ES2295177T3 - Nuevas composiciones para la estabilizacion de acidos nucleicos en materiales biologicos. - Google Patents
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Abstract
Solución estabilizante acuosa que abarca como componentes un compuesto catiónico de la fórmula general Y+R1R2R3R4X- en la cual pueden significar Y nitrógeno o fósforo R1, R2, R3 y R4, independientemente entre sí, un radical alquilo(C1-C20) no ramificado o ramificado y/o un radical arilo(C8-C20), así como un radical aralquilo(C8-C28), y X- un anión de un ácido mono o polibásico, inorgánico u orgánico, y al menos un donante de protones, con la condición de que en el caso de una solución acuosa de ácido cítrico al 2, 5 a 10% la concentración del compuesto catiónico cloruro de cetiltrimetilamonio no se sitúe en un intervalo de 2 a 8% en peso, y en el caso de una solución acuosa de ácido acético al 10% la concentración del compuesto catiónico acetato de dodecildimetilamonio, 2-etilhexanoato de dodecildimetilamonio, cloruro de dodecildimetilamonio, no sea del 2% en peso.
Description
Nuevas composiciones para la estabilización de
ácidos nucleicos en materiales biológicos.
La presente invención se refiere a soluciones
estabilizantes para la estabilización de ácidos nucleicos en
materiales de origen biológico. Las soluciones estabilizantes
abarcan como componente esencial un compuesto catiónico de la
fórmula general
Y^{+}R_{1}R_{2}R_{3}R_{4}X^{-}
en la cual pueden
significar
Y nitrógeno o fósforo
R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4},
independientemente entre sí, un radical
alquilo(C_{1}-C_{20}) ramificado o no
ramificado y/o un radical
arilo(C_{8}-C_{20}), así como un radical
aralquilo(C_{8}-C_{28}), y
X^{-} un anión de un ácido mono o polibásico,
inorgánico u orgánico,
y al menos un donante de protones como
aditivo,
con la condición de que
en el caso de una solución acuosa de ácido
cítrico al 2,5 a 10% la concentración del compuesto catiónico
cloruro de cetiltrimetilamonio no se sitúe en un intervalo de 2 a
8% en peso, y en el caso de una solución acuosa de ácido acético al
10% la concentración del compuesto catiónico acetato de
didecildimetilamonio, 2-etilhexanoato de
didecildimetilamonio, cloruro de didecildimetilamonio, no sea del 2%
en peso.
Junto a esto, la presente invención se refiere a
la utilización de una composición que abarca un compuesto catiónico
de la fórmula general
Y^{+}R_{1}R_{2}R_{3}R_{4}X^{-}
en la cual pueden
significar
Y nitrógeno o fósforo
R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4},
independientemente entre sí, un radical
alquilo(C_{1}-C_{20}) ramificado o no
ramificado y/o un radical
arilo(C_{6}-C_{20}), así como un radical
aralquilo(C_{6}-C_{26}), y
X^{-} un anión de un ácido mono o polibásico,
inorgánico u orgánico,
y al menos un donante de protones para la
estabilización de ácidos nucleicos, así como equipos (kits) y
composiciones diagnósticas para esta utilización.
Se prefieren soluciones estabilizantes acuosas,
en las cuales los compuestos catiónicos se componen de una sal de
amonio, en la que R_{1} significa un radical alquilo superior,
preferentemente con 12, 14 o 16 átomos de carbono, y R_{2},
R_{3} y R_{4}, significa en cada caso un grupo metilo.
Se prefieren, además, soluciones estabilizantes,
en las cuales R_{1} significa un grupo aralquilo - preferentemente
un grupo bencilo -, R_{2} un radical alquilo superior -
preferentemente con 12, 14 o 16 átomos de carbono - y R_{3} y
R_{4} un grupo metilo.
Como aniones se prefieren bromuro, cloruro,
fosfato, sulfato, formiato, acetato, propionato, oxalato o
succinato.
Alquilo(C_{1}-C_{6})
representa en general un radical hidrocarburo ramificado o no
ramificado con 1 a 6 átomos de carbono, el cual puede estar
sustituido eventualmente con uno a varios átomos de halógeno -
preferentemente flúor -, los cuales pueden ser iguales o diferentes
entre sí. Como ejemplos se pueden citar los siguientes radicales de
hidrocarburos:
Metilo, etilo, propilo,
1-metiletilo (iso-propilo), butilo,
1-metilpropilo, 2-metilpropilo,
1,1-dimetiletilo, n-pentilo,
1-metilbutilo, 2-metilbutilo,
3-metilbutilo, 1,1-dimetilpropilo,
1,2-dimetilpropilo,
2,2-dimetilpropilo, 1-etilpropilo,
hexilo, 1-metilpentilo,
2-metilpentilo, 3-metilpentilo,
4-metilpentilo, 1,1-dimetilbutilo,
1,2-dimetilbutilo,
1,3-dimetilbutilo,
2,2-dimetilbutilo,
2,3-dimetilbutilo,
3,3-dimetilbutilo, 1-etilbutilo,
2-etilbutilo, 1,1,2-trimetilpropilo,
1,2,2-trimetilpropilo,
1-etil-1-metilpropilo
y
1-etil-2-metilpropilo.
Radical alquilo superior representa un radical
alquilo(C_{7}-C_{20}), ramificado o no
ramificado el cual puede estar eventualmente sustituido con uno o
varios átomos de halógeno - preferentemente flúor -, los cuales
pueden ser iguales o diferentes entre sí. Como ejemplos se pueden
citar los siguientes radicales hidrocarburo: heptilo, octilo,
nonilo, decilo, undecilo, dodecilo, tetradecilo, hexadecilo,
dodecadecilo y elcosilo, ramificados o no ramificados.
Alquenilo(C_{3}-C_{6})
representa en general un radical hidrocarburo ramificado o no
ramificado, con 3 a 6 átomos de carbono, con uno o eventualmente
varios enlaces dobles, el cual eventualmente puede estar sustituido
con uno o varios átomos de halógeno - preferentemente flúor -, los
cuales pueden ser iguales o diferentes entre sí. Como ejemplos se
pueden citar los siguientes radicales hidrocarburo:
2-propenilo (alilo),
2-butenilo, 3-butenilo,
1-metil-2-propenilo,
2-metil-2-propenilo,
2-pentenilo, 3-pentenilo,
4-pentenilo,
1-metil-2-butenilo,
2-metil-2-butenilo,
3-metil-2-butenilo,
1-metil-3-butenilo,
2-metil-3-butenilo,
3-metil-3-butenilo,1,1-dimetil-2-propenilo,
1,2-dimetil-2-propenilo,
1-etil-2-propenilo,
2-hexenilo, 3-hexenilo,
4-hexenilo, 5-hexenilo,
1-metil-2-pentenilo,
2-metil-2-pentenilo,
3-metil-2-pentenilo,
4-metil-2-pentenilo,
1-metil-3-pentenilo,
2-metil-3-pentenilo,
3-metil-3-pentenilo,
4-metil-3-pentenilo,
1-metil-4-pentenilo,
3-metil-4-pentenilo,
4-metil-4-pentenilo,
1,1-dimetil-1-butenilo,
1,1-dimetil-2-butenilo,
1,1-dimetil-3-butenilo,
1,2-dimetil-2-butenilo,
1,2-dimetil-3-butenilo,
1,3-dimetil-2-butenilo,
1,3-dimetil-3-butenilo,
2,2-dimetil-3-butenilo,
2,3-dimetil-2-butenilo,
2,3-dimetil-3-butenilo,
1-etil-2-butenilo,
1-etil-3-butenilo,
2-etil-1-butenilo,
2-etil-2-butenilo,
2-etil-3-butenilo,
1,1,2-trimetil-2-propenilo,
1-etil-1-metil-2-propenilo
y
1-etil-2-metil-2-propenilo.
Alquinilo(C_{3}-C_{6})
representa en general un radical hidrocarburo ramificado o no
ramificado, con 3 a 6 átomos de carbono, con uno o eventualmente
varios enlaces triples, el cual eventualmente puede estar sustituido
con uno o varios átomos de halógeno - preferentemente flúor -, los
cuales pueden ser iguales o diferentes entre sí. Como ejemplos se
pueden citar los siguientes radicales de hidrocarburos:
2-propinilo (propargilo),
2-butinilo, 3-butinilo,
1-metil-2-propinilo,
2-metil-2-propinilo,
2-pentinilo, 3-pentinilo,
4-pentinilo,
1-metil-2-butinilo,
2-metil-2-butinilo,
3-metil-2-butinilo,
1-metil-3-butinilo,
2-metil-3-butinilo,
3-metil-3-butinilo,
1,1-dimetil-2-propinilo,
1,2-dimetil-2-propinilo,
1-etil-2-propinilo,
2-hexinilo, 3-hexinilo,
4-hexinilo, 5-hexinilo,
1-metil-2-pentinilo,
2-metil-2-pentinilo,
3-metil-2-pentinilo,
4-metil-2-pentinilo,
1-metil-3-pentinilo,
2-metil-3-pentinilo,
3-metil-3-pentinilo,
4-metil-3-pentinilo,
1-metil-4-pentinilo,
3-metil-4-pentinilo,
4-metil-4-pentinilo,
1,1-dimetil-1-butinilo,
1,1-dimetil-2-butinilo,
1,1-dimetil-3-butinilo,
1,2-dimetil-2-butinilo,
1,2-dimetil-3-butinilo,
1,3-dimetil-2-butinilo,
1,3-dimetil-3-butinilo,
2,2-dimetil-3-butinilo,
2,3-dimetil-2-butinilo,
2,3-dimetil-3-butinilo,
1-etil-2-butinilo,
1-etil-3-butinilo,
2-etil-1-butinilo,
2-etil-2-butinilo,
2-etil-3-butinilo,
1,1,2-trimetil-2-propinilo,
1-etil-1-metil-2-propinilo
y
1-etil-2-metil-2-propinilo.
Arilo representa - siempre que no se defina de
otro modo - un radical aromático mono o polinuclear con 4 a 22
átomos de C, el cual puede contener eventualmente uno o dos
heteroátomos. Como ejemplos se pueden citar: fenilo, naftilo,
antracilo o, respectivamente, pirrol, furano, tiofeno, piridina,
piridazina, pirimidina o pirazina, y el cual eventualmente,
independientemente entre sí puede estar sustituido una o varias
veces con halógeno (F, Cl, Br, I) - preferentemente flúor - o con
un grupo alquilo.
Aralquilo significa un radical arilo mono o
polinuclear en el sentido de la definición precedente, el cual a
través de un puente de
alquileno(C_{1}-C_{6}),
alquenileno(C_{3}-C_{6}) o
alquinileno(C_{3}-C_{6}), para los
cuales valen respectivamente las definiciones de los grupos
alquilo(C_{1}-C_{6}),
alquenilo(C_{3}-C_{6}) y
alquinilo(C_{3}-C_{6}), está unido a la
estructura parcial catiónica. En el sentido de la presente invención
se prefiere el grupo bencilo.
Como iones conjugados X^{-} son adecuados
preferentemente todos los aniones de los hidrácidos halogenados o
los aniones de ácidos orgánicos mono o dibásicos tales como acetato
u oxalato, malonato, succinato o citrato.
Como donantes de protones en el sentido de la
presente invención son adecuados en primer lugar ácidos
monocarboxílicos alifáticos saturados, ácidos alquenilcarboxílicos
insaturados, ácidos
dicarboxílicos(C_{2}-C_{6}) alifáticos
saturados y/o insaturados, ácidos cetocarboxílicos o ácidos
cetodicarboxílicos alifáticos, así como aminoácidos, junto con
ácidos minerales o sus sales, solos o en combinación. En este caso
se pueden emplear todos los ácidos orgánicos citados en forma no
sustituida o como derivados sustituidos, entre los cuales se
prefieren - siempre que no se indique de otro modo - los no
sustituidos o los derivados una o, respectivamente, varias veces
sustituidos con grupos hidroxilo.
Como ácidos monocarboxílicos alifáticos,
saturados, en el sentido de la presente invención, se entienden,
junto al ácido fórmico, preferentemente ácidos
alquil(C_{1}-C_{6}) carboxílicos, entre
los cuales se prefieren el ácido acético, ácido propiónico, ácido
n-butírico, ácido n-valérico, ácido
isovalérico, ácido
etil-metil-acético (ácido
2-metil-butírico), ácido
2,2-dimetilpropiónico (ácido pivalínico), ácido
n-hexanoico, ácido n-octanoico,
ácido n-decanoico, así como ácido
n-dodecanoico (ácido láurico). Junto a ellos se
pueden utilizar también los ácidos cetocarboxílicos que se derivan
de los ácidos citados.
Como ácidos alquenilcarboxílicos insaturados en
el sentido de la invención se pueden citar, por ejemplo, ácido
acrílico (ácido propenoico), ácido metacrílico, ácido crotónico,
ácido iso-crotónico, así como ácido
vinilacético.
