WO2003072816A2 - Verfahren zur änderung der transkriptkonzentrationen in ribonukleinsäurehaltigen biologischen proben - Google Patents

Verfahren zur änderung der transkriptkonzentrationen in ribonukleinsäurehaltigen biologischen proben Download PDF

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WO2003072816A2
WO2003072816A2 PCT/EP2003/001966 EP0301966W WO03072816A2 WO 2003072816 A2 WO2003072816 A2 WO 2003072816A2 EP 0301966 W EP0301966 W EP 0301966W WO 03072816 A2 WO03072816 A2 WO 03072816A2
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Stephan Martin
Reiner FÜTH
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Qiagen Gmbh
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for changing transcript concentrations and to a kit for carrying out this method in which a sample containing nucleic acid is first mixed with a stimulant or repressor and then with a stabilizing compound.
  • test systems which have hitherto been established in the prior art and are used to diagnose diseases are based almost exclusively on the analysis of proteins.
  • the utilization of gene expression profiles for such purposes is still at a very early stage and, accordingly, has hardly found its way into clinical practice.
  • transcript concentrations In addition to increasing the transcript concentrations, it is also conceivable to draw analytical or prognostic conclusions from the reaction of a biological sample to the repression of the transcript synthesis, that is to say the reduction in transcript reactions.
  • Another difficulty after the addition of stimulants or repressors to the biological / clinical sample is that after a defined time the RNA profile generated has to be fixed in the sample in order to enable reproducible, standardized and comparable analyzes. Without such a stabilization of the RNA profile to take place at a defined point in time, the change in the RNA profile produced by the stimulation would continue uncontrollably and not reproducibly.
  • the difficulty arises particularly when processing several samples in parallel. To obtain standardized results, the duration of the stimulation must be exactly the same for all samples.
  • the currently available methods e.g. the addition of toxic phenol or phenol-chloroform solutions or the rapid freezing of the stimulated or repressed samples, e.g. in liquid nitrogen can be used to a limited extent, but are not suitable for routine use. In addition, they usually involve complex procedures for isolating the RNA.
  • the object of the present invention is therefore to reproducibly and significantly change or, in particular, to increase the number of transcripts detectable using the methods known from the prior art.
  • a further object of the present invention is to provide a method which, based on the RNA profile generated by the stimulation and / or repression of the gene expression, provides analytical and diagnostic information about the condition of the biological / clinical sample and thus possibly about the Organism from which the sample originates, such as a patient.
  • RNA profile after a defined duration of the stimulation, so that further changes by synthesis and / or degradation of RNA molecules can be prevented in order to enable standardized, reproducible analyzes in routine ,
  • the immediate stabilization of the RNA profile is also very important for the non-stimulated control samples, which have to be compared with the stimulated samples to determine the effect of the stimulant or repressor.
  • the non-stimulated control samples are stabilized at the point in time at which the samples to be stimulated are provided with the stimulant.
  • Transcript concentrations are determined by first testing a nucleic acid containing sample with a stimulant or repressor then with a stabilizing compound, preferably a salt of the general formula
  • Ri, R 2 , R 3 and ⁇ independently of one another an unbranched or branched d-C 20 alkyl radical and / or a C 6 -C 2 o-aryl radical and a C 6 -C 26 aralkyl radical
  • n is an integer 1, 2, 3, 4, 5 or 6
  • R 5 , R 6 and R independently of one another are an unbranched or branched CC 2 o -alkyl radical and / or a C 6 -C 2 o-aryl radical and a C 6 -C 26 aralkyl radical
  • Y and optionally Z are preferably nitrogen.
  • dC 6 alkyl generally represents a branched or unbranched hydrocarbon radical having 1 to 6 carbon atoms, which may optionally be substituted by one or more halogen atoms, preferably fluorine, which are the same as or can be different.
  • halogen atoms preferably fluorine
  • a higher alkyl radical represents a branched or unbranched C 7 -C 20 -alkyl radical which may be substituted by one or more halogen atoms, preferably fluorine, which may be identical or different from one another.
  • halogen atoms preferably fluorine
  • hydrocarbon radicals may be mentioned as examples: branched or unbranched heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tetradecyl, hexadecyl, dodecadecyl and eicosyl.
  • aryl stands for an aromatic mono- or polynuclear radical with 4 to 22 C atoms, which can optionally contain one or two heteroatoms. Examples include: phenyl, naphthyl, anthracyl or pyrol, furan, thiophene, pyridine, pyridazine, pyrimidine or pyrazine, and optionally by halogen (F, Cl, Br, J) - preferably fluorine or independently by an alkyl group can be substituted one or more times from one another.
  • halogen F, Cl, Br, J
  • Aralkyl - unless defined otherwise - a monocyclic or polycyclic aryl group as defined below definition of a C- ⁇ -C 6 alkylene, C 3 -C 6 - alkenylene or C 3 -C 6 -Alkinylen Kunststoff, for which apply the definition of the CrC 6 alkyl, C 3 -C 6 alkenyl and C 3 -C 6 alkynyl groups accordingly to the cationic Partial structure is bound.
  • the benzyl group is preferred.
  • C 3 -C 6 alkenyl generally represents a branched or unbranched hydrocarbon radical having 3 to 6 carbon atoms, one or possibly more double bonds, which may have one or more halogen atoms. can preferably be fluorine-substituted, which can be identical or different from one another.
  • the following hydrocarbon radicals may be mentioned as examples:
  • 2-propenyl (allyl), 2-butenyl, 3-butenyl, 1-methyl-2-propenyl, 2-methyl-2-propenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 4-pentenyl, 1-methyl-2-butenyl , 2-methyl-2-butenyl, 3-methyl-2-butenyl, 1-methyl-3-butenyl, 2-methyl-3-butenyl, 3-methyl-3-butenyl, 1, 1-dimethyl-2-propenyl , 1, 2-dimethyl-2-propenyl, 1-ethyl-2-propenyl, 2-hexenyl, 3-hexenyl, 4-hexenyl, 5-hexenyl, 1-methyl-2-pentenyl, 2-methyl-2-pentenyl , 3-methyl-2-pentenyl, 4-methyl-2-pentenyl, 1-methyl-3-pentenyl, 2-methyl-3-pentenyl, 3-methyl-3-pentenyl, 4-methyl-3-pentenyl, 1 -Met
  • C 3 -C 6 -alkynyl generally represents a branched or unbranched hydrocarbon radical having 3 to 6 carbon atoms, one or possibly more triple bonds, which may have one or more halogen atoms -
  • fluorine - may be substituted, which may be the same or different from each other.
  • hydrocarbon radicals may be mentioned as examples:
  • 2-propynyl (propargyl), 2-butynyl, 3-butynyl, 1-methyl-2-propynyl, 2-methyl-2-propynyl, 2-pentynyl, 3-pentynyl, 4-pentynyl, 1-methyl-2-butynyl , 2-methyl-2-butynyl, 3-methyl-2-butynyl, 1-methyl-3-butynyl, 2-methyl-3-butynyl, 3-methyl-3-butynyl, 1, 1-dimethyl-2- propynyl, 1, 2-dimethyl-2-propynyl, 1-ethyl-2-propynyl, 2-hexynyl, 3-hexynyl, 4-hexynyl, 5-hexynyl, 1-methyl-2-pentynyl, 2-methyl-2- pentynyl, 3-methyl-2-pentynyl, 4-methyl-2-pentynyl, 1-methyl-3-pentyn
  • R 1 is a higher alkyl radical - preferably having 12, 14 or 16 carbon atoms and R 2 , R 3 and R 4 are each a methyl group.
  • R 1 is an aralkyl group - preferably a benzyl group -
  • R 2 is a higher alkyl radical - preferably having 12, 14 or 16 carbon atoms - and R 3 and * are a methyl group.
  • Suitable counterions X " are preferably all anions of mineral or hydrohalic acids or anions of mono- or dibasic organic acids such as acetate or oxalate, malonate, succinate or citrate.
  • Bromide, chloride, phosphate, sulfate, formate, acetate, propionate, oxalate or succinate are preferred as anions.
  • tetradecyltrimethylammonium oxalate is particularly preferably used, optionally in conjunction with a proton donor.
  • Proton donors in the sense of the present invention are primarily saturated aliphatic monocarboxylic acids, unsaturated alkenylcarboxylic acids, saturated and / or unsaturated aliphatic C 2 -C 6 -dicarboxylic acids, aliphatic ketocarboxylic acids or ketodicarboxylic acids and amino acids as well Mineral acids or their salts are suitable alone or in combination. All of the organic acids mentioned can be used in unsubstituted form or as substituted derivatives, of which - unless stated otherwise - preference is given to the unsubstituted derivatives or the derivatives substituted one or more times by hydroxyl groups. Molecular formulas and trivial names of some acids can be found in Table 1.
  • saturated aliphatic monocarboxylic acids in the context of the present invention are preferably understood to be CrC ⁇ -alkylcarboxylic acids, including acetic acid, propionic acid, n-butyric acid, n-valeric acid, isovaleric acid, ethyl-methyl-acetic acid (2-methyl-butyric acid), 2,2-
  • Dimethylpropionic acid pivalic acid
  • n-hexanoic acid n-octanoic acid
  • n-decanoic acid n-dodecanoic acid
  • lauric acid n-dodecanoic acid
  • ketocarboxylic acids derived from the acids mentioned can also be used.
  • unsaturated alkenylcarboxylic acids in the context of the invention are acrylic acid (propenoic acid), methacrylic acid, crotonic acid, iso-crotonic acid and vinyl acetic acid.
  • saturated aliphatic C 2 -C 6 -dicarboxylic acids such as, for example, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid or adipic acid, of which oxalic acid and succinic acid are very particularly preferred.
