CN1250520C - 由阳离子化合物和质子供体组成的组合物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及组合物在分离和/或稳定诸如原核生物、真菌、原生动物或藻类这样的微生物中或来自它们的核酸中的应用。该组合物包括通式Y+R1R2R3R4X-的阳离子化合物作为必要组分,其中Y可以代表氮或磷;R1、R2、R3和R4可以独立地代表非支链的或支链的C1-C20烷基和/或C6-C20芳基以及C6-C26芳烷基;且X-可以代表与无机或有机一元或多元酸相关的阴离子。
Description
本发明涉及“含有”下列通式的阳离子化合物作为必要组分和至少一种质子供体作为添加剂的组合物在稳定和/或分离诸如原核生物、真菌、原生动物或藻类这样的微生物中或来自它们中的RNA和/或DNA中的新用途:
Y+R1R2R3R4X-
其中Y可以代表氮或磷;
R1、R2、R3和R4可以彼此独立地表示非支链的或支链的C1-C20烷基和/或C6-C20芳基以及C7-C26芳烷基;且
X-可以表示无机或有机一元或多元酸的阴离子。
优选的组合物是所述的阳离子化合物由铵盐组成的那些组合物,其中R1表示高级烷基、优选带有12、14或16个碳原子的高级烷基且R2、R3和R4在每种情况中均表示甲基。
另外优选的是这样一些组合物,其中R1表示芳烷基-优选苄基;R2表示高级烷基、优选带有12、14或16个碳原子的高级烷基且R3和R4表示甲基。
优选的阴离子是溴离子、氯离子、磷酸根离子、硫酸根离子、甲酸根离子、乙酸根离子、丙酸根离子、草酸根离子、丙二酸根离子或琥珀酸根离子。
C1-C6烷基一般指的是带有1-6个碳原子的支链或非支链的烃基,所述的烃基可以被一个或多个卤原子、优选氟所取代或不被它们取代,所述的卤原子彼此可以相同或不同。所提及的烃基实例如下:
甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基(异丙基)、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基;1,1-二甲基乙基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1,1,2-三甲基丁基、1,2,2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基和1-乙基-2-甲基丙基。
术语高级烷基指的是可以被一个或多个卤原子、优选氟所取代或不被它们取代的支链或非支链C7-C20-烷基,所述的卤原子彼此可以相同或不同。所提及的烃基实例如下:支链或非支链的庚基、辛基、壬基、癸基、十一基、十二基、十四基、十六基、二十二基和二十烷基。
C3-C6-链烯基一般指的是带有3-6个碳原子与一个或可能是多个双键的支链或非支链烃基,它们可以被一个或多个卤原子、优选氟取代或不被它们取代,所述的卤原子彼此可以相同或不同。所提及的烃基实例如下:
2-丙烯基(烯丙基)、2-丁烯基、3-丁烯基、1-甲基-2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、1-甲基-2-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、3-甲基-2-丁烯基、1-甲基-3-丁烯基、2-甲基-3-丁烯基、3-甲基-3-丁烯基、1,1-二甲基-2-丙烯基、1,2-二甲基-2-丙烯基、1-乙基-2-丙烯基、2-己烯基、3-己烯基,4-己烯基,5-己烯基,1-甲基-2-戊烯基,2-甲基-2-戊烯基,3-甲基-2-戊烯基,4-甲基-2-戊烯基、1-甲基-3-戊烯基、2-甲基-3-戊烯基、3-甲基-3-戊烯基、4-甲基-3-戊烯基、1-甲基-4-戊烯基、3-甲基-4-戊烯基、4-甲基-4-戊烯基、1,1-二甲基-2-丁烯基、1,1-二甲基-2-丁烯基、1,1-二甲基-3-丁烯基、1,2-二甲基-2-丁烯基、1,2-二甲基-3-丁烯基、1,3-二甲基-2-丁烯基、1,3-二甲基-3-丁烯基、2,2-二甲基-3-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-3-丁烯基、1-乙基-2-丁烯基、1-乙基-3-丁烯基、2-乙基-1-丁烯基、2-乙基-2-丁烯基、2-乙基-3-丁烯基、1,1,2-三甲基-2-丙烯基、1-乙基-1-甲基-2-丙烯基和1-乙基-2-甲基-2-丙烯基。
C3-C6-炔基一般指的是带有3-6个碳原子与一个或可能是多个三键的支链或非支链烃基,它们可以被一个或多个卤原子、优选氟取代或不被它们取代,所述的卤原子彼此可以相同或不同。所提及的烃基实例如下:
2-丙炔基(丙炔基)、2-丁炔基、3-丁炔基、1-甲基-2-丙炔基、2-甲基-2-丙炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-甲基-2-丁炔基、2-甲基-2-丁炔基、3-甲基-2-丁炔基、1-甲基-3-丁炔基、2-甲基-3-丁炔基、3-甲基-3-丁炔基、1,1-二甲基-2-丙炔基、1,2-二甲基-2-丙炔基、1-乙基-2-丙炔基、2-己炔基、3-己炔基,4-己炔基,5-己炔基,1-甲基-2-戊炔基,2-甲基-2-戊炔基,3-甲基-2-戊炔基,4-甲基-2-戊炔基、1-甲基-3-戊炔基、2-甲基-3-戊炔基、3-甲基-3-戊炔基、4-甲基-3-戊炔基、1-甲基-4-戊炔基、3-甲基-4-戊炔基、4-甲基-4-戊炔基、1,1-二甲基-2-丁炔基、1,1-二甲基-2-丁炔基、1,1-二甲基-3-丁炔基、1,2-二甲基-2-丁炔基、1,2-二甲基-3-丁炔基、1,3-二甲基-2-丁炔基、1,3-二甲基-3-丁炔基、2,2-二甲基-3-丁炔基、2,3-二甲基-2-丁炔基、2,3-二甲基-3-丁炔基、1-乙基-2-丁炔基、1-乙基-3-丁炔基、2-乙基-1-丁炔基、2-乙基-2-丁炔基、2-乙基-3-丁炔基、1,1,2-三甲基-2-丙炔基、1-乙基-1-甲基-2-丙炔基和1-乙基-2-甲基-2-丙炔基。