Preferidos en el sentido de la presente
invención son los ácidos
dicarboxílicos(C_{2}-C_{6}) alifáticos,
saturados, tales como, por ejemplo, ácido oxálico, ácido malónico,
ácido succínico, ácido glutárico o ácido adípico, entre los cuales
se prefieren de modo particular el ácido oxálico y el ácido
succínico.
De modo particularmente preferido, para la
solución del problema conforme a la invención se emplean
hidroxiácidos di- y tri-carboxílicos alifáticos,
entre los cuales se prefieren de modo particular el ácido
tartrónico, ácido D-(+)-, L-(-)- o DL málico, ácido (2R,
3R)-(+)-tartárico, (2S,
3S)-(-)-tartárico, ácido
meso-tartárico y ácido cítrico.
Junto con ello, para la solución de las
presentes invenciones son además adecuados ácidos dicarboxílicos
insaturados tales como ácido maleico o fumárico o ácidos
tricarboxílicos insaturados tales como, por ejemplo, ácido
aconítico
Sin embargo, en el sentido de la presente
invención se pueden emplear también como aditivos ácidos
cetodicarboxílicos alifáticos tales como, por ejemplo, ácido
mesoxálico y ácido oxalacético, prefiriéndose de modo muy particular
el ácido oxalacético.
Además, en el sentido de la presente invención
se pueden emplear aminoácidos, entre los cuales se prefieren
\alpha-aminoácidos tales como, por ejemplo, ácido
aminoacético (glicina), ácido aminopropiónico (alanina), ácido
\alpha-amino-iso-valérico
(valina), ácido
\alpha-amino-isocaproico (leucina)
y ácido
\alpha-amino-\beta-metilvalérico
(isoleucina). En este caso, se utiliza glicina de modo
particularmente preferido.
Los donantes de protones citados se pueden
emplear como sustancias individuales o, respectivamente, en forma
de los estereoisómeros puros así como también mezclados.
Como otros aditivos se pueden emplear igualmente
en el sentido de la presente invención ácidos minerales y sus
sales. Se emplean preferentemente en este caso sales de ácidos
minerales - tales como ácido fosfórico y ácido sulfúrico - con
metales alcalinos o sus sales de amonio. Se utilizan en este caso de
modo particularmente preferido ácido fosfórico y sulfato de
amonio.
Como ácidos nucleicos se entienden en el sentido
de la presente invención ácidos nucleicos en el sentido más amplio,
que abarcan, por ejemplo, ácidos ribonucleicos (ARN) así como
también ácidos desoxiribonucleicos (ADN) en todas sus longitudes y
configuraciones que abarcan la doble hélice, la monohélice, circular
y lineal, ramificada, etc., y todas los posibles subtipos tales
como, por ejemplo, nucleótidos monómeros, oligómeros, plásmidos,
ADN y ARN virales y bacterianos, así como ADN y ARN genómicos y no
genómicos de células animales y vegetales o de otros eucariotas,
mARN en forma procesada y no procesada, tARN,
hn-ARN, rARN, cADN, así como todos los demás ácidos
nucleicos posibles.
Como muestra biológica con ácidos nucleicos se
puede utilizar material de muestra exento de células, plasma,
líquidos corporales tales como, por ejemplo, sangre suero, células,
fracciones de leucocitos, costra flogística, esputo, orina,
esperma, heces, frotis, punciones, muestras de tejidos de cualquier
tipo - tales como, por ejemplo, biopsias - partes de tejidos y
órganos, muestras de alimentos que contienen ácidos nucleicos libres
o ligados o células que contienen ácidos nucleicos, muestras del
medio ambiente que contienen ácidos nucleicos libres o ligados o
células que contienen ácidos nucleicos - tales como organismos (uni-
o pluricelulares, insectos, etc), plantas y partes de plantas,
bacterias, virus, levaduras y otros hongos, otros eucariotas y
procariotas, como los que se publican, por ejemplo, en la solicitud
de patente europea nº 95909684.3, o también ácidos nucleicos
libres.
Del estado actual de la técnica se sabe desde
hace tiempo que el origen genético y la actividad funcional de una
célula se pueden determinar y examinar estudiando sus ácidos
nucleicos. Los análisis de los ácidos nucleicos y de las proteínas
posibilitan el acceso directo al origen de las actividades
celulares. Por consiguiente, son potencialmente superiores a los
métodos convencionales indirectos, como, por ejemplo, la detección
de productos metabólicos. Así, se emplean ya análisis biológico-
moleculares en muchos sectores, por ejemplo en el diagnóstico
médico y clínico, en farmacia en el caso del desarrollo y evaluación
de medicamentos, en la analítica de los productos alimentarios, así
como en el control de la preparación de productos alimentarios, en
la economía agraria en el caso del cultivo de plantas y animales
útiles, así como en la analítica del medio ambiente y en muchos
campos de investigación.
Por el análisis de los ARN, especialmente de los
mARN en células, se pueden determinar directamente la actividad de
genes. El análisis cuantitativo de modelos de transcriptasas
(modelos de mARN) en células por modernos métodos de biología
molecular como, por ejemplo, tiempo real de transcriptasa inversa
PCR ("real time RT PCR") o análisis de chip de expresión
génica posibilita, por ejemplo, el reconocimiento de genes
expresados con defectos, por lo cual se pueden reconocer, por
ejemplo enfermedades metabólicas, infecciones o la aparición de
cáncer. El análisis de los ADN de células por métodos de la biología
molecular tales como, por ejemplo, PCR, RFLP, AFLP, SNP o por
secuenciación posibilita, por ejemplo, la detección de defectos
genéticos o la determinación del tipo HLA, así como de otros
marcadores genéticos.
El análisis de ADN y ARN genómicos se emplea
también para la detección directa de patógenos infecciosos tales
como virus y bacterias.
Premisa indispensable para la analítica de
ácidos nucleicos es la inmediata estabilización de los ácidos
nucleicos y de las proteínas después de la extracción de la muestra
biológica a partir de su entorno natural. Esto vale para ADN y
especialmente ARN, los cuales después de la extracción de la muestra
biológica se pueden degradar muy rápidamente. Por otro lado,
después de la extracción de la muestra biológica, por inducción por
ejemplo de genes estresantes se puede llegar también a la síntesis
de nuevas moléculas de mARN, por lo que la muestra de transcripción
de las células se puede modificar. Debido a ello, los análisis
posteriores se pueden falsear. Especialmente en el sector medicinal
es necesaria la estabilización de los ácidos nucleicos, puesto que
aquí - por ejemplo en un consultorio - se toman frecuentemente
muestras que contienen ácidos nucleicos, las cuales después de un
almacenamiento prolongado y de un transporte, se puedan seguir
analizando en un laboratorio.
En el tiempo intermedio, los ácidos nucleicos
contenidos en las muestras se pueden modificar o incluso degradar
totalmente. Naturalmente, esto influye masivamente sobre el
resultado de los ensayos efectuados posteriormente, o hace que
éstos sean totalmente imposibles. Para estos ensayos se emplean
técnicas de biología molecular tales como análisis
Northern-Blot, así como
Southern-Blot, PCR, RT-PCR, SunRise,
LCR, ADN ramificado (branched) (bADN), SDA, chips de ADN y ARN y
arreglos (arrays) para la analítica de la expresión génica y
mutacional, RFLP, AFLP, análisis SNP, síntesis de cADN, hibridación
sustractiva o la tecnología Taqman y otros procedimientos de
cuantificación en tiempo real. Por otro lado, la utilización de
ácido nucleico - ADN o ARN - altamente puro, intacto, personifica
un criterio de relevancia fundamental para la aplicación y
realización de los ensayos anteriormente citados. Junto a ello, el
aislamiento de las muestras que contienen ácidos nucleicos, así como
los ensayos representan en cada caso una larga etapa de trabajo.
Además, la contaminación de un laboratorio de investigación que
trabaja en el sector de la biología molecular - como se puede
presentar, por ejemplo, en el caso de una realización defectuosa
del ensayo - puede conducir a falsos resultados de la
investigación.
Un gran número de publicaciones propone la
utilización de mezclas a base de etanol y acetona como fijativos
para el subsiguiente aislamiento del ácido nucleico de una
correspondiente muestra - tal como, por ejemplo, tejido -. No
obstante, después de estudiar esta bibliografía, parece claro que
tales mezclas de etanol/acetona no pueden cumplir ni con mucho
todas las exigencias que se imponen a una obtención segura de ARN.
Así, estas mezclas no están en condiciones de proteger el ARN
contra la degradación. Junto a ello, no se asegura la protección
del ARN en muestras sólidas constituidas por asociaciones celulares
de mayor amplitud. Junto a ello, las mezclas propuestas son
fácilmente inflamables
y expuestas a la explosión, lo que va ligado a un evento no carente de peligrosidad durante el trabajo en el laboratorio.
y expuestas a la explosión, lo que va ligado a un evento no carente de peligrosidad durante el trabajo en el laboratorio.
Junto a ello, un estado de la técnica
periféricamente más importante se refiere a la obtención de ARN a
partir de muestras de tejidos fijados o respectivamente
conservados. Estos trabajos tienen esencialmente por objeto la
aptitud de los preparados histológicos para maximizar la potencia de
señal que se consigue en el caso de una hibridación in situ.
Con otras palabras, estos experimentos sirven más bien para detectar
ARN en lugar de conservarlos [patentes US- 5 196 182 y
US-5 260 048].
Otros informes tienen por objeto la obtención de
ARN o ADN fragmentados a partir de un tejido fijado, para poder
someter los fragmentos así obtenidos a un análisis molecular -
limitado - con ayuda de PCR. Para poder obtener un ADN o
respectivamente, ARN fragmentado de este modo, las correspondientes
muestras se tratan habitualmente con proteinasa K, para poder
degradar los componentes tisulares que forman la estructura; sólo
después se extrae el ARN con una solución que contiene una sal de
guanidina. Sin embargo, el ARN obtenido de esta manera a partir de
tejido fijado es de escasa calidad y presenta tan solo un tamaño de
aproximadamente 200 bases. Esto, conforme al estado actual de la
técnica, se puede atribuir a un cierto número de determinados
factores, los cuales, entre otros, abarcan la influencia
desventajosa de reacciones endógenas así como de reticulación del
ADN y respectivamente ARN dentro de la matriz intracelular durante
la fijación. En base a la circunstancia de que el ADN o,
respectivamente, ARN en la predominante mayoría de las veces está al
menos parcialmente degradado, un ADN o, respectivamente ARN así
obtenido no se puede emplear ya con éxito en un análisis Northern.
Un ARN aislado de esta manera a lo sumo se podría emplear con
ciertas perspectivas de éxito en una reacción
RT-PCR, pero allí sólo para la amplificación de
fragmentos relativamente pequeños.
Además, del estado actual de la técnica se
deduce la utilización de sulfato de amonio para la conservación de
ARN a temperaturas superiores al punto de congelación [documento WO
00/06780]. Una composición de este tipo ha encontrado entrada en el
estado actual de la técnica bajo la denominación ARNlater.
Sin embargo, tales soluciones acuosas de sulfato de amonio no son
adecuadas para estabilizar ARN en sangre, plasma o suero. Debido a
la circunstancia de que las citadas muestras presentan una elevada
concentración de proteínas, al ponerse en contacto con este tipo de
soluciones de sal de amonio se forma inmediatamente un precipitado
difícilmente soluble [información del producto ARNlater de
la razón social Ambion, Austin, Texas (EE.UU)].
Además de esto, desde hace algún tiempo del
estado de la técnica se conoce emplear compuestos denominados
catiónicos para el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de
muestras biológicas. Este tipo de aplicaciones se describen, entre
otras, en las patentes US-5,010,183 y
US-5,300,635 así como en la memoria de patente
europea EP 0442026. En los citados documentos la muestra biológica
se incuba respectivamente con el compuesto catiónico sólo en el
marco de los tiempos de incubación habituales para una preparación
de muestras, es decir en el espacio de minutos; a continuación, el
ácido nucleico se sigue purificando.
Una revisión de los compuestos conocidos en el
estado actual de la técnica ha dado como resultado que los
compuestos catiónicos citados en el estado de la técnica -
especialmente el oxalato de tetradeciltrimetilamonio dado a conocer
en las patentes de EE.UU.- no garantizan una suficiente
estabilización del ARN celular - por ejemplo en el caso de un
almacenamiento más prolongado de la sangre.
En el estado de la técnica se conocen
ciertamente ensayos para estabilizar por ejemplo virus en sangre
durante un espacio de tiempo de varios días, pero de estos
hallazgos no se puede deducir ningún tipo de referencia sobre la
integridad del ARN. Así, Schmidt y MacFarlane [J. Medical Virology
47 (1995) 153] describen la estabilización de virus de hepatitis C
en sangre mediante Catrimox-14^{TM} durante siete
días a la temperatura ambiente. La detección de los virus se
efectuó en este caso mediante amplificación RT-PCR
de un fragmento de 250 pB de longitud del genoma HCV. La detección
allí publicada no ofrece, sin embargo, ningún criterio suficiente
sobre la integridad del ARN, puesto que sólo se amplificó un
fragmento corto. Además, el ensayo se llevó a cabo con una muestra
con una carga de virus indeterminada, de modo que no se pudieron
sacar conclusiones sobre una degradación de ARN viral durante el
almacenamiento.
