CZ20024129A3 - Použití směsi z kationtových sloučenin a donorů protonů pro stabilizaci a/nebo isolaci nukleových kyselin v mikroorganismech nebo z mikroorganismů, jako jsou prokaryonta, houby, prvoci nebo řasy - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká použití směsí z kationtových sloučenin a donorů protonů pro stabilizaci anebo isolaci nukleových kyselin v mikroorganismech nebo z mikroorganismů jako jsou prokaryonta (bezjaderné organismy), houby, prvoci (protozoa) nebo řasy.

Dosavadní stav techniky

K úkolu předkládaného vynálezu:

Obecný úkol předmětného vynálezu spočívá v tom, odstranit popsané a ze stavu techniky známé nedostatky.

Dalším úkolem předmětného vynálezu je zabránit při izolaci nukleové kyseliny z mikroorganismů, jako jsou baktérie, houby, jako např. kvasinky, prvoci nebo řasy, změně genexpresivního vzoru, způsobeného zpracováním, takže genexpresivní vzor buněk odráží definované kulturní podmínky nebo podmínky v původním vzorku, jako například vzorku odebraného z pacienta nebo z potraviny, a ne změny vyvolané podmínkami sběru buněk, resp. způsobem izolace nukleové kyseliny, aby se tím zajistila validita případných následujících analýz.

····

- 2 Další úkol existujícího vynálezu spočívá v tom, umožnit časově paralelní zpracování větších počtů vzorků k izolaci RNA a DNA.

Úkolem předmětného vynálezu je vedle toho úkol připravit směs ve formě stabilizačního roztoku, jehož složky nejsou zdravotně závadné a tím například mohou být použity také pro stabilizaci RNA anebo DNA v biologickém materiálu vzorku během dopravy z míst odběru k laboratoři bez zdravotních nebezpečí, jaká vznikají například při používání fenolu, pro osoby zabývající se zpracováním vzorků.

Podstata vynálezu

Vynález se týká nového použití směsí, které mají jako podstatné složky:

kationtovou sloučeninu obecného vzorce Y⁺RiR₂R₃R4X, ve kterém Y je dusík nebo fosfor, R_x, R₂, R3 a R4 jsou nezávisle na sobě nerozvětvené nebo rozvětvené alkylové zbytky s 1 až 20 atomy uhlíku anebo arylové zbytky s 6 až 20 atomy uhlíku nebo aralkylové zbytky se 6 až 26 atomy uhlíku a X je aniont anorganické nebo organické jednosytné nebo vícesytné kyseliny a alespoň jeden donor protonů jako aditivum k stabilizaci anebo izolaci RNA anebo DNA z mikroorganismů, jako jsou prokaryonta (bezjaderné organismy), houby, prvoci (protozoa) nebo řasy.

Výhodné jsou směsi, ve kterých se kationtové sloučeniny skládají z amoniové soli, ve které Ri znamená zbytek vyššího alkylu, s výhodou s 12, 14 nebo 16 atomy uhlíku a R₂, R₃ a R₄ znamenají vždy methylovou skupinu.

• · · · • · '····

. - 3 Výhodné jsou dále směsi, ve kterých R_x znamená aralkylovou skupinu, s výhodou benzylovou skupinu, R₂ zbytek vyššího alkylu, s výhodou s 12, 14 nebo 16 atomy uhlíku a R₃ a R₄ methylovou skupinu.

Jako anionty se s výhodou používají bromid, chlorid, fosfát, sulfát, formiát, acetát, propionát, oxalát, malonát, sukcinát; nebo citrát.

Alkyl s 1 až 6 atomy uhlíku znamená obecně rozvětvený nebo nerozvětvený uhlovodíkový zbytek s 1 až 6 atomy uhlíku, který může být popřípadě substituován jedním nebo více atomy halogenu, s výhodou fluorem, přičemž alkyly mohou být navzájem stejné nebo rozdílné. Jako příklady se uvádějí následující uhlovodíkové zbytky:

methyl, ethyl, propyl, 1-methylethyl (iso-propyl), butyl, **ζ '·?;·· ·

1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1,1-dimethylethyl, n-pentyl,

1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, 1,1-dimethylpropyl,

1,2-dimethylpropyl, 2,2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, hexyl,

1-methylpentyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl, 4-methylpentyl,

1.1- dimethylbutyl, 1,2-dimethylbutyl, 1,3-dimethylbutyl,

2.2- dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl,

1-ethylbutyl, 2-ethylbutyl, 1,1,2-trimethylpropyl,

1.2.2- trimethylpropyl, 1-ethyl-l-methylpropyl a l-ethyl-2-methylpropyl.