除非另有定义,芳基指的是带有4-22个C原子的可以含有一个或两个杂原子或不含杂原子的芳族单核或多核基团。实例包括:苯基、萘基、蒽基或吡咯基、呋喃基、噻吩、吡啶、哒嗪、嘧啶或吡嗪,它们可以彼此独立地被卤素(F、Cl、Br、I)、优选氟或彼此独立地被烷基单取代或多取代或不被它们取代。
芳烷基指的是上述定义的通过C1-C6-亚烷基、C3-C6-亚烯基或C3-C6-亚炔基桥与阳离子部分结构连接的单核或单核芳基,其中所述的C1-C6-烷基、C3-C6-链烯基或C3-C6-炔基如上文所定义。为了本发明的目的优选苄基。
合适的抗衡离子X-优选是所有的氢卤酸的阴离子或一元或二元有机酸的阴离子,所述的有机酸诸如乙酸或草酸、丙二酸、琥珀酸或柠檬酸。
用于本发明的合适的质子供体除无机酸及其盐外主要还有单一或组合形式的饱和脂肪族一元羧酸类、不饱和的链烯基-羧酸类、饱和和/或不饱和脂肪族C2-C6-二羧酸类和/或三羧酸类、脂肪族酮基羧酸类或酮基二羧酸类以及氨基酸。可以使用未取代形式或作为取代衍生物形式的所有上述有机酸,其中,除非另有说明,优选未取代的衍生物或被羟基单或多取代的衍生物。
用于本发明的术语饱和脂肪族一元羧酸类优选包括C1-C6-烷基-羧酸类,其中除甲酸外还优选乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、异戊酸、乙基-甲基-乙酸(2-甲基-丁酸)、2,2-二甲基丙酸(新戊酸)、正己酸、正辛酸、正癸酸和正十二酸(月桂酸)或它们的混合物。此外,还可以使用来源于上述酸的酮基羧酸类。
用于本发明的不饱和链烯基-羧酸类的实例包括丙烯酸(propenoic acid)、甲基丙烯酸、巴豆酸、异巴豆酸和乙烯基乙酸。
本发明优选饱和的脂肪族C2-C6-二羧酸类,诸如:例如草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸或己二酸,而特别优选草酸和琥珀酸。
为了解决本发明的问题,特别优选使用脂肪族羟基-二羧酸类和羟基-三羧酸类,其中最特别优选的是丙醇二酸、D-(+)-苹果酸、L-(-)-苹果酸或DL-苹果酸、(2R,3R)-(+)-酒石酸、(2S,3S)-(-)-酒石酸、中酒石酸和柠檬酸。
因此,诸如马来酸或富马酸这样的不饱和二羧酸类或诸如乌头酸这样的不饱和三羧酸类也适合于解决本发明的问题。
不过,对本发明来说,还可以将诸如中草酸和草酰乙酸这样的脂肪族酮基二羧酸类用作添加剂,最特别优选的是草酰乙酸。
对本发明来说,还能够使用氨基酸,其中优选α-氨基酸,诸如氨基乙酸(甘氨酸)、α-氨基丙酸(丙氨酸)、α-氨基-异戊酸(缬氨酸)、α-氨基异己酸(亮氨酸)和α-氨基-β-甲基戊酸(异亮氨酸)。特别优选使用甘氨酸。
可以将上述质子供体作为单个物质使用或以其纯的立体异构体的形式使用且也可以使用其混合物的形式。
还可以将无机酸及其盐用作本发明的其它添加剂。优选使用诸如磷酸或硫酸这样的无机酸与碱金属形成的盐或其铵盐。最优选使用磷酸和硫酸铵。
表1
名称 | 通式 |
乙酸 | CH3-COOH |
草酸 | HOOC-COOH |
丙二酸 | HOOC-CH2-COOH |
丙醇二酸 | HOOC-CHOH-COOH |
琥珀酸 | HOOC-CH2-CH2-COOH |
苹果酸 | HOOC-CHOH-CH2-COOH |
酒石酸 | HOOC-CHOH-CHOH-COOH |
戊二酸 | HOOC-CH2-CH2-CH2-COOH |
己二酸 | HOOC-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH |
柠檬酸 | HOOC-CH2-COHCOOH-CH2-COOH |
马来酸 | HOOC-CH=CH-COOH |
草酰乙酸 | HOOC-CO-CH2-COOH |
甘氨酸 | H2N-CH2-COOH |
所述的添加剂可以以各种浓度存在于所述组合物中。还能够使用不同添加剂的组合。随着所述添加剂性质的不同,可以证明其它浓度范围是有利的。还能够使用不同添加剂的组合。
所述阳离子化合物在所述组合物水溶液中的浓度在0.01%(w/v)-饱和的范围、优选0.1%-10%(w/v)和饱和之间的范围、更优选0.5-8%(w/v)的范围且最优选2-6%(w/v)的范围。
这种类型的组合物公开在公开的德国申请100 31 236的说明书以及权利要求1-17中,本申请基于该优先权申请。
当添加阳离子化合物和添加剂的溶液时,最佳浓度自然根据生物样品的相应体积和稳定溶液的体积与生物样品的体积的体积比来确定。
除非另有说明,用于本发明的核酸是广泛意义上的核酸,例如核糖核酸(RNA),还包括所有长度或构象的脱氧核糖核酸,诸如双链、单链、环状和直链的DNA和诸如加工和非加工形式的单体核苷酸、寡聚体、质粒、细菌DNA和RNA这样所有可能的亚类。
所用的生物样品可以是食物样品或环境样品,它们含有游离或结合的核酸或含有本发明关注的核酸的微生物,诸如:例如生物体(单或多细胞生物体;昆虫等)、植物和植物部位、细菌、病毒、酵母和其它真菌或原核生物。
含有用于本发明的用作原料的微生物的生物样品还可以是:血浆;体液,诸如血液、血清、细胞、白细胞级分、炎性痂(crusta phlogistica)、痰、尿、精液、粪便、污斑、抽吸物(aspirates)、所有类型的组织样品,诸如活检组织这样的组织样品,例如组织和器官的部分;含有游离或结合的核酸或含有核酸的细胞的食物样品。
除此之外,能够用本发明的组合物稳定来源于上述生物样品和真核生物来源的核酸。因此,能够按照本发明的教导稳定德国专利申请100 31 236(原始提交的文件第6页第二段)中所述的真核生物性质的物质。以这种方式,按照本发明的教导,可以如德国专利申请100 31 236的实施例1-15和附图1-15中所公开的成功地稳定诸如来源于血液、痰或骨髓这样的真核生物来源的核酸,将该文献引入本文作为参考。
所述的添加剂可以以不同浓度的稳定试剂存在;例如它可以存在于稳定溶液与血液的混合物中,体积比为1∶1,优选3∶1,浓度为50mM-饱和,优选100-1M,且最优选浓度为200-500mM。随着所述添加剂性质的不同,可以证明其它浓度范围是有利的。还能够使用不同添加剂的组合。