Junto a ello, en la solicitud de patente
internacional WO 99/29904 se describe la estabilización de ADN en
líquidos corporales utilizando EDTA, EGTA o BAPTA en combinación con
hidrocloruro de guanidina, tiocianato de guanidina, cloruro de
litio, cloruro de manganeso, sarcosil, SDS, perclorato de sodio,
salicilato de sodio y tiocianato de sodio. Además, del estado
actual de la técnica se deduce que los reactivos que contienen fenol
tales como, por ejemplo, Trizol^{TM} se pueden utilizar para la
estabilización de ARN durante el almacenamiento. Sin embargo, todos
estos reactivos son muy nocivos para la salud y, por ello, no son
adecuados para aplicaciones rutinarias.
Por lo tanto, la presente invención se
fundamenta en la misión de poner a disposición una solución acuosa
estabilizante que permita la estabilización de ARN en presencia de
tejidos o, respectivamente, sangre, plasma o suero.
Junto a ello, la presente invención se
fundamenta en la misión de poner a disposición una solución acuosa
estabilizante, cuyos componentes no sean nocivos para la salud y
que, además, se pueda emplear también, por ejemplo, para una
estabilización de material de ensayo biológico durante el transporte
desde el lugar de la extracción hasta un laboratorio sin riesgos
para la salud del personal encargado de la elaboración de las
muestras.
Junto a ello, una misión más de la presente
invención consiste en poner a disposición una solución estabilizante
acuosa, con la cual se cumpla la premisa de que también el reactivo
de estabilización permanezca estable incluso en solución y no
requiera de ningún tipo de tratamiento previo - como, por ejemplo,
la disolución de precipitados difícilmente solubles - por el
personal que lo aplica. Esta clase de tratamientos previos van
siempre unidos con el riesgo de una variación en la eficacia de la
estabilización.
Otra misión de la presente invención consiste en
poner a disposición una solución estabilizante de múltiple uso, es
decir: que se pueda aplicar en un amplio espectro de muestras
biológicas.
Sorprendentemente se comprobó, ahora, que la
estabilización de ácidos nucleicos se consigue durante un prolongado
espacio de tiempo cuando los ácidos nucleicos de una muestra
biológica se ponen en contacto con un compuesto catiónico tal como
se da a conocer, entre otras, en las patentes De EE.UU. US- 5 010
183 y 5 300 635 y, conforme a la invención, se hacen reaccionar con
uno o varios de los aditivos descritos al comienzo. Los aditivos que
son preferentemente adecuados para la solución de la misión
conforme a la invención se exponen en la Tabla 1:
El aditivo se puede presentar en el reactivo de
estabilización en diferentes concentraciones; por ejemplo, en
mezclas de la solución estabilizante con sangre puede estar presente
en una relación en volumen de 1:1, preferentemente 3:1 en una
concentración 50 mM hasta la saturación, preferentemente 100 a 1 M y
de modo particularmente preferido en una concentración de 200 - 500
mM. En este caso, en función de la naturaleza del aditivo pueden
resultar ventajosos otros intervalos de concentración. Junto a ello
también es posible el empleo de combinaciones de diferentes
aditivos.
El compuesto catiónico presenta en la solución
estabilizante acuosa una concentración en un intervalo de 0,01% en
peso y saturación, preferentemente entre 0,1% en peso y saturación
y, de modo particularmente preferido, entre 0,5% en peso y 15% en
peso y, de modo muy preferido, entre 2% en peso y 10% en peso.
Naturalmente, en el caso de la adición de una
solución de compuestos catiónicos y aditivo, las respectivas
concentraciones óptimas se determinan por el volumen de la muestra
biológica y la relación de volumen entre solución estabilizante y
muestra biológica.
El valor del pH de la mezcla de compuesto
catiónico y aditivo se puede variar en función de la muestra, en
general en un amplio intervalo de pH (pH 2 a 12) y se sitúa
preferentemente en un intervalo de pH 2 a pH 10 y, de modo
particularmente preferido, en un intervalo de pH 3 a 8. En este
caso, el intervalo de pH preferido depende de la muestra biológica
empleada. Para sangre, plasma y suero se prefiere un valor del pH en
un intervalo comprendido entre pH 2 y pH 6 y, particularmente,
entre pH 3 y pH 4.
Para muestras biológicas como para otros
líquidos corporales celulares excepto sangre, plasma y suero o, por
ejemplo, bacterias, punciones, células, tejidos y otras muestras
biológicas - tales como las descritas anteriormente - el valor del
pH en la solución estabilizante constituida por compuesto catiónico
y aditivo se sitúa preferentemente en un intervalo de pH 3 a pH 10
y, de modo particularmente preferido, en un intervalo de pH 4 a pH
8.
Para la estabilización de ácidos nucleicos en
muestras biológicas se puede mezclar la muestra con una solución
que contenga el o los compuestos catiónicos y los aditivos. En este
caso es posible un volumen añadido de 0,1 a 10.000 volúmenes de la
muestra biológica; se prefiere un volumen añadido en un intervalo de
1 a 1000 y, de modo muy particularmente preferido, en un intervalo
de 1 a 100 volúmenes. Sin embargo, en función de la clase de
muestra - por ejemplo muestras de biopsias por agujas finas o de
cultivos celulares bajos - se pueden considerar circunstancialmente
volúmenes esencialmente más elevados.
Igualmente, los compuestos catiónicos y aditivos
anteriormente citados se pueden añadir también como sustancia
sólida cuando la propia muestra biológica contiene líquido para la
disolución de la sustancia sólida (tal como, por ejemplo, líquidos
corporales que contienen células, células en un medio, orina), o se
añade un líquido como, por ejemplo, agua, para la solubilización de
la sustancia sólida. La adición como sustancia sólida ofrece la
ventaja de que las sustancias sólidas son generalmente más estables
químicamente y su adición a la muestra es frecuentemente más fácil
de llevar a cabo.
Además de esto, especialmente en muestras
biológicas muy compactas, tales como por ejemplo tejidos, es posible
una fragmentación o, respectivamente, homogeneización de la muestra
en la solución estabilizante o, respectivamente, antes de la
mezcladura con la solución estabilizante para que, por ejemplo, por
efectos mecánicos, químicos, físicos o enzimáticos sobre la muestra
fomentar la liberación de los ácidos nucleicos o de células
individuales o, respectivamente, asociaciones de células por
destrucción de una muestra compacta. Un efecto mecánico puede tener
lugar, por ejemplo, con un cuchillo mecánico, un molino de bolas o
por prensado a través de una jerinquilla, mientras que se ofrecen
enzimas adecuadas para actuar sobre la muestra - por ejemplo
hidrolasas, proteasas o lipasas.
Además de esto, la muestra también se puede
tratar previamente por vía puramente física, por ejemplo mediante
ultrasonidos.
El tratamiento previo se puede efectuar, además,
por vía química - bien sea sola o en combinación con métodos
puramente físicos. Como agentes para apoyar la lisis se pueden
utilizar, por ejemplo alcoholes alifáticos - especialmente
isopropanol - o aldehídos o, respectivamente, dialdehídos - tales
como, por ejemplo, glioxal - o también fenoles o derivados de
fenoles - tales como, por ejemplo, 2-bifenilol o
compuestos iónicos, híbridos o no iónicos - tales como, por
ejemplo, sulfhidrilo - o reactivos reductores - tales como, por
ejemplo, ditiotreitol y \beta-mercaptoetanol - o
derivados del ácido fosfórico - tales como, por ejemplo,
tributilfosfato - o también reactivos caotrópicos tales como, por
ejemplo, urea, tiocianato de guanidina o hidrocloruro de guanidina -
o sales individualmente o en combinación.
Otras posibilidades en cuanto a la acción
mecánica, química, física o enzimática sobre las muestras son
conocidas por el experto en la materia y deben ser abarcadas
aquí.
El almacenamiento del material de muestra, según
las necesidades individuales, puede tener lugar durante espacios de
tiempo más prolongados como, por ejemplo, de 1 a 14 días o más, a la
temperatura ambiente, pero también a temperaturas superiores como,
por ejemplo, 40ºC o más y, también, a temperaturas más bajas, por
ejemplo, 4ºC o -20ºC.
A continuación del almacenamiento de la muestra
biológica en la solución de los compuestos anteriormente citados se
pueden anexionar directamente o bien técnicas de análisis de ácidos
nucleicos, o puede tener lugar una purificación de los ácidos
nucleicos de la muestra.
Una detección/analítica directa de ácidos
nucleicos se puede ver, por ejemplo, en
Blotting-Techniken, métodos electroforéticos en gel
para la separación de biomoléculas y por métodos
cromatográficos.
Para la purificación de los ácidos nucleicos de
la muestra biológica los ácidos nucleicos libres o las células o
partículas que contienen ácidos nucleicos se separan, por ejemplo
por centrifugación o filtración de la solución restante y se llevan
a una purificación ulterior, la cual ventajosamente puede tener
lugar en un volumen más reducido, tal como se describe en las
patentes de EE.UU. US 5.010.183, US 5.300.635 y en la solicitud de
patente europea con el número de solicitud 99103457.
La separación directa de los ácidos nucleicos o,
respectivamente, de las células o partículas que contienen ácidos
nucleicos en el recipiente de almacenamiento posibilita, en este
caso, el ahorro de etapas adicionales para transvasar las muestras
a otros recipientes para su purificación, y reduce, por
consiguiente, tanto la pérdida de muestra como también el riesgo de
confusiones y de contaminación por arrastre de ácidos nucleicos de
muestra a muestra. La aplicación de estos reactivos de
estabilización posibilita, por consiguiente, un procedimiento de 1
etapa para la estabilización y el aislamiento directo de ácidos
nucleicos en muestras biológicas, pudiéndose aislar ARN y ADN
alternativamente de la muestra biológica o paralelamente a partir de
una muestra.
Por la estabilización de los ácidos nucleicos
con ayuda de las soluciones estabilizantes, acuosas, conformes a la
invención, a base de uno o varios compuestos catiónicos y uno o
varios aditivos se consigue que los ácidos nucleicos en una muestra
no se modifiquen tampoco en el caso de un almacenamiento prolongado
o durante un transporte. Con ello se incrementa claramente la
exactitud de los ensayos efectuados posteriormente. En determinados
casos - cuando por ejemplo el material de muestra tiene que ser
transportado a largas distancias o tiene que ser almacenado durante
tiempo prolongado - el procedimiento conforme a la invención hace
realmente posible este ensayo después de tal espacio de tiempo.
Las ventajas de esta invención se encuentran
especialmente tanto en el campo de la investigación, por ejemplo
para el análisis de niveles de trascriptasa, que se tienen que fijar
directamente después de la extracción, como también en el campo de
los análisis clínicos - tales como, por ejemplo el diagnóstico
molecular - en donde las muestras de pacientes después de la
extracción se tienen que estabilizar igualmente durante el
almacenamiento y transporte para el análisis. Especialmente, el
aislamiento y estabilización de ácidos nucleicos encuentra
aplicación en el diagnóstico de tumores, en el diagnóstico de
enfermedades muy condicionadas, así como en el diagnóstico y en la
monitorización de virus y en el diagnóstico y la monitorización de
virus de otros patógenos infecciosos, así como en el análisis de
modelos de la expresión génica.
Los campos de aplicación de la presente
invención se extienden en este caso no sólo a campos de aplicación
medicínales o zoológicos, sino abarcan también el análisis de
sistemas botánicos, fúngicos y procarióticos. La estabilización y
aislamiento de ácidos nucleicos a partir de plantas y partes de
plantas, algas, hongos, así como bacterias a partir de cultivos y
hábitats naturales encuentran aplicación en el sector de la
investigación, por ejemplo para el análisis de niveles de
transcriptasa y modelos de la expresión génica, así como para la
identificación y cuantificación de especies en colonias complejas,
por ejemplo de bacterias en una muestra de suelo.
Aparte de esto, el potencial de aplicación se
extiende también a otros campos analíticos tales como, por ejemplo,
la analítica de los productos alimentarios.
La presente invención se explica con ayuda de
los siguientes ejemplos y de las figuras. En la descripción y en
los ejemplos se utilizan las siguientes abreviaturas:
- AFLP
- polimorfismo longitudinal de fragmentos amplificados
- A. dest.
