DE10208005A1

DE10208005A1 - Verfahren zur Änderung der Transkriptkonzentration in ribonukleinsäurehaltigen biologischen Proben

Info

Publication number: DE10208005A1
Application number: DE2002108005
Authority: DE
Inventors: Stephan Martin; Reiner Fueth
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2002-02-26
Filing date: 2002-02-26
Publication date: 2003-09-04
Also published as: WO2003072816A2; AU2003210362A1; AU2003210362A8; WO2003072816A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Änderung von Transkriptkonzentrationen sowie ein Kit zur Durchführung dieses Verfahrens, in dem eine Nukleinsäure-haltige Probe zunächst mit einer Stimulans oder Repressor und anschließend mit einer stabilisierenden Verbindung insbesondere eines Salzes der allgemeinen Formel DOLLAR A Y·+·R¶1¶R¶2¶R¶3¶R¶4¶X·-· (I) DOLLAR A versetzt wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Änderung von Transkriptkonzentrationen sowie ein Kit zur Durchführung dieses Verfahrens, indem eine Nukleinsäure-haltige Probe zunächst mit einem Stimulans oder Repressor und anschließend mit einer stabilisierenden Verbindung versetzt wird.
Die bisher im Stand der Technik etablierten Testsysteme, die zur Diagnose von Krankheiten dienen, basieren nahezu ausschließlich auf der Analyse von Proteinen. Die Nutzbarmachung von Genexpressionsprofilen zu derartigen Zwecken befindet sich noch in einem sehr frühen Anfangsstadium und hat dementsprechend noch so gut wie gar keinen Eingang in die klinische Praxis gefunden.
Der Grund dafür ist darin zu suchen, dass im Stand der Technik bislang eine generelle und große Skepsis hinsichtlich der Messung von zellulären RNA-Profilen zu diagnostischen Zwecken vorhanden ist. So wurden bislang Genexpressionsmuster noch sehr wenig auf ihren diagnostischen Wert untersucht. Die Skepsis resultiert auch aus dem Vorurteil, dass nur die Proteine die Basis für diagnostische Zwecke sein können, das sie die wesentlichen direkten Faktoren sind, die zu einer biologischen Wirkung führen. Weiterhin herrscht im Stand der Technik die Auffassung vor, dass durch die posttranslationale Modifikation von Proteinen weitere wesentliche Funktionen der Wirksamkeit bestimmt werden. Zusammenfassend ist festzustellen, dass im Stand der Technik erhebliche Zweifel bestehen, dass mRNA-Messungen, insbesondere die Messung von stimulierten Proben valide und reproduzierbare Ergebnisse liefert.
Dass beispielsweise der spezifischen Analyse von Nukleinsäuren bisher eine so geringe Bedeutung in der Klinik zukommt, ist u. a. auch darin begründet, dass mit den bisher aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, wie z. B. der Verwendung von sog. DNA-Chips zur Expressionsanalyse, aufgrund der geringen Sensitivität eine vergleichsweise hohe Anzahl der jeweiligen RNA-Moleküle vorhanden sein muss, um detektierbar zu sein. Die Sensitivität dieser Verfahren ist also nicht ausreichend.
Daneben besteht insbesondere bei der Analyse von RNA-Expressionsmustern in biologischen und/oder klinischen Proben die Schwierigkeit, dass Transkripte häufig in sehr niedrigen Konzentrationen in der Probe vorliegen, wodurch der Nachweis der Transkripte sehr schwierig oder gar nicht möglich ist.
Aus diesem Grund besteht ein Bedarf nach einer einfachen Methode, die die Konzentration an Transkripten in der biologischen/klinischen Probe in einer ex vivo Stimulation (EVS-Diagnostik) reproduzierbar erhöht und gleichzeitig nach der anschließend durchzuführenden Analyse des RNA-Profiles der Probe noch analytische Schlüsse über den ursprünglichen physiologischen Zustand der Probe ermöglicht, wodurch auch z. B. diagnostische Aussagen für z. B. Patienten möglich werden.
Hierbei würde die spezifische Veränderung des Genexpressionsmusters auf die Zugabe des Stimulans/Repressors genutzt, um analytische bzw. diagnostische Aussagen zu treffen. Bislang ist aus dem Stand der Technik jedoch kein Verfahren bekannt, das es ermöglichen würde, solche analytischen oder diagnostischen Aussagen aus der Reaktion von biologischen und/oder klinischen Proben auf die Stimulationen zur Erhöhung oder auch Reduktion von Transkriptkonzentrationen zu ziehen.
Ein Bedarf nach der Erhöhung spezifischer Transkripte besteht daneben z. B. auch in der Tumordiagnostik. So können restliche Tumorzellen z. B. im Blut oder Urin durch Nachweis tumor-spezifischer Transkripte identifiziert werden (Minimal Residual Disease). Dabei besteht die Schwierigkeit, dass in der Regel nur eine niedrige Anzahl an solchen Transkripten in der biologischen/klinischen Probe enthalten ist. Eine Erhöhung der Konzentration an tumor-spezifischen Transkripten in den Tumorzellen würde die Sensitivität nachfolgender RNA-Analytik erhöhen können. Dies würde dazu führen, dass eine kleinere Anzahl an restlichen Tumorzellen in einer biologischen/klinischen Probe nachweisbar wäre.
Des weiteren besteht z. B. bei Lebensmitteln oder Umweltproben, die mit Bakterien und/oder Mikroorganismen verseucht sind, ebenfalls der Bedarf nach schnelleren, sensitiveren und einfachen Methoden, um eine möglichst geringe Zahl an Erregern noch nachweisen zu können. Eine Erhöhung der Konzentration Erreger-spezifischer Transkripte mit einer anschließenden molekularbiologischen Analyse, wie z. B. RT- PCR oder anderer Nukleinsäure-Amplifikations-Technologien oder Biochip- Technologien, würde auch in diesem Bereich die Sensitivität der Analysen und somit die Sicherheit von z. B. Lebensmitteln erhöhen können.
Neben der Erhöhung der Transkriptkonzentrationen ist es aber auch denkbar aus der Reaktion einer biologischen Probe auf die Repression der Transkriptsynthese, also der Erniedrigung von Transkriptreaktionen, analytische oder prognostische Schlüsse zu ziehen.
Ein weitere Schwierigkeit nach der Zugabe von Stimulantien bzw. Repressoren zu der biologischen/klinischen Probe besteht darin, dass nach einer definierten Zeit das erzeugte RNA-Profil in der Probe fixiert werden muss, um reproduzierbare, standardisierte und vergleichbare Analysen zu ermöglichen. Ohne eine solche zu einem definierten Zeitpunkt zu erfolgende Stabilisierung des RNA-Profils würde die durch die Stimulation erzeugte Veränderung des RNA-Profils unkontrolliert und nicht reproduzierbar fortgesetzt. Die Schwierigkeit besteht insbesondere bei der parallelen Verarbeitung von mehreren Proben. Um standardisierte Ergebnisse zu erhalten, muss die Dauer der Stimulation bei allen Proben exakt gleich sein. Dabei besteht insbesondere der Bedarf nach einem einfachen, routinefähigen Verfahren. Die zur Zeit zur Verfügung stehenden Verfahren, wie z. B. die Zugabe von giftigen Phenol- oder Phenol-Chloroform-Lösungen oder das schnelle Einfrieren der stimulierten oder reprimierten Proben, z. B. in flüssigen Stickstoff sind in begrenztem Umfang einsetzbar, sind aber für die Routine nicht geeignet. Sie ziehen zudem meistens aufwendige Verfahren zur Isolierung der RNA nach sich.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, die Zahl der mit den bisher aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren nachweisbaren Transkripte reproduzierbar und signifikant zu verändern bzw. insbesondere zu steigern.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das aus dem durch die Stimulation und/oder Repression der Genexpression erzeugten RNA-Profil analytische und diagnostische Aussagen über den Zustand der biologischen/klinischen Probe und damit ggf. über den Organismus, aus dem die Probe stammt, wie z. B. eines Patienten, ermöglicht.
Daneben besteht eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, das RNA- Profil nach einer definierten Dauer der Stimulation zu fixieren, sodass weitere Veränderungen durch Synthese und/ober Abbau von RNA-Molekülen verhindert werden können, um standardisierte, reproduzierbare Analysen in der Routine zu ermöglichen.
Die sofortige Stabilisierung des RNA-Profiles ist auch für die nicht stimulierten Kontrollproben sehr wichtig, die mit den stimulierten Proben zur Bestimmung der Wirkung des Stimulans oder Repressors verglichen werden müssen. Die nicht stimulierten Kontrollproben werden zu dem Zeitpunkt stabilisiert, zu dem die zu stimulierenden Proben mit dem Stimulans versehen werden.
Gelöst werden die vorgenannten Aufgabe durch das nachfolgend beschriebene Verfahren, bei dessen Anwendung durch die Messung der Konzentration von spezifischen RNA-Molekülen nach Stimulation der biologischen/klinischen Probe