Vyšší alkylový zbytek znamená rozvětvený nebo nerozvětvený alkylový zbytek se 7 až 20 atomy uhlíku, který může být popřípadě substituován jedním nebo více halogenovými atomy, s výhodou fluorem, přičemž alkylové zbytky mohou být stejné nebo rozdílné. Jako příklady se uvádějí následující uhlovodíkové zbytky: rozvětvený nebo nerozvětvený heptyl, oktyl, nonyl, ···· • ·

• · · · • · · · · • · · · · • 4 4 4 ·

- 4 decyl, undecyl, dodecyl, tetradecyl, hexadecyl, dodekadecyl a eikosyl.

Alkenyl se třemi až 6 atomy uhlíku znamená obecně rozvětvený nebo nerozvětvený uhlovodíkový zbytek se 3 až 6 atomy uhlíku s jednou nebo popřípadě více dvojnými vazbami, který může být popřípadě substituován jedním nebo více atomy halogenu, s výhodou fluoru, přičemž alkenyly mohou být stejné nebo rozdílné. Jako příklady se uvádějí následující uhlovodíkové zbytky:

2-propenyl (allyl), 2-butenyl, 3-butenyl, l-methyl-2-propenyl,

2- methyl-2-propenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 4-pentenyl, l-methyl-2-butenyl, 2-methyl-2-butenyl, 3-methyl-2-butenyl, l-methyl-3-butenyl, 2-methyl-3-butenyl, 3-methyl-3-butenyl,

1.1- dimethyl-2-propenyl, 1,2-dimethyl-2-propenyl, l-ethyl-2-propenyl, 2-hexenyl, 3-hexenyl, 4-hexenyl, 5-hexenyl, l-methyl-2-pentenyl, 2-methyl-2-pentenyl, 3-methyl-2-pentenyl, 4-methyl-2-pentenyl, l-methyl-3-pentenyl, 2-methyl-3-pentenyl,

3- methyl-3-pentenyl, 4-methyl-3-pentenyl, l-methyl-4-pentenyl,

3-methyl-4-pentenyl, 4-methyl-4-pentenyl,

1.1- dimethyl-2-butenyl, 1,l-dimethyl-2-butenyl,

1.1- dimethyl-3-butenyl, 1,2-dimethyl-2-butenyl,

1.2- dimethyl-3-butenyl, 1,3-dimethyl-2-butenyl,

1.3- dimethyl-3-butenyl, 2,2-dimethyl-3-butenyl,

2.3- dimethyl-2-butenyl, 2,3-dimethyl-3-butenyl,

1- ethyl-2-butenyl, l-ethyl-3-butenyl, 2-ethyl-l-butenyl,

2- ethyl-2-butenyl, 2-ethyl-3-butenyl,

1,1,2-trimethyl-2-propenyl, l-ethyl-l-methyl-2-propenyl a l-ethyl-2-methyl-2-propenyl.

Alkinyl s 3 až 6 atomy uhlíku znamená obecně rozvětvený nebo nerozvětvený uhlovodíkový zbytek se 3 až 6 atomy uhlíku s jedním nebo popřípadě více trojnými vazbami, který může být popřípadě substituován jedním nebo více atomy halogenu, s výhodou fluoru,

4 · · · · • · · · ·

- 5 přičemž alkinyly mohou být navzájem stejné nebo rozdílné. Jako příklady se uvádějí následující uhlovodíkové zbytky:

2- propinyl (propagryl), 2-butinyl, 3-butinyl,

1- methyl-2-propinyl, 2-methyl-2-propinyl, 2-pentinyl,

3- pentinyl, 4-pentinyl, l-methyl-2-butinyl, 2-methyl-2-butinyl,

3-methyl-2-butinyl, l-methyl-3-butinyl, 2-methyl-3-butinyl,

3-methyl-3-butinyl, 1,l-dimethyl-2-propinyl,

1,2-dimethyl-2-propinyl, l-ethyl-2-propinyl, 2-hexinyl,

3- hexinyl, 4-hexinyl, 5-hexinyl, l-methyl-2-pentinyl,

2- methyl-2-pentinyl, 3-methyl-2-pentinyl, 4-methyl-2-pentinyl, l-methyl-3-pentinyl, 2-methyl-3-pentinyl, 3-methyl-3-pentinyl,

4- methyl-3-pentinyl, 1-methyl-4-pentinyl, 3-methyl-4-pentinyl,

4-methyl-4-pentinyl, 1,l-dimethyl-2-butinyl,

1.1- dimethyl-3-butinyl, 1,2-dimethyl-2-butinyl,

1.2- dimethyl-3-butinyl, 1,3-dimethyl-2-butinyl,

1.3- dimethyl-3-butinyl, 2,2-dimethyl-3-butinyl,

2.3- dimethyl-2-butinyl, 2,3-dimethyl-3-butinyl,

1- ethyl-2-butinyl, l-ethyl-3-butinyl, 2-ethyl-l-butinyl,

2- ethyl-2-butinyl, 2-ethyl-3-butinyl,

1,1,2-trimethyl-2-propinyl, l-ethyl-l-methyl-2-propinyl a l-ethyl-2-methyl-2-propinyl.