所述阳离子化合物在所述组合物水溶液中的浓度在0.01%(重量比)-饱和的范围、优选0.1%(重量比)-饱和的范围、更优选0.5-15%(重量比)的范围且最优选2-10%(重量比)的范围。
当添加阳离子化合物与添加剂的溶液时,最佳浓度自然根据生物样品的相应体积和稳定溶液与生物样品的体积比来确定。
在与所述样品混合前,阳离子化合物与添加剂的混合物的pH一般可以作为样品的函数在宽pH范围(pH 2-12)范围内改变且优选在pH2-pH 10的范围且更优选在pH 3-8的范围。优选的pH范围取决于所用的生物样品。就血液、血浆和血清而言,pH值在pH 2-pH 6的范围且尤其优选pH 3-pH4。
阳离子化合物与添加剂的混合物的pH一般可以作为样品的函数在宽pH范围(pH 2-12)范围内改变且优选在pH 2-pH 8的范围且更优选在pH 2-5的范围,其中所述的阳离子化合物与添加剂的混合物用于稳定和/或分离诸如原核生物、真菌、原生动物或藻类这样的微生物中或来自它们中的核酸。优选的pH范围取决于所用的样品。
就除血液、血浆和血清或例如细菌、抽吸物、细胞、组织和诸如如上所述的那些其它生物样品之外的诸如其它细胞体液这样的生物样品而言,由阳离子化合物和添加剂组成的稳定溶液中的pH值优选在pH 3-pH 10的范围且更优选在pH 4-pH 8的范围。将所有给出的pH值理解为是与生物样品混合前的pH。
为了稳定生物样品中的核酸,可以将样品与含有阳离子化合物和添加剂的溶液混合。能够添加0.1-10,000个体积的生物样品;优选添加1-1000个体积,最优选所述体积在1-100的范围。然而,随着诸如来源于细针状活检组织或低细胞计数培养物这样样品性质的不同,还可以在某些情况中使用基本上较大的体积。
类似地,还可以以固体形式添加上述阳离子化合物和添加剂,条件是所述的生物样品本身含有溶解该固体的液体(诸如含有细胞的体液、培养基中的细胞、尿)或条件是向其中添加例如水这样的液体以便溶解所述固体。添加固体的优点在在于固体通常在化学性质上更为稳定且通常易于将其添加到所述样品中。
此外,例如,特别就诸如组织这样极为致密的生物样品而言,能够在稳定溶液中或在将其与所述稳定溶液混合前将该样品磨碎或匀化,有助于通过例如经机械、化学、物理或酶对样品的作用来破坏致密样品而释放核酸或各个细胞或细胞聚集物。例如可以用电刀、玻珠研磨机或通过经注射器挤压来实施机械作用,而对样品起作用的合适的酶例如可以是水解酶、蛋白酶或脂酶。
此外,可以通过例如使用超声这样的纯物理方式来预处理所述样品。
还可以以化学方式单独或与纯物理方法联用来进行预处理。帮助裂解的方式例如包括应用:脂肪醇类、特别是异丙醇或醛类或二醛类,诸如乙二醛;或还有酚类或酚衍生物,诸如2-联苯酚或离子型、两性离子型和非离子型化合物,诸如巯基;或还原试剂,诸如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇;或磷酸衍生物,诸如三丁基磷酸酯;或离液序列高(chaotropic)的试剂,诸如脲、硫氰酸胍或盐酸胍;或盐;可以单独或以组合方式使用它们。
其它的机械、化学、物理或酶方式对样品的作用在本领域中是公知的且包括在本文内。
根据具体要求的不同,可以将所述样品材料保存相当长的期限,诸如1-14天或14天以上,不仅可以在环境温度下,而且可以在升温条件下,诸如40℃或40℃以上,且还可以在低温条件下,诸如4℃或-20℃或-20℃以下。
可以在将所述生物样品储存在所述化合物溶液中后直接用分析核酸的技术分析核酸或可以从所述样品中纯化所述核酸。
有关本发明的技术背景如下:
将通过诸如定量RT-PCR、NASBA、bDNA技术或生物芯片以及RNA印迹这样的分子生物学方法研究微生物中RNA表达模式的方式用于分析原核生物以及原生动物、真菌和藻类中基因表达的基础研究中且还例如在医学诊断、鉴定微生物病原体、研发和评价药物组合物的药物工业、生产研究和治疗应用所用的重组蛋白的生物技术、生态学和种体生物学以及用于检测微生物污染的食品分析方面获得了提高的重要性。
存在为了分离核酸而必须将生物体从其天然环境中分离出来以便获得研究用细胞且然后必须将它们转运至用于分离所述核酸的位置这样的问题。同时,存在RNA分布且DNA还会改变的主要危险。它会导致例如对细菌培养物的基因表达或例如在研究形成用于分析核酸或被细菌、真菌、原生动物或藻类污染的食品的基础的被感染患者的物质(例如,取自炎症部位的样品)的医学/临床诊断中的错误的诊断或分析。在来自患者的食物样品或临床样品中,微生物甚至可能是死亡的且核酸、特别是RNA会随之完全被断裂。因此,在取出样品后立即使核酸、特别是RNA保持稳定具有最大程度的重要性。
细菌的特性是其基因表达对环境条件的极其迅速的适应性。可能产生基因表达模式的短期改变,因为细菌中细胞mRNAs半衰期极短及其在几秒钟或几分钟内合成新RNA转录物的能力所导致的。这些适应性机制是分析原核生物RNA表达模式的问题,因为RNA表达模式的改变甚至可以在收集细胞和RNA制备过程进行时发生。因此,在随后的分析中,它不再是所确定的所认为的实验培养条件下的表达模式,而是反映出在对细胞裂解物的所述收集、裂解或随后加工过程中的条件的RNA表达模式。
因此,还可以将本发明的教导用于非mRNA的RNA类型,诸如rRNA、snRNA、tRNA、低分子量(LMW)RNA种类,还用于诸如基因组DNA(gDNA)这样的DNA。
从诸如原核生物、真菌、原生动物或藻类这样的微生物中分离RNA的常规方法例如基于诸如苯酚和氯仿(三氯甲烷)这样的有机溶剂的应用、基于离液序列高的盐或这些物质的组合的应用。从迄今为止已知的原核生物、真菌、原生动物或藻类中分离核酸的所有方法中,首先必须通过在可以进行进一步的加工前离心或从培养基中过滤而将细胞浓缩。在这第一步过程中,在大量情况下,因环境条件改变(例如温度的改变、由离心或过滤产生的机械压力、气氛的改变等)而在细胞中存在基因表达模式的改变,使得细胞的基因表达模式没有反映出确定的培养条件,而是分离核酸过程中的条件。因此,对任何随后的分析的正确性会产生怀疑。