1. reproduzierbare Werte erhalten werden,
2. diese Werte biologisch/medizinisch relevante Informationen liefern,
3. schneller Änderungen der Aktivierung von Zellregulationen zeigen als die entsprechenden Proteine und
4. sensitiver sind als unstimulierte RNA-Werte oder Proteine und
5. die Zahl der nachweisbaren Transkripte und damit die Sensitivität nachfolgender Analytikverfahren deutlich gesteigert werden kann.

Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren ist einfach durchführbar und damit routinefähig. Transkriptkonzentrationen werden bestimmt, indem eine nukleinsäurehaltige Probe zunächst mit einem Stimulans oder Repressor und anschließend mit einer stabilisierenden Verbindung, insbesondere eines Salzes der allgemeinen Formel

Y⁺R₁R₂R₃R₄X^- (I)

worin
Y Stickstoff oder Phosphor und
R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander einen unverzweigten oder verzweigten C₁- C₂₀-Alkylrest und/oder einen C₆-C₂₀-Arylrest sowie einen C₆-C₂₆-Aralkylrest
und/oder R₁ eine Gruppe der allgemeinen Formel -(CH₂)_n-Z⁺R₅R₆R₇
worin
n eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6
Z Stickstoff oder Phosphor und
R₅, R₆, und R₇ unabhängig voneinander einen unverzweigten oder verzweigten C₁- C₂₀-Alkylrest und/oder einen C₆-C₂₀-Arylrest sowie einen C₆-C₂₆-Aralkylrest
X- ein oder mehrere Anion(en) einer anorganischen oder organischen, ein- oder mehrbasischen Säure
bedeuten können, ggf. mit einem oder mehreren Protonendonor(en),
versetzt wird.
Y und ggf. Z bedeuten vorzugsweise Stickstoff.
C₁-C₆-Alkyl steht - sofern nicht anders definiert - im allgemeinen für einen verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatom(en), der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - vorzugsweise Fluor - substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien folgende Kohlenwasserstoffreste genannt:
Methyl, Ethyl, Propyl, 1-Methylethyl (iso-Propyl), Butyl, 1-Methylpropyl, 2- Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3- Methylbutyl, 1,1-Dimethylpropyl, 1,2-Dimethylpropyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1- Ethylpropyl, Hexyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1,1-Dimethylbutyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3- Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-1-methylpropyl und 1-Ethyl-2methyl-propyl.
Höherer Alkylrest steht - sofern nichts anderes angegeben ist - für einen verzweigten oder unverzweigten C₇-C₂₀-Alkylrest der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - vorzugsweise Fluor - substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien folgende Kohlenwasserstoffreste genannt: verzweigtes oder unverzweigtes Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tetradecyl, Hexadecyl, Dodecadecyl und Eicosyl.
Aryl steht - sofern nicht anders definiert - für einen aromatischen ein- oder mehrkernigen Rest mit 4 bis 22 C-Atomen, der ggf. ein oder zwei Heteroatome enthalten kann. Als Beispiele seien genannt: Phenyl, Naphthyl, Anthracyl bzw. Pyrol, Furan, Thiophen, Pyridin, Pyridazin, Pyrimidin oder Pyrazin, und der ggf. durch Halogen (F, Cl, Br, J) - vorzugsweise Fluor- oder durch eine Alkylgruppe unabhängig voneinander ein- oder mehrfach substituiert sein kann.
Aralkyl bedeutet - sofern nicht anders definiert - einen ein oder mehrkernigen Arylrest im Sinne der nachstehenden Definition der über eine C₁-C₆-Alkylen-, C₃-C₆- Alkenylen- oder eine C₃-C₆-Alkinylenbrücke, für welche die Definition der C₁-C₆-Alkyl-, C₃-C₆-Alkenyl- und C₃-C₆-Alkinylgruppen entsprechend gelten, an die kationische Partialstruktur gebunden ist. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird die Benzylgruppe bevorzugt.
C₃-C₆-Alkenyl steht - sofern nicht anders definiert - im allgemeinen für einen verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 3 bis 6 Kohlenstoffatom(en), mit einer oder ggf. mehreren Doppelbindungen, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - vorzugsweise Fluor - substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien folgende Kohlenwasserstoffreste genannt:
2-Propenyl (Allyl), 2-Butenyl, 3-Butenyl, 1-Methyl-2-propenyl, 2-Methyl-2-propenyl, 2- Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-2-butenyl, 3-Methyl- 2-butenyl, 1-Methyl-3-butenyl, 2-Methyl-3-butenyl, 3-Methyl-3-butenyl, 1,1-Dimethyl- 2-propenyl, 1,2-Dimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-2-propenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4- Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-2-pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl, 3-Methyl-2-pentenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, 1-Methyl-3-pentenyl, 2-Methyl-3-pentenyl, 3-Methyl-3-pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl, 1-Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-pentenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1,1-Dimethyl-2-butenyl, 1,1-Dimethyl-2-butenyl, 1,1-Dimethyl-3-butenyl, 1,2-Dimethyl- 2-butenyl, 1,2-Dimethyl-3-butenyl, 1,3-Dimethyl-2-butenyl, 1,3-Dimethyl-3-butenyl, 2,2-Dimethyl-3-butenyl, 2,3-Dimethyl-2-Butenyl, 2,3-Dimethyl-3-butenyl, 1-Ethyl-2- butenyl, 1-Ethyl-3-butenyl, 2-Ethyl-1-butenyl, 2-Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3-butenyl, 1,1,2-Trimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-1-methyl-2-propenyl und 1-Ethyl-2-methyl-2- propenyl.