- agua destilada
- BAPTA
- ácido 1,2-bis(2-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacético
- EcoR1
- enzima de restricción de Escherichia coli cepa R
- E_{260}/E_{280}
- cociente de las extinciones a 260 y 280 nm
- EDTA
- ácido etilendiamin-N,N,N',N'-tetraacético
- EGTA
- ácido [etilenbis(oxietilennitrilo)tetraacético
- GAPDH
- glicerinaldehído-3-fosfato-deshidrogenasa
- Hind III
- enzima de restricción de Haemophilus influenzae
- hugI
- homólogo humano de larvas gigantes
- IFN-\gamma
- gamma interferona
- LM
- marcador de longitud
- MOPS
- ácido 3-(N-morfolin)-2-hidroxipropanosulfónico
- nd
- no determinado
- Nonidet P40
- Imbentin-N/52; octilfenilpolietilenglicol
- OD
- densidad óptica
- PBS
- fosfato salino tamponado
- PCR
- reacción en cadena de polimerasa
- RFLP
- polimorfismo de longitud del fragmento de restricción
- rpm
- revoluciones por minuto
- mARN
- ARN mensajero
- rARN
- ARN ribosomal
- TA
- temperatura ambiente
- RT-PCR
- transcriptasa inversa PCR
- SDS
- dodecilsulfato de sodio
- SNP
- polimorfismo de nucleótido individual
- SSC
- solución de sal común/citrato de sodio
- TBE
- tampón EDTA-tris-borato
- Tris
- 2-amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol
- U
- unidades
\vskip1.000000\baselineskip
Abreviaturas no reseñadas - tales como, por
ejemplo h para horas - son habituales en su significado para el
experto o, por su utilización en el estado actual de la técnica son
suficientemente conocidas.
Fig. 1 muestra la estabilización de ARN en
sangre mediante oxalato de tetradeciltrimetilamonio (TTAOx) en
diferentes tampones de ácido carboxílico con diferentes valores de
pH.
Fig. 2 muestra la estabilización de ARN en
sangre entera mediante oxalato de tetradeciltrimetilamonio,
tamponado con ácido tartárico, pH 3 en diferentes
concentraciones.
Fig. 3 muestra la estabilización de ARN en
sangre entera mediante oxalato de tetradeciltrimetilamonio,
tamponado con ácido tartárico 250 mM. pH 3.
Fig. 4 muestra la estabilización de ARN en
sangre entera mediante oxalato de tetradeciltrimetilamonio,
tamponado con ácido tartárico pH 3,7 como resultado de una
hibridación-Northern con una sonda marcada
radioactivamente para el mARN del gen GAPDH (A) y del gen
IFN-\gamma (B). También después de un
almacenamiento durante un espacio de tiempo de 72 h es detectable
en este experimento el mARN del GAPDH-gen y del
IFN-\gamma-gen.
Fig. 5 muestra la estabilización de ADN genómico
en sangre mediante oxalato de tetradeciltrimetilamonio, tamponado
con ácido tartárico a pH 3,7.
Junto al ARN celular, con el procedimiento aquí
desarrollado se puede aislar también el ADN genómico de los
leucocitos, estabilizado y a continuación aislado por unión a una
membrana de sílice. Fig. 5 muestra que también después de un
almacenamiento de 72 h se aísla ADN de alto peso molecular (longitud
> 20 kB).
Fig. 6 muestra los resultados de la utilización
del ADN genómico en reacciones enzimáticas. El ADN aislado después
de un almacenamiento de 24 o 72 horas (véase ejemplo 5) se emplea en
diversas reacciones enzimáticas.
- A.
- En cada caso, 2 \mug del ADN se cortan con 6 U de las enzimas de restricción EcoRI (E) o, respectivamente, Hind III (H) durante 3 h a 37ºC y, a continuación, se separan sobre un gel de agarosa/TBE al 0,8%. Como control se muestra en cada caso el ADN sin cortar.
- B.
- respectivamente 150 o 300 ng del ADN genómico se emplean en una reacción PCR (volumen total 50 \mul) en la cual se amplificó un fragmento de 1,1 kB de longitud del gen hugI (homólogo humano de...). Los productos del PCR se separan en un gel de agarosa/TBE al 1,2%.
Fig. 7 muestra la estabilización de ARN en
plasma mediante oxalato de tetradeciltrimetilamonio, mezclado con
diferentes aditivos. En este caso, todas las muestras se disponen en
forma de determinaciones dobles: respectivamente 30 \mul de los
eluídos se separan en un gel de
agarosa-formaldehído-MOPS al 1%. Las
respectivas muestras se describen en la Tabla 2.
Fig. 8 muestra la estabilización de ARN en
plasma mediante oxalato de tetradeciltrimetilamonio, mezclado con
ácido tartárico o, respectivamente, ácido tartrónico durante
diferentes espacios de tiempo.
En este caso, todas las muestras se disponen en
forma de determinaciones dobles: cada 30 \mul de los eluídos se
separan en un gel de
agarosa-formaldehído-MOPS al 1%. Las
respectivas muestras se describen en la Tabla 3.
Fig. 9 muestra la estabilización de ARN en 1 ml
de plasma mediante oxalato de tetradeciltrimetilamonio, mezclado con
diferentes aditivos.
En este caso, todas las muestras se disponen en
forma de determinaciones dobles: cada 30 \mul de los eluídos se
separan en un gel de
agarosa-formaldehído-MOPS al 1%. Las
respectivas muestras se describen en la Tabla 4.
Fig. 10 muestra la estabilización de ARN en
células Hela mediante oxalato de tetradeciltrimetilamonio, mezclado
con diferentes aditivos.
En este caso, las muestras se disponen en forma
de determinaciones dobles, las muestras 14, 40, 66 y 92 como
determinaciones simples: cada 20 \mul de los eluídos se separan en
un gel de agarosa-formaldehído-MOPS
al 1%. Las respectivas muestras se describen en la Tabla 5.
Fig. 11 muestra la estabilización de ARN en
diferentes cantidades de células Hela. En este caso, todas las
muestras se disponen en forma de determinaciones dobles: cada 20
\mul de los eluídos se separan en un gel de
agarosa-formaldehído-MOPS al 1%. Las
respectivas muestras se describen en la Tabla 7.
Fig. 12 muestra la estabilización de ARN en
macrófagos. En este caso, todas las muestras se disponen en forma
de determinaciones dobles: cada 20 \mul de los eluídos se separan
en un gel de
agarosa-formaldehído-MOPS al 1%.
Las respectivas muestras se describen en la Tabla 9.
Fig. 13 muestra la estabilización de ARN en
células Hela adherentes sin separación del medio. En este caso,
cada 20 \mul de los eluídos se separan en un gel de
agarosa-formaldehído-MOPS al 1%. Las
respectivas muestras se describen en el ejemplo 13.
Fig. 14 muestra la estabilización de ARN en
tejido renal mediante oxalato de tetradeciltrimetilamonio, mezclado
con diferentes aditivos. En este caso, todas las muestras se
disponen en forma de determinaciones dobles; cada 20 \mul de los
eluídos se separan en un gel de
agarosa-formaldehído-MOPS al 1%. Las
respectivas muestras se describen en la Tabla 12.
Fig. 15 muestra la estabilización y aislamiento
de ADN paralelamente a la estabilización y aislamiento de ARN. En
este caso, cada 40 \mul de los eluídos se separan en un gel de
agarosa-TBE al 0,8%. Las respectivas muestras se
describen en el ejemplo 15.
Como aditivos se eligen ácidos carboxílicos con
diferente longitud de cadena. Además se ensayan ácidos mono-,
di- y tri-carboxílicos, ácidos carboxílicos hidroxilados y no hidroxilados. Todas las sustancias se emplean para la estabilización en combinación con el compuesto catiónico oxalato de tetradeciltrimetilamonio. En este caso se varían tanto el valor del pH como también la concentración de las sustancias.
di- y tri-carboxílicos, ácidos carboxílicos hidroxilados y no hidroxilados. Todas las sustancias se emplean para la estabilización en combinación con el compuesto catiónico oxalato de tetradeciltrimetilamonio. En este caso se varían tanto el valor del pH como también la concentración de las sustancias.
La Fig. 1 muestra los resultados de las pruebas.
En todos los casos, se puede aislar ARN intacto también después de
24 o 48 h. Las cantidades de ARN, en parte bajas, dependen del bajo
volumen de sangre que fue elaborado y del diferente contenido en
ARN en diferentes muestras de sangre. En estos experimentos una
parte del ADN genómico se obtuvo igualmente en las fracciones de
ARN.
500 \mul de sangre se almacenaron con 500
\mul de un tampón constituido por 10% (p/v) de oxalato de
tetradeciltrimetilamonio - tamponado con diferentes ácidos
carboxílicos, en cada caso en una concentración 200 mM - así como
con los respectivos valores diferentes de pH del correspondiente
ácido carboxílico - durante 24 y 48 h a la TA. Para el aislamiento
del ARN se separan por centrifugación los complejos, constituidos
por compuesto catiónico y ácido nucleico; el aglomerado (pellet) se
lava una vez con agua, de nuevo se separa por centrifugación y se
recoge en 300 \mul de un tampón de lisis habitual en el comercio -
tal como, por ejemplo, tampón RLT de la razón social QIAGEN. La
muestra se diluye con 360 \mul de agua y se trata durante 10
minutos a 55ºC con 40 \mul de proteinasa K. A continuación, la
muestra se centrifuga, el material sobrenadante se trata con etanol
y se aplica sobre una columna Spin que contiene membrana de sílice.
La muestra se pasa por la membrana mediante centrifugación. La
columna Spin se lava dos veces con un tampón de lavado que contiene
isotiocianato de guanidina, adquirible comercialmente - por ejemplo
con el tampón RW1 de la razón social QIAGEN - y dos veces con un
tampón de lavado que contiene alcohol, habitual en el comercio - por
ejemplo tampón RPE de la razón social QIAGEN - y, a continuación,
el ARN se eluye en 60 \mul de agua exenta de RNasa, la cual se
pasa de nuevo por centrifugación por la membrana. Cada 30 \mul del
eluído se separan sobre un gel de agarosa/formaldehído al 1,2%
500 \mul de sangre se almacenan con 500 \mul
de un tampón constituido por 10% (p/v) de oxalato de
tetradeciltrimetilamonio y ácido tartárico 50-500
mM, pH 3 durante 2,5, 24 y 48 horas a la TA. El aislamiento del ARN
tiene lugar tal como se describe en la Fig. 1, con la diferencia de
que adicionalmente el ADN genómico se separa por un tratamiento de
la muestra con DNasa con el "RNase.Free.DNase Set" de la razón
social QIAGEN. El ARN se eluye con 80 \mul de agua exenta de
RNasa. Cada 30 \mul de eluído se separan sobre un gel de
agarosa/formaldehído al 1,2%.
El ARN se estabiliza en sangre durante al menos
72 horas sin degradación o pérdida de rendimiento en una solución
de oxalato de tetradeciltrimetilamonio, tamponado con un tampón de
ácido carboxílico, por ejemplo ácido tartárico 250 mM, pH 3,0 (véase
Fig. 3).
2 ml de sangre se mezclan con 2 ml de un tampón
constituido por 10% (p/v) de oxalato de tetradeciltrimetilamonio y
ácido tartárico 250 mM, pH 3 y se almacenan durante 24 - 72 horas a
la TA. El aislamiento del ARN tiene lugar tal como se describe en
el ejemplo 2, con la diferencia de que la muestra antes de la
centrifugación de los complejos -constituidos por el compuesto
catiónico y el ácido nucleico - se trata con un tampón de lisis de
eritrocitos habitual en el comercio - tal como, por ejemplo, el
tampón EL de la razón social QIAGEN GmbH y, después, se incuba
durante 10 minutos sobre hielo. El ARN se eluye con 80 \mul de
agua exenta de RNasa. Cada 30 \mul de eluído se separan sobre un
gel de agarosa/formaldehído al 1,2% o, respectivamente se miden en
un fotómetro espectral. La cantidad de ARN total aislado se obtiene,
después de diluir con agua, por medición fotométrica de la
absorción de luz en una longitud de onda de 260 nm. La pureza del
ARN así obtenido se calcula por determinación fotométrica de la
relación de la absorción de la luz a 260 nm con respecto a la
correspondiente a 280 nm.
2,5 ml de sangre se mezclan con 6,9 ml de un
tampón constituido por 4% de oxalato de tetradeciltrimetilamonio y
ácido tartárico 200 mM, pH 3,7 y se almacenan durante 1 h, 24 h, 48
h y 72 h a la TA. Para el aislamiento del ARN se separan por
centrifugación los complejos de compuesto catiónico y ácido
nucleico. El aglomerado se lava una vez con agua y luego se recoge
en 300 \mul de tampón de lisis - por ejemplo, tampón RLT de la
razón social QIAGEN -. La elaboración posterior de la muestra tiene
lugar tal como se describe en la Fig. 2. Cada 2,5 \mul del total
de ARN se separan a continuación sobre un gel de
agarosa/formaldehído al 1,2%. A continuación el ARN se transfiere a
una membrana de nilón y durante un espacio de tiempo de
aproximadamente 12 h se hibridiza en un tampón fosfato de
sodio/SDS, a 68ºC, con una sonda de ARN anti-sense
marcada radioactivamente para el gen GAPDH (Fig. 4A) o,
respectivamente el gen IFN-\gamma (Fig. 4B). La
membrana se lava con tampones de lavado con concentración salina
decreciente de 2xSSC/0,1%SDS hasta 0,1xSSC/0,1%SDS a una
temperatura de 68ºC. La membrana de nilón se expone a continuación
sobre una película para rayos X. Tanto la señal de
GAPDH-mARN como también la señal de
IFN-\gamma-mRAN permanecen
constantes durante un tiempo de almacenamiento superior a 72 h.