主要是RNA酶或诸如脱质子化这样的化学影响对RNA进行非特异性裂解或使特定序列断裂的RNA酶破坏RNA的序列特异性裂解,它们是导致表达模式改变的主要原因。此外,新合成的RNA还有缺陷和由此产生的不需要的影响。
通常通过快速细胞收集和快速细胞裂解来尝试将这种影响降低到最低限度,而这种方法不能完全防止基因表达模式的改变。此外,同时处理较大量的样品是不可能的。此外,酶细胞裂解通常得到避免,此时这种现象可能仅在添加有机溶剂或浓离液序列的盐水溶液前发生且需要至少几分钟。因此,在酶细胞裂解过程中,酶RNA降解和新RNA合成能够同时发生,这会改变细胞的基因表达模式。由于这一原因,所以就随后的基因表达分析而言,始终存在发生酶细胞裂解的缺陷。
从原核生物、真菌、藻类和原生动物中分离核酸(RNA和DNA)的另一个问题是细胞的裂解,因为细胞壁必须因此开放。一种广泛应用的方法是用溶菌酶消化原核生物细胞中的胞壁质;另一方面,还可以使用其它酶类,诸如溶葡萄球菌酶或蛋白酶类。在消化过程中,所处理的样品中的条件必须如此以便确保相应酶的酶活性。然而,这类条件同时通常还使得细菌mRNA被RNA酶裂解或使核酸发生化学水解,结果是通常从相应的制品中获得了降解的核酸。此外,不能确保在细胞的酶裂解过程中不合成核酸,这一结果也附加地改变了RNA的表达模式。
有关本发明的目的如下:
本发明的一般目的是避免上述现有技术中已知的缺点。
本发明的目的由此是避免在从诸如细菌、真菌(诸如酵母)、原生动物或藻类这样的微生物中分离核酸的过程中基因表达模式的加工诱导的改变,使得细胞的基因表达模式反映出特定的培养条件或诸如来自患者或食物样品的样品这样原始样品中的条件,而不是因细胞收集或核酸分离过程的条件所导致的改变,从而确保随后进行的任何分析是有效的。
本发明的另一个目的是使得能够同时平行处理大量样品以便分离RNA和DNA。本发明还提供了一种稳定溶液形式的组合物,其中的组分不会有害健康且由此还可以例如用于在从取出位置到实验室的运送过程中稳定生物样品中的RNA和/或DNA而对健康无任何损害,诸如处理样品制备物的工作人员使用苯酚时发生的损害。
可以将本发明的教导特别用于原核生物中的真细菌以及古细菌纲(诸如Methanothermobacter marbirgensis)。真细菌包括革兰氏阳性菌以及革兰氏阴性菌还有光养菌或衣原体、支原体(诸如:例如穿透枝原体(Mycoplasmapenetrans)、立克次氏体、螺旋菌和螺旋体(Spirochetes)(诸如布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)),对它们可以应用本发明的教导。
在革兰氏阳性真细菌中,特别可以提及的是芽孢杆菌属(诸如:例如枯草芽孢杆菌)、葡萄球菌属(诸如:例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis))、链球菌属(Streptomyces)(诸如:例如蓝色链霉菌(Streptomyces coelicotor)或浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans))、黄杆菌属(Flavobacterium)(诸如:例如Flavobacterium johnsoniae)、分枝杆菌属(诸如:例如鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium))或链球菌属(Streptococcus)。
还将本发明的教导用于下列革兰氏阳性真细菌:
梭菌属(诸如:例如艰难梭菌、破伤风梭菌和产气荚膜梭菌);
利斯特氏菌属;
消化球菌属;
消化链球菌属;
肠球菌属;
棒状杆菌属(诸如:例如白喉棒杆菌或谷氨酸棒杆菌);
丙酸杆菌属;
乳杆菌属。
革兰氏阴性真细菌特别包括埃希氏菌属(诸如:例如大肠埃希氏菌)、假单胞菌属(诸如:例如铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌或丁香假单胞菌)、克雷白氏菌属(诸如:例如肺炎克雷白氏菌)、沙门氏菌属(诸如:例如鼠伤寒沙门氏菌)、中华根瘤菌属(诸如:例如苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti))或弯曲杆菌属。
此外,还将本发明的教导用于下列革兰氏阴性菌:
奈瑟氏球菌属(诸如:例如淋病奈瑟氏球菌或脑膜炎奈瑟氏球菌);
弧菌属(诸如:例如霍乱弧菌);
志贺氏菌属;
沙雷氏菌属;
肠杆菌属;
不动杆菌属;
变形菌属;
耶尔森氏菌属;
布鲁氏菌属(诸如:例如流产布鲁氏菌);
嗜血菌属(诸如:例如流感嗜血菌);
拟杆菌属;
弯曲杆菌属;
螺杆菌属(诸如:例如幽门螺杆菌);
博德特氏菌属;
军团菌属;
巴斯德氏菌属。
在真核生物中值得特别提及的包括皮肤真菌族在内的真菌、酵母、霉菌和双相性真菌。
在酵母中特别提及的应由糖酵母属(诸如:例如啤酒糖酵母)、假丝酵母属(诸如:例如白色假丝酵母)、隐球酵母属(诸如:例如新型隐球酵母)组成。在霉菌中,特别提及的应由曲霉属(诸如:例如烟曲霉)或青霉属或毛霉属组成。
真核生物的其它实例有藻类和诸如锥虫、毒浆体、阿米巴、合胞体、鞭毛虫这样的原生动物,可以将本发明的教导用于它们。
有关解决本发明问题的内容如下:
上述本发明的问题通过下列步骤来解决:使确定的细菌、真菌、原生动物或藻类的培养物或含有细菌和/或真菌和/或原生动物和/或藻类的样品与包括通式1的阳离子化合物和至少一种质子供体的组合物或其水溶液接触。
为了随后收集细胞并进一步处理所述样品,可以用溶菌酶以酶促方式消化例如细菌细胞壁的胞壁质基本结构这样的细胞壁,而样品中的核酸不会发生任何的酶或化学降解且没有新的核酸合成,从而防止了对RNA表达模式的任何改变。
另一方面,还能够使用其它酶细胞裂解的方法,例如使用溶葡萄球菌素、蛋白酶K或洗涤剂介导的细胞裂解或这些方法的组合,即与机械裂解方法组合使用。
酶细胞裂解不同于诸如使用玻珠研磨机(bead mill)或在液氮中研磨这样的机械方法,它主要具有相对易于自动化的优点。此外,酶细胞裂解与在现有技术中也是公知的细胞机械裂解方法相比产生了高样品生产量并将交叉污染的危险降低到最低限度。