  • Aliphatic hydroxy-di- and tricarboxylic acids including tartronic acid, D- (+) -, L - (-) - or DL-malic acid, (2R, 3R) - (+) - tartaric acid are particularly preferably used to achieve the object according to the invention , (2S, 3S) - (-) - tartaric acid, meso-tartaric acid and citric acid are very particularly preferred.
  • Unsaturated dicarboxylic acids such as maleic or fumaric acid or unsaturated tricarboxylic acids such as aconitic acid are also suitable for solving the present problem.
  • aliphatic ketodicarboxylic acids can also be used as additives, such as, for example, mesoxalic acid and oxaloacetic acid, of which oxaloacetic acid is very particularly preferred.
  • amino acids can be used for the purposes of the present invention, including ⁇ -amino acids, such as e.g. Amino acetic acid (glycine), ⁇ -aminopropionic acid (alanine), ⁇ -amino / so-valeric acid (valine), ⁇ -amino / so-caproic acid (leucine) and ⁇ -amino- ⁇ -methylvaleric acid (isoleucine) are preferred.
  • Glycine is particularly preferably used.
  • the proton donors mentioned can be used as individual substances or in the form of the pure stereoisomers as well as in mixtures.
  • Mineral acids and their salts can also be used as further additives for the purposes of the present invention.
  • the salts of mineral acids - such as phosphoric acid or sulfuric acid - are preferred Alkali metals or their ammonium salts for use. Phosphoric acid and ammonium sulfate are particularly preferably used.
  • the additive can be present in the composition in different concentrations. It is also possible to use combinations of different additives. Depending on the nature of the additive, other concentration ranges can prove to be advantageous. It is also possible to use combinations of different additives.
  • the compounds mentioned are known from the prior art and can be prepared by known processes.
  • the compounds can be used in pure substance, in the form of their mixtures and as an - aqueous - solution.
  • RNA profile can also be stabilized by adding salt solutions, e.g. Ammonium sulfate, and / or an organic solvent such as e.g. aliphatic, branched or unbranched alcohols with one to five carbon atoms, e.g. Ethanol, propanol or iso-propanol, branched or unbranched aldehydes or ketones with one to 5 carbon atoms, e.g. Formaldehyde or acetone, halogenated branched or unbranched hydrocarbons with one to five carbon atoms, e.g. Chloroform, amides of organic branched or unbranched carboxylic acid with one to five carbon atoms, e.g.
  • salt solutions e.g. Ammonium sulfate
  • organic solvent such as e.g. aliphatic, branched or unbranched alcohols with one to five carbon atoms, e.g. Ethanol, propano
  • Formamide or aromatic hydroxy compounds having six to ten carbon atoms, e.g. Phenol, a chaotropic compound such as Guanidinium hydrochloride, guanidinium isothiocyanate or urea, a detergent, e.g. SDS, metal ion complexing compounds, e.g. EDTA, reducing compounds, e.g. ß-mercaptoethanol, DMSO as a single substance or in the form of a mixture, and a proton donor may be present as a further component of the mixture.
  • a chaotropic compound such as Guanidinium hydrochloride, guanidinium isothiocyanate or urea
  • a detergent e.g. SDS
  • metal ion complexing compounds e.g. EDTA
  • reducing compounds e.g. ß-mercaptoethanol, DMSO as a single substance or in the form of a mixture
  • DMSO a proton donor
  • RNA profile by keeping the stimulated or repressed sample in a temperature range from -200 ° C to + 8 ° C, preferably from -80 ° C to + 8 ° C.
  • biological and / or clinical samples such as, inter alia, body fluids, such as blood, plasma, serum, spinal fluid,, sputum, urine, sperm, ascites fluid, and cells obtained from blood can be used as sample material (biological sample) Leukocyte fractions, crusta phlogistica, faeces, smears, punctures, tissue samples of all kinds, such as biopsies, tissue parts and organs, bone marrow, which contain free or bound nucleic acids or cells containing nucleic acids, are used.
  • microorganisms e.g. Bacteria, but also single or multi-cell eukaryotes are used, the microorganisms e.g. can also be contained in the biological and / or clinical sample.
  • Another important component of the invention is the dilution of the sample before stimulation or repression. This is particularly the case when using blood. Surprisingly, it was found that tests which were carried out with undiluted blood did not lead to an increase in mRNA expression.
  • the dilution can e.g. with RPMI1640 medium or, for example, with physiological saline. Other suitable media are known to the person skilled in the art and are readily available commercially.
  • the sample to be examined - in particular blood or tissue sample - is analyzed with a stimulant / repressor - such as PHA (phytohaemaglutinin) [A. Kretowski et al., Immunol. Lett. 7 ⁇ (2) (2000) 85; I. Wilke et al., Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. 246 (1996) 279].
  • PHA phytohaemaglutinin
  • a stimulant / repressor - such as PHA (phytohaemaglutinin)
  • PWM Poke Weat Mitogen
  • IL2 Interleukin 2
  • hsp heat shock proteins
  • LPS lipopolysaccharide from bacteria
  • the temperature of the biological sample can be increased or decreased to change the transcript concentration.
  • the transcript concentrations thus generated are then mixed with one or more stabilizing compounds.
  • stabilizing compounds of the general formula I are preferred.
  • RNA and protein levels were determined using the Kolmogorov-Smirnov test. Since a Gaussian distribution could not be assumed for all values, the Mann-Whitney test for independent and the Wilcoxon matched pairs test was used for paired values (the measurements were carried out in whole human blood unless otherwise stated):
  • Fig. 2 illustrates the basal levels of TNF mRNA per 10 3 molecules of ß-actin mRNA in the course of hemodialysis in two different dialysis centers group;
  • TGF ⁇ mRNA shows the basal levels of TGF ⁇ mRNA based on 10 3 molecules of ⁇ -actin mRNA in the course of hemodialysis in two different dialysis centers;
  • FIG. 4 represents a representation of the secretion of TNF ⁇ protein in normal persons after stimulation with 10 ⁇ g / ml PHA in comparison to one
  • TNF ⁇ -mRNA levels of three different control subjects after stimulation with 10 ⁇ g / ml PHA as a function of time (TNF ⁇ -mRNA molecules per 10 3 molecules of ⁇ -actin mRNA);
  • Fig. 6 represents an illustration of the secretion of IFN ⁇ protein in
  • FIG. 7 embodies a representation of the IFN ⁇ -mRNA levels of three different control subjects after stimulation with 10 ⁇ g / ml PHA as a function of time (IFN ⁇ -mRNA molecules per 10 3 molecules of ⁇ -actin mRNA);
  • Fig. 8 represents an illustration of the secretion of the cytokine IL-10 in
  • Fig. 10 represents an illustration of the secretion of the cytokine IL-4 in
  • 11 represents a representation of the mRNA level of the cytokine IL-4 of three different control subjects after stimulation with 10 ⁇ g / ml PHA as a function of time (IL-4 mRNA molecules per 10 3 molecules of ⁇ -actin mRNA) ;
  • FIG. 12 shows the levels of TNF ⁇ mRNA in the course of hemodialysis and after stimulation with 10 ⁇ g / ml PHA (TNF ⁇ mRNA molecules per 10 3 molecules of ⁇ -actin);
  • FIG. 13 shows the quotient from the TNF ⁇ mRNA level after stimulation with 10 ⁇ g / ml PHA and the basal level for the various dialysis centers;
  • FIG. 14 shows the levels of TGF ⁇ mRNA in the course of the hemodialysis and after stimulation with 10 ⁇ g / ml PHA (TGFß mRNA molecules per 10 3 molecules of ⁇ -actin);
  • the method according to the invention also permits the determination of the effect of active substances on samples from different patients ex vivo. Each substance is tested for its individual effects on biological / clinical samples.
  • the examples below show that, for example, the effect of different dialysis techniques on the human immune system can be examined. Examples
  • Blood is drawn from patients at different times during hemodialysis.
  • the blood is partly stabilized immediately with an aqueous solution of 4% tetradecyltrimethylammonium oxalate and 200 mmol / L tartaric acid, pH 3.7 (QCX solution) at room temperature or partly mixed in a volume ratio of 1: 2 with RPMI 1640 medium and activated with 10 ⁇ g / ml PHA over a period of two hours and then mixed with QCX solution.
  • the samples were each mixed in a 1: 1 ratio with QCX solution.
  • any other volume ratio that seems sensible to a person skilled in the art is also conceivable here, such as 10: 27.6.
  • RNA is then isolated from all samples and after quantitative RT-PCR (TaqMan RT-PCR) with specific oligonucleotides for interleukin (IL) -4, interferon (IFN) - ⁇ , tumor necrosis factor (TNF) - ⁇ , IL -10, Tissue Growth Factor (TGF) -ß and ß-actin performed.
  • IL interleukin
  • IFN interferon
  • TNF tumor necrosis factor
  • TGF Tissue Growth Factor
  • transcripts for ⁇ -actin, TNF ⁇ and TGFß could be detected in the peripheral blood, the transcripts of the cytokines IL-4, IL-10 and IFN ⁇ were not detectable.
  • Fig. 2 (TNF ⁇ ) and in Fig. 3 (TGFß) the number of TNF ⁇ and TGFß mRNA molecules are normalized to 10 6 ß-actin mRNA molecules and at two different times (before and 2 hours after the start of dialysis) shown.
  • patients from two different dialysis centers, each using different dialysis techniques were compared. It can be seen that the basal levels of TNF ⁇ mRNA (FIG. 2) are increased in comparison to healthy controls in dialysis patients.
  • TGFß mRNA (FIG. 3) are significantly reduced in dialysis patients compared to normal people. While there was a significant increase in TGFß in dialysis center 1 during treatment, no change was detectable in center 2.