C₃-C₆-Alkinyl steht - sofern nicht anders definiert - im allgemeinen für einen verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 3 bis 6 Kohlenstoffatom(en), mit einer oder ggf. mehreren Dreifachbindungen, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - vorzugsweise Fluor - substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien folgende Kohlenwasserstoffreste genannt:
2-Propinyl (Propargyl), 2-Butinyl, 3-Butinyl, 1-Methyl-2-propinyl, 2-Methyl-2-propinyl, 2-Pentinyl, 3-pentinyl, 4-Pentinyl, 1-Methyl-2-butinyl, 2-Methyl-2-butinyl, 3-Methyl-2- butinyl, 1-Methyl-3-butinyl, 2-Methyl-3-butinyl, 3-Methyl-3-butinyl, 1,1-Dimethyl-2- propinyl, 1,2-Dimethyl-2-propinyl, 1-Ethyl-2-propinyl, 2-Hexinyl, 3-Hexinyl, 4-Hexinyl, 5-Hexinyl, 1-Methyl-2-pentinyl, 2-Methyl-2-pentinyl, 3-Methyl-2-pentinyl, 4-Methyl-2- pentinyl, 1-Methyl-3-pentinyl, 2-Methyl-3-pentinyl, 3-Methyl-3-pentinyl, 4-Methyl-3- pentinyl, 1-Methyl-4-pentinyl, 3-Methyl-4-pentinyl, 4-Methyl-4-pentinyl, 1,1-Dimethyl- 2-butinyl, 1,1-Dimethyl-2-butinyl, 1,1-Dimethyl-3-butinyl, 1,2-Dimethyl-2-butinyl, 1,2- Dimethyl-3-butinyl, 1,3-Dimethyl-2-butinyl, 1,3-Dimethyl-3-butinyl, 2,2-Dimethyl-3- butinyl, 2,3-Dimethyl-2-butinyl, 2,3-Dimethyi-3-butinyl, 1-Ethyl-2-butinyl, 1-Ethyl-3- butinyl, 2-Ethyl-1-butinyl, 2-Ethyl-2-butinyl, 2-Ethyl-3-butinyl, 1,1,2-Trimethyl-2- propinyl, 1-Ethyl-1-methyl-2-propinyl und 1-Ethyl-2-methyl-2-propinyl.
Als Gegenionen X^- eignen sich bevorzugt alle Anionen von Mineral- bzw. Halogenwasserstoffsäuren oder Anionen ein- oder zweibasischer organischer Säuren wie zum Beispiel Acetat oder Oxalat, Malonat, Succinat oder Citrat. Bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der R₁ einen höheren Alkylrest - vorzugsweise mit 12, 14 oder 16 Kohlenstoffatomen und R₂, R₃ und R₄ jeweils eine Methylgruppe bedeutet.
Bevorzugt sind weiterhin Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der R₁ eine Aralkylgruppe - vorzugsweise eine Benzylgruppe -, R₂ einen höheren Alkylrest - vorzugsweise mit 12, 14 oder 16 Kohlenstoffatomen - und R₃ und R₄ eine Methylgruppe bedeutet.
Als Anionen werden Bromid, Chlorid, Phosphat, Sulfat, Formiat, Acetat, Propionat, Oxalat oder Succinat bevorzugt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird besonders bevorzugt Tetradecyltrimethylammoniumoxalat (QCX) eingesetzt.
Als Protonendonoren im Sinne der vorliegenden Erfindung sind in erster Linie gesättigte aliphatische Monocarbonsäuren, ungesättigte Alkenyl-carbonsäuren, gesättigte und/oder ungesättigte aliphatische C₂-C₆-Dicarbonsäuren, aliphatische Ketocarbonsäuren oder Ketodicarbonsäuren sowie Aminosäuren neben Mineralsäuren oder deren Salze allein oder in Kombination geeignet. Dabei können alle genannten organischen Säuren in unsubstituierter Form oder als substituierte Derivate eingesetzt werden, worunter - sofern nicht anders angegeben - die unsubstituierten oder ein bzw. mehrfach durch Hydroxyl-Gruppen substituierten Derivate bevorzugt werden.
Als gesättigte aliphatische Monocarbonsäuren im Sinne der vorliegenden Erfindung werden neben Ameisensäure vorzugsweise C₁-C₆-Alkyl-carbonsäuren verstanden, worunter Essigsäure, Propionsäure, n-Buttersäure, n-Valeriansäure, Isovaleriansäure, Ethyl-methylessigsäure (2-Methyl-buttersäure), 2,2- Dimethylpropionsäure (Pivalinsäure), n-Hexansäure, n-Octansäure, n-Decansäure sowie n-Dodecansäure (Laurinsäure) bevorzugt werden. Daneben können auch die sich von den genannten Säuren ableitenden Ketocarbonsäuren Verwendung finden.
Als ungesättigte Alkenyl-carbonsäuren im Sinne der Erfindung seien beispielsweise Acrylsäure (Propensäure), Methacrylsäure, Crotonsäure, iso-Crotonsäure sowie Vinylessigsäure genannt.
Bevorzugt im Sinne der vorliegenden Erfindung sind gesättigte aliphatische C₂-C₆- Dicarbonsäuren, wie zum Beispiel Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure oder Adipinsäure, worunter Oxalsäure und Bernsteinsäure ganz besonders bevorzugt werden.
Besonders bevorzugt werden zur Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe aliphatische Hydroxi-di- und -tricarbonsäuren eingesetzt, worunter Tartronsäure, D- (+)-, L-(-)- oder DL-Äpfelsäure, (2R, 3R)-(+)-Weinsäure, (2S, 3S)-(-)-Weinsäure, meso-Weinsäure und Zitronensäure ganz besonders bevorzugt werden.
Zur Lösung der vorliegenden Aufgabe eignen sich daneben auch ungesättigte Dicarbonsäuren wie Malein- oder Fumarsäure oder ungesättigte Tricarbonsäuren, wie zum Beispiel Aconitsäure.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung können jedoch auch aliphatische Ketodicarbonsäuren als Additive eingesetzt werden, wie z. B. Mesoxalsäure und Oxalessigsäure, worunter Oxalessigsäure ganz besonders bevorzugt wird.