Este resultado confirma que no ha tenido lugar una degradación del
m-ARN durante el citado espacio de tiempo.
Con el procedimiento aquí desarrollado, junto
con el ARN celular, se puede aislar también el ADN genómico de
sangre entera, estabilizado y aislado a continuación por unión a una
membrana de sílice. Fig. 5 muestra que también después de un
almacenamiento de 72 h a TA se aísla ADN de elevado peso molecular
(longitud > 20 kB).
2,5 ml de sangre se mezclan con 6,9 ml de una
solución constituida por oxalato de tetradeciltrimetilamonio al 4%
(p/v) y ácido tartárico 200 mM a pH 3,7 y se almacenan durante 24
h, respectivamente, 72 h a la TA. Para el aislamiento del ADN se
separan por centrifugación los complejos de compuesto catiónico y
ADN. El aglomerado se recoge en 300 \mul de un tampón que
contiene cloruro de sodio y EDTA, después se añaden 360 \mul de un
tampón de hidrocloruro de guanidina obtenible comercialmente - tal
como por ejemplo tampón AL de la razón social QIAGEN -, así como 20
\mul de proteinasa K. Las muestras se incuban durante 10 minutos
a 65ºC, después se añaden 420 \mul de etanol y la muestra se
aplica sobre una columna Spin que contiene una membrana de sílice.
La muestra se pasa a través de la membrana mediante centrifugación.
La membrana de sílice se lava en cada caso una vez con un tampón de
hidrocloruro de guanidina que contiene etanol, obtenible
comercialmente - tal como, por ejemplo, el tampón AW1 de la razón
social QIAGEN - y una vez con un tampón de lavado que contiene
etanol - tal como, por ejemplo, el tampón AW2 de la razón social
QIAGEN. El ADN se eluye con 300 \mul de un tampón TRIS (pH 8).
Respectivamente 5 \mul de eluído se separan sobre un gel de
agarosa/TBE al 8%.
La Fig. 6 muestra que el ADN aislado de forma
correspondiente al Ejemplo 5 se puede emplear en diferentes
reacciones enzimáticas (restricción y amplificación por PCR).
El ADN aislado después de un almacenamiento de
24, respectivamente, 72 horas (véase Ejemplo 5) se emplea en
diferentes reacciones enzimáticas. Esto es una demostración de la
elevada pureza y buena calidad del ADN aislado.
- A)
- En cada caso, 2 \mug del ADN se cortan con 6 U de las enzimas de restricción EcoRI (E), respectivamente Hind III (H) durante 3 h a 37ºC y, a continuación, se separan sobre un gel de agarosa/TBE al 0,8%. Como control se muestra en cada caso el ADN sin cortar.
- B)
- respectivamente 150 o 300 ng del ADN genómico se emplean en una reacción PCR (volumen total 50 \mul) en la cual se amplificó un fragmento de 1,1 kB de longitud del gen hugI. Los productos del PCR se separan en un gel de agarosa/TBE al 1,2%.
Estos experimentos demuestran que la adición de
ácidos carboxílicos y otros aditivos al oxalato de
tetradeciltrimetilamonio mejora claramente la estabilización de ARN
libre en plasma, en comparación con la estabilización de ARN sólo
con oxalato de tetradeciltrimetilamonio.
Para la preparación de las soluciones utilizadas
en este experimento se mezcla una solución patrón de 30% de oxalato
de tetradeciltrimetilamonio, con respectivamente una solución patrón
de 0,5 M de ácido tartárico, ácido cítrico, ácido tartrónico, ácido
succínico, sulfato de amonio o ácido fosfórico para dar una
concentración final de 2% o 4% de oxalato de
tetradeciltrimetilamonio, y 200 mM del aditivo. La solución patrón
de los aditivos, antes de la mezcladura con oxalato de
tetradeciltrimetilamonio, se ajustan al valor de pH indicado
mediante lejía de sodio. Como control se utiliza una solución de
oxalato de tetradeciltrimetilamonio al 5% sin adición de
aditivo.
Respectivamente 0,5 ml de cada una de las
soluciones así preparadas se dispone previamente en un recipiente
Eppendorf de 2 ml, 15 \mul de ARN completo de células Hela, el
cual se aísla antes, por ejemplo mediante un equipo para
aislamiento de ARN obtenible comercialmente (por ejemplo equipo de
aislamiento de ARN RNeasy® Maxi-Kits de la razón
social QIAGEN), se pipetea por la tapadera del recipiente Eppendorf.
Se añaden a la solución 0,5 ml de plasma sanguíneo humano, se
cierra la tapadera del recipiente y se invierte cinco veces
rápidamente el recipiente para su mezcladura. Las muestras se
almacenan 1 día a la TA (aproximadamente 20 a 25ºC). Todos los
experimentos se llevaron a cabo en forma de determinaciones
dobles.
Para el aislamiento del ARN se centrifugan las
muestras durante un espacio de tiempo de 3 minutos a 25000xg. El
líquido sobrenadante se retira y sobre el aglomerado se vierte 0,5
ml de un tampón calentado a 60ºC, el cual contiene hidrocloruro de
guanidina y Nanidet P40 pH 7,0, así como proteinasa K. El aglomerado
se disuelve por vibración en un vibrador Vortex y se incuba durante
15 minutos a 50ºC. A continuación se añaden 0,5 ml de una solución
de etanol-Nonidet P40 y la muestra se mezcla en el
Vortex durante un espacio de tiempo de aproximadamente 5 s. La
muestra se aplica a continuación sobre una columna Spin que contiene
una membrana de sílice - tal como, por ejemplo columnas QIAamp de
la razón social QIAGEN - y por centrifugación (1 min a 10.000xg) se
pasa a través de la membrana. El ARN se queda unido a la membrana y
a continuación se lava dos veces con un tampón de lavado que
contiene alcohol, por ejemplo tampón AW2 de la razón social QIAGEN.
Los tampones de lavado se llevan entonces a través de la membrana en
cada caso por centrifugación (1 minuto a 10.000xg). A continuación
del lavado con el tampón de lavado que contiene alcohol la membrana
se seca, sin adición de tampón, por una centrifugación (3 minutos
de máx. rpm, aquí 25.000xg. Para la elución se pipetean sobre la
membrana 30 \mul de agua exenta de RNasa para desprender de la
membrana el ARN purificado. El eluído se pasa por la membrana por
centrifugación (1 minuto a 10.000xg) y con el fin de una elución
completa el proceso de elución se repite aún una vez.
El ARN aislado se analiza sobre geles de agarosa
que fueron teñidos con bromuro de etidio. Para ello se preparan,
por ejemplo, geles de
MOPS-agarosa-formaldehído al 1,0%.
Se emplean respectivamente 30 \mul de eluído. El resultado se
reproduce en la Fig. 7. La carga de las huellas de gel se recopila
en la Tabla 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La huella 45 contiene para la comparación de la
calidad del ARN de las muestras individuales 3,75 \mug del ARN
completo de células Hela empleado para estos ensayos.
La separación por electroforesis en gel del ARN
completo de Hela empleado para este experimento muestra después de
la tinción con bromuro de etidio las bandas intactas 28S y 18S de
rARN. La superior de las bandas de ARN visibles (28S rARN) es en
este caso claramente más intensa y gruesa que la banda inferior de
rARN (18S rARN), lo que representa una característica típica de ARN
intacto, no degradado. La comparación del ARN completo de Hela,
almacenado por un día en plasma mezclado con 5% de oxalato de
tetradeciltrimetilamonio sin aditivo, con el ARN que fue aislado
después de un almacenamiento por un día a partir de plasma mezclado
con oxalato de tetradeciltrimetilamonio y diferentes aditivos,
muestra claramente que la adición de adtivos mejora la
estabilización de ARN. Si se añade ARN sin la adición de un
compuesto estabilizante al plasma, esto conduce en pocos minutos,
de forma conocida, a una degradación total del ARN.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos experimentos muestran que el ARN por las
mezcladuras en plasma de oxalato de tetradeciltrimetilamonio y
aditivo se estabiliza al menos durante 14 días.
Para la preparación de las soluciones utilizadas
en este experimento se mezcla una solución patrón de 30% de oxalato
de tetradeciltrimetilamonio, con respectivamente una solución patrón
de 0,5 M de ácido tartárico pH 3 o ácido tartrónico pH 3 para dar
una concentración final de 6% o 8% de oxalato de
tetradeciltrimetilamonio, y 200 mM del aditivo.
Respectivamente 0,5 ml de cada una de las
soluciones así obtenidas se dispone previamente en un recipiente
Eppendorf de 2 ml. 15 \mug de ARN completo de células Hela, el
cual se aísla antes, por ejemplo mediante un equipo para
aislamiento de ARN obtenible comercialmente -como por ejemplo el
Maxi-Kit RNeasy® de la razón social QIAGEN), se
pipetea en la tapadera del recipiente Eppendorf. Se añaden a la
solución 0,5 ml de plasma sanguíneo humano, se cierra la tapadera
del recipiente y se invierte cinco veces rápidamente el recipiente
para su mezcladura. Las muestras se almacenan 3, 7, 10 y 14 días a
la TA (aproximadamente 20 a 25ºC). Todos los experimentos se
llevaron a cabo en forma de determinaciones dobles.
El aislamiento del ARN se efectúa tal como se
describe en el Ejemplo 7.
El ARN aislado se analiza sobre geles de agarosa
que fueron teñidos con bromuro de etidio. Para ello se preparan,
por ejemplo, geles de
MOPS-agarosa-formaldehído al 1,0%.
Se emplean respectivamente 30 \mul del eluído. El resultado se
reproduce en la Fig. 8. La carga de las huellas de gel se recopila
en la Tabla 3.
La huella "K" contiene para la comparación
de la calidad del ARN de las muestras individuales 3,75 \mug del
ARN completo de células Hela empleado para estos ensayos.
La separación por electroforesis en gel del ARN
completo de Hela empleado para este experimento muestra después de
la tinción con bromuro de etidio las bandas intactas 28S y 18S del
rARN, aún después de un almacenamiento de hasta 14 días del ARN
completo de Hela en plasma, el cual fue mezclado con oxalato de
tetradeciltrimetilamonio y ácido tartárico o, respectivamente,
ácido tartrónico, pH 3.
Estos experimentos muestran que la
estabilización de ARN por mezclas de oxalato de
tetradeciltrimetilamonio y aditivos es posible también en volúmenes
de plasma más elevados.
Para la preparación de las soluciones utilizadas
en este experimento se mezcla una solución patrón de 30% de oxalato
de tetradeciltrimetilamonio con respectivamente una solución patrón
de 0,5 M de ácido tartárico a pH 3 o pH 4, ácido tartrónico a pH 3
o pH 4 o de ácido fosfórico a pH 3 o pH 4 para dar una concentración
final de 4% de oxalato de tetradeciltrimetilamonio y 200 mM del
aditivo.
Respectivamente 1 ml de cada una de las
soluciones así obtenidas se dispone previamente en un recipiente
Eppendorf de 2 ml. 15 \mug de ARN completo de células Hela, el
cual se aísla antes, por ejemplo mediante el equipo para el
aislamiento de ARN Maxi-Kit RNeasy® de la razón
social QIAGEN), se pipetea en la tapadera del recipiente Eppendorf.
Se añaden a la solución 1 ml de plasma sanguíneo humano, se cierra
la tapadera del recipiente y se invierte el recipiente cinco veces
rápidamente para su mezcladura. Las muestras se almacenan 3 días a
la TA (aproximadamente 20 a 25ºC). Todos los experimentos se
llevaron a cabo en forma de determinaciones dobles.
El aislamiento del ARN se efectúa tal como se
describe en el Ejemplo 7.
El ARN aislado se analiza sobre geles de agarosa
que fueron teñidos con bromuro de etidio. Para ello se preparan,
por ejemplo, geles de
MOPS-agarosa-formaldehído al 1,0%.
Se emplean respectivamente 30 \mul del eluído. El resultado se
reproduce en la Fig. 9. La carga de las huellas de gel se recopila
en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La huella 13 contiene para la comparación de la
calidad del ARN de las muestras individuales 3,75 \mug del ARN
completo de células Hela empleado para estos ensayos.
La separación por electroforesis en gel del ARN
completo de Hela empleado para este experimento muestra después de
la tinción con bromuro de etidio las bandas intactas 28S y 18S del
rARN. Por consiguiente, el ARN se estabiliza también en mayores
volúmenes de plasma por medio de la mezcla de oxalato de
tetradeciltrimetilamonio y aditivo.
Estos experimentos muestran que mezclas de
oxalato de tetradeciltrimetilamonio y diferentes aditivos hacen
posible la estabilización de ARN en células Hela durante un tiempo
de almacenamiento de hasta 14 días a la TA.