  • the test was characterized in experiments with the blood of 3 healthy normal persons and the mRNA levels (FIGS. 5, 7, 9, 11) were compared with the respective protein secretion (FIGS. 4, 6, 8, 10).
  • TNF ⁇ mRNA was examined as the first transcript, since it can already be detected in the basal state.
  • TNF ⁇ showed a maximum of protein secretion in normal people after 5 hours (FIG. 4), while TNF ⁇ was maximally stimulated at the RNA level (FIG. 5) after only two hours.
  • the number of detectable mRNA molecules increased by 50-300 times as a result of the stimulation compared to the unstimulated state (FIG. 13, subjects).
  • the RNA was also detected much earlier and the maximum of the RNA expression was 2 to 6 hours earlier than that of the proteins after 24 hours or later.
  • the comparison of blood samples from three different subjects showed a very comparable stimulation both in terms of the amount and at the time of the maximum stimulation.
  • the stimulation test was also used in the previously presented dialysis patients by stimulating blood in addition to the basal blood draws in the stimulation assay shown above, i.e. mixed in a volume ratio of 1: 2 with RPMI 1640 medium, activated with 10 ⁇ g / ml PHA over a period of two hours and then QCX solution was added.
  • RNA was then isolated from all samples and, as described above, subjected to a quantitative TaqMan RT-PCR.
  • the results for TNF ⁇ and TGFß are shown in FIGS. 12 and 'Fig. 14.
  • the stimulation with PHA also results in a significant increase in the RNA for TNF ⁇ mRNA in dialysis patients.
  • the individual stimulability was determined for the individual patients by calculating the quotient of the stimulated and basal mRNA levels. There were no differences in the individual stimulability of healthy controls and patients before the start of dialysis (cf. FIG. 13). In the course of dialysis (2 h value), both dialysis techniques showed a significantly reduced stimulability of TNF ⁇ mRNA synthesis. These findings are of particular clinical interest because patients undergo significant immune changes during dialysis. The loss of the ability to stimulate TNF ⁇ can explain the increased susceptibility to infection of these patients. With this method, new dialysis techniques could now be examined for better biocompatibility.
  • TGFß For TGFß, the addition of PHA showed a significantly reduced mRNA level (Fig. 3 versus Fig. 14) both for control subjects and for dialysis patients. While the basal TGFß-mRNA level did not change with the dialysis technique in center 2 (FIG. 3), the TGFß-mRNA levels increased with the addition of PHA (FIG. 14). In center 1, the basal TGFß mRNA level increased (Fig. 3), but there was no increase under PHA stimulation (Fig. 14). The calculation of the stimulability (quotient stimulated / basal) of TGFß (FIG. 15) showed a significantly smaller decrease in TGFß-mRNA synthesis in dialysis patients compared to control subjects.
  • the TGFß stimulation showed no differences in the course of the dialysis in dialysis center 1.
  • the results obtained provide clear evidence of the reproducible enhancement of RNA expression achieved according to the invention, which leads to additional valuable biological / medical information.
  • more relevant transcripts can be generated than in the unstimulated state and may also only be detected.
  • the change in the regulation of cellular processes can be measured more quickly and more sensitively than with changes at the protein level.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Änderung von Transkriptkonzentrationen sowie ein Kit zur Durchführung dieses Verfahrens, in dem eine nukleinsäurehaltige Probe zunächst mit einem Stimulans oder Repressor und anschliessend mit einer stabilisierenden Verbindung, insbesondere einem Salz der allgemeinen Formel (I) Y+R1R2R3R4 X- versetzt wird.

Description

Verfahren zur Änderung der Transkriptkonzentrationen in ribonukleinsäurehaltigen biologischen Proben
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Änderung von Transkriptkonzentrationen sowie ein Kit zur Durchführung dieses Verfahrens, indem eine nukleinsäurehaltige Probe zunächst mit einem Stimulans oder Repressor und anschließend mit einer stabilisierenden Verbindung versetzt wird.
Die bisher im Stand der Technik etablierten Testsysteme, die zur Diagnose von Krankheiten dienen, basieren nahezu ausschließlich auf der Analyse von Proteinen. Die Nutzbarmachung von Genexpressionsprofilen zu derartigen Zwecken befindet sich noch in einem sehr frühen Anfangsstadium und hat dementsprechend noch so gut wie gar keinen Eingang in die klinische Praxis gefunden.
Der Grund dafür ist darin zu suchen, dass im Stand der Technik bislang eine generelle und große Skepsis hinsichtlich der Messung von zellulären RNA-Profilen zu diagnostischen Zwecken vorhanden ist. So wurden bislang Genexpressionsmuster noch sehr wenig auf ihren diagnostischen Wert untersucht. Die Skepsis resultiert auch aus dem Vorurteil, dass nur die Proteine die Basis für diagnostische Zwecke sein können, das sie die wesentlichen direkten Faktoren sind, die zu einer biologischen Wirkung führen. Weiterhin herrscht im Stand der Technik die Auffassung vor, dass durch die posttranslationale Modifikation von Proteinen weitere wesentliche Funktionen der Wirksamkeit bestimmt werden. Zusammenfassend ist festzustellen, dass im Stand der Technik erhebliche Zweifel bestehen, dass mRNA-Messungen, insbesondere die Messung von stimulierten Proben valide und reproduzierbare Ergebnisse liefert.
Dass beispielsweise der spezifischen Analyse von Nukleinsäuren bisher eine so geringe Bedeutung in der Klinik zukommt, ist u.a. auch darin begründet, dass mit den bisher aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, wie z.B. der Verwendung von sog. DNA-Chips zur Expressionsanalyse, aufgrund der geringen Sensitivität eine vergleichsweise hohe Anzahl der jeweiligen RNA-Moleküle vorhanden sein muss, um detektierbar zu sein. Die Sensitivität dieser Verfahren ist also nicht ausreichend. Daneben besteht insbesondere bei der Analyse von RNA-Expressionsmustern in biologischen und/oder klinischen Proben die Schwierigkeit, dass Transkripte häufig in sehr niedrigen Konzentrationen in der Probe vorliegen, wodurch der Nachweis der Transkripte sehr schwierig oder gar nicht möglich ist.
Aus diesem Grund besteht ein Bedarf nach einer einfachen Methode, die die Konzentration an Transkripten in der biologischen/klinischen Probe in" einer ex vivo Stimulation (EVS-Diagnostik) reproduzierbar erhöht und gleichzeitig nach der anschließend durchzuführenden Analyse des RNA-Profiles der Probe noch analytische Schlüsse über den ursprünglichen physiologischen Zustand der Probe ermöglicht, wodurch auch z.B. diagnostische Aussagen für z.B. Patienten möglich werden.
Hierbei würde die spezifische Veränderung des Genexpressionsmusters auf die Zugabe des Stimulans/Repressors genutzt, um analytische bzw. diagnostische Aussagen zu treffen. Bislang ist aus dem Stand der Technik jedoch kein Verfahren bekannt, das es ermöglichen würde, solche analytischen oder diagnostischen Aussagen aus der Reaktion von biologischen und/oder klinischen Proben auf die Stimulationen zur Erhöhung oder auch Reduktion von Transkriptkonzentrationen zu ziehen.
Ein Bedarf nach der Erhöhung spezifischer Transkripte besteht daneben z.B. auch in der Tumordiagnostik. So können bereits wenige Tumorzellen, z.B. im Blut oder Urin, durch Nachweis tumor-spezifischer Transkripte identifiziert werden (Minimal Residual Disease). Dabei besteht die Schwierigkeit, dass in der Regel nur eine niedrige Anzahl an solchen Transkripten in der biologischen/klinischen Probe enthalten ist. Eine Erhöhung der Konzentration an tumor-spezifischen Transkripten in den Tumorzellen würde die Sensitivität nachfolgender RNA-Analytik erhöhen können. Dies würde dazu führen, dass bereits eine kleine Anzahl an Tumorzellen in einer biologischen/klinischen Probe nachweisbar wäre.
Des weiteren besteht z.B. bei Lebensmitteln oder Umweltproben, wie z.B. Wasser-, Boden- oder Luftproben verschiedenster Herkunft, die mit Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien, aber auch ein- oder mehrzelligen Eukaryonten, oder Viren verseucht sind, ebenfalls der Bedarf nach schnelleren, sensitiveren und einfachen Methoden, um eine möglichst geringe Zahl an potentiellen Erregern noch nachweisen zu können. Eine Erhöhung der Konzentration Erreger-spezifischer Transkripte mit einer anschließenden molekularbiologischen Analyse, wie z.B. RT-PCR oder anderer Nukleinsäure-Amplifikations-Technologien oder Biochip-Technologien, würde auch in diesem Bereich die Sensitivität der Analysen und somit die Sicherheit von z.B. Lebensmitteln erhöhen können.
Neben der Erhöhung der Transkriptkonzentrationen ist es aber auch denkbar aus der Reaktion einer biologischen Probe auf die Repression der Transkriptsynthese, also der Erniedrigung von Transkriptreaktionen, analytische oder prognostische Schlüsse zu ziehen.