除对细菌的酶细胞裂解方法外,还可以选择使用消解酶(zymolase)或溶细胞酶来裂解酵母细胞或用蛋白酶或其它酶类或在用本发明的组合物稳定细胞后使用洗涤剂以不同方式裂解真核细胞。
尽管酶细胞裂解在理论上针对所述理由而言具有优势,但是如果必须在实施常规制备方法时的该步骤中预测RNA表达模式的改变,那么该方法实际上不能用于分析基因表达模式。本文所述方法的应用提供了通过甚至在收集细胞前稳定细胞中的RNA来解决这一问题的可能方式。在随后的步骤中,可能进行酶细胞裂解,同时防止了RNA的酶或化学降解以及新的合成。
除酶细胞裂解外,可以进行机械、热或化学细胞裂解以及上述裂解方法中的一种或多种的组合。
在稳定和细胞裂解后,可以将基于从现有技术中已知的改性硅胶物质分离核酸的方法用于进一步处理样品。
本发明提供了例如在使用有机溶剂、离液序列高的盐分离RNA的过程中或通过使核酸盐析或通过使用磁性颗粒或通过杂交俘获法来进一步处理样品的可能方式。
与迄今为止从现有技术中得知的诸如TRIzol或RNeasy这样的RNA提取方法比较,通过使用包括通式I的阳离子型洗涤剂和质子供体的本发明组合物可以获得2-3倍于例如使用上述常规方法获得的产量,其中所述的质子供体是添加剂的形式,优选脂肪族羧酸的形式、更优选二羧酸的形式,其中最特别优选的是酒石酸。
这种高RNA产量对分析低表达的RNA转录物或仅由所分析的细菌群体亚型所表达的RNA转录物而言特别有利。此外,迄今为止还没有从细菌中分离mRNA的可操作的方法,使得当分析细菌mRNAs时,技术人员不得不要处理其它RNA种类(rRNA、tRNA、snRNPs)的强背景。在这类情况中,因产率提高而必然推定分析过程灵敏度增加。
本发明的优点特别在于保留在必须对微生物(原核生物、原生动物、真菌、藻类)中的基因表达模式进行分析的所有应用中。这类应用例如包括为调节原核生物基因表达提供基本理解的科学研究和分析所选的基因的表达与细菌致病性之间的相关性的研究。这后一种问题特别与诊断相关且用于治疗细菌感染。
本发明的另一个重要应用领域是在药物研究和开发过程中用于分析原核生物、原生动物和真菌的基因表达。使例如原核生物RNA表达模式的稳定相对简化了对可能在基因表达的时间依赖性得到证实的实验范围内对转录物反映或完全表达模式的分析。此外,使例如土壤样品中的细菌或来自患者样品中的病原体这样的复杂群体中的种类的鉴定和定量变得极为容易。此外,潜在的应用还扩展到诸如食品分析的其它分析领域。
使用本发明的一种或多种阳离子化合物和一种或多种添加剂的组合物稳定核酸的方法确保了样品中的核酸甚至在长期储存或转运过程中也不会发生改变。因此,在随后阶段进行检测的精确性得到显著提高。在某些情况中,例如当必须将样品物质进行长距离转运或长期储存时,本发明的方法使得在这类期限后进行这些检测首次成为可能。
本发明的优点特别在于例如用于分析在取出后必须立即固定的转录物水平和诸如分子学诊断这样的临床分析领域的研究领域中,例如在所述的临床分析领域中,一旦取出了患者的样品,则在储存和转运期间必须将其稳定,直到准备进行分析为止。
此外,将核酸的分离和稳定用于肿瘤诊断、用于诊断遗传性疾病并用于诊断和监测病毒和诊断和监测其它感染性病原体以及用于分析基因表达模式。
对附图的解释:
附图1以图解方式表示了RNA产量对洗涤剂溶液pH和培养物与洗涤剂溶液的体积比的依赖性。
附图2以图解方式表示了RNA产量对所述方法的不同变化形式的依赖性。
附图3以图解方式表示了RNA产量作为本发明化合物水溶液体积的函数。
附图4表示了对用不同浓度不同体积的阳离子化合物和质子供体的组合物溶液分离的大肠杆菌RNA进行的变性琼脂糖凝胶电泳和ompA RNA印迹分析结果。
附图5表示了对在添加利福平后使用和不使用本发明组合物的溶液分离的大肠杆菌RNA进行的ompA(“外膜蛋白A”)RNA印迹分析。
附图6表示了对在添加利福平后使用和不使用阳离子化合物和添加剂的组合物或其水溶液分离的大肠杆菌RNA进行的bla(β-内酰胺酶)RNA印迹分析。
下列实施例用来解释本发明:
实施例1
从大肠杆菌中分离RNA
用氢氧化钠溶液将由4%(w/v)十四烷基三甲基草酸铵和200mM酒石酸组成的水溶液调节至下列pH值:
2.2(不添加NaOH);2.5;3.0;3.5;4.0;4.5和5.0。
25。
为了进行本实验,就各混合物而言,用移液管将不同pH值的2、3或4个体积的洗涤剂溶液吸量入400μl大肠杆菌在LB培养基中的培养物的等分部分并通过下列方法分离RNA:
-将400μl大肠杆菌培养物添加到制备好的洗涤剂溶液中,涡旋;
-在4℃下以5000×g离心10分钟;
-滗析上清液;
-将沉淀重新悬浮于1ml H2O中;
-在4℃下以5000×g离心10分钟;
-滗析上清液;
-将沉淀与400μg/ml溶菌酶一起重新悬浮于100μl TE缓冲液1)中;
-在环境温度下保温5分钟;
-添加300μl RLT缓冲液2),涡旋;
-添加260μl H2O,涡旋;
-添加40μl蛋白酶K(18mg/ml),涡旋;
-在55℃下保温10分钟;
-以14000×g离心3分钟。
1)缓冲液由10mM Tris-HCl和1mM EDTA组成,其缓冲至pH为8。
2)RLT缓冲液指的是基于诸如异硫氰酸胍这样的胍盐和多元有机酸的碱金属盐以及β-巯基乙醇的缓冲至pH 7的标准商品缓冲液(获自Messrs.QIAGEN,Hilden)。
-取出上清液,添加350μl的100%乙醇,涡旋;
-使所述溶液上样到Rneasy小型旋转柱;
-如现有技术中所得知的、例如Messrs.QIAGEN,Hilden所述的RNeasyMini步骤来进一步处理以便从上述步骤5的细菌中分离总RNA。
附图1表示RNA产量作为洗涤剂溶液的pH和培养物与洗涤剂溶液体积比的函数。
所获得的结果还表明当本发明组合物的水溶液具有3.5-5.0范围的pH时获得了最高产量的RNA。
通过琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性。在每种情况中均发现了完整的核糖体RNA带。
实施例2
通过不同的可选择步骤从大肠杆菌中分离RNA