Des weiteren können im Sinne der vorliegenden Erfindung Aminosäuren eingesetzt werden, worunter α-Aminosäuren - wie z. B. Aminoessigsäure (Glycin), α- Aminopropionsäure (Alanin), α-Amino-iso-valeriansäure (Valin), α-Amino-isocapronsäure (Leucin) und α-Amino-β-methylvaleriansäure (Isoleucin) bevorzugt werden. Besonders bevorzugt findet dabei Glycin Verwendung.
Die genannten Protonendonoren können als Einzelsubstanzen bzw. in Form der reinen Stereoisomeren als auch in Mischungen eingesetzt werden.
Als weitere Additive können im Sinne der vorliegenden Erfindung ebenfalls Mineralsäuren und deren Salze eingesetzt werden. Bevorzugt kommen dabei deren Salze von Mineralsäuren - wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure - mit Alkalimetallen oder deren Ammoniumsalze zur Anwendung. Besonders bevorzugt finden dabei Phosphorsäure und Ammoniumsulfat Verwendung. Tabelle 1
Das Additiv kann in unterschiedlichen Konzentrationen in der Komposition vorliegen. Des weiteren ist auch der Einsatz von Kombinationen verschiedener Additive möglich. Dabei können in Abhängigkeit von der Natur des Additivs sich andere Konzentrationsbereiche als vorteilhaft erweisen. Daneben ist auch der Einsatz von Kombinationen verschiedener Additive möglich.
Die erwähnten Verbindungen sind aus dem Stand der Technik bekannt und können nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Die Verbindungen können in Reinsubstanz, in Form ihrer Mischungen sowie als - wässrige - Lösung eingesetzt werden.
Als Probenmaterial (biologische Probe) können im Sinne der vorliegenden Erfindung biologische und/oder klinische Proben - wie u. a. Plasma oder Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise Blut, Spinalflüssigkeit, Serum, Zellen, Leukozytenfraktionen, Crusta Phlogistica, Sputum, Urin, Sperma, Faeces, Abstriche, Punktate, Gewebeproben jeder Art - wie z. B. Biopsien -, Gewebeteile und Organe, Aszitis, Knochenmark, die freie oder gebundene Nukleinsäuren oder nukleinsäurehaltige Zellen enthalten, dienen.
Des weiteren können als Proben zellhaltige Lebensmittel- und Umweltproben als auch Mikroorganismen und/oder Bakterien eingesetzt werden, wobei letztere z. B. auch in der biologischen und/oder klinischen Probe enthalten sein können.
Ein wichtiger Bestandteil der Erfindung ist daneben die Verdünnung der Probe vor der Stimulation oder Repression. Dies ist insbesondere beim Einsatz von Blut der Fall. Es wurde nämlich überraschenderweise gefunden, dass Versuche, welche mit unverdünntem Blut durchgeführt wurden, zu keiner Steigerung der mRNA- Expression führten. Die Verdünnung kann z. B. mit RPMI1640 Medium oder aber beispielsweise mit physiologischer Kochssalzlösung durchgeführt werden. Weitere geeignete Medien sind dem Fachmann bekannt und unschwer kommerziell erhältlich.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die zu untersuchende Probe - insbesondere Blut- oder Gewebeprobe - vor der Analyse mit einem Stimulans/Repressor - wie z. B. PHA (Phytohaemaglutinin) [A. Kretowski et al., Immunol. Lett. 71 (2) (2000) 85; I. Wilke et al., Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. 246 (1996) 279] versetzt. Aus dem Stand der Technik ist jedoch daneben eine Vielzahl von weiteren Stimulantien bekannt, wie z. B. PWM (Poke Weat Mitogen), IL2 (Interleukin 2), hsp (Hitzeschockproteine), LPS (Lipopolysaccharid aus Bakterien) [H. Bruungaard et al., Clin. Exp. Immunol. 118 (1999) 235; A. G. Heriot, Br. J. Cancer 82 (5) (2000) 1009]; Superantigene wie z. B. TSST-1, SEB, MAS u. a. [J. M. Brand et al., Rheumatol. Int. 16 (1997) 207; L. Alvarez-Osorio et al., Scand. J. Immunol. 47 (1998) 43], fMLP (Formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin) [M. Mineshita et al. J. Immunol. Methods 202 (1) (1997) 59], PMA/Ionomycin [W. A: Sewell et al. J Immunol. Methods 209 (1) (1997) 67], Hormone, wie z. B. Angiotensin II oder aber Proteine, Nukleinsäuren (DNA, RNA), chemische Wirkstoffe, Allergene, Toxine, Tumorantigene, Zytokine, Monokine, Chemokine, Lektine, Peptide, etc. oder Bakterien [S. Halme et al. Eur. Heart J. 18 (7) (197) 1095] Mycobacterium tuberkulosis mit Concanavalin [Scand. J. Immunol. 49 (2) (1999) 210] oder Tumorzellen [Z. D. Jurnic et al., Neoplasma 46 (4) (1999) 224], HIV-Antigene [D. Hober et al., Scand. J. Immunol. 51 (4) (2000) 429] oder Trichophyten [A. Lund et al. Vet. Dermatol. 12 (2) (2001) 75] oder andere Lebewesen oder Viren oder Metallionen, wie z. B. Zink (11) - Ionen [C. Driessen et al., Immunology 84 (2) (1995) 272].
Die so erzeugten Transkriptkonzentrationen werden danach mit einer oder mehreren stabilisierenden Verbindungen versetzt. Erfindungsgemäß werden stabilisierende Verbindungen der allgemeinen Formel I bevorzugt.