Aryl znamená, pokud není definováno něco jiného, aromatický zbytek s jédmm nebo více jádry se 4 az 22 atomy uhlíku, který může popřípadě obsahovat jeden nebo dva heteroatomy. Jako příklad lze uvést fenyl, naftyl, anthracyl respektive pyrol, furan, thiofen, pyridin, pyridazin, pyrimidin nebo pyrazin a může být popřípadě navzájem nezávisle jednou nebo vícekrát substituován halogenem (F, Cl, Br, J) s výhodou fluorem nebo alkylovou skupinou.

Aralkyl znamená arylový zbytek s jedním nebo více jádry ve smyslu výše uvedené definice, který je přes Ci až C₆ alkylenový,

00 0 • 0 00 · ·

- 6 C₃ až C6 alkenylový nebo C₃ až Cg alkinylenový můstek, pro který platí odpovídajícím způsobem definice Ci až C₆ alkylových, C₃ až Cg alkenylových a C₃ až C₆ alkinylových skupin, vázán na kationtovou parciální strukturu vynálezu se upřednostňuje benzylová

Jako protiionty X^- se hodí halogenovodíkových kyselin nebo dvojsytných organických kyselin, malonát, sukcinát nebo citrát.

Ve smyslu předkládaného skupina.

s výhodou všechny anionty aniontů jednosytných nebo jako acetát nebo oxalát,

Jako donory protonů jsou ve smyslu předkládaného vynálezu vhodné v první řadě nasycené alifatické monokarboxylové kyseliny, nenasycené alkenylové karboxylové kyseliny, nasycené anebo nenasycené alifatické dikarboxylové kyseliny s 2 až 6 atomy uhlíku, alifatické ketokarboxylové kyseliny nebo ketodikarboxylové kyseliny, jakož i aminokyseliny vedle minerálních kyselin nebo jejich solí samotných nebo v kombinaci. Přitom se mohou všechny jmenované organické kyseliny použít v nesubstituované formě nebo jako substituované deriváty, přičemž se upřednostňují, pokud není uvedeno nic jiného, nesubstituované nebo jednou respektive vícekrát hydroxylovými skupinami substituované deriváty.

Jako nasycené alifatické monokarboxylové kyseliny ve smyslu předkládaného vynálezu se vedle kyseliny mravenčí rozumí s výhodou alkylové karboxylové kyseliny s 1 až 6 atomy uhlíku, z nichž se upřednostňují kyselina octová, kyselina propionová, kyselina n-máselná, kyselina n-valerová, kyselina išovalerová, kyselina ethyl-methyl-octová (kyselina 2-methyl-máselná), kyselina 2,2-dimethylpropionová (kyselina pivalinová), kyselina n-hexanová, kyselina n-oktanová, kyselina n-dekanová, jakož i • 99 · • 9 · · · · ···· ··

- 7 kyselina n-dodekanová (kyselina laurinová). Vedle toho se mohou také použít od uvedených kyselin odvozené ketonkarboxylové kyseliny.

Jako nenasycené alkenylkarboxylové kyseliny ve smyslu vynálezu se uvádí například kyselina akrylová (kyselina propenová), kyselina methakrylová, kyselina krotonová, kyselina isokrotonová, jakož i kyselina vinyloctová.

Ve smyslu předkládaného vynálezu jsou zvláště výhodné nasycené alifatické dikarboxylové kyseliny s 2 až 6 atomy uhlíku, jako například kyselina oxalová, kyselina malonová, kyselina jantarová, kyselina glutarová nebo kyselina adipinová, přičemž zvláště výhodné jsou kyselina oxalová a kyselina jantarová.

K řešení úkolu podle vynálezu jsou zvláště výhodné alifatické hydroxy-di-trikarboxylové kyseliny, přičemž zvláště výhodné jsou kyselina tartronová, D-(+)-, kyselina L—{—)— nebo DL-jablečná, kyselina (2R, 3R)-(+)-vinná, kyselina (2S, 3S)-(-)-vinná, kyselina meso-vinná a kyselina citrónová.

K řešení předkládaného úkolu se hodí vedle toho také nenasycené dikarboxylové kyseliny, jako je kyselina maleinová nebo kyselina fumarová nebo nenasycené kyseliny trikarboxylové, jako například kyselina akonitová.

Ve smyslu překládaného vynálezu se mohou ale také používat alifatické ketodikarboxylové kyseliny jako aditivy, jako například kyselina mesoxalová a kyselina oxaloctová, přičemž nejvýhodnější je kyselina oxaloctová.