本实施例中收集的实验用原料也是生长在LB培养基中生长的大肠杆菌培养物。使用1.5×108和3×108细胞进行所有不同的可选择的步骤。就该系列实验而言,使用具有下列组成的本发明组合物的水溶液:
4%(w/v)十四烷基三甲基草酸铵
200mM酒石酸
pH为4.0。
从RNA分离方法的如下部分步骤尝试进行不同可选择的步骤:
1)细胞的收集
向大肠杆菌培养物中添加3个体积的洗涤剂溶液,涡旋,在4℃下以5000×g离心10分钟,滗析上清液;
2)洗涤沉淀
将沉淀重新悬浮于1ml H2O中,在4℃下以5000×g离心10分钟,滗析上清液;
3)溶菌酶消化
将沉淀与400μg/ml溶菌酶一起重新悬浮于100μl TE缓冲液中,在环境温度下保温5分钟;
4)建立结合条件
添加350μl RLT缓冲液,涡旋,添加250μl 100%乙醇。
5)蛋白酶K消化
添加300μl RLT缓冲液,涡旋,添加260μl H2O,添加40μl蛋白酶K(18mg/ml),涡旋,在55℃下保温10分钟,以14000×g离心3分钟,除去上清液,添加350μl 100%乙醇,涡旋;
6)在稀RLT缓冲液中进行的溶菌酶消化和蛋白酶K消化
添加300μl RLT缓冲液,涡旋,添加160μl H2O,涡旋,添加100μl TE缓冲液与400μl/ml溶菌酶,在环境温度下保温5分钟,添加40μl蛋白酶K(18mg/ml),涡旋,在55℃下保温10分钟,以14000×g离心3分钟,除去上清液,添加350μl 100%乙醇,涡旋;
7)使用可以改性或不改性的诸如RNeasy小型旋转柱(获自Messrs.QIAGEN,Hilden)这样的硅胶柱进行处理。将所述溶液上样到所述柱,按照步骤5的从细菌中分离总RNA的RNeasy Mini方法进一步处理。
将原始方法与下列可选择的方法进行比较:
变化形式1):步骤1);3);4)和7)
变化形式2):步骤1);2);3);4)和7)
变化形式3):步骤1);2);3);5)和7)(如实施例1中所述的原始方法)
变化形式4):步骤1);6)和7)。
附图2表示不同可选择方法的RNA产量。
这些实验的结果提供了清楚的指示,即实施变化形式1与原始方法(变化形式3)在RNA产量方面具有可比性。在这种变化形式中,没有洗涤步骤或蛋白质K消化步骤。因此,处理过程作为整体基本上得到缩短且由此将这种变化形式用作下列实施例中的标准方法。
实施例3
用不同体积比的培养物与本发明组合物的水溶液从大肠杆菌中分离RNA
使用具有下列组成的本发明组合物的水溶液:
溶液QCX1 4%(w/v)十四烷基三甲基草酸铵
200mM酒石酸
pH为4.0
溶液QCX2 6%(w/v)十四烷基三甲基草酸铵
300mM酒石酸
pH为4.0
溶液QCX3 8%(w/v)十四烷基三甲基草酸铵
400mM酒石酸
pH为4.0
溶液QCX4 15%(w/v)十四烷基三甲基草酸铵
750mM酒石酸
pH为4.0
将400μl在LB培养基(10g Trypton;5g酵母提取物;10g NaCl;H2O加至1000ml)中生长的大肠杆菌培养物的等份部分与2、3或4个体积的适宜溶液合并并通过实施例2中所确定的标准方法处理。
附图3表示RNA产量作为通式1的阳离子化合物和添加剂的水溶液体积的函数。
从本实验发现可以看出,当使用2或3个体积的不同洗涤剂溶液时RNA产量完全具有可比性。当使用4个体积的所述溶液时,RNA产量存在一定程度的损失。在使用2或3个体积的洗涤剂溶液的混合物中,获得的产量与使用溶液1、2和3所获得的产量具有可比性。
为了评价所分离的RNA的完整性,在变性琼脂糖凝胶上分离RNA且然后进行RNA印迹分析(参见附图4)。
对rRNA带的肉眼观察分析显示在琼脂糖凝胶上存在基本上完整的核糖体RNA带。仅使用溶液4获得的带显示出RNA的部分降解。这一发现通过RNA印迹分析得到证实,其中使用定向于来自大肠杆菌的ompA(“外膜蛋白A”)mRNA的探针进行杂交。
*所述的ompA mRNA是具有15分钟半衰期的相对长生存期的RNA转录物(Nature 1984,312:75-77)。
使用溶液4分离的RNA再次出现了一定程度的降解。当比较其它RNA样品时,发现了微量的最尖的ompAmRNA带,其中使用溶液1分离RNA。然而,总之,使用溶液1-3分离的RNA样品仅在RNA质量上显示出了极轻度的差异。
附图4表示了对使用不同体积和浓度的溶液分离的大肠杆菌RNA的变性琼脂糖凝胶电泳和ompARNA印迹分析的结果。
实施例4
稳定大肠杆菌RNA
为了评价稳定的功效,在本实施例中进行将RNA聚合酶抑制剂利福平添加到培养基中的大肠杆菌细胞中的实验(FEBS Letters 1998,440:172-174)。该步骤防止了合成新的RNA转录物,由此能够较容易地分析RNA转录物的降解情况。在特定的时间添加所述抑制剂后,从细胞中分离RNA。所用的对照品是进行类似处理的混合物,但其中分离RNA而不添加所述溶液(RNeasy标准方法)。为了评价mRNA的完整性,在分离RNA后进行RNA印迹实验。
附图5表示了对在添加利福平后使用和不使用本发明组合物溶液分离的大肠杆菌RNA进行的ompA(“外膜蛋白A”)RNA印迹分析。
ompA mRNA是在所用培养条件下具有15分钟半衰期的大肠杆菌转录物(Nature 1984,312:75-77)。RNA印迹分析(附图5)表明在用本发明溶液处理的样品中,在研究的整个期限内可以检测到ompAmRNA的强度均匀的信号(达15分钟)。相反,就在不添加洗涤剂的样品中的ompAmRNA而言,仅在0-5分钟后就观察到转录物的显著损失。
附图6表示了对在添加利福平后使用和不使用阳离子化合物和添加剂的组合物或其水溶液分离的大肠杆菌RNA进行的bla(β-内酰胺酶)RNA印迹分析。
在RNA印迹分析中,对β-内酰胺酶mRNA(bla)甚至可以更清楚地检测到相同作用。这种mRNA转录物在所选择的培养条件下具有2-5分钟的半衰期(Nature 1984,312:75-77)。正如从附图6中显而易见的,在整个研究期内可以在通过添加溶液分离的RNA样品中以可比的信号强度检测到了这种转录物。另一方面,在不使用洗涤剂溶液的对照组批量中,尽管立即处理了RNA(0分钟),但是bla mRNA转录物几乎完全损耗。分离RNA的两种方法之间的bla mRNA信号强度差异反映出使用本发明组合物的相应水溶液使mRNA即刻稳定。