Ein weitere Schwierigkeit nach der Zugabe von Stimulantien bzw. Repressoren zu der biologischen/klinischen Probe besteht darin, dass nach einer definierten Zeit das erzeugte RNA-Profil in der Probe fixiert werden muss, um reproduzierbare, standardisierte und vergleichbare Analysen zu ermöglichen. Ohne eine solche zu einem definierten Zeitpunkt zu erfolgende Stabilisierung des RNA-Profils würde die durch die Stimulation erzeugte Veränderung des RNA-Profils unkontrolliert und nicht reproduzierbar fortgesetzt. Die Schwierigkeit besteht insbesondere bei der parallelen Verarbeitung von mehreren Proben. Um standardisierte Ergebnisse zu erhalten, muss die Dauer der Stimulation bei allen Proben exakt gleich sein. Dabei besteht insbesondere der Bedarf nach einem einfachen, routinefähigen Verfahren. Die zur Zeit zur Verfügung stehenden Verfahren, wie z.B. die Zugabe von giftigen Phenol- oder Phenol-Chloroform-Lösungen oder das schnelle Einfrieren der stimulierten oder reprimierten Proben, z.B. in flüssigen Stickstoff sind in begrenztem Umfang einsetzbar, sind aber für die Routine nicht geeignet. Sie ziehen zudem meistens aufwendige Verfahren zur Isolierung der RNA nach sich.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, die Zahl der mit den bisher aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren nachweisbaren Transkripte reproduzierbar und signifikant zu verändern bzw. insbesondere zu steigern. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das aus dem durch die Stimulation und/oder Repression der Genexpression erzeugten RNA-Profil analytische und diagnostische Aussagen über den Zustand der biologischen/klinischen Probe und damit ggf. über den Organismus, aus dem die Probe stammt, wie z.B. eines Patienten, ermöglicht.
Daneben besteht eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung dann, das RNA- Profil nach einer definierten Dauer der Stimulation zu fixieren, sodass weitere Veränderungen durch Synthese und/ober Abbau von RNA-Molekülen verhindert werden können, um standardisierte, reproduzierbare Analysen in der Routine zu ermöglichen.
Die sofortige Stabilisierung des RNA-Profiles ist auch für die nicht stimulierten Kontrollproben sehr wichtig, die mit den stimulierten Proben zur Bestimmung der Wirkung des Stimulans oder Repressors verglichen werden müssen. Die nicht stimulierten Kontrollproben werden zu dem Zeitpunkt stabilisiert, zu dem die zu stimulierenden Proben mit dem Stimulans versehen werden.
Gelöst werden die vorgenannten Aufgabe durch das nachfolgend beschriebene Verfahren, bei dessen Anwendung durch die Messung der Konzentration von spezifischen RNA-Molekülen nach Stimulation der biologischen/klinischen Probe
1. reproduzierbare Werte erhalten werden,
2. diese Werte biologisch/medizinisch relevante Informationen liefern, 3. schneller Änderungen der Aktivierung von Zellregulationen zeigen als die entsprechenden Proteine und
4. sensitiver sind als unstimulierte RNA-Werte oder Proteine und
5. die Zahl der nachweisbaren Transkripte und damit die Sensitivität nachfolgender Analytikverfahren deutlich gesteigert werden kann.
Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren ist einfach durchführbar und damit routinefähig. Transkriptkonzentrationen werden bestimmt, indem eine nukleinsäurehaltige Probe zunächst mit einem Stimulans oder Repressor und anschließend mit einer stabilisierenden Verbindung, bevorzugt einem Salz der allgemeinen Formel
Y+RιR2R3R-. X" (I)
worin
Y Stickstoff oder Phosphor und
Ri, R2, R3 und ^ unabhängig voneinander einen unverzweigten oder verzweigten d- C20-Alkylrest und/oder einen C6-C2o-Arylrest sowie einen C6-C26-Aralkylrest
oder R-ι eine Gruppe der allgemeinen Formel -(CH2)n-Z+R5R6R7
worin
n eine ganze Zahl 1 ,2,3,4,5 oder 6
Z Stickstoff oder Phosphor und
R5, R6, und R unabhängig voneinander einen unverzweigten oder verzweigten C C2o-Alkylrest und/oder einen C6-C2o-Arylrest sowie einen C6-C26-Aralkylrest
X" ein oder mehrere Anion(en) einer anorganischen oder organischen, ein- oder mehrbasischen Säure
bedeuten können, ggf. mit einem oder mehreren Protonendonor(en),
versetzt wird.
Y und ggf. Z bedeuten vorzugsweise Stickstoff. d-C6-Alkyl steht - sofern nicht anders definiert - im allgemeinen für einen verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatom(en), der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - vorzugsweise Fluor - substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien folgende Kohlenwasserstoffreste genannt:
Methyl, Ethyl, Propyl, 1-Methylethyl (iso-Propyl), Butyl, 1-Methylpropyl, 2- Methylpropyl, 1 ,1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3- Methylbutyl, 1 ,1-Dimethylpropyl, 1 ,2-Dimethylpropyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1- Ethylpropyl, Hexyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1 ,1-Dimethylbutyl, 1 ,2-Dimethylbutyl, 1 ,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3- Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1 ,1 ,2-Trimethylpropyl, 1 ,2,2-Trimethylpropyl, 1 -Ethyl- 1 -methylpropyl und1-Ethyl-2methyl-propyl.
Höherer Alkylrest steht - sofern nichts anderes angegeben ist - für einen verzweigten oder unverzweigten C7-C20-Alkylrest der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - vorzugsweise Fluor - substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien folgende Kohlenwasserstoffreste genannt: verzweigtes oder unverzweigtes Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tetradecyl, Hexadecyl, Dodecadecyl und Eicosyl.
Aryl steht - sofern nicht anders definiert - für einen aromatischen ein- oder mehrkernigen Rest mit 4 bis 22 C-Atomen, der ggf. ein oder zwei Heteroatome enthalten kann. Als Beispiele seien genannt: Phenyl, Naphthyl, Anthracyl bzw. Pyrol, Furan, Thiophen, Pyridin, Pyridazin, Pyrimidin oder Pyrazin, und der ggf. durch Halogen (F, Cl, Br, J) - vorzugsweise Fluor- oder durch eine Alkylgruppe unabhängig voneinander ein- oder mehrfach substituiert sein kann.
Aralkyl bedeutet - sofern nicht anders definiert - einen ein oder mehrkernigen Arylrest im Sinne der nachstehenden Definition der über eine C-ι-C6-Alkylen-, C3-C6- Alkenylen- oder eine C3-C6-Alkinylenbrücke, für welche die Definition der CrC6-Alkyl- , C3-C6-Alkenyl- und C3-C6-Alkinylgruppen entsprechend gelten, an die kationische Partialstruktur gebunden ist. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird die Benzylgruppe bevorzugt.
C3-C6-Alkenyl steht - sofern nicht anders definiert - im allgemeinen für einen verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 3 bis 6 Kohlenstoffatom(en), mit einer oder ggf. mehreren Doppelbindungen, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - vorzugsweise Fluor - substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien folgende Kohlenwasserstoffreste genannt:
2-Propenyl (Allyl), 2-Butenyl, 3-Butenyl, 1-Methyl-2-propenyl, 2-Methyl-2-propenyl, 2- Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-2-butenyl, 3-Methyl- 2-butenyl, 1-Methyl-3-butenyl, 2-Methyl-3-butenyl, 3-Methyl-3-butenyl, 1 ,1-Dimethyl- 2-propenyl, 1 ,2-Dimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-2-propenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4- Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-2-pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl, 3-Methyl-2-pentenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, 1-Methyl-3-pentenyl, 2-Methyl-3-pentenyl, 3-Methyl-3-pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl, 1-Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-pentenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1 ,1-Dimethyl-2-butenyl, 1 ,1-Dimethyl-2-butenyl, 1 ,1-Dimethyl-3-butenyl, 1 ,2-Dimethyl- 2-butenyl, 1 ,2-Dimethyl-3-butenyl, 1 ,3-Dimethyl-2-butenyl, 1 ,3-Dimethyl-3-butenyl, 2,2-Dimethyl-3-butenyl, 2,3-Dimethyl-2-Butenyl, 2,3-Dimethyl-3-butenyl, 1 -Ethyl-2- butenyl, 1-Ethyl-3-butenyl, 2-Ethyl-1-butenyl, 2-Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3-butenyl, 1 ,1 ,2-Trimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-1-methyl-2-propenyl und 1-Ethyl-2-methyl-2- propenyl.
C3-C6-Alkinyl steht - sofern nicht anders definiert - im allgemeinen für einen verzweigten oder unverzweigten Kohlenwasserstoff rest mit 3 bis 6 Kohlenstoffatom(en), mit einer oder ggf. mehreren Dreifachbindungen, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatom(en) - vorzugsweise Fluor - substituiert sein kann, die untereinander gleich oder verschieden sein können. Als Beispiele seien folgende Kohlenwasserstoffreste genannt:
2-Propinyl (Propargyl), 2-Butinyl, 3-Butinyl, 1-Methyl-2-propinyl, 2-Methyl-2-propinyl, 2-Pentinyl, 3-pentinyl, 4-Pentinyl, 1-Methyl-2-butinyl, 2-Methyl-2-butinyl, 3-Methyl-2- butinyl, 1-Methyl-3-butinyl, 2-Methyl-3-butinyl, 3-Methyl-3-butinyl, 1 ,1-Dimethyl-2- propinyl, 1 ,2-Dimethyl-2-propinyl, 1 -Ethyl-2-propinyl, 2-Hexinyl, 3-Hexinyl, 4-Hexinyl, 5-Hexinyl, 1-Methyl-2-pentinyl, 2-Methyl-2-pentinyl, 3-Methyl-2-pentinyl, 4-Methyl-2- pentinyl, 1-Methyl-3-pentinyl, 2-Methyl-3-pentinyl, 3-Methyl-3-pentinyl, 4-Methyl-3- pentinyl, 1-Methyl-4-pentinyl, 3-Methyl-4-pentinyl, 4-Methyl-4-pentinyl, 1 ,1-Dimethyl- 2-butinyl, 1 ,1-Dimethyl-2-butinyl, 1 ,1-Dimethyl-3-butinyl, 1 ,2-Dimethyl-2-butinyl, 1 ,2- Dimethyl-3-butinyl, 1 ,3-Dimethyl-2-butinyl, 1 ,3-Dimethyl-3-butinyl, 2,2-Dimethyl-3- butinyl, 2,3-Dimethyl-2-butinyl, 2,3-Dimethyl-3-butinyl, l-Ethyl-2-butinyl, 1 -Ethyl-3- butinyl, 2-Ethyl-1-butinyl, 2-Ethyl-2-butinyl, 2-Ethyl-3-butinyl, 1 ,1 ,2-Trimethyl-2- propinyl, 1-Ethyl-1-methyl-2-propinyl und 1-Ethyl-2-methyl-2-propinyl.
Bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der Ri einen höheren Alkylrest - vorzugsweise mit 12, 14 oder 16 Kohlenstoffatomen und R2, R3 und R4 jeweils eine Methylgruppe bedeutet.
Bevorzugt sind weiterhin Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der Ri eine Aralkylgruppe - vorzugsweise eine Benzylgruppe -, R2 einen höheren Alkylrest - vorzugsweise mit 12, 14 oder 16 Kohlenstoffatomen - und R3 und * eine Methylgruppe bedeutet.
Als Gegenionen X" eignen sich bevorzugt alle Anionen von Mineral- bzw. Halogenwasserstoffsäuren oder Anionen ein- oder zweibasischer organischer Säuren wie zum Beispiel Acetat oder Oxalat, Malonat, Succinat oder Citrat.
Als Anionen werden Bromid, Chlorid, Phosphat, Sulfat, Formiat, Acetat, Propionat, Oxalat oder Succinat bevorzugt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird entsprechend der allgemeinen Formel I besonders bevorzugt Tetradecyltrimethylammoniumoxalat (QCX), ggf. in Verbindung mit einem Protonendonor, eingesetzt.
Als Protonendonoren im Sinne der vorliegenden Erfindung sind in erster Linie gesättigte aliphatische Monocarbonsäuren, ungesättigte Alkenylcarbonsäuren, gesättigte und/oder ungesättigte aliphatische C2-C6-Dicarbonsäuren, aliphatische Ketocarbonsäuren oder Ketodicarbonsäuren sowie Aminosäuren neben Mineralsäuren oder deren Salze allein oder in Kombination geeignet. Dabei können alle genannten organischen Säuren in unsubstituierter Form oder als substituierte Derivate eingesetzt werden, worunter - sofern nicht anders angegeben - die unsubstituierten oder die ein- bzw. mehrfach durch Hydroxyl-Gruppen substituierten Derivate bevorzugt werden. Summenformeln und Trivialnamen einiger Säuren finden sich in Tabelle 1.
Als gesättigte aliphatische Monocarbonsäuren im Sinne der vorliegenden Erfindung werden neben Ameisensäure vorzugsweise CrCβ-Alkylcarbonsäuren verstanden, worunter Essigsäure, Propionsäure, n-Buttersäure, n-Valeriansäure, Isovaleriansäure, Ethyl-methyl-essigsäure (2-Methyl-buttersäure), 2,2-
Dimethylpropionsäure (Pivalinsäure), n-Hexansäure, n-Octansäure, n-Decansäure sowie n-Dodecansäure (Laurinsäure) bevorzugt werden. Daneben können auch die sich von den genannten Säuren ableitenden Ketocarbonsäuren Verwendung finden.
Als ungesättigte Alkenylcarbonsäuren im Sinne der Erfindung seien beispielsweise Acrylsäure (Propensäure), Methacrylsäure, Crotonsäure, iso-Crotonsäure sowie Vinylessigsäure genannt.
Bevorzugt im Sinne der vorliegenden Erfindung sind gesättigte aliphatische C2-C6- Dicarbonsäuren, wie zum Beispiel Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure oder Adipinsäure, worunter Oxalsäure und Bernsteinsäure ganz besonders bevorzugt werden.
Besonders bevorzugt werden zur Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe aliphatische Hydroxi-di- und -tricarbonsäuren eingesetzt, worunter Tartronsäure, D- (+)-, L-(-)- oder DL-Äpfelsäure, (2R, 3R)-(+)-Weinsäure, (2S, 3S)-(-)-Weinsäure, meso-Weinsäure und Zitronensäure ganz besonders bevorzugt werden.
Zur Lösung der vorliegenden Aufgabe eignen sich daneben auch ungesättigte Dicarbonsäuren wie Malein- oder Fumarsäure oder ungesättigte Tricarbonsäuren, wie zum Beispiel Aconitsäure. Im Sinne der vorliegenden Erfindung können jedoch auch aliphatische Ketodicarbonsäuren als Additive eingesetzt werden, wie z.B. Mesoxalsäure und Oxalessigsäure, worunter Oxalessigsäure ganz besonders bevorzugt wird.
Des weiteren können im Sinne der vorliegenden Erfindung Aminosäuren eingesetzt werden, worunter α-Aminosäuren, wie z.B. Aminoessigsäure (Glycin), α- Aminopropionsäure (Alanin), α-Amino-/so-valeriansäure (Valin), α-Amino-/so- capronsäure (Leucin) und α-Amino-ß-methylvaleriansäure (Isoleucin), bevorzugt werden. Besonders bevorzugt findet dabei Glycin Verwendung.
Die genannten Protonendonoren können als Einzelsubstanzen bzw. in Form der reinen Stereoisomeren als auch in Mischungen eingesetzt werden.
Tabelle 1
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Als weitere Additive können im Sinne der vorliegenden Erfindung ebenfalls Mineralsäuren und deren Salze eingesetzt werden. Bevorzugt kommen dabei deren Salze von Mineralsäuren - wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure - mit Alkalimetallen oder deren Ammoniumsalze zur Anwendung. Besonders bevorzugt finden dabei Phosphorsäure und Ammoniumsulfat Verwendung.
Das Additiv kann in unterschiedlichen Konzentrationen in der Komposition vorliegen. Des weiteren ist auch der Einsatz von Kombinationen verschiedener Additive möglich. Dabei können in Abhängigkeit von der Natur des Additivs sich andere Konzentrationsbereiche als vorteilhaft erweisen. Daneben ist auch der Einsatz von Kombinationen verschiedener Additive möglich.
Die erwähnten Verbindungen sind aus dem Stand der Technik bekannt und können nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Die Verbindungen können in Reinsubstanz, in Form ihrer Mischungen sowie als - wässrige - Lösung eingesetzt werden.
Eine Stabilisierung des RNA-Profiles kann ebenfalls durch Zugabe von Salzlösungen, wie z.B. Ammoniumsulfat, und/oder ein organisches Lösungsmittel, wie z.B. aliphatische, verzweigte oder unverzweigte Alkohole mit eins bis 5 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Ethanol, Propanol oder Iso-Propanol, verzweigte oder unverzweigte Aldehyde oder Ketone mit einem bis 5 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Formaldehyd oder Aceton, halogenierte verzweigte oder unverzweigte Kohlenwasserstoffe mit eins bis fünf Kohlenstoffatomen, wie z.B. Chloroform, Amide von organischen verzweigten oder unverzweigten Carbonsäure mit eins bis fünf Kohlenstoffatomen, wie z.B. Formamid, oder aromatische Hydroxyverbindungen mit sechs bis zehn Kohlenstoffatomen, wie z.B. Phenol, eine chaotrope Verbindung, wie z.B. Guanidiniumhydrochlorid, Guanidiniumisothiocyanat oder Harnstoff, ein Detergenz, wie z.B. SDS, Metallionen-komplexierende Verbindungen, wie z.B. EDTA, reduzierend wirkende Verbindungen, wie z.B. ß-Mercaptoethanol, DMSO als Einzelsubstanz oder in Form einer Mischung, erreicht werden und ggf. ein Protonendonor als weiterer Mischungsbestandteil zugegen ist.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, dass zur Stabilisierung des RNA-Profiles die stimulierte oder reprimierte Probe in einem Temperaturbereich von -200°C bis +8°C, vorzugsweise von -80 °C bis +8°C, gehalten wird. Als Probenmaterial (biologische Probe) können im Sinne der vorliegenden Erfindung biologische und/oder klinische Proben, wie u.a. Körperflüssigkeiten, wie beispielsweise Blut, Plasma, Serum, Spinalflüssigkeit, , Sputum, Urin, Sperma, Aszites-Flüssigkeit, sowie Zellen, aus Blut gewonnene Leukozytenfraktionen, Crusta phlogistica, Faeces, Abstriche, Punktate, Gewebeproben jeder Art, wie z.B. Biopsien, Gewebeteile und Organe, Knochenmark, die freie oder gebundene Nukleinsäuren oder nukleinsäurehaltige Zellen enthalten, dienen.
Des weiteren können als Proben zellhaltige Lebensmittel- und Umweltproben als auch Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien, aber auch ein- oder mehrzellige Eukaryonteneingesetzt werden, wobei die Mikroorganismen z.B. auch in der biologischen und/oder klinischen Probe enthalten sein können.