• 99 9

999·

9 9 9

99

- 8 Dále se mohou ve smyslu předkládaného vynálezu používat kyseliny aminové, přičemž kyseliny, jako například α-aminopropionová (alanin), zvláště výhodné jsou cc-aminové kyselina aminooctová (glycin), α-amino-iso-valerová (valin), α-amino-iso-kapronová (leucin) a kyselina a-amino-ft-methylvalerová (isoleucin). Zvláště výhodné je přitom použití glycinu.

Uvedené donory protonů se mohou používat jako jednotlivé látky, popřípadě ve formě čistých stereoisomerů, jakož i ve směsích.

Jako další aditivy se mohou ve smyslu předkládaného vynálezu také používat minerální kyseliny a jejich soli. S výhodou se přitom používají soli minerálních kyselin, jako je kyselina fosforečná nebo kyselina sírová s alkalickými kovy nebo jejich amonné soli. Zvláště výhodné přitom je použití kyseliny fosforečné a síranu amonného.

Tabulka 1

Označení	Vzorec
Kyselina octová	CH3-COOH
Kyselina oxalová	HOOC-COOH
Kyselina malonová	HOOC-CH2-CÚOH
Kyselina tartonová	HOOC-CHOH-COOH
Kyselina jantarová	HOOC-CH2-CH2-COOH
Kyselina jablečná	HOOC-CHOH-CH2-COOH
Kyselina vinná	HOOC-CHOH-COOH-COOH
Kyselina glutarová	HOOC-CH2-CH2-CH2-COOH
Kyselina adipinová	HCOOH-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH
Kyselina citrónová	HOOC-CH2-COHCOOH-CH2-COOH
Kyselina maleinová	HOOC-CH=CH-COOH

···· » · « ι · · 1 • · · ·

Kyselina oxaloctová	HOOC-CO-CH2-COOH
Glycin	H2N-CH2-COOH

Aditiv může být ve směsi v různých koncentracích. Také je možné použití kombinací různých aditiv. Přitom se mohou v závislosti na povaze aditiva jako výhodné ukázat i jiné koncentrační oblasti. Vedle toho je možné i použití kombinací různých aditiv.

Kationtová sloučenina má ve vodném roztoku směsi koncentraci v oblasti od 0,01 % (w/v) do nasycenosti, s výhodou mezi 0,1 % a 10 % (w/v) a zvláště s výhodou v rozmezí od 0,5 do 8 % (w/v) a nejvýhodněji v rozmezí mezi 2 a 6 % (w/v).

Takové směsi se uvádějí v popisu německé zveřejněné přihlášky DOS 100 31 236, která tvoří prioritní přihlášku k předmětné přihlášce, jakož i v nárocích 1 až 17.

Přirozeně se při přidání roztoku kationtových sloučenin a aditiv určují příslušné optimální koncentrace příslušným objemem biologického vzorku a určuje se objemový poměr objemem stabilizačního roztoku a objemem biologického vzorku.

Jako nukleové kyseliny se ve smyslu předkládaného vynálezu, pokud není uvedeno něco jiného, rozumí nukleové kyseliny v širším slova smyslu, takže zahrnují například ribonukleové kyseliny (RNA), které zahrnují také desoxyribonukleové (DNA) kyseliny ve všech délkách nebo konfiguracích, jako je DNA s dvojitým pramencem, jedním pramencem, cirkulární DNA a lineární DNA, jakož i všechny možné poddruhy, jako například monomerní nukleotidy, oligomery, plasmidy, bakteriální DNA a RNA ve zpracované a nezpracované formě.

•9 9999

9999

9

9

9

9 9

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9

99 99

- 10 Jako biologický vzorek se mohou použít vzorky potravin nebo vzorky ze životního prostředí, jako jsou volné nebo vázané nukleové kyseliny nebo mikroorganismy obsahující nukleové kyseliny ve smyslu vynálezu, jako například organismy (jednobuněčné nebo vícebuněčné, hmyz atd.), rostliny a části rostlin, bakterie, viry, kvasinky a jiné houby nebo prokaryonta.

Dále může jako výchozí materiál pro biologický vzorek, který obsahuje mikroorganismy ve smyslu předmětného Vynálezu, sloužit plasma, tělesné tekutiny, jako například krev, sérum, buňky, frakce leukocytů, crusta phlogistica, sputum, moč, sperma, faeces, výtěry, punktáty, vzorky tkání všeho druhu, jako např. biopsie, části tkání a orgány, vzorky potravin, které obsahují volné nebo vázané nukleové kyseliny nebo buňky obsahující nukleové kyseliny.