这些实验表明本发明的组合物开放了在不含任何来自导致表达模式畸变的分离方法的人工制品的液态培养物中固定细菌RNA表达模式的可能性。
实施例5
使用十四烷基三甲基溴化铵(TTAB)进行RNA稳定
在下列实验中使用具有下列组成的TTAB溶液:
4%(w/v)TTAB
200mM酒石酸
pH 4.0
不同种类的细菌在其细胞壁性质方面尤其存在差异。当使用不同的种类时,细胞裂解是分离RNA的关键步骤。
与特别对革兰氏阴性菌种类而言得到良好结果的酶细胞裂解相比,机械细胞裂解可能具有裂解所有类型细胞的能力。
下表表示了一方面使用现有技术的方法(使用溶菌酶介导的细胞裂解的RNeasy)、使用本发明的组合物和包括溶菌酶消化在内的RNeasy、而另一方面使用本发明的组合物和通过使用玻珠研磨机辅助酶细胞裂解的RNeasy“获得的”不同产量进行比较。当使用玻珠研磨机(Messrs QIAGEN的MM 300)时,每批使用50mg的酸洗涤的玻璃珠(直径150-600μm)。在最大振动速度(30Hz)下使细胞裂解在所述玻珠研磨机中进行5分钟。
表2
使用不同细胞裂解方法、随后用RNeasy进行RNA分离而从1×108
个枯草芽孢杆菌细胞中得到的RNA产量
细胞裂解 | 溶菌酶消化 | TTAB溶液+溶菌酶消化 | TTAB溶液+玻珠研磨+溶菌酶消化 |
LB培养基中的枯草芽孢杆菌 | 7μg | 15μg | 19μg |
矿物培养基中的枯草芽孢杆菌 | 3μg | 8μg | 10μg |
从上述比较可以清楚地看出,使用本发明组合物溶液联合机械细胞裂解进行的RNA分离比使用所述溶液的酶细胞裂解进行的RNA分离提高了约25%(表2)。与按照RNeasy标准方法进行的RNA分离相比,使用洗涤剂溶液的机械细胞裂解使产量平均提高了3倍。
这些结果清楚地指示了使用洗涤剂溶液进行的酶细胞裂解也可以有效地在革兰氏阳性枯草芽孢杆菌细胞中进行,这意味着在这里可以省略或不省略机械细胞裂解。
然而,与不使用酶或机械细胞裂解的RNA分离相比,使用诸如玻珠研磨的机械方法但不使用酶细胞裂解还达到了使产量增加约6倍的可能性,这通过下列实验结果可以清楚地证实。
所用的原料是在LB培养基中生长的枯草芽孢杆菌培养物。在每种情况中,比较来自1.8×108个细胞/混合物的RNA产量(表3)。在某些样品中,每批用采用50mg酸洗涤的玻璃珠(直径为150-600μm)的玻珠研磨机(MessrsQIAGEN的MM 300)进行细胞裂解。在最大的振动速度下(30Hz)使玻珠研磨机中的细胞裂解进行5分钟。在另一组样品中,既不进行酶细胞裂解,也不进行机械细胞裂解(参考文献:J.Microbol.Methods 44(2001):235-238)Promega“SV总RNA分离系统”。
表3
作为细胞裂解法和添加的TTAB溶液函数的来自枯草芽孢杆菌
的RNA产量
不使用酶或机械细胞裂解 | 机械细胞裂解 | |
使用TTAB溶液 | 3μg | 18μg |
Claims (61)
1.含有下列通式的阳离子化合物和至少一种质子供体作为组分的组合物在稳定和/或分离微生物中的或来自它们的核酸中的应用:
Y+R1R2R3R4X-
其中Y代表氮或磷;
R1、R2、R3和R4彼此独立地表示非支链的或支链的C1-C20烷基和/或C6-C20芳基以及C7-C26芳烷基;且
X-表示无机或有机一元或多元酸的阴离子。
2.权利要求1的组合物的应用,其中所述微生物包括原核生物、真菌、原生动物和藻类。
3.权利要求1的组合物的应用,其特征在于Y表示氮。
4.权利要求1-3中之一的组合物的应用,其特征在于R1表示高级烷基且R2、R3和R4在每种情况中均表示甲基,其中高级烷基为被一个或多个卤原子取代的或不被它们取代的支链或非支链C7-C20-烷基,所述卤原子彼此相同或不同。
5.权利要求4的组合物的应用,其中所述R1表示带有12、14或16个碳原子的高级烷基。
6.权利要求1-5中之一的组合物的应用,其特征在于阴离子X-选自氢卤酸的阴离子或一元或二元有机酸的阴离子。
7.权利要求6的组合物的应用,其特征在于将来自溴化物、氯化物、磷酸盐、硫酸盐、富马酸盐、乙酸盐、丙酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐或柠檬酸盐的阴离子选作所述的阴离子X-。
8.权利要求1-7之一的组合物的应用,其特征在于所述的质子供体选自饱和脂肪族一元羧酸类、不饱和的链烯基-羧酸类、饱和和/或不饱和脂肪族C2-C6-二羧酸类和/或三羧酸类、脂肪族酮基羧酸类、氨基酸类或无机酸或其盐,是它们自身或其组合形式。
9.权利要求8的组合物的应用,其特征在于将C1-C6-烷基-羧酸类或其混合物用作所述的脂肪族一羧酸。
10.权利要求9的组合物的应用,其特征在于C1-C6-烷基-羧酸类是乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、异戊酸、2-甲基-丁酸、2,2-二甲基丙酸、正己酸、正辛酸、正癸酸或正十二酸。
11.权利要求8的组合物的应用,其特征在于将丙烯酸、甲基丙烯酸、巴豆酸、异巴豆酸或乙烯基乙酸或上述酸的混合物用作脂肪族链烯基-羧酸类。
12.权利要求8的组合物的应用,其特征在于将选自草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸或己二酸的二羧酸或上述酸的混合物用作所述的饱和脂肪族C2-C6-二羧酸。
13.权利要求12的组合物的应用,其特征在于将脂肪族二羧酸类或其混合物用作质子供体。
14.权利要求13的组合物的应用,其特征在于所述脂肪族二羧酸类是草酸或琥珀酸。
15.权利要求8的组合物的应用,其特征在于将脂肪族羟基-二羧酸类和羟基-三羧酸类或上述酸的混合物用作质子供体。
16.权利要求15的组合物的应用,其特征在于所述脂肪族羟基-二羧酸类和羟基-三羧酸类是丙醇二酸、D-(+)-苹果酸、L-(-)-苹果酸或DL-苹果酸、(2R,3R)-(+)-酒石酸、(2S,3S)-(-)-酒石酸、中酒石酸或柠檬酸。
