mayor que
-20ºC.
18. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1
a 17, en el que la muestra se almacena en el medio de conservación
de ARN antes de aislar el ARN.
19. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1
a 18, en el que la muestra se almacena a una temperatura mayor que
0ºC.
20. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que la muestra que contiene ARN y la sal se mezclan en un
líquido.
21. El uso de acuerdo con la reivindicación 20,
en el que la muestra es una célula sanguínea y el líquido es suero
sanguíneo.
22. El uso de acuerdo con la reivindicación 20,
en el que el líquido es agua.
23. El uso de acuerdo con la reivindicación 20,
en el que el líquido es un tampón.
24. El uso de acuerdo con la reivindicación 20,
en el que la sal está en una forma sólida antes de mezclarla con la
muestra y el líquido.
25. El uso de acuerdo con la reivindicación 20,
en el que la sal está comprendida en el líquido antes de mezclar la
muestra con la sal.
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