Kromě toho je možné stabilizovat nukleové kyseliny, které pocházejí z výše uvedených biologických vzorků a které mají eukaryontový původ, se směsmi podle vynálezu. Tak je možné isolovat respektive stabilizovat materiály eukaryontového charakteru, které jsou uvedeny v DOS 100 31 236 (str. 6, druhý odstavec původně podaných podkladů), podle předmětného vynálezu. Tímto způsobem se dají podle předmětného vynálezu úspěšně stabilizovat nukleové kyseliny eukaryontového původu, jako například z krve, sputa nebo morku kostí tak, jak je to uvedeno v příkladech 1 až 15, jakož i obr. 1 až 15 v DOS 100 31 236.

Aditiv může být v stabilizační reagencii v rozdílných koncentracích, například se může přidávat do směsí stabilizačního roztoku s krví v objemovém poměru 1:1, s výhodou 3:1 v koncentraci 50 mM až do nasycení, s výhodou 100 až 1 M a zvláště výhodně v koncentraci 200 až 500 mM. Přitom se mohou V ·*·· ·· ♦··· • · · ·

závislosti	na povaze	aditiv	11 - jako	výhodné ukázat	i jiné
koncentrační	oblasti.	Vedle	toho	je možné také	použití

kombinací různých aditiv.

Kationtová sloučenina má ve vodném roztoku směsi koncentraci v oblasti od 0,01 % hmotn. do nasycení s výhodou od 0,1 % hmotn. do nasycení a zvláště výhodně mezi 0,5 % hmotn. a 15 % hmotn. a nejvýhodněji mezí 2 % hmotn. a 10 % hmotn.

Přirozeně budou při přidání roztoku kationtových sloučenin a aditiv příslušné optimální koncentrace určovány objemem biologického vzorku a objemovým poměrem stabilizačního roztoku k biologickému vzorku.

Hodnota pH směsi z kationtové sloučeniny a aditivu před směšováním se vzorkem se může v závislosti na vzorku obecně měnit v širokém rozsahu pH (pH ě až 12) a leží s výhodou v intervalu pH 2 až pH 10 a zejména s výhodou v intervalu od pH 3 do 8. Přitom výhodná oblast pH závisí na použitém biologickém vzorku, pro krev, plasmu a sérum je pH hodnota v rozsahu mezi pH 2 a pH 6 a zejména v rozmezí mezi pH 3 a pH 4.

Hodnota pH směsi z kationtové sloučeniny a aditivu se může měnit v závislosti na vzorku, ve kterém se provádí stabilizace anebo izolace nukleových kyselin např z mikroorganismů, jako jsou prokaryonta, houby, protozoa (prvoci) nebo řasy, v širokém rozsahu pH (pH 2 až 12) a je s výhodu v intervalu od pH 2 do

pH 8 a zejména oblast pH závisí	v intervalu na použitém	od pH vzorku.	2 do	pH 5	Přitom výhodná
Pro biologické vzorky,	jako	pro	j iné	buněčné	tělesné
tekutiny, kromě	krve, plasmy a	séra,	nebo	např.	bakterie,

···· ·« *·«·

9999

- 12 punktáty, buňky, tkáně a další biologické vzorky, jak je to popsáno výše, leží hodnota pH v stabilizačním roztoku, skládajícím se z kationtové sloučeniny a aditivu, s výhodu v oblasti pH 3 až pH 10 a zejména s výhodu v intervalu pH 4 až pH 8. Přitom se rozumí u všech údajů pH hodnota pH před míšením s biologickým vzorkem.

K stabilizování nukleových kyselin v biologických vzorcích se může vzorek smíchat s roztokem, který obsahuje kationtovou sloučeninu nebo sloučeniny a aditiv. Přitom je možný objem přídavku 0,1 až 10 000 objemů biologického vzorku, s výhodou bude objem přídavku v oblasti od 1 do 1000 a zvláště výhodně v intervalu od 1 do 100 objemů. V závislosti na druhu vzorku, jako například vzorků z jemných jehlových biopsií nebo nízkobuněčných kultur mohou ale za určitých okolností přicházet v úvahu i podstatně vyšší objemy.

Kromě toho se mohou výše jmenované kationtové sloučeniny a aditiva přidávat i jako pevná látka, když biologický vzorek sám obsahuje kapalinu pro rozpuštění pevné látky (jako například buňky Obsahující tělesné kapaliny, buňky v rtiédiu, moč) nebo se přidává kapalina, například voda k rozpuštění pevné látky. Přídavek jako pevné látky nabízí výhodu, že jsou pevné látky většinou chemicky stabilní a jejich přidání ke vzorku je často jednodušeji proveditelné.