17.权利要求8的组合物的应用,其特征在于将不饱和二羧酸类或其混合物用作质子供体。
18.权利要求17的组合物的应用,其特征在于所述不饱和二羧酸类是马来酸或富马酸。
19.权利要求8的组合物的应用,其特征在于不饱和三羧酸类或其混合物用作质子供体。
20.权利要求19的组合物的应用,其特征在于不饱和三羧酸类是乌头酸。
21.权利要求8的组合物的应用,其特征在于脂肪族酮基二羧酸类或其混合物用作质子供体。
22.权利要求21的组合物的应用,其特征在于所述脂肪族酮基二羧酸类是中草酸或草酰乙酸。
23.权利要求8的组合物的应用,其特征在于将氨基酸类或其混合物用作质子供体。
24.权利要求23的组合物的应用,其特征在于所述氨基酸类是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。
25.权利要求1-24之一的组合物的应用,其特征在于所用的组合物是水溶液形式。
26.权利要求25的组合物的应用,其特征在于所述阳离子化合物在所述组合物中的浓度在0.01%(W/V)-饱和的范围。
27.权利要求26的组合物的应用,其特征在于所述阳离子化合物在所述组合物中的浓度在0.1%-10%(W/V)。
28.权利要求27的组合物的应用,其特征在于所述阳离子化合物在所述组合物中的浓度在0.5-8%(W/V)的范围。
29.权利要求28的组合物的应用,其特征在于所述阳离子化合物在所述组合物中的浓度在2-6%(W/V)的范围。
30.权利要求1-29之一的组合物的应用,其特征在于所述的核酸来源于原核生物、古细菌纲或真细菌。
31.权利要求30的组合物的应用,其特征在于所述的核酸来源于Methanothermobacter marbirgensis。
32.权利要求30或31的应用,其特征在于所述的核酸来源于革兰氏阳性菌。
33.权利要求32的应用,其特征在于所述的核酸来源于:芽孢杆菌属;葡萄球菌属;链球菌属;黄杆菌属;分枝杆菌属;链球菌属;梭菌属;利斯特氏菌属;消化球菌属;消化链球菌属;肠球菌属;棒状杆菌属;丙酸杆菌属;或乳杆菌属。
34.权利要求33的应用,其特征在于所述的核酸来源于枯草芽孢杆菌,金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌,蓝色链霉菌或浅青紫链霉菌,Flavobacterium johnsoniae,鸟分枝杆菌,艰难梭菌、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌,或白喉棒杆菌或谷氨酸棒杆菌。
35.权利要求30或31的应用,其特征在于所述的核酸来源于革兰氏阴性菌。
36.权利要求35的应用,其特征在于所述的核酸来源于:埃希氏菌属;假单胞菌属;克雷白氏菌属;沙门氏菌属;中华根瘤菌属;弯曲杆菌属;奈瑟氏球菌属;弧菌属;志贺氏菌属;沙雷氏菌属;肠杆菌属;不动杆菌属;变形菌属;耶尔森氏菌属;布鲁氏菌属;嗜血菌属;拟杆菌属;螺杆菌属;博德特氏菌属;军团菌属;或巴斯德氏菌属。
37.权利要求36的应用,其特征在于所述的核酸来源于大肠埃希氏菌,铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌或丁香假单胞菌,肺炎克雷白氏菌,鼠伤寒沙门氏菌,苜蓿中华根瘤菌,淋病奈瑟氏球菌或脑膜炎奈瑟氏球菌,霍乱弧菌,流产布鲁氏菌,流感嗜血菌,或幽门螺杆菌。
38.权利要求30或31的应用,其特征在于所述的核酸来源于衣原体。
39.权利要求30或31的应用,其特征在于所述的核酸来源于光养菌。
40.权利要求30或31的应用,其特征在于所述的核酸来源于支原体。
41.权利要求40的应用,其中所述支原体包括穿透支原体。
42.权利要求30或31的应用,其特征在于所述的核酸来源于立克次氏体。
43.权利要求30或31的应用,其特征在于所述的核酸来源于螺旋体。
44.权利要求30或31的应用,其特征在于所述的核酸来源于螺旋菌。
45.权利要求1-29之一的应用,其特征在于所述的核酸来源于真核微生物。
46.权利要求45的应用,其特征在于所述的核酸来源于皮肤真菌族真菌、酵母、霉菌或双相性真菌。
47.权利要求46的应用,其特征在于所述的核酸来源于:糖酵母属;假丝酵母属;或隐球酵母属。
48.权利要求47的应用,其特征在于所述的核酸来源于啤酒糖酵母,白色假丝酵母,或新型隐球酵母。
49.权利要求46的应用,其特征在于所述的核酸来源于曲霉属的霉菌。
50.权利要求49的应用,其中所述曲霉属的霉菌包括烟曲霉。
51.权利要求46的应用,其特征在于所述的核酸来源于青霉属的霉菌。
52.权利要求46的应用,其特征在于所述的核酸来源于毛霉属的霉菌。
53.权利要求45的应用,其特征在于所述的核酸来源于藻类。
54.权利要求45的应用,其特征在于所述的核酸来源于原生动物。
55.权利要求54的应用,其中所述原生动物包括锥虫、毒浆体、阿米巴、合胞体和鞭毛虫。
56.权利要求1-55之一的组合物的应用,其特征在于对细菌或真菌或原生动物或藻类进行酶、机械、热或化学的裂解或使用所述裂解方法的组合。
57.权利要求1-55之一的组合物的应用,其特征在于所述组合物的pH在2-12的范围。
58.权利要求57的组合物的应用,其特征在于所述组合物的pH在2-8的范围。
59.权利要求58的组合物的应用,其特征在于所述组合物的pH在2-5的范围。
60.权利要求1-29之一的组合物的应用,其是以用于稳定核酸的试剂盒的形式使用。
61.权利要求1-29之一的组合物的应用,其中所述组合物是与权利要求30-54之一的生物样品以混合物的形式使用,且其中可以含有或不含其它赋形剂。
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- 2014-10-02 JP JP2014203545A patent/JP2015027310A/ja active Pending
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2015
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