Para la preparación de las soluciones utilizadas
en este experimento se mezcla una solución patrón de 20% o 30% de
oxalato de tetradeciltrimetilamonio con respectivamente una solución
patrón de 0,5 M de ácido tartárico, ácido cítrico, ácido
tartrónico, sulfato de amonio o ácido fosfórico para dar una
concentración final de 2% o 4% de oxalato de
tetradeciltrimetilamonio y 200 mM del aditivo. Las soluciones patrón
de los aditivos se ajustan al valor de pH indicado antes de la
mezcladura con oxalato de tetradeciltrimetilamonio mediante lejía
de sodio o, respectivamente ácido sulfúrico.
Respectivamente 1x10^{6} células Hela, que
previamente se cosecharon directamente del cultivo celular y se
lavaron con PBS, se aglomeran por centrifugación (1 minuto a 120xg)
y el sobrenadante se retira. A las células se añaden
respectivamente 300 \mul de las soluciones citadas en la Tabla 4 y
las muestras se mezclan mediante el Vortex, al tiempo que se las
vuelve a suspender. Las muestras se almacenan 3, 7, 10 y 14 días a
la TA (aproximadamente 20 a 25ºC). Todos los experimentos se
llevaron a cabo en forma de determinaciones dobles.
Para el aislamiento del ARN las células se
aglomeran por centrifugación durante 3 minutos a 1200xg y el líquido
sobrenadante se retira. El aglomerado se vuelve a suspender en 600
\mul de un tampón de isotiocianato-guanidina
habitual en el comercio- tal como, por ejemplo tampón RLT de la
razón social QIAGEN - por múltiples succiones y expulsiones con la
pipeta o por Vortex durante un espacio de tiempo de aproximadamente
10 s o más. A continuación se añade 1 volumen (600 \mul) de
etanol al 70% y se mezcla por múltiples succiones y expulsiones con
pipeta o por Vortex durante un espacio de tiempo de aproximadamente
5 s. A continuación, el lisado se aplica sobre una columna Spin que
contiene una membrana de sílice, habitual en el comercio - tal como,
por ejemplo columnas RNeasy de la razón social QIAGEN - y por
centrifugación (1 min a 10.000xg) se pasa a través de la membrana.
El ARN se queda unido a la membrana y a continuación se lava con un
primer tampón de lavado que contiene isotiocianato y guanidina
habitual en el comercio, por ejemplo tampón RW1 de la razón social
QIAGEN - y después con un segundo tampón que contiene alcohol - por
ejemplo RPE de la razón social QIAGEN. En este caso los tampones de
lavado se pasan a través de la membrana en cada caso por
centrifugación (1 minuto a 10.000xg). El líquido de lavado con el
segundo tampón de lavado que contiene alcohol se repite con un
volumen más bajo, por lo que al mismo tiempo la membrana se seca
por la centrifugación (2 minutos de máx. rpm, aquí 20.000xg). Para
la elución se pipetean sobre la membrana 40 \mul de agua exenta
de RNasa, para desprender de la membrana el ARN purificado. El
eluído se pasa por la membrana por centrifugación (1 minuto a
10.000xg) y con el fin de una elución completa se repite aún una vez
el proceso de elución.
El ARN aislado se analiza sobre geles de agarosa
que se han teñido con bromuro de etidio. Para ello se preparan, por
ejemplo, geles de
MOPS-agarosa-formaldehído al 1,0%.
Se emplean respectivamente 20 \mul del eluído. El resultado se
reproduce en la Fig. 10. Las muestras se recopilan en la Tabla 5,
habiéndose llevado a cabo y representado todas las pruebas 2 veces
a excepción de las pruebas 14, 40, 66 y 92 que se efectuaron y
representaron 1 vez.
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\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras "K" indican un ARN completo,
el cual se aísla sin almacenamiento previo con ayuda de un equipo
de aislamiento - tal como, por ejemplo el Mini Kit RNeasy® de la
razón social QIAGEN - a partir de respectivamente 1 x 10^{6}
células Hela (= control positivo). Las muestras "a", "b",
"c" y "d" presentan un ARN completo, que se aísla después
de 3, 7, 10, respectivamente 14 días de almacenamiento de
respectivamente 1 x 10^{6} células Hela en PBS - sin aditivos -
tal como se describió anteriormente.
La cantidad de ARN completo se obtiene después
de diluir con agua, por medición fotométrica de la absorción de luz
en una longitud de onda de 260 nm. La pureza del ARN así obtenido se
halla por determinación fotométrica de la relación de la absorción
de la luz a 260 nm con respecto a la correspondiente a 280 nm. Los
resultados de los aislamientos se representan en la siguiente Tabla
6. Se indican en cada caso los valores medios de la determinación
doble.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La separación por electroforesis en gel muestra
después de la tinción con bromuro de etidio las bandas intactas de
28S y 18S del rARN en los controles positivos. La superior de las
bandas de ARN (28S rARN) es en este caso claramente más intensa y
gruesa que la banda inferior de rARN (18S rARN), lo que representa
una característica típica de ARN intacto, no degradado. Después de
un almacenamiento durante 3 días de las células en PBS se ha
degradado en parte el ARN, puesto que las dos bandas de rARN
muestran la misma intensidad y el ARN es claramente menos visible.
Después de un almacenamiento de 7 días o más ya no es visible más
ARN. En contraposición con esto, ARN en células Hela por oxalato de
tetradeciltrimetilamonio mezclado con diferentes aditivos se
estabiliza hasta 14 días. Esto se confirma por el rendimiento y
pureza del ARN determinado por medición de la DO. La estabilización
se influye por el valor del pH. En este caso, se prefieren valores
finales del pH en la mezcla superiores a 4, es decir después de la
mezcladura de oxalato de tetradeciltrimetilamonio y aditivo con
valor definido de pH.
Estos experimentos muestran que la
estabilización de ARN en células Hela mediante mezclas de oxalato de
tetradeciltrimetilamonio con aditivos tiene lugar
independientemente del número de celas empleado.
Para la preparación de la solución utilizada en
este experimento se mezcla una solución patrón de 20% de oxalato de
tetradeciltrimetilamonio con una solución patrón de 0,5 M de ácido
tartárico a pH 6 para dar una concentración final de 4% de oxalato
de tetradeciltrimetilamonio y 200 mM del aditivo. La solución patrón
del aditivo, antes de la mezcladura con el oxalato de
tetradeciltrimetilamonio, se ajusta mediante lejía de sodio al valor
de pH indicado.
\global\parskip0.850000\baselineskip
Respectivamente 1x10^{5}, 5x10^{5},
1x10^{6} y 5x10^{6} células Hela, que directamente antes se
cosecharon del cultivo celular y se lavaron con PBS, se aglomeran
por centrifugación (1 minuto a 120xg) y el sobrenadante se retira.
A las células se añaden respectivamente 300 \mul de solución con
4% de oxalato de tetradeciltrimetilamonio y 200 mM de ácido
tartárico y las muestras se mezclan mediante el Vortex al tiempo que
se vuelve a suspender las células. Las muestras se almacenan 15
minutos y, respectivamente 1 día a la TA (aproximadamente 20 a
25ºC). Todos los experimentos se llevan a cabo en forma de
determinaciones dobles.
El aislamiento del ARN se efectúa tal como se
describe en el Ejemplo 10.
Como controles se emplean respectivamente
1x10^{5}, 5x10^{5}, 1x10^{6} y 5x10^{6} células Hela, sin
tratamiento previo con 4% de oxalato de tetradeciltrimetilamonio,
200 mM de ácido tartárico y sin almacenamiento, para el aislamiento
de ARN tal como se describe anteriormente.
El ARN aislado se analiza sobre geles de agarosa
que fueron teñidos con bromuro de etidio. Para ello se preparan,
por ejemplo, geles de
MOPS-agarosa-formaldehído al 1,0%.
Se emplean respectivamente 20 \mul del eluído. El resultado se
reproduce en la Fig. 11. Las muestras se recopilan en la Tabla 7
habiéndose llevado a cabo y representado todas las pruebas
respectivamente 2 veces.
La cantidad de ARN completo aislado se obtiene
después de diluir con agua, por medición fotométrica de la
absorción de la luz en una longitud de onda de 260 nm. La pureza del
ARN así obtenido se halla por la determinación fotométrica de la
relación de la absorción de la luz a 260 nm con respecto a la
correspondiente a 280 nm. Los resultados de los aislamientos se
representan en la siguiente Tabla 8. Se indican en cada caso los
valores medios de la determinación doble.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La separación por electroforesis en gel muestra
después de la tinción con bromuro de etidio las bandas intactas 28S
y 18S del rARN en las muestras de control almacenadas como también
en las no almacenadas. En este caso, no se reconoce diferencia
alguna entre los controles no almacenados y las muestras
almacenadas. Igualmente, el rendimiento y la pureza del ARN
determinadas por medición de la DO confirma que la estabilización
del ARN en diferentes cantidades de células tiene lugar en igual
medida, sin reducción de los rendimientos en ARN o la pureza del
ARN. Los cocientes E_{260}/E_{280} que disminuyen al aumentar el
número de células se deben a que las mediciones se llevaron a cabo
en agua y no en un sistema tamponado.
\global\parskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos experimentos demuestran que se puede
emplear ARN en diferentes tipos de células. Los macrófagos empleados
en este experimento contienen más RNasas que las células Hela
utilizadas anteriormente, por lo cual se fuerza la degradación de
ARN en las células.
Para la preparación de las soluciones utilizadas
en este experimento se mezcla una solución patrón de 20% de oxalato
de tetradeciltrimetilamonio con una solución patrón de 0,5 M de
ácido tartárico a pH 5, 0,5 M de ácido tartrónico pH 5 o 0,5 M de
ácido fosfórico pH 5 para dar una concentración final de 4% de
oxalato de tetradeciltrimetilamonio, 200 mM del aditivo. La
solución patrón del aditivo, antes de la mezcladura con el oxalato
de tetradeciltrimetilamonio se ajusta mediante lejía de sodio al
valor de pH indicado.
Respectivamente 1x10^{6} células Hela, que
directamente antes se cosechan del cultivo celular y se lavan con
PBS, se aglomeran por centrifugación (1 minuto a 120xg) y el
sobrenadante se retira. A las células se añaden respectivamente 300
\mul de solución con 4% de oxalato de tetradeciltrimetilamonio y
200 mM de aditivo y las muestras se mezclan mediante el Vortex al
tiempo que se vuelven a suspender las células. Las muestras se
almacenan 2, días, 6 días, 9 días y, respectivamente, 14 días a la
TA (aproximadamente 20 a 25ºC). Todos los experimentos se llevan a
cabo en forma de determinaciones dobles.
El aislamiento del ARN se efectúa tal como se
describe en el Ejemplo 10.
El ARN aislado se analiza sobre geles de agarosa
que fueron teñidos con bromuro de etidio. Para ello se preparan,
por ejemplo, geles de
MOPS-agarosa-formaldehído al 1,0%.
Se emplean respectivamente 20 \mul del eluído. El resultado se
reproduce en la Fig. 12. Las muestras se recopilan en la Tabla 9
habiéndose llevado a cabo y representado todas las pruebas
respectivamente 2 veces.
Las huellas 25 y 26 muestran un ARN completo que
se aísla sin previo almacenamiento de los macrófagos con ayuda de
un equipo de aislamiento adquirible comercialmente - tal como, por
ejemplo, Mini Kits RNeasy® de la razón social QIAGEN - a partir de
respectivamente 1 x 10^{6} macrófagos (= control positivo).
La cantidad de ARN completo aislado se obtiene,
después de diluir con agua, por medición fotométrica de la
absorción de la luz en una longitud de onda de 260 nm. La pureza del
ARN así obtenido se halla por la determinación fotométrica de la
relación de la absorción de la luz a 260 nm con respecto a la
correspondiente a 280 nm. Los resultados de los aislamientos se
representan en la siguiente Tabla 10. Se indican en cada caso los
valores medios de la determinación doble.
La separación por electroforesis en gel muestra
después de la tinción con bromuro de etidio las bandas intactas 28S
y 18S del rARN en las muestras almacenadas, así como en las no
almacenadas, no pudiéndose reconocer ni tampoco después de un
almacenamiento de 14 días ninguna degradación del ARN. Del mismo
modo, los rendimientos y la pureza del ARN determinados por
medición fotométrica permanecen inalterados durante el
almacenamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Estos experimentos muestran que mediante mezclas
de oxalato de tetradeciltrimetilamonio y aditivo también se puede
estabilizar ARN en células adherentes. En este caso, la
estabilización tiene lugar también cuando el medio en el que se
encuentran las células no se retira y la mezclas de oxalato de
tetradeciltrimetilamonio y aditivo se añade al medio. Las células
en el medio se pueden considerar en este caso como modelo para
células en líquidos
corporales.
corporales.