Die vorteilhafte Wirkung der beschriebenen Verbindungen konnte experimentell eindrucksvoll nachgewiesen werden. Dazu wurde zum Zweck der Überprüfung des Immunsystems und von Genexpressionsprofilen Blut von Personen mit einem normalen Gesundheitszustand und von Patienten mit bekannten bzw. unbekannten Erkrankungen verdünnt und mit verschiedenen Substanzen über einen unterschiedlich langen Zeitraum stimuliert. Anschließend wird die RNA mit einer Verbindung der allgemeinen Formel I bzw. deren wässrigen Lösung wie auch mit anderen aus dem Stand der Technik bekannten Substanzen stabilisiert, isoliert und anschließend mittels quantitativer RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaktion), DNA-Expressions-Chip-Verfahren oder anderer geeigneter Verfahren analysiert.
Die experimentellen Befunde der durchgeführten Bestimmung der RNA- Konzentration spezifischer Transkripte nach Durchführung des beschriebenen Verfahrens belegen eindeutig, dass die eingangs gestellten Aufgaben durch die vorliegende Erfindungen in der Tat gelöst werden.
Die beigefügten Figuren geben folgende Sachverhalte wieder (p: statistische Signifikanz, die Messungen wurden sofern nicht anders angegeben in humanem Vollblut vorgenommen):
Fig. 1 gibt eine schematische Darstellung des Prinzips der in-vitro Stimulationstests wieder;
Fig. 2 stellt die basale TNF-α Genexpression bei der Hämodialyse verschiedener Dialysezentren dar;
Fig. 3 stellt die basale TGF-β Genexpression bei der Hämodialyse verschiedener Dialysezentren dar;
Fig. 4 verkörpert eine Darstellung der TNF-α-Sekretion auf Proteinebene bei Normalpersonen nach Stimulation mit PHA im Vergleich zu einer Mediumkontrolle in Abhängigkeit von der Zeit;
Fig. 5 verkörpert eine Darstellung der TNF-α-Produktion auf RNA-Ebene nach Stimulation mit PHA in Abhängigkeit von der Zeit (TNF-α-Moleküle pro 10³ Moleküle β-Aktin);
Fig. 6 verkörpert eine Darstellung der IFN-γ-Sekretion auf Proteinebene bei Normalpersonen nach Stimulation mit PHA im Vergleich zu einer Mediumkontrolle in Abhängigkeit von der Zeit;
Fig. 7 verkörpert eine Darstellung der IFN-γ-Produktion auf RNA-Ebene nach Stimulation mit PHA in Abhängigkeit von der Zeit (IFN-γ-Moleküle pro 10³ Moleküle β-Aktin);
Fig. 8 verkörpert eine Darstellung der Sekretion des Zytokins IL-10 auf Proteinebene bei Normalpersonen nach Stimulation mit PHA im Vergleich zu einer Mediumkontrolle in Abhängigkeit von der Zeit;
Fig. 9 verkörpert eine Darstellung der Produktion des Zytokins IL-10 auf RNA- Ebene nach Stimulation mit PHA in Abhängigkeit von der Zeit (IL-10- Moleküle pro 10³ Moleküle β-Aktin);
Fig. 10 verkörpert eine Darstellung der Sekretion des Zytokins 1L-4 auf Proteinebene bei Normalpersonen nach Stimulation mit PHA im Vergleich zu einer Mediumkontrolle in Abhängigkeit von der Zeit;
Fig. 11 verkörpert eine Darstellung der Produktion des Zytokins IL-4 auf RNA-Ebene nach Stimulation mit PHA in Abhängigkeit von der Zeit (IL-4-Moleküle pro 10³ Moleküle β-Aktin);
Fig. 12 gibt die TNF-α-Genexpression bei der Hämodialyse und nach PHA- Stimulation wieder;
Fig. 13 gibt den Quotienten aus der Differenz der PHA-Stimulation bezüglich der TNF-α-Genexpression und der basalen Expression für die verschiedenen Dialysezentren wieder;
Fig. 14 gibt die TGF-β-Genexpression bei der Hämodialyse und nach PHA- Stimulation wieder (TGF-β-Moleküle pro 10³ Moleküle β-Aktin);
Fig. 15 gibt den Quotienten aus der Differenz der PHA-Stimulation bezüglich der TGF-β-Genexpression und der basalen Expression für die verschiedenen Dialysezentren wieder.
Die unten aufgeführten Beispiele der Anwendung des Verfahrens zeigen u. a. auch, dass klinische Probenmaterialien aus verschieden vorbehandelten Patienten unterschiedlich auf die Stimulation der Genexpression bei Anwendung des beschriebenen Verfahrens zur Erhöhung der Transkriptkonzentrationen reagieren können, die medizinisch relevante Informationen liefern können. Dieses ist überraschend, da davon auszugehen war, dass die Zugabe - von Stimulantien/Repressoren zu klinischen Probenmaterialien aus Patienten zu ähnlichen Effekten führt. Es war bislang kein Verfahren bekannt, dass individuelle Veränderungen im RNA-Profil bewirkt und messbar macht, woraus diagnostische Schlüsse für Patienten gezogen werden können. Gleichzeitig konnte durch Anwendung des Verfahrens gezeigt werden, dass durch die Erhöhung der Transkriptkonzentrationen eine deutliche Sensitivitätssteigerung der nachfolgenden RNA-Analytik erreicht werden konnte.
Es wird ausdrücklich darauf hingewiesen, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch die Ermittlung der Wirkung von Wirkstoffen auf Proben aus verschiedenen Patienten ex vivo zulässt. Dabei wird jeder Stoff in seiner individuellen Wirkung auf biologische/klinische Proben getestet. Die unten aufgeführten Beispiele zeigen, dass z. B. der Effekt unterschiedlicher Dialysetechniken auf das Immunsystem von Menschen untersucht werden kann.