Ein wichtiger Bestandteil der Erfindung ist daneben die Verdünnung der Probe vor der Stimulation oder Repression. Dies ist insbesondere beim Einsatz von Blut der Fall. Es wurde nämlich überraschenderweise gefunden, dass Versuche, welche mit unverdünntem Blut durchgeführt wurden, zu keiner Steigerung der mRNA- Expression führten. Die Verdünnung kann z.B. mit RPMI1640 Medium oder aber beispielsweise mit physiologischer Kochssalzlösung durchgeführt werden. Weitere geeignete Medien sind dem Fachmann bekannt und unschwer kommerziell erhältlich.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die zu untersuchende Probe - insbesondere Blut- oder Gewebeprobe - vor der Analyse mit einem Stimulans/Repressor - wie z.B. PHA (Phytohaemaglutinin) [A. Kretowski et al., Immunol. Lett. 7± (2) (2000) 85; I. Wilke et al., Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. 246 (1996) 279] versetzt. Aus dem Stand der Technik ist jedoch daneben eine Vielzahl von weiteren Stimulantien bekannt, wie z.B. PWM (Poke Weat Mitogen), IL2 (Interleukin 2), hsp (Hitzeschockproteine), LPS (Lipopolysaccharid aus Bakterien) [H. Bruungaard et al., Clin. Exp. Immunol. 118 (1999) 235; A.G. Heriot, Br. J. Cancer 82 (5) (2000) 1009]; Superantigene wie z.B. TSST-1 , SEB, MAS u.a. [J.M. Brand et al., Rheumatol. Int. 16 (1997) 207; L. Alvarez-Osorio et al., Scand. J. Immunol. 47 (1998) 43], fMLP (Formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin) [M. Mineshita et al. J. Immunol. Methods 202 (1 ) (1997) 59], PMA/Ionomycin [W.A: Sewell et al. J Immunol. Methods 209 (1 ) (1997) 67], Hormone, wie z.B. Angiotensin II oder aber Proteine, Peptide, Oligopeptide, Nukleinsäuren (DNA, RNA), chemische Wirkstoffe, Allergene, Toxine, Tumorantigene, Zytokine, Monokine, Chemokine, Lektine, etc. oder Bakterien [S. Halme et al. Eur. Heart J. 18 (7) (197) 1095], wie z.B. Mycobacterium tuberkulosis mit Concanavalin [Scand. J. Immunol. 49 (2) (1999) 210], oder Tumorzellen [Z.D. Jurnic et al., Neoplasma 46 (4) (1999) 224], HIV-Antigene [D. Hober et al., Scand. J. Immunol. 5J. (4) (2000) 429] oder Trichophyten [A. Lund et al. Vet. Dermatol. 12 (2) (2001 ) 75] oder andere Lebewesen oder Viren oder Metallionen, wie z.B. Zink (II) - Ionen [C. Driessen et al., Immunology 84 (2) (1995) 272].
Des weiteren kann zur Änderung der Transkriptkonzentration auch eine Temperaturerhöhung oder Temperaturerniedrigung der biologischen Probe durchgeführt werden.
Die so erzeugten Transkriptkonzentrationen werden danach mit einer oder mehreren stabilisierenden Verbindungen versetzt. Erfindungsgemäß werden stabilisierende Verbindungen der allgemeinen Formel I bevorzugt.
Die vorteilhafte Wirkung der beschriebenen Verbindungen kann experimentell eindrucksvoll nachgewiesen werden. Dazu wird zum Zweck der Überprüfung des Immunsystems und von Genexpressionsprofilen Blut von Personen mit einem normalen Gesundheitszustand und von Patienten mit bekannten bzw. unbekannten Erkrankungen verdünnt und mit verschiedenen Substanzen über einen unterschiedlich langen Zeitraum stimuliert. Anschließend wird die RNA mit einer Verbindung der allgemeinen Formel I bzw. deren wässrigen Lösung wie auch mit anderen aus dem Stand der Technik bekannten Substanzen stabilisiert, isoliert und anschließend mittels quantitativer RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaktion), DNA-Expressions-Chip-Verfahren oder anderer geeigneter Verfahren analysiert.
Die experimentellen Befunde der durchgeführten Bestimmung der RNA- Konzentration spezifischer Transkripte nach Durchführung des beschriebenen Verfahrens belegen eindeutig, dass die eingangs gestellten Aufgaben durch die vorliegende Erfindungen in der Tat gelöst werden. Die beigefügten Figuren geben folgende Sachverhalte wieder (mRNA- und Protein- Level wurden mittels des Kolmogorov-Smirnov-Tests bestimmt. Da nicht für alle Werte eine Gaus'sche Verteilung angenommen werden konnte, wurde der Mann- Whitney-Test für unabhängige und der Wilcoxon matched pairs-Test für gepaarte Werte verwendet. Die Messungen wurden, sofern nicht anders angegeben, in humanem Vollblut vorgenommen):
Fig. 1 gibt eine schematische Darstellung des Prinzips der in-vitro Stimulationstests wieder;
Fig. 2 stellt die basalen Level an TNFα-mRNA bezogen auf 103 Moleküle ß-Aktin- mRNA im Verlauf der Hämodialyse in zwei unterschiedlichen Dialysezentren dar;
Fig. 3 stellt die basalen Level an TGFß-mRNA bezogen auf 103 Moleküle ß-Aktin- mRNA im Verlauf der Hämodialyse in zwei unterschiedlichen Dialysezentren dar;
Fig. 4 verkörpert eine Darstellung der Sekretion von TNFα-Protein bei Normalpersonen nach Stimulation mit 10μg/ml PHA im Vergleich zu einer
Mediumkontrolle (in Figur nicht erkennbar, da extrem niedrig) in Abhängigkeit von der Zeit;
Fig. 5 verkörpert eine Darstellung der TNFα-mRNA-Level dreier unterschiedlicher Kontrollprobanden nach Stimulation mit 10μg/ml PHA in Abhängigkeit von der Zeit (TNFα-mRNA-Moleküle pro 103 Moleküle ß-Aktin-mRNA);
Fig. 6 verkörpert eine Darstellung der Sekretion von IFNγ-Protein bei
Normalpersonen nach Stimulation mit 10 μg/ml PHA im Vergleich zu einer Mediumkontrolle (in Figur nicht erkennbar, da extrem niedrig) in Abhängigkeit von der Zeit; Fig. 7 verkörpert eine Darstellung der IFNγ-mRNA-Level dreier unterschiedlicher Kontrollprobanden nach Stimulation mit 10 μg/ml PHA in Abhängigkeit von der zeit (IFNγ-mRNA-Moleküle pro 103 Moleküle ß-Aktin-mRNA);
Fig. 8 verkörpert eine Darstellung der Sekretion des Zytokins IL-10 bei
Normalpersonen nach Stimulation mit 10 μg/ml PHA im Vergleich zu einer Mediumkontrolle (in Figur nicht erkennbar, da extrem niedrig) in Abhängigkeit von der Zeit;
Fig. 9 verkörpert eine Darstellung der mRNA-Level des Zytokins IL-10 dreier unterschiedlicher Kontrollprobanden nach Stimulation mit 10 μg/ml PHA in Abhängigkeit von der Zeit (IL-10-mRNA-Moleküle pro 103 Moleküle ß-Aktin- mRNA);
Fig. 10 verkörpert eine Darstellung der Sekretion des Zytokins IL-4 bei
Normalpersonen nach Stimulation mit 10 μg/ml PHA im Vergleich zu einer Mediumkontrolle (in Figur nicht erkennbar, da extrem niedrig) in Abhängigkeit von der Zeit;
Fig. 1 1 verkörpert eine Darstellung der mRNA-Level des Zytokins IL-4 dreier unterschiedlicher Kontrollprobanden nach Stimulation mit 10 μg/ml PHA in Abhängigkeit von der Zeit (IL-4-mRNA-Moleküle pro 103 Moleküle ß-Aktin- mRNA);
Fig. 12 gibt die Level an TNFα-mRNA im Verlauf der Hämodialyse und nach Stimulation mit 10 μg/ml PHA wieder (TNFα-mRNA-Moleküle pro 103 Moleküle ß-Aktin);
Fig. 13 gibt den Quotienten aus den TNFα-mRNA-Level nach Stmulation mit 10 μg/ml PHA und den basalen Level für die verschiedenen Dialysezentren wieder; Fig. 14 gibt die Level an TGFß-mRNA im Verlauf der Hämodialyse und nach Stimulation mit 10 μg/ml PHA wieder (TGFß-mRNA-Moleküle pro 103 Moleküle ß-Aktin);
Fig. 15 gibt den Quotienten aus den TGFß-mRNA-Level nach Stmulation mit 10 μg/ml PHA und den basalen Level für die verschiedenen Dialysezentren wieder.
Die unten aufgeführten Beispiele der Anwendung des Verfahrens zeigen u.a. auch, dass klinische Probenmaterialien aus verschieden vorbehandelten Patienten unterschiedlich auf die Stimulation der Genexpression bei Anwendung des beschriebenen Verfahrens zur Erhöhung der Transkriptkonzentrationen reagieren können, die medizinisch relevante Informationen liefern können. Dieses ist überraschend, da davon auszugehen war, dass die Zugabe von Stimulantien/Repressoren zu klinischen Probenmaterialien aus Patienten zu vergleichbaren Effekten führt. Es war bislang kein Verfahren bekannt, dass individuelle Veränderungen im RNA-Profil bewirkt und messbar macht, woraus diagnostische Schlüsse für Patienten gezogen werden können. Gleichzeitig konnte durch Anwendung des Verfahrens gezeigt werden, dass durch die Erhöhung der Transkriptkonzentrationen eine deutliche Sensitivitätssteigerung der nachfolgenden RNA-Analytik erreicht werden konnte.