Para la preparación de las soluciones utilizadas
en este experimento se pesan el oxalato de tetradeciltrimetilamonio
y el respectivo aditivo ácido tartárico o, respectivamente, sulfato
de amonio, y disuelven en agua para dar una concentración final de
4% de oxalato de tetradeciltrimetilamonio y 200 mM aditivo. El pH de
la solución en el caso de 4% de oxalato de tetradeciltrimetilamonio
y 200 mM de ácido tartárico se ajusta con lejía de sodio y, en el
caso de 4% de oxalato de tetradeciltrimetilamonio y 200 mM de
sulfato de amonio, con ácido sulfúrico, en ambos casos a pH 5. Las
células Hela se cultivan en placas de 6 pocillos con respectivamente
2 ml de medio. Las células crecen de forma adherente, es decir se
adhieren al fondo del pocillo. Para la estabilización del ARN en
las células se añaden respectivamente a cada pocillo 10 ml de
oxalato de tetradeciltrimetilamonio al 4% y ácido tartárico 200 mM
o, respectivamente, oxalato de tetradeciltrimetilamonio al 4% y
sulfato de amonio 200 mM pH 5, y las placas se almacenan durante 4
días a la TA. Como control negativo se almacena durante 4 días a la
TA un pocillo con medio pero sin adición de una mezcla de oxalato de
tetradeciltrimetilamonio al 4%, aditivo 200 mM.
Como control positivo, a partir de un pocillo se
aísla el ARN de las células Hela sin previo almacenamiento, con
ayuda de un equipo para aislamiento habitual en el comercio - tal
como, por ejemplo, Mini Kits RNeasy® de la razón social QIAGEN -.
Para ello, se retira totalmente el medio de las células y se mezcla
con 350 \mul de tampón de lisis RLT (componente del kit RNeasy).
Las células se separan del fondo del pocillo con una rasqueta y el
lisado se transvasan a un homogeneizador denominado "Shredder"
- tal como, por ejemplo el QIAshredder de la razón social QIAGEN-.
Por centrifugación durante 2 minutos a 14.000 rpm se pasa el lisado
a través del Shredder homogeneizando así la muestra. El líquido
pasado se mezcla con 70% de etanol y tal como se describe en el
Ejemplo 10 se aísla el ARN.
Al cabo de 4 días de almacenamiento de las
células en un medio mezclado con 4% de oxalato de
tetradeciltrimetilamonio, aditivo 200 mM se recogen totalmente las
células, ahora desprendidas, junto con el sobrenadante y se
centrifugan durante 5 minutos a 3.000xg. Los líquidos sobrenadantes
se separan y el aglomerado de células se utiliza para el
aislamiento de ARN, tal como se describe en el Ejemplo 10.
Al cabo de 4 días de almacenamiento de las
células en un medio sin 4% de oxalato de tetradeciltrimetilamonio,
aditivo 200 mM (= control negativo) se aísla el ARN tal como se
describe para el control positivo.
El ARN aislado se analiza sobre geles de agarosa
que fueron teñidos con bromuro de etidio. Para ello se preparan,
por ejemplo, geles de
MOPS-agarosa-formaldehído al 1,0%.
Se emplean respectivamente 20 \mul del eluído. El resultado se
reproduce en la Fig. 13. La huella 1 contiene ARN completo, el cual
se aísla después de un almacenamiento de las células en el medio
mezclado con 4% de oxalato de tetradeciltrimetilamonio, ácido
tartárico 200 mM, pH 5. La huella 2 muestra ARN completo, el cual
se aísla después de un almacenamiento de las células en el medio
mezclado con 4% de oxalato de tetradeciltrimetilamonio, fosfato de
amonio 200 mM, pH 5. La huella 3 muestra un ARN completo, el cual
se aísla después de un almacenamiento de las células sólo en el
medio, y la huella 4 muestra un ARN completo, el cual se aísla como
control positivo sin previo almacenamiento.
La cantidad de ARN completo aislado se obtiene,
después de diluir con agua, por medición fotométrica de la
absorción de la luz en una longitud de onda de 260 nm. La pureza del
ARN así obtenido se halla por la determinación fotométrica de la
relación de la absorción de la luz a 260 nm con respecto a la
correspondiente a 280 nm. Los resultados de los aislamientos se
representan en la siguiente Tabla 11.
La separación por electroforesis en gel muestra
después de la tinción con bromuro de etidio las bandas intactas 28S
y 18S del rARN en la muestra no almacenada, así como en las muestras
almacenadas con mezclas de oxalato de tetradeciltrimetilamonio y
aditivo. Por el contrario, el ARN en las células que se almacenan en
medio sin adición de oxalato de tetradeciltrimetilamonio ni aditivo
está degradado casi totalmente. Del mismo modo, no existe diferencia
alguna entre muestras no almacenadas y estabilizadas en cuanto al
rendimiento y la pureza de ARN determinados por medición de la DO,
mientras que el rendimiento y la pureza del ARN de las muestras
almacenadas en el medio sin adición de oxalato de
tetradeciltrimetilamonio y aditivo son claramente más
reducidos.
Estos experimentos muestran que oxalato de
tetradeciltrimetilamonio mezclado con diferentes aditivos también
es adecuado para estabilizar el ARN de tejidos.
Para la preparación de las soluciones utilizadas
en este experimento se mezcla una solución patrón de 20% de oxalato
de tetradeciltrimetilamonio con respectivamente una solución patrón
0,5 M de ácido tartárico, ácido cítrico, ácido tartrónico, sulfato
de amonio, fosfato de potasio, ácido oxálico o ácido fosfórico hasta
una concentración final de 4% de oxalato de
tetradeciltrimetilamonio y 200 mM de aditivo. Las soluciones patrón
de los aditivos, antes de la mezcladura con el oxalato de
tetradeciltrimetilamonio se ajusta mediante lejía de sodio o ácido
sulfúrico (o sulfato de amonio)
o lejía de potasio o, respectivamente, ácido fosfórico (o fosfato de potasio) al valor de pH respectivamente indicado.
o lejía de potasio o, respectivamente, ácido fosfórico (o fosfato de potasio) al valor de pH respectivamente indicado.
Para este experimento se utiliza tejido renal de
ratón, el cual inmediatamente después de su extracción se congeló
en nitrógeno líquido y, a continuación, se almacenó a -70ºC.
Aproximadamente 70 a 90 mg del tejido se mezclan respectivamente,
congelados, con 500 \mul por cada 10 mg de tejido con el tampón
citado en la Tabla 12 e inmediatamente se homogeneizan mediante un
homogeneizador rotor-estátor - tal como, por ejemplo
el "Polytron" de la razón social Kinematica - durante 30 a 60
s. De este homogeneizado se toman partes alícuotas de
respectivamente 500 \mul de solución, que, por consiguiente,
corresponden a 10 mg de tejido. Las muestras se almacenan durante
un día a la TA.
A continuación del almacenamiento las muestras
se centrifugan durante 3 minutos a 10.000xg y el sobrenadante se
retira. El aglomerado se disuelve totalmente en 600 \mul de un
tampón de guanidina-isotiocianato habitual en el
comercio - tal como, por ejemplo, tampón RLT de la razón social
QIAGEN - mediante el Vortex. A continuación, se añade 1 volumen
(600 \mul) de etanol al 70% y se mezcla por varias succiones y
expulsiones de la pipeta o por el Vortex durante un espacio de
tiempo de casi 5 s. El lisado se aplica a continuación sobre una
columna "spin" que contiene una membrana de sílice habitual en
el comercio - tal como, por ejemplo, las columnas RNeasy de la
razón social QIAGEN - y por centrifugación (1 min a 10.000xg) se
pasa por la membrana. El ARN queda ligado a la membrana y, a
continuación, se lava con un primer tampón de lavado que contiene
guanidina-isotiocianato habitual en el comercio -
por ejemplo con el tampón RW1 de la razón social QIAGEN - y después
con un segundo tampón de lavado que contiene alcohol - por ejemplo
con el tampón RPE de la razón social QIAGEN -. En este caso, los
tampones de lavado pasan respectivamente por centrifugación (1 min a
10.000xg) a través de la membrana. El lavado con el segundo tampón
de lavado que contiene alcohol se repite con un volumen más bajo,
secándose al mismo tiempo por la centrifugación la membrana (2 min
a rpm máximo, aquí 20.000 rpm). Para la elución se pipetean sobre
la membrana 40 \mul de agua exenta de RNasa para separar por
disolución el ARN purificado. Por centrifugación (1 min a 10.000xg)
se pasa
el eluído a través de la membrana y con el fin de una elución completa se vuelve a repetir otra vez la etapa de elución.
el eluído a través de la membrana y con el fin de una elución completa se vuelve a repetir otra vez la etapa de elución.
El ARN aislado se analiza sobre geles de agarosa
que fueron teñidos con bromuro de etidio. Para ello se preparan,
por ejemplo, geles de
MOPS-agarosa-formaldehído al 1,0%.
Se emplean respectivamente 20 \mul del eluído. El resultado se
reproduce en la Fig. 14. Las muestras se recopilan en la Tabla 12
habiéndose llevado a cabo y representado todas las pruebas
respectivamente 2 veces.
Las muestras "K" presentan un ARN completo,
el cual se aísla sin almacenamiento previo con ayuda de un equipo
de aislamiento (RNeasy® de la razón social QIAGEN GmbH) a partir de
10 mg de tejido renal congelado (= control positivo). Las huellas
"N" muestran un ARN completo, el cual se aísla tras un
almacenamiento de un día a partir de 10 mg de tejido renal seco, es
decir sin adición de disolvente, con ayuda del Mini Kit RNeasy® de
la razón social QIAGEN) (= control negativo).
La separación por electroforesis en gel muestra
después de la tinción con bromuro de etidio las bandas intactas 28S
y 18S del rARN en el control positivo. El control negativo, tejido
renal almacenado sin solución estabilizante, muestra ARN totalmente
degradado. En contraposición con esto, después del almacenamiento de
las muestras en oxalato de tetradeciltrimetilamonio mezclado con
diferentes aditivos como en el control positivo, se pueden ver las
bandas intactas del rARN. La estabilización está influenciada en
este caso por el valor del pH. En el caso de la estabilización de
ARN en tejido se prefieren valores finales del pH de la solución
estabilizante superiores a 4, después de la mezcladura de oxalato
de tetradeciltrimetilamonio y aditivo con valor pH definido.
Estos experimentos demuestran que mediante
oxalato de tetradeciltrimetilamonio mezclado con diferentes
aditivos, junto a ARN también se puede estabilizar el ADN en
tejidos. En este caso, a partir de una muestra se puede aislar
paralelamente junto a ARN también ADN.
Para la preparación de las soluciones utilizadas
en este experimento se mezcla una solución patrón de 20% de oxalato
de tetradeciltrimetilamonio con una solución patrón de ácido cítrico
0,5 M, pH 5, ajustada con lejía de sodio hasta una concentración
final de oxalato de 4% de tetradeciltrimetilamonio y 200 mM de
aditivo.
Para este experimento se utiliza tejido renal de
ratón, el cual inmediatamente después de su extracción se congeló
en nitrógeno líquido y, a continuación, se almacenó a -70ºC.
Aproximadamente 80 mg de tejido se mezclan, congelados, con 4,2 ml
de oxalato de tetradeciltrimetilamonio al 4% y 200 mM de ácido
cítrico, pH 5 e inmediatamente se homogeneizan mediante un
homogeneizador rotor-estátor - tal como, por ejemplo
el "Polytron" de la razón social Kinematica - durante 30 a 60
s. De este homogeneizado se toman partes alícuotas de
respectivamente 500 \mul de solución, que, por consiguiente,
corresponden a 10 mg de tejido. Las muestras se almacenan durante un
día a la TA.
A continuación del almacenamiento las muestras
se centrifugan durante 3 minutos a 10.000xg y el sobrenadante se
retira. El aglomerado se disuelve totalmente en 600 \mul de un
tampón de guanidina-isotiocianato habitual en el
comercio - tal como, por ejemplo, tampón RLT de la razón social
QIAGEN - mediante el Vortex. A continuación, se añade 1 volumen
(600 \mul) de etanol al 70% y se mezcla por varias succiones y
expulsiones de pipeta o por el Vortex durante un espacio de tiempo
de casi 5 s. El lisado se aplica a continuación sobre una columna
"spin" habitual en el comercio que contiene una membrana de
sílice - tal como, por ejemplo, las columnas RNeasy de la razón
social QIAGEN - y por centrifugación (1 min a 10.000xg) se pasa por
la membrana. El ARN queda ligado a la membrana y, a continuación,
se puede aislar tal como se describe en el Ejemplo 14. El líquido
pasado (aproximadamente 1200 \mul) se recoge y se mezcla con 200
\mul de etanol al 100% y se mezcla mediante Vortex. Estas
muestras se aplican nuevamente sobre una columna "spin"
habitual en el comercio que contiene una membrana de sílice - tal
como, por ejemplo las columnas QIAamp de la razón social QIAGEN - y
por centrifugación (1 min a 10.000xg) se pasa por la membrana. El
ADN queda ligado a la membrana y, a continuación, se lava con un
primer tampón de lavado de guanidina-isotiocianato
habitual en el comercio - por ejemplo con el tampón RW1 de la razón
social QIAGEN - y después con un segundo tampón de lavado que
contiene alcohol - por ejemplo tampón RPE de la razón social QIAGEN
-. En este caso, los tampones de lavado se llevan respectivamente
por centrifugación (1 min a 10.000xg) a través de la membrana. El
lavado con el segundo tampón de lavado que contiene alcohol se
repite con un volumen más bajo, secándose al mismo tiempo por la
centrifugación la membrana (2 min a rpm máximo, aquí 20.000 rpm).