Kromě toho je zejména u velmi kompaktních biologických vzorků, jako například tkání, možné rozmělnění resp. homogenizace vzorku ve stabilizačním roztoku, resp. před mícháním se stabilizačním roztokem, aby se například mechanickým, chemickým, fyzikálním nebo enzymatickým působením ná vzorek podporovalo uvolnění nukleových kyselin nebo ·« ··♦·

jednotlivých buněk resp. svazů buněk rozrušením kompaktního vzorku. Mechanické působení může nastat například elektrickým nožem, kulovým mlýnem nebo stlačením stříkačkou, zatímco se nabízejí vhodné enzymy k působení na vzorek, například hydrolázy, proteázy nebo lipázy.

Vedle toho se může vzorek předupravit čistě fyzikálním způsobem, například pomocí ultrazvuku.

Předúprava může proběhnout dále chemickým způsobem, buď jen tímto způsobem nebo v kombinaci s čistě fyzikálními způsoby. Jako prostředek pro podporu lýzy se mohou použít například alifatické alkoholy, zejména isopropanol, nebo aldehydy, resp. dialdehydy, jako například glyoxal nebo také fenoly nebo fenolové deriváty, jako například 2-bifenol nebo iontové, obojetné a neiontové sloučeniny, jako například sulfhydryl nebo redukující reagencie, jako například dithiothreitol a β-merkaptoethanol nebo deriváty kyseliny fosforečné, jako například tributylfosfát nebo ale chaotropní reagencie, jako např. močovina, guanidinium-thiokyanát nebo guanidiniumhydrochlorid nebo soli jednotlivě nebo v kombinaci.

Odborníkovi jsou známy další možnosti k mechanickému, chemickému, fyzikálnímu nebo enzymatickému působení na vzorky a rozumí se, že jsou zde také zahrnuty.

Materiál vzorků se může skladovat podle příslušných potřeb delší dobu, jako například 1 až 14 dní nebo déle za pokojové teploty, ale také za zvýšené teploty, jako například 40 °C nebo více a také za snížených teplot, jako např. 4 °C nebo -2 0 °C nebo nižší.

4« 4444 ·» ··»»

- 14 V návazností na skladování biologického vzorku v roztoku výše uvedených sloučenin se mohou napojit buď přímo způsoby analýzy nukleových kyselin nebo může dojít k vyčištění nukleových kyselin ze vzorku.

K technologickému pozadí vynálezu:

Prošetřování RNA-expresních vzorků u mikroorganismů pomocí molekulárně biologických metod, jako např. kvantitativní RT-PCR, NASBA, bDNA technologie nebo biočipů a Northern Blotting nalézá použití v základním výzkumu u analýzy genových expresí u prokaryontů, jakož i u prvoků, hub a řas a nabývá navíc narůstajícího významu například u lékařské diagnostiky u identifikování mikrobiologických původců chorob, ve farmaceutickém odvětví u vývoje a vyhodnocování léků, v biotechnologii u výroby rekombinantních proteinů pro výzkum a terapeutické použití, v ekologii a populační biologii nebo také v analytice potravin při důkazu zamoření mikroorganismy.

Přitom existuje obtíž, že se organismy musí k isolaci nukleových kyselin odstranit z jejich přirozeného prostředí k získání zkoumaných buněk a že se musí dopravit na místo izolace nukleových kyselin. Přitom existuje veliké nebezpečí, že se profily RNA, ale také DNA změní. To by vedlo k chybným diagnózám, nebo analýzám genových experesí v kulturách bakterií nebo například také v medicínské a klinické diagnostice při vyšetřování infikovaného pacientského materiálu (například vzorků z ložisek zánětu) spočívajícím na analýze nukleových kyselin nebo také u potravin infikovaných bakteriemi, houbami, prvoky nebo řasami. U vzorků potravin nebo klinických vzorků odebraných z pacientů mohou mikroorganismy dokonce odumřít a tím se mohou nukleové kyseliny, zejména RNA zcela odbourat. Proto má «•frfr fr'A frfr·*· • fr ··*· fr fr *

• · · • · * fr· · • frfr · 9· ·· • fr ·

9 9 frfr fr ·· · • fr ··

- 15 nejvyšší význam, aby nukleové kyseliny, stabilizovány ihned při odběru vzorku.

zejména RNA, byly

Zvláštností bakterií je, že se jejich genová exprese extrémně rychle přizpůsobuje na podmínky prostředí. Z toho vyplývající krátkodobé změny vzoru genové exprese jsou možné na základě velmi krátkých poločasů buněčných mRNA v bakteriích, jakož i jejich schopnosti během několika vteřin nebo minut syntetizovat nové transkripty RNA. Tyto mechanismy přizpůsobení představují při analýze prokaryontických RNA-experesních vzorů obtíž, protože již během sbírání buněk a procedury přípravy RNA může dojít ke změně RNA-experesních vzorů. Tím by se v následujících analýzách již nepozoroval expresní vzor za definovaných podmínek kultury, nýbrž RNA-expresní vzor, který odráží podmínky během sběru, lýzy nebo následujícího buněčného lyzátu.