Es wird ausdrücklich darauf hingewiesen, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch die Ermittlung der Wirkung von Wirkstoffen auf Proben aus verschiedenen Patienten ex vivo zulässt. Dabei wird jeder Stoff in seiner individuellen Wirkung auf biologische/klinische Proben getestet. Die unten aufgeführten Beispiele zeigen, dass z.B. der Effekt unterschiedlicher Dialysetechniken auf das Immunsystem von Menschen untersucht werden kann. Beispiele
Patienten wird während der Hämodialyse Blut zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen. Das Blut wird zum Teil zur Stabilisierung sofort mit einer wässrigen Lösung aus 4 % Tetradecyltrimethylammoniumoxalat und 200 mmol/L Weinsäure, pH 3,7 (QCX-Lösung) bei Raumtemperatur stabilisiert oder zum anderen Teil im Volumenverhältnis 1 :2 mit RPMI 1640 Medium gemischt und mit 10 μg/ml PHA über einen Zeitraum von zwei Stunden aktiviert und anschließend mit QCX-Lösung versetzt. Die Proben wurde dabei jeweils im Verhältnis 1 :1 mit QCX-Lösung versetzt. Hier ist jedoch auch jedes andere dem Fachmann sinnvoll erscheinende Volumenverhältnis denkbar, wie z.B. 10:27,6. Anschließend wird die RNA aus allen Proben isoliert und nach quantitativer RT-PCR (TaqMan RT-PCR) mit spezifischen Oligonukleotiden für lnterleukin(IL)-4, lnterferon(IFN)-γ, Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)- α, IL-10, Tissue-Growth-Factor(TGF)-ß und ß-Aktin durchgeführt.
a) Ergebnisse der Analysen der basalen Werte bei Dialysepatienten:
Während im peripheren Blut Transkripte für ß-Aktin, TNFα und TGFß nachgewiesen werden konnten, waren die Transkripte der Zytokine IL-4, IL-10 und IFNγ nicht nachweisbar. In Fig. 2 (TNFα) und in Fig. 3 (TGFß) sind die Zahl von TNFα- und TGFß-mRNA-Molekülen auf 106 ß-Aktin-mRNA-Moleküle normiert und zu zwei verschiedenen Zeitpunkten (vor und 2h nach Dialysebeginn) dargestellt. Zusätzlich wurden Patienten aus zwei verschiedenen Dialysezentren, die jeweils sich unterscheidende Dialysetechniken verwenden, miteinander verglichen. Man erkennt, dass die basalen Spiegel von TNFα-mRNA (Fig. 2) im Vergleich zu gesunden Kontrollen bei Dialysepatienten erhöht sind. Bei den Patienten aus beiden Zentren kommt es im Verlauf der Dialyse zu einem signifikanten Anstieg von TNFα. Die basalen Spiegel von TGFß-mRNA (Fig. 3) sind bei Dialysepatienten im Vergleich zu Normalpersonen signifikant erniedrigt. Während es im Dialysezentrum 1 im Verlaufe der Behandlung zu einem signifikanten Anstieg von TGFß kommt, ist in Zentrum 2 keine Änderung nachweisbar.
Um auch die mRNA von IL-4, IL-10 und IFNγ im peripheren Blut nachzuweisen wurde der oben beschriebene Stimulationstest (Fig. 1 ) etabliert. Dieser ist in seiner Handhabung sehr einfach und benötigt keine Inkubatoren, so dass dieser Test auch in jeder Arztpraxis durchführbar ist.
b) Ergebnisse aus dem Blut von Normalpersonen:
In Experimenten mit dem Blut von 3 gesunden Normalpersonen wurde der Test charakterisiert und die mRNA-Level (Fig. 5, 7, 9, 11 ) mit der jeweiligen Proteinsekretion verglichen (Fig. 4, 6, 8, 10). Als erstes Transkript wurde TNFα- mRNA untersucht, da es bereits im basalen Zustand nachgewiesen werden kann. Auf Proteinebene zeigte TNFα nach 5 Stunden ein Maximum der Proteinsekretion bei den Normalpersonen (Fig. 4), während TNFα auf RNA-Ebene (Fig. 5) bereits nach zwei Stunden maximal stimuliert war. Die Anzahl von nachweisbaren mRNA- Molekülen stieg durch die Stimulation um das 50-300-fache im Vergleich zum unstimulierten Zustand an (Fig. 13, Probanden).
Die im basalen Zustand nicht nachweisbare mRNA von IFNγ (Fig. 7), IL-10 (Fig. 9) und IL-4 (Fig. 11 ) waren nach der PHA-Stimulation mittels quantitativer RT-PCR nachweisbar. Im Vergleich zu der Proteinexpression (Fig. 6, 8, 10) wurde auch hier die RNA deutlich früher nachgewiesen und das Maximum der RNA-Expression lag mit 2 bis 6 Stunden deutlich früher, als das der Proteine nach 24 Stunden oder später. Unerwarteterweise zeigte der Vergleich von Blutproben dreier unterschiedlicher Probanden eine sehr vergleichbare Stimulation sowohl in der Höhe wie auch im Zeitpunkt der maximalen Stimulation.
c) Ergebnisse der Stimulation bei Dialysepatienten:
Der Stimulationstest wurde auch bei den schon zuvor dargestellten Dialyse-Patienten angewendet, indem zusätzlich zu den basalen Blutabnahmen Blut im oben dargestellten Stimulationsassay stimuliert, d.h. im Volumenverhältnis 1 :2 mit RPMI 1640-Medium gemischt, mit 10 μg/ml PHA über einen Zeitraum von zwei Stunden aktiviert und anschließend mit QCX-Lösung versetzt wurde.
Anschließend wurde die RNA aus allen Proben isoliert und - wie zuvor beschrieben - einer quantitativen TaqMan RT-PCR unterworfen. Die Ergebnisse für TNFα und TGFß sind in den Fig. 12 bzw.' Fig. 14 dargestellt. Durch die Stimulation mit PHA kommt es auch bei den Dialysepatienten zu einem deutlichen Anstieg der RNA für TNFα-mRNA.
Während es im Laufe der Dialyse zu einem Anstieg des basalen TNFα-mRNA-Levels kam (Fig. 2), nahmen unter Stimulation die TNFα-mRNA-Level bei den Patienten im Zentrum 1 nach 2 Stunden Dialyse deutlich ab. Dieses Phänomen wurde jedoch in Zentrum 2, das mit einer anderen Dialysetechnik arbeitet, nicht beobachtet (Fig. 12).
In einer weiteren Analyse wurde für die einzelnen Patienten die individuelle Stimulierbarkeit bestimmt, indem der Quotient aus stimulierten und basalen mRNA- Level berechnet wurde. Dabei zeigten sich für die individuelle Stimulierbarkeit von gesunden Kontrollen und Patienten vor Beginn der Dialyse keine Unterschiede (vgl. Fig. 13). Im Verlaufe der Dialyse (2h -Wert) zeigte sich bei beiden Dialysetechniken eine signifikant reduzierte Stimulierbarkeit der TNFα-mRNA-Synthese. Diese Befunde sind von besonderem klinischen Interesse, da Patienten unter der Dialyse deutliche Immunveränderungen zeigen. Durch den Verlust der Fähigkeit einer TNFα- Stimulation lässt sich eine erhöhte Infektionsanfälligkeit dieser Patienten erklären. Mit diesem Verfahren könnten nun neue Dialysetechniken auf eine bessere Biokompatibilität untersucht werden.
Die Stimulation führt jedoch nicht bei allen Genen zu einer Erhöhung der Genexpression. Für TGFß zeigte sich durch die Zugabe von PHA ein signifikant reduziertes mRNA-Level (Fig. 3 versus Fig. 14) sowohl für Kontrollprobanden als auch für Dialysepatienten. Während sich das basale TGFß-mRNA-Level mit der Dialysetechnik in Zentrum 2 nicht änderte (Fig. 3), kam es unter der PHA-Zugabe zu einem Anstieg der TGFß-mRNA-Levels (Fig. 14). In Zentrum 1 stieg das basale TGFß-mRNA-Level an (Fig. 3), jedoch zeigte sich kein Anstieg unter PHA-Stimulation (Fig. 14). Die Berechnung der Stimulierbarkeit (Quotient stimuliert/basal) von TGFß (Fig. 15) zeigte bei Dialysepatienten eine signifikant geringeren Abfall der TGFß- mRNA-Synthese im Vergleich zu Kontrollprobanden. Die TGFß-Stimulation zeigte im Verlauf der Dialyse in Dialysezentrum 1 keine Unterschiede. Die erhaltenen Ergebnisse liefern einen eindeutigen Beleg für die erfindungsgemäß erzielte reproduzierbare Verstärkung der RNA-Expression, die zu zusätzlichen wertvollen biologisch/medizinischen Informationen führt. Weiterhin können mit diesem Verfahren mehr relevante Transkripte als im unstimulierten Zustand zunächst erzeugt und darüber hinaus möglicherweise erst nachgewiesen werden. Zusätzlich kann durch dieses Verfahren schneller und sensitiver die Änderung der Regulation zellulärer Prozesse gemessen werden als über Änderungen auf Proteinebene.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Änderung von Transkriptkonzentrationen von Ribonukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass man eine nukleinsäurehaltige Probe zunächst mit einem Stimulans oder Repressor und anschließend mit einer stabilisierenden Verbindung und ggf. mit einem oder mehreren Protonendonor(en) versetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als stabilisierende Verbindung ein Salz der allgemeinen Formel (I)
Figure imgf000022_0001
worin
Y Stickstoff oder Phosphor und
Ri, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander einen unverzweigten oder verzweigten C-ι-C2o-Alkylrest und/oder einen C6-C2o-Arylrest sowie einen CQ-
C26-Aralkylrest
oder R-ι eine Gruppe der allgemeinen Formel -(CH2)n-Z+R5R6R7
worin
n eine ganze Zahl 1 ,2,3,4,5 oder 6
Z Stickstoff oder Phosphor und
R5, R6, und R7 unabhängig voneinander einen unverzweigten oder verzweigten C C2o-Alkylrest und/oder einen C6-C20-Arylrest sowie einen C6-C26-Aralkylrest X" ein oder mehrere Anion(en) einer anorganischen oder organischen, ein- oder mehrbasischen Säure
bedeuten können,
eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Y und ggf. Z für ein Stickstoffatom steht.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet dass die kationische Verbindungen aus einem Ammoniumsalz besteht, in dem R^ einen höheren Alkylrest - bevorzugt mit 12, 14 oder 16 Kohlenstoffatomen - und R2, R3 und F jeweils eine Methylgruppe bedeutet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass Ri eine Aralkylgruppe - vorzugsweise eine Benzylgruppe -, R2 einen höheren Alkylrest - vorzugsweise mit 12, 14 oder 16 Kohlenstoffatomen - und R3 und R4 eine Methylgruppe bedeutet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Gegenion X" Bromid, Chlorid, Phosphat, Sulfat, Formiat, Acetat, Propionat, Oxalat oder Succinat eingesetzt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 dadurch gekennzeichnet, dass der Protonendonor aus der Gruppe der gesättigten aliphatischen Monocarbonsäuren, der ungesättigten Alkenylcarbonsäuren, der gesättigten und/oder ungesättigten aliphatische C2-C6-Dicarbonsäuren und/oder Tricarbonsäuren, der aliphatischen Ketodicarbonsäuren, der Aminosäuren oder aus der Gruppe der Mineralsäuren oder deren Salze allein oder in
Kombination ausgewählt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als gesättigte aliphatische Monocarbonsäure eine CrC6-Alkylcarbonsäure, vorzugsweise Essigsäure, Propionsäure, n-Buttersäure, n-Valeriansäure, Isovaleriansäure, Ethyl-methyl-essigsäure (2-Methyl-buttersäure), 2,2-Dimethylpropionsäure (Pivalinsäure), n-Hexansäure, n-Octansäure, n-Decansäure bzw. n- Dodecansäure (Laurinsäure) oder Mischungen hiervon oder Mischungen mit den in Anspruch 7 genannten Säuren eingesetzt werden.