Para la elución se pipetean sobre la membrana 200 \mul de agua y
se incuba durante 1 minuto a la TA, para separar por disolución el
ADN purificado. Por centrifugación (1 min a 10.000xg) se pasa el
eluído a través de la membrana y con el fin de una elución completa
se vuelve a repetir la etapa de elución.
El ADN aislado se analiza sobre geles de agarosa
que fueron teñidos con bromuro de etidio. Para ello se preparan,
por ejemplo, geles de TBE-agarosa al 0,8%. Se
emplean respectivamente 40 \mul de las muestras 1 a 4 y 20 \mul
de las muestras 5 a 9. El resultado se reproduce en la Fig. 15.
Las huellas 1 y 2 muestran el ADN completo
aislado de forma correspondiente al Ejemplo 15. Las huellas 3 y 4
muestran como referencia 0,1 \mug o, respectivamente, 0,5 \mug
de un ADN completo para la demostración del comportamiento de
elución de un ADN genómico intacto en el gel de agarosa utilizado.
La huella 5 muestra un ADN completo que sin almacenamiento previo
se aisló con ayuda de un equipo de aislamiento obtenible
comercialmente (Mini Kits QIAamp® de la razón social QIAGEN GmbH) a
partir de 10 mg de tejido renal congelado de rata (= control
positivo). Como control negativo servía ADN completo, el cual se
aisló después de un almacenamiento de un día de 10 mg de tejido
renal seco, es decir sin adición de disolvente, o en agua destilada,
con ayuda del Mini Kit QIAamp® de la razón social QIAGEN. Este ADN
se muestra en las huellas 6 y 7 (almacenamiento en seco) y en las
huellas 8 y 9 (almacenamiento en agua destilada).
La separación por electroforesis en gel muestra
ADN de elevado peso molecular, no degradado, tanto en las huellas
que muestran el ADN de referencia, como también en las huellas que
contienen el ADN del control positivo no almacenado. El
almacenamiento del tejido seco o en agua conduce a una degradación
total del ADN. Por el contrario, de las muestras tratadas de forma
correspondiente al Ejemplo 15, permanece intacto y durante el
almacenamiento no se degrada. Por consiguiente, las mezclas de
oxalato de tetradeciltrimetil amonio con aditivos son también
adecuadas para estabilizar ADN en muestras biológicas y permiten,
además, un aislamiento paralelo de ARN y ADN a partir de una
muestra.
Claims (43)
1. Solución estabilizante acuosa que abarca como
componentes un compuesto catiónico de la fórmula general
Y^{+}R_{1}R_{2}R_{3}R_{4}X^{-}
en la cual pueden
significar
Y nitrógeno o fósforo
R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4},
independientemente entre sí, un radical
alquilo(C_{1}-C_{20}) no ramificado o
ramificado y/o un radical
arilo(C_{8}-C_{20}), así como un radical
aralquilo(C_{8}-C_{28}), y
X^{-} un anión de un ácido mono o polibásico,
inorgánico u orgánico,
y al menos un donante de protones,
con la condición de que
en el caso de una solución acuosa de ácido
cítrico al 2,5 a 10% la concentración del compuesto catiónico
cloruro de cetiltrimetilamonio no se sitúe en un intervalo de 2 a
8% en peso, y en el caso de una solución acuosa de ácido acético al
10% la concentración del compuesto catiónico acetato de
dodecildimetilamonio, 2-etilhexanoato de
dodecildimetilamonio, cloruro de dodecildimetilamonio, no sea del 2%
en peso.
2. Solución estabilizante según la
reivindicación 1, caracterizada porque Y significa
nitrógeno.
3. Solución estabilizante según la
reivindicación 1 o 2, caracterizada porque R_{1} significa
un radical alquilo superior y R_{2}, R_{3} y R_{4} significan
respectivamente un grupo metilo.
4. Solución estabilizante según la
reivindicación 3, caracterizada porque R_{1} significa un
radical alquilo con 12, 14 o 16 átomos de carbono y R_{2},
R_{3} y R_{4} significan respectivamente un grupo metilo.
5. Solución estabilizante según una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el anión X^{-}
se elige del grupo de los aniones de hidrácidos halogenados o de
aniones de ácidos orgánicos monobásicos o dibásicos.
6. Solución estabilizante según la
reivindicación 5, caracterizada porque el anión X^{-} se
elige de los aniones del grupo bromuro, cloruro, fosfato, sulfato,
formiato, acetato, propionato, oxalato, malonato, succinato o
citrato.
7. Solución estabilizante según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el donante de
protones se elige del grupo de los ácidos monocarboxílicos
alifáticos saturados, de los ácidos alquenilcarboxílicos
insaturados, de los ácidos
dicarboxílicos(C_{2}-C_{6}) alifáticos
saturados y/o insaturados, de los ácidos cetodicarboxílicos
alifáticos, de los aminoácidos o del grupo de los ácidos minerales o
de sus sales, solos o en combinación.
8. Solución estabilizante según la
reivindicación 7, caracterizada porque como ácido
monocarboxílico alifático se emplea un ácido
alquil(C_{1}-C_{6})carboxílico o
mezclas de estos ácidos.
9. Solución estabilizante según la
reivindicación 7, caracterizada porque se emplean ácido
acético, ácido propiónico, ácido n-butírico, ácido
n-valérico, ácido isovalérico, ácido
etil-metil-acético (ácido
2-metil-butírico), ácido
2,2-dimetilpropiónico (ácido pivalínico), ácido
n-hexanoico, ácido n-octanoico,
ácido n-decanoico, respectivamente ácido
n-dodecanoico (ácido láurico) o mezclas de los
citados ácidos.
10. Solución estabilizante según la
reivindicación 7, caracterizada porque como ácido
alquenilcarboxílico alifático se emplean ácido acrílico (ácido
propenoico), ácido metacrílico, ácido crotónico, ácido
iso-crotónico o ácido vinilacético o mezclas de los
citados ácidos.
11. Solución estabilizante según la
reivindicación 7, caracterizada porque como ácido
dicarboxílico(C_{2}-C_{6}) alifático
saturado se emplea un ácido dicarboxílico del grupo ácido oxálico,
ácido malónico, ácido succínico, ácido glutárico o,
respectivamente, ácido atípico o mezclas de los citados ácidos.
12. Solución estabilizante según la
reivindicación 11, caracterizada porque como donantes de
protones se emplean ácidos dicarboxílicos alifáticos.
13. Solución estabilizante según la
reivindicación 12, caracterizada porque como donantes de
protones se emplean los ácidos dicarboxílicos alifáticos ácido
oxálico o ácido succínico o mezclas de los citados ácidos.
14. Solución estabilizante según la
reivindicación 7, caracterizada porque como donantes de
protones se emplean hidroxiácidos di- y
tri-carboxílicos alifáticos.
15. Solución estabilizante según la
reivindicación 14, caracterizada porque como donantes de
protones se emplean ácido tartrónico, ácido D-(+)-, L-(-)- o DL
málico, ácido (2R, 3R)-(+)-tartárico, (2S,
3S)-(-)-tartárico, ácido
meso-tartárico y ácido cítrico o mezclas de los
citados ácidos.
16. Solución estabilizante según la
reivindicación 7, caracterizada porque como donantes de
protones se emplean ácidos dicarboxílicos insaturados.
17. Solución estabilizante según la
reivindicación 16, caracterizada porque se emplean ácido
maleico y/o ácido fumárico o mezclas de los citados ácidos.
18. Solución estabilizante según la
reivindicación 7, caracterizada porque como donantes de
protones se emplean ácidos tricarboxílicos insaturados.
19. Solución estabilizante según la
reivindicación 18, caracterizada porque como donante de
protones se emplea ácido aconítico.
20. Solución estabilizante según la
reivindicación 7, caracterizada porque como donantes de
protones se emplean ácidos cetodicarboxílicos alifáticos.
21. Solución estabilizante según la
reivindicación 20, caracterizada porque como donante de
protones se emplea ácido mesoxálico o ácido oxálico o mezclas de
los citados ácidos.
22. Solución estabilizante según la
reivindicación 7, caracterizada porque como donantes de
protones se emplean aminoácidos.
23. Solución estabilizante según la
reivindicación 22, caracterizada porque como donantes de
protones se emplean ácido aminoacético (glicina), ácido
\alpha-aminopropiónico (alanina), ácido
\alpha-amino-iso-valérico
(valina), ácido
\alpha-amino-isocaproico (leucina)
y ácido
\alpha-amino-\beta-metilvalérico
(isoleucina) o mezclas de los citados ácidos.
24. Solución estabilizante según una de las
reivindicaciones 1 a 23, caracterizada porque el compuesto
catiónico se presenta en una concentración comprendida en un
intervalo de 0,01% en peso hasta la saturación.
25. Solución estabilizante según la
reivindicación 24, caracterizada porque el compuesto
catiónico se presenta en una concentración comprendida en un
intervalo entre 0,1% en peso hasta la saturación.
26. Solución estabilizante según la
reivindicación 25, caracterizada porque el compuesto
catiónico se presenta en una concentración comprendida en un
intervalo entre 2 y 10% en peso.
27. Procedimiento para la preparación de una de
las soluciones estabilizantes según una de las reivindicaciones 1 a
26, caracterizado porque los componentes individuales se
reúnen en solución acuosa y se mezclan.
28. Utilización de una composición que abarca un
compuesto catiónico de la fórmula general
Y^{+}R_{1}R_{2}R_{3}R_{4}X^{-}
en la cual pueden
significar
Y nitrógeno o fósforo
R_{1}, R_{2}, R_{3} y R_{4},
independientemente entre sí, un radical
alquilo(C_{1}-C_{20}) ramificado o no
ramificado y/o un radical
arilo(C_{6}-C_{20}), así como un radical
aralquilo(C_{8}-C_{28}), y
X^{-} un anión de un ácido inorgánico u
orgánico, mono o polibásico, y al menos un donante de protones para
la estabilización de los ácidos nucleicos.
29. Utilización conforme a la reivindicación 28,
caracterizada porque como ácidos nucleicos se estabilizan
ácidos ribonucleicos (ARN) y ácidos desoxiribonucleicos (ADN).
30. Utilización conforme a la reivindicación 29,
caracterizada porque como ácidos nucleicos se estabilizan
ácidos ribonucleicos (ARN) o ácidos desoxiribonucleicos (ADN) en
forma de nucleótidos monómeros, oligómeros, plásmidos, en forma de
ADN y ARN virales y/o bacterianos, así como ADN y ARN genómicos y no
genómicos de células animales y vegetales o de otros
eucariotas.
31. Utilización conforme a la reivindicación 30,
caracterizada porque como ácidos nucleicos se estabilizan
mARN en forma procesada y no procesada, tARN, mARN, rARN y cADN.
\newpage
32. Composición diagnóstica, que contiene una
solución estabilizante conforme a una de las reivindicaciones 1 a
26.
33. Equipo (kit) para la estabilización de
ácidos nucleicos que contiene una solución estabilizante acuosa
conforma a una de las reivindicaciones 1 a 26.
34. Mezcla que contiene una muestra biológica
que contiene un ácido nucleico y una solución estabilizante acuosa
según una de las reivindicaciones 1 a 26, eventualmente junto a
otros coadyuvantes.
35. Mezcla según la reivindicación 34,
caracterizada porque el valor del pH de la mezcla se sitúa en
un intervalo de 2 a 12.
36. Mezcla según la reivindicación 35,
caracterizada porque el valor del pH de la mezcla se sitúa en
un intervalo de 2 a 10.
37. Mezcla según la reivindicación 36,
caracterizada porque el valor del pH de la mezcla se sitúa en
un intervalo de 3 a 8.
38. Mezcla según la reivindicación 34,
caracterizada porque la muestra biológica que eventualmente
puede contener virus o bacterias puede ser sangre, plasma o
suero.
39. Mezcla según la reivindicación 38,
caracterizada porque el valor del pH de la mezcla se sitúa en
un intervalo de 2 a 6.
40. Mezcla según la reivindicación 39,
caracterizada porque el valor del pH de la mezcla se sitúa en
un intervalo de 3 a 4.
41. Mezcla según la reivindicación 34,
caracterizada porque la muestra biológica que eventualmente
puede contener virus o bacterias se materializa por una punción,
por células, tejidos o bacterias.
42. Mezcla según la reivindicación 41,
caracterizada porque el valor del pH de la mezcla se sitúa en
un intervalo de 3 a 10.
43. Mezcla según la reivindicación 42,
caracterizada porque el valor del pH de la mezcla se sitúa en
un intervalo de 4 a 8.
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