Vedle toho se dá podstata předkládaného vynálezu použít také na jiné druhy RNA, než je mRNA, jako jsou například rRNA, snRNA, tRNA, RNA druhy s nízkomolekulární hmotností, ale také na DNA, jako je například genomická DNA (gDNA).

Klasické způsoby izolace RNA z mikroorganismů, jako jsou prokaryonta, houby, prvoci nebo řasy spočívají například na použití organických rozpouštědel, jako je fenol a chloroform (trichlormethan), na použití chaotropních solí nebo kombinací těchto látek. U všech dosud známých způsobů k izolaci nukleové kyseliny z prokaryontů, hub, prvoků nebo řas musí být buňky nejprve obohaceny odstřeďováním nebo filtrací z média kultury před dalším Zpracováním. Během tohoto prvního pracovního kroku dochází ve velmi mnoha případech v buňkách na základě změněných podmínek prostředí (např. změny teploty, mechanického zatížení odstředěním, popřípadě filtrací, změněné atmosféře plynu atd.) k • · · · • · • · · · • · · · • · · * · • · · · ·

- 16 změně genexpresního vzoru, takže genexpresní vzor buněk neodráží definované podmínky kultury, nýbrž podmínky procedury izolace nukleové kyseliny. Tím se validita následujících analýz stane sporná.

Za změnu expresního vzoru je v první linii zodpovědno nespecifické odbourávání RNA RNasami nebo chemickými vlivy, jako je deprotonace, nebo sekvenčně specifické odbourávání RNA RNazami, které odbourávají speciální sekvence. Vedle toho má nová syntéza RNA rovněž nevýhodný a proto nežádoucí vliv.

Častokrát je snaha tento vliv minimalizovat velmi rychlým sběrem buněk a rychlým otevřením buněk, ale touto cestou není možné zcela přerušit změnu genexpresního vzoru. Tím je dále nemožné současné zpracování větších počtů vzorků. K tomu bylo enzymatickému otevření buněk často zabráněno, protože bylo možné jen před přidáním organických rozpouštědel nebo koncentrovaných chaotropních roztoků solí a vyžadovalo čas nejméně 3 minut. Tak byla během enzymatického otevírání buněk současně možná i enzymatická degradace RNA, jakož i nová syntéza RNA, čímž by se buněk.

změnil geneexpresní vzor následné genexpresní analýzy enzymatického otevírání buněk.

Z tohoto důvodu bylo pro vždy nevýhodné provádění

Další obtíž při izolaci nukleové kyseliny (RNA a DNA) z prokaryontů, hub, řas a prvoků spočívá v lýze buněk, protože k tomu se musí otevřít stěna buněk. Rozšířený způsob spočívá například ve strávení mureinu v prokaryontické stěně buněk enzymem lyzozym; alternativně se mohou také použít i jiné enzymy, jako např. lysostafin nebo proteinázy. Během strávení se musí ve zpracovávaném vzorku vytvořit podmínky, které zabezpečují enzymatickou aktivitu odpovídajícího enzymu.

• · · · • · · · · · • · · ·

- 17 Současně takové podmínky dovolují většinou ale také štěpení bakterielní mRNA RNasami nebo chemickou hydrolýzou nukleových kyselin, takže často degradované nukleové kyseliny vyplývají z odpovídajících preparátů. Dále nemůže být vyloučeno, že během tohoto enzymatického otvírání buněk dochází k syntéze nukleových kyselin, čímž by se navíc změnil RNA-expresní vzor.

Vynález je použitelný u prokaryontů, vedle archaebakterií (jako například Methanothermobacter marbirgensis), zejména u eubakterií. Do eubakterií spadají gram-pozitivní, jakož i gram-negativní bakteria, jakož i fototropní bakterie, resp. kmeny Clamydia, Mycoplasma (jako například Mycoplasma penetrans), Rickettsiae, Spirillum a Spirochaeta (jako například Borrelia burgdorferi), na které se vztahuje vynález.

Mezi gram-pozitivními eubakteriemi je nutno především jmenovat kmeny Bacillus (jako například Bacillus subtilis), Staphylococcus (jako například Staphylococcus aureus nebo Staphylococcus epidermis), Streptomyces (jako například Streptomyces coelicotor nebo Streptomyces lividans), Flavobakterium (jako například Flavobakterium johnsoniae), Mycobakterium (jako například Mycobakterium avium) nebo Streptococcus.

Dále se dá vynález použít u následujících gram-pozitivních kmenů eubakterií: Clostridium (jako např. C. difficile, C. tetan a C. perfringens) , Lysteria, Peptococcus, Peptostreptococcus, Enterococcus, Corynebacterium (jako například C. diphteriae nebo C. glutamicum), Propionibakterium, Lactobacillus.