9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als aliphatische Alkenylcarbonsäure Acrylsäure (Propensäure), Methacrylsäure, Crotonsäure, iso-Crotonsäure oder Vinylessigsäure oder Mischungen hiervon oder Mischungen mit den in Anspruch 7 bis 8 genannten Säuren eingesetzt werden.
10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als gesättigte aliphatische C2-C6-Dicarbonsäure eine Dicarbonsäure aus der Gruppe Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure bzw. Adipinsäure oder
Mischungen hiervon eingesetzt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Protonendonoren aliphatische Dicarbonsäuren, vorzugsweise Oxalsäure oder Bernsteinsäure oder Mischungen hiervon oder Mischungen mit den in
Anspruch 7 bis 10 genannten Säuren eingesetzt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Protonendonoren aliphatische Hydroxi-di- und -tricarbonsäuren, vorzugsweise Tartronsäure, D-(+)-, L-(-)- oder DL-Äpfelsäure, (2R, 3R)-(+)-Weinsäure, (2S,
3S)-(-)-Weinsäure, meso-Weinsäure und Zitronensäure oder Mischungen hiervon oder in Mischungen mit den in Anspruch 7 bis 1 1 genannten Säuren eingesetzt werden.
13. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Protonendonoren ungesättigte Dicarbonsäuren, vorzugsweise Malein- und/oder Fumarsäure, deren Mischungen oder Mischungen mit den in Anspruch 7 bis 12 genannten Säuren eingesetzt werden.
14. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Protonendonoren ungesättigte Tricarbonsäuren, vorzugsweise Aconitsäure, oder Mischungen mit den Anspruch 7 bis 13 genannten Säuren eingesetzt werden.
15. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Protonendonoren aliphatische Ketodicarbonsäuren, vorzugsweise Mesoxalsäure oder Oxalessigsäure, oder Mischungen hiervon oder Mischungen mit den in Anspruch 7 bis 14 genannten Säuren eingesetzt werden.
16. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Protonendonoren Aminosäuren, vorzugsweise Aminoessigsäure (Glycin), α- Aminopropionsäure (Alanin), α-Amino-/so-valeriansäure (Valin), α-Amino-/so- capronsäure (Leucin) und α-Amino-ß-methylvaleriansäure (Isoleucin), besonders bevorzugt Glycin, oder Mischungen hiervon oder Mischungen den in Anspruch 7 bis 15 genannten Säuren eingesetzt werden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass als Verbindung gemäß der allgemeinen Formel I
Tetradecyltrimethylammoniumoxalat (QCX), ggf. mit einem Protonendonor, eingesetzt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass zur Stabilisierung des RNA-Profils wässrige Lösungen eines oder mehrer Salze, bevorzugt eines oder mehrerer anorganischer Salze und besonders bevorzugt eine wässrige Lösung von Ammoniumsulfat, ggf. mit einem Protonendonor gemäß Anspruch 7 bis 16, eingesetzt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass zur Stabilisierung des RNA-Profils ein organisches Lösungsmittel, ggf. mit einem Protonendonor gemäß einem der Ansprüche 7 bis 16, eingesetzt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel ein aliphatischer verzweigter oder unverzweigter Alkohol, bevorzugt mit einem bis fünf Kohlenstoffatom(en) und besonders bevorzugt Ethanol, Propanol oder /so-Propanol ist oder eine Mischung dieser Alkohole darstellt.
21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel ein verzweigtes oder unverzweigtes Aldehyd oder Keton mit einem bis 5 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Formaldehyd oder Aceton, ist.
22. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel ein halogenierter verzweigter oder unverzweigter Kohlenwasserstoff, bevorzugt mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen und besonders bevorzugt Chloroform, ist.
23. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel ein Amid einer organischen verzweigten oder unverzweigten Carbonsäure, bevorzugt mit einem bis fünf Kohlenstoffatomen und besonders bevorzugt Formamid, ist.
24. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das organische Lösungsmittel eine aromatische Hydroxyverbindung, vorzugsweise mit sechs bis zehn Kohlenstoffatomen und besonders bevorzugt Phenol, ist.
25. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass zur Stabilisierung des RNA-Profils eine chaotrope Verbindung, bevorzugt Guanidiniumhydrochlorid, Guanidiniumisothiocyanat oder Harnstoff, ggf. in Kombination mit einem Protonendonor gemäß einem der Ansprüche 7 bis 16, eingesetzt wird.
26. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass zur Stabilisierung des RNA-Profils ein Detergenz, bevorzugt SDS, ggf. in Kombination mit einem Protonendonor gemäß einem der Ansprüche 7 bis 16, eingesetzt wird.
27. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass zur Stabilisierung des RNA-Profils eine Metallionen-komplexierende Verbindungen, bevorzugt EDTA, ggf. in Kombination mit einem Protonendonor gemäß einem der Ansprüche 7 bis 16, eingesetzt wird.
28. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass zur Stabilisierung des RNA-Profils eine reduzierend wirkende Verbindung - bevorzugt ß- Mercaptoethanol oder DMSO als Einzelsubstanzen oder in Form einer Mischung - und ggf. in Kombination mit einem Protonendonor gemäß einem der Ansprüche 7 bis 16 eingesetzt wird.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass als die Änderung der Transkriptkonzentration bewirkende Substanz PHA eingesetzt wird.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung zur Stimulation und/oder Repression der Genexpression aus der Klasse der Proteine, der Nukleinsäuren, der Fette, der Kohlehydrate, der Allergene, der Toxine, der Tumorantigene, der Zytokine, der Chemokine, der Monokine, der Lektine, der Peptide, der Hormone, der Umweltgifte, der
Vitamine, der Stoffwechselprodukte, der Nahrungsmittel, der Arzneimittel oder anderer Wirkstoffe, der Wachstumsfaktoren, der Erreger, bevorzugt von Viren, Bakterien, Protozoen oder Pilzen, stammt.
31. Verfahren zur Änderung von Transkriptkonzentrationen von Ribonukleinsäuren nach Anspruch 1 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass zur Änderung der Transkriptkonzentration anstelle der Zugabe eine Stimulans oder Repressors eine Temperaturerhöhung oder Temperaturerniedrigung an der biologischen Probe vorgenommen wird.
32. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet dass zur Stabilisierung des RNA-Profiles die stimulierte oder reprimierte Probe in einem Temperaturbereich von -200°C bis +8°C, vorzugsweise von -80°C bis +8°C, gehalten wird.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass vor oder gleichzeitig mit der Zugabe der Verbindung/Substanz zur Stimulation/Repression der RNA-Synthese die biologische/klinische Probe verdünnt wird.
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit zur Verdünnung der biologischen Probe ein Zellkulturmedium, bevorzugt RPMI 1640 oder physiologische Kochsalzlösung verkörpert.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass als Probenmaterial (biologische/klinische Probe) eine Körperflüssigkeit eingesetzt wird.
36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass als Körperflüssigkeit Blut, Plasma, Serum, Sputum, Urin, Spinalflüssigkeit, Aszites-Flüssigkeit oder Sperma eingesetzt wird.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 34 dadurch gekennzeichnet, dass als Probenmaterial (biologische/klinische Probe) Zellen, aus Blut gewonnene
Leukozytenfraktionen, Crusta phlogistica, Faeces, Abstriche, Punktate, Gewebeproben jeder Art, wie z.B. Biopsien, Gewebeteile und Organe, Knochenmark, die freie oder gebundene Nukleinsäuren enthalten oder nukleinsäurehaltige Zellen enthalten, eingesetzt werden.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 34 dadurch gekennzeichnet, dass als biologische/klinische Probe eine Umweltprobe oder eine Lebensmittelprobe eingesetzt wird.
39. Kit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 38 enthaltend ein Aufnahmegefäß zum Sammeln der Probe, eine stimulierende und/oder reprimierende Substanz sowie eine Verbindung zur Stabilisierung des RNA-Profiles sowie ggf. eine Lösung zur Verdünnung der biologischen Probe.
0. Kit nach Anspruch 39, enthaltend eine Vorrichtung zum Abnehmen und Sammeln von Blut, mindestens ein Zellkulturmedium - bevorzugt RPMI 1640 - mindestens eine zur Änderung der Transkriptkonzentration befähigte Verbindung - bevorzugt PHA - sowie eine zur Stabilisierung geeignete Verbindung gemäß der allgemeinen Formel I.
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