Beispiele

Patienten wird während der Hämodialyse Blut zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen. Das Blut wird zum Teil sofort mit einer wässrigen Lösung aus 4% Tetradecyltrimethylammoniumoxalat und 200 mM Weinsäure, pH 3,7 (QCX-Lösung) stabilisiert oder zum anderen Teil im Volumenverhältnis 1 : 2 mit RPMI 1640 Medium gemischt und mit 10 µg/ml PHA über einen Zeitraum von zwei Stunden aktiviert und anschließend mit QCX-Lösung versetzt.

Ergebnisse der Analysen der basalen Werte bei Dialysepatienten

Anschließend wird die RNA aus allen Proben isoliert und nach quantitativer RT-PCR (TaqMan RT-PCR) mit spezifischen Oligonukleotiden für Interleukin(IL)-4, Interferon(IFN)-γ, Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)-α, IL-10, Tissue-Growth-Factor(TGF)- β und β-Aktin durchgeführt. Während im peripheren Blut Transkripte für β-Aktin, TNF- α und TGF-β nachgewiesen werden konnten, waren die Transkripte der Zytokine IL- 4, IL-10 und IFN-γ nicht nachweisbar. In Fig. 2 (TNF-α) und in Fig. 3 (TGF-β) sind die Zahl von TNF-α- und TGF-β mRNA-Molekülen auf 10⁶ β-Aktin mRNA-Moleküle normiert und zu zwei verschiedenen Zeitpunkten (vor und 120 min. nach Dialysebeginn) dargestellt. Zusätzlich wurden Patienten aus zwei verschiedenen Dialysezentren, die jeweils sich unterscheidende Dialysetechniken verwenden, miteinander verglichen. Man erkennt, dass die basalen Spiegel von TNF-α mRNA (Fig. 2) im Vergleich zu gesunden Kontrollen bei Dialysepatienten erhöht sind. Bei den Patienten aus beiden Zentren kommt es im Verlauf der Dialyse zu einem signifikanten Anstieg von TNF-α. Die basalen Spiegel von TGF-β mRNA (Fig. 3) sind bei Dialysepatienten im Vergleich zu Normalpersonen signifikant erniedrigt. Während es im Dialysezentrum 1 im Verlaufe der Behandlung zu einem signifikanten Anstieg von TGF-β kommt, ist in Zentrum 2 keine Änderung nachweisbar.
Um auch die mRNA von IL-4, IL-10 und IFN-γ im peripheren Blut nachzuweisen wurde der oben beschriebene Stimulationstest (Fig. 1) etabliert. Dieser ist in seiner Handhabung sehr einfach und benötigt keine Inkubatoren, so dass dieser Test auch in jeder Arztpraxis durchführbar ist.

Ergebnisse aus dem Blut von Normalpersonen

In Experimenten mit dem Blut von 3 gesunden Normalpersonen wurde der Test charakterisiert und die RNA-Expression (Fig. 5, 7, 9, 11) mit der jeweiligen Proteinsekretion verglichen (Fig. 4, 6, 8, 10). Als erstes Transkript wurde TNF-α mRNA untersucht, da es bereits im basalen Zustand nachgewiesen werden kann. Auf Proteinebene zeigte TNF-α nach 5 Stunden ein Maximum der Proteinsekretion bei den Normalpersonen (Fig. 4), während TNF-α auf RNA-Ebene (Fig. 5) bereits nach zwei Stunden maximal stimuliert war. Die Anzahl von nachweisbaren mRNA- Molekülen stieg durch die Stimulation um das 50-300-fache im Vergleich zum unstimulierten Zustand an (Fig. 13, Probanden).
Die im basalen Zustand nicht nachweisbare mRNA des IFN-γ (Fig. 7), IL-10 (Fig. 9) und IL-4 (Fig. 11) waren nach der PHA-Stimulation mittels quantitativer RT-PCR nachweisbar. Im Vergleich zu der Proteinexpression (Fig. 6, 8, 10) wurde auch hier die RNA-Expression deutlich früher nachgewiesen und das Maximum der RNA- Expression lag mit 2 bis 6 Stunden deutlich früher, als das der Proteine nach 24 Stunden oder später. Entgegen der Erwartung von vielen Wissenschaftlern zeigte der Vergleich von drei verschiedenen Blutproben eine sehr vergleichbare Stimulation sowohl in der Höhe wie auch im Zeitpunkt der maximalen Stimulation.

Ergebnisse der Stimulation bei Dialysepatienten

Der Stimulationstest wurde auch bei den schon zuvor dargestellten Dialyse-Patienten angewendet, indem zusätzlich zu den basalen Blutabnahmen Blut im oben dargestellten Stimulationsassay stimuliert, d. h. im Volumenverhältnis 1 : 2 mit RPMI 1640-Medium gemischt, mit 10 µg/ml PHA über einen Zeitraum von zwei Stunden aktiviert und anschließend erneut mit QCX-Lösung versetzt.
Anschließend wurde die RNA aus allen Proben isoliert und - wie zuvor beschrieben - einer quantitativen TaqMan RT-PCR unterworfen. Die Ergebnisse für TNF-α und TGF-β sind in den Fig. 12 bzw. Fig. 14 dargestellt. Durch die Stimulation mit PHA kommt es auch bei den Dialysepatienten zu einem deutlichen Anstieg der RNA für TNF-α mRNA.
Während es bei der basalen TNF-α Expression im Verlauf der Dialyse zu einem Anstieg der mRNA kam (Fig. 2), nahmen unter Stimulation die TNF-α mRNA Werte bei den Patienten im Zentrum 1 nach 2 Stunden Dialyse deutlich ab. Dieses Phänomen wurde jedoch nicht in Zentrum 2, das mit einer anderen Dialysetechnik arbeitet, nicht beobachtet.
In einer weiteren Analyse wurde für die einzelnen Patienten die individuelle Stimulierbarkeit bestimmt, indem der Quotient aus stimulierter und basaler mRNA- Expression berechnet wurde. Dabei zeigten sich für die individuelle Stimulierbarkeit von gesunden Kontrollen und Patienten vor Beginn der Dialyse keine Unterschiede (vgl. Fig. 13). Im Verlaufe der Dialyse (2 Stundenwert) zeigt sich bei beiden Dialysetechniken eine signifikant reduzierte Stimulierbarkeit von TNF-α. Diese Befunde sind von besonderem klinischen Interesse, da Patienten unter der Dialyse deutliche Immunveränderungen zeigen. Durch den Verlust der Fähigkeit einer TNF-α Stimulation lässt sich eine erhöhte Infektionsanfälligkeit dieser Patienten erklären. Mit diesem Verfahren könnten nun neue Dialysetechniken auf eine bessere Biokompatibilität untersucht werden.
Die Stimulation führt jedoch nicht bei allen Genen zu einer Stimulation der Genexpression. Für TGF-β zeigte sich durch die Zugabe von PHA eine signifikant reduzierte RNA-Expression (Fig. 3 versus Fig. 10) sowohl für normale Kontrollen als auch für Dialysepatienten. Während sich die basale TGF-β mRNA Expression mit der Dialysetechnik in Zentrum 2 nicht änderte (Fig. 3) kam es unter der PHA Zugabe zu einem Anstieg der TGF-β Expression (Fig. 14). In Zentrum 1 stieg die basale TGF-β Expression an (Fig. 3), jedoch nicht die stimulierte Expression (Fig. 14). Die Berechnung der Stimulierbarkeit (Quotient stimuliert/basal) von TGF-β (Fig. 15) zeigt bei Dialysepatienten eine signifikant geringeren Abfall der TGF-β Expression im Vergleich zu gesunden Kontrollen. Die TGF-β Stimulation zeigte im Verlauf der Dialyse keine Unterschiede, die nach dem Verfahren 1 durchgeführt wurde. Danach kommt es im Verlauf der Dialyse zu einer Normalisierung der TGF-β-Expression im Vergleich zu den Normalpersonen.
Die erhaltenen Ergebnisse liefern einen eindeutigen Beleg für die erfindungsgemäß erzielte reproduzierbare Verstärkung der RNA-Expression, die zu zusätzlichen biologisch/medizinischen Informationen führt. Weiterhin können mit diesem Verfahren mehr relevante Transkripte als im unstimulierten Zustand nachgewiesen werden. Zusätzlich kann durch dieses Verfahren schneller und sensitiver die Änderung der Zellregulation gemessen werden als durch Proteine.

Claims

1. Verfahren zur Änderung von Transkriptkonzentrationen von Ribonukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Nukleinsäurehaltige Probe zunächst mit einem Stimulans oder Repressor und anschließend mit einer stabilisierenden Verbindung insbesondere eines Salzes der allgemeinen Formel

[Y⁺R₁R₂R₃R₄]X^- (I)

worin
Y Stickstoff oder Phosphor und
R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander einen unverzweigten oder verzweigten C₁-C₂₀-Alkylrest und/oder einen C₆-C₂₀-Arylrest sowie einen C₆- C₂₆-Aralkylrest
oder R₁ eine Gruppe der allgemeinen Formel -(CH₂)_n-Z⁺R₅R₆R₇
worin
n eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6
Z Stickstoff oder Phosphor und
R₅, R₆, und R₇ unabhängig voneinander einen unverzweigten oder verzweigten C₁-C₂₀-Alkylrest und/oder einen C₆-C₂₀-Arylrest sowie einen C₆-C₂₆-Aralkylrest
X^- ein oder mehrere Anion(en) einer anorganischen oder organischen, ein- oder mehrbasischen Säure
bedeuten können, ggf. mit einem oder mehreren Protonendonor(en) versetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Y und ggf. Z für ein Stickstoffatom steht.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass die kationische Verbindungen aus einem Ammoniumsalz besteht, in dem R₁ einen höheren Alkylrest - vorzugsweise mit 12, 14 oder 16 Kohlenstoffatomen und R₂, R₃ und R₄ jeweils eine Methylgruppe bedeutet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass R₁ eine Aralkylgruppe - vorzugsweise eine Benzylgruppe -, R₂ einen höheren Alkylrest - vorzugsweise mit 12, 14 oder 16 Kohlenstoffatomen - und R₃ und R₄ eine Methylgruppe bedeutet.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Gegenion X Bromid, Chlorid, Phosphat, Sulfat, Formiat, Acetat, Propionat, Oxalat oder Succinat eingesetzt werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass der Protonendonor aus der Gruppe der gesättigten aliphatischen Monocarbonsäuren, der ungesättigten Alkenyl-carbonsäuren, der gesättigten und/oder ungesättigten aliphatische C₂-C₆-Dicarbonsäuren und/oder Tricarbonsäuren, der aliphatischen Ketodicarbonsäuren, der Aminosäuren oder aus der Gruppe der Mineralsäuren oder deren Salze allein oder in Kombination ausgewählt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als aliphatische Monocarbonsäure eine C₁-C₆-Alkyl-carbonsäure, vorzugsweise Essigsäure, Propionsäure, n-Buttersäure, n-Valeriansäure, Isovaleriansäure, Ethyl-methylessigsäure (2-Methyl-buttersäure), 2,2-Dimethylpropionsäure (Pivalinsäure), n-Hexansäure, n-Octansäure, n-Decansäure bzw. n-Dodecansäure (Laurinsäure) oder Mischungen der genannten Säuren eingesetzt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als aliphatische Alkenyl-carbonsäure Acrylsäure (Propensäure), Methacrylsäure, Crotonsäure, iso-Crotonsäure oder Vinylessigsäure oder Mischungen der genannten Säuren eingesetzt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet als gesättigte aliphatische C₂-C₆-Dicarbonsäure eine Dicarbonsäure aus der Gruppe Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure bzw. Adipinsäure oder Mischungen der genannten Säuren eingesetzt werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Protonendonoren aliphatische Dicarbonsäuren, vorzugsweise Oxalsäure oder Bernsteinsäure oder Mischungen der genannten Säuren eingesetzt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Protonendonoren aliphatische Hydroxi-di- und -tricarbonsäuren, vorzugsweise Tartronsäure, D-(+)-, L-(-)- oder DL-Äpfelsäure, (2R, 3R)-(+)-Weinsäure, (2S, 3S)-(-)-Weinsäure, meso-Weinsäure und Zitronensäure oder Mischungen der genannten Säuren eingesetzt werden.

12. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Protonendonoren ungesättigte Dicarbonsäuren, vorzugsweise Malein- und/oder Fumarsäure oder Mischungen der genannten Säuren eingesetzt werden.

13. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Protonendonoren ungesättigte Tricarbonsäuren, vorzugsweise Aconitsäure, oder Mischungen dieser Säuren eingesetzt werden.

14. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Protonendonoren aliphatische Ketodicarbonsäuren, vorzugsweise Mesoxalsäure oder Oxalessigsäure, oder Mischungen der genannten Säuren eingesetzt werden.

15. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Protonendonoren Aminosäuren, vorzugsweise Aminoessigsäure (Glycin), α- Aminopropionsäure (Alanin), α-Amino-iso-valeriansäure (Valin), α-Amino-isocapronsäure (Leucin) und α-Amino-β-methylvaleriansäure (Isoleucin), oder Mischungen der genannten Säuren eingesetzt werden.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass zur Stabilisierung des RNA-Profiles Salzlösungen, wie z. B. Ammoniumsulfat, und/oder ein organisches Lösungsmittel, wie z. B. aliphatische, verzweigte oder unverzweigte Alkohole mit eins bis 5 Kohlenstoffatomen - wie z. B. Ethanol, Propanol oder Iso-Propanol -, verzweigte oder unverzweigte Aldehyde oder Ketone mit einem bis 5 Kohlenstoffatomen - wie z. B. Formaldehyd oder Aceton -, halogenierte verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffe mit eins bis fünf Kohlenstoffatomen wie z. B. Chloroform -, Amide von organischen verzweigten oder unverzweigten Carbonsäure mit eins bis fünf Kohlenstoffatomen - wie z. B. Formamid -, oder aromatische Hydroxyverbindungen mit sechs bis zehn Kohlenstoffatomen - wie z. B. Phenol -, eine chaotrope Verbindung, wie z. B. Guanidinium-hydrochlorid, Guanidinium-isothiocyanat oder Harnstoff -, ein Detergenz, wie z. B. SDS -, Metallionen komplexierende Verbindungen, wie z. B. EDTA, reduzierend wirkende Verbindungen, wie z. B. β-Mercaptoethanol, DMSO als Einzelsubstanz oder in Form einer Mischung zugesetzt werden und ggf. ein Protonendonor als weiterer Mischungsbestandteil zugegen ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass als Verbindung gemäß der allgemeinen Formel I Tetradecyltrimethylammoniumoxalat (QCX) ggf. mit einem Protonendonor eingesetzt wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass vor oder gleichzeitig mit der Zugabe der Verbindung zur Stimulation/Repression der RNA-Synthese die biologische/klinische Probe verdünnt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit zur Verdünnung der biologischen Probe ein Zellkulturmedium, wie z. B. RPMI 1640, oder physiologische Kochsalzlösung verkörpert.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung zur Stimulation und/oder Repression der Genexpression aus der Klasse der Proteine, der Nukleinsäuren, der Fette, der Kohlehydrate, der Allergene, der Toxine, der Tumorantigene, der Zytokine, der Chemokine, der Monokine, der Lektine, der Peptide, der Hormone, der Umweltgifte, der Vitamine, der Stoffwechselprodukte, der Nahrungsmittel, der Arzneimittel oder anderer Wirkstoffe, der Wachstumsfaktoren, der Erreger, wie Viren, Bakterien Protozoen oder Pilze stammt.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass als die Änderung der Transkriptkonzentration bewirkende Substanz PHA eingesetzt wird.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass als Probenmaterial (biologische Probe) eine Körperflüssigkeit eingesetzt wird.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass als Körperflüssigkeit Blut, Plasma, Serum, Zellen, Leukozytenfraktionen, Crusta Phlogistica, Sputum, Urin oder Sperma eingesetzt wird.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 dadurch gekennzeichnet, dass als Probenmaterial (biologische Probe) Faeces, Abstriche, Punktate, Gewebeproben jeder Art - wie z. B. Biopsien -, Gewebeteile und Organe, die freie oder gebundene Nukleinsäuren enthalten, eingesetzt werden.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 dadurch gekennzeichnet, dass als biologische Probe eine Umweltprobe oder eine Lebensmittelprobe eingesetzt wird.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet dass zur Stabilisierung des RNA-Profiles die stimulierte oder reprimierte Probe in einem Temperaturbereich von -80°C bis +8°C gehalten wird

27. Kit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 26 enthaltend ein Aufnahmegefäß zum Sammeln der Probe, eine stimulierende und/oder reprimierende Substanz sowie eine Verbindung zur Stabilisierung des RNA-Profiles sowie ggf. eine Lösung zur Verdünnung der biologischen Probe.

28. Kit nach Anspruch 27, enthaltend eine Vorrichtung zum Abnehmen und Sammeln von Blut, mindestens ein Zellkulturmedium - wie z. B. RPMI 1640 - mindestens eine zur Änderung der Transkriptkonzentration befähigte Verbindung - wie z. B. PHA- sowie eine Verbindung der allgemeinen Formel I.

29. Verfahren zur Änderung von Transkriptkonzentrationen von Ribonukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass zur Änderung der Transkriptkonzentration eine Temperaturerhöhung oder Temperaturerniedrigung der biologischen Probe durchgeführt wird.