U gram-negativních eubakterií je vynález použitelný zejména na Escherichia (jako např. Escherichia coli), Pseudomonas (jako

např. Pseoudomonas aeroginosa, Pseudomonas putida nebo Pseeudomonas syringae), Klebsiella (jako např. Klebsiella pneumoniae), Salmonella (jako např. Salmonella typhimurium), Sinorhizobium (jako např. Sinorhizobium meliloti) nebo Camphylobacter) .

Vedle toho gram-negativních se dá vynález použít bakterií: Neisseria (jako gonorrhoae nebo N. meningitidis), Vibrio (jako např. Vibrio cholerae), Shigella, Serratia, Enterobacter, Acinetobacter,

Próteus, Yersinia, Brucella (jako např. B. abortus), Haemophilus (jako například H. influenza), Bacteroides, Campylobacter, Helicobacter (jako např. H. pylori), Bordetella, Legionella, Pasteurella.

u následujících např. Neisseria

Mezi Eukaryonty je třeba jmenovat zejména houby, z nich skupinu hub dermatofytů, kvasinky, plísňové houby a bifázní houby.

Mezi kvasinkami je třeba zejména zmínit rody Saccaromyces (jako například Saccaromyces cerévisiae), Candida (jako například Candida albicans), Cryptococcus (jako například Cryptococcus neoformans). Mezi plísňovými houbami je třeba zejména zmínit rody Aspergillus (jako například Aspergillus fumigatus) nebo Penicillium nebo Mucor.

Dále je třeba jako příklady na eukaryonty jmenovat řasy a protozoa, jako například trypanosomy, toxoplasmy, ameoby, plasmodia, flageláty, na které se dá vynález použít.

- 19 Řešení úkolu podle vynálezu:

Výše uvedené úkoly předkládaného vynálezu se řeší tím, že se definovaná kultura bakterií, hub, prvoků nebo řas nebo vzorek, který obsahuje bakterie anebo houby anebo prvoky anebo řasy uvede do styku se směsí, popřípadě s jejím vodným roztokem, která obsahuje kationtovou sloučeninu obecného vzorce 1 a alespoň jeden donor protonů.

K následnému sběru buněk a dalšímu zpracování vzorku je možné enzymatické strávení buněčné Stěny, například základní mureinové stavby bakteriální buněčné stěny lysozymem, přičemž nukleové kyseliny ve vzorku nepodléhají žádné enzymatické nebo chemické degradaci, resp. nekoná se žádná nová syntéza nukleových kyselin, takže se zabrání změně vzorku RNA-exprese.

Alternativně jsou myslitelné i jiné enzymatické způsoby otevření buňky, například za použití lysostafinu, próteinázy K nebo také detergentně zprostředkované otevření buňky, resp. kombinace uvedených způsobů otevření i s mechanickými způsoby otevření.

Přitom nabízí enzymatické otevření oproti mechanickým způsobům otevření, jako například s použitím kulového mlýnu nebo hmoždíře v kapalném dusíku, principiálně tu výhodu, že se dá relativně dobře automatizovat. Dále umožňuje enzymatické otevření buněk vysoké prosazení vzorků a minimalizuje Ve srovnání se způsoby otevření buněk mechanicky podle známého stavu techniky nebezpečí křížových kontaminací.

• · · · φ φ φφφ φφφ · • · φφφ φφφ φφ φφφ φφφφ φ * φ φφφφ φφφφ • · · φ φφ φ φ · φ φ φ

- 20 Vedle enzymatického otevření buněk baktérií se nabízí také otevření buněk kvasinek pomocí zymolázy nebo lytikázy nebo také jiné otevření eukaryontických buněk proteinázou nebo jinými enzymy, respektive pomocí detergencií po stabilizaci buněk směsmi podle vynálezu.

Ačkoli z uváděných důvodů je principiálně výhodné enzymatické otevírání buněk, tento způsob se sotva používá pro analýzy genexpresních vzorků, protože během tohoto pracovního kroku se při provádění běžných preparačních způsobů musí počítat ge změnou RNA-expresních vzorků. Použití zde popsaného způsobu nabízí možnost k řešení tohoto problému tím, že se RNA v buňkách stabilizuje již před sběrem buněk. V následujícím pracovním kroku je možné otevření buněk, přičemž se přeruší enzymatická nebo chemická degradace RNA, jakož i nová syntéza.

Alternativně k enzymatickému otevírání buněk může také dojít k mechanickému, tepelnému nebo chemickému otevření buněk, jakož i ke kombinaci jednoho nebo více uvedených způsobů otevření.

Po stabilizaci a otevření buněk se mohou použít k dalšímu zpracování vzorku způsoby známé ze stavu techniky k izolaci nukleových kyselin na bázi modifikovaných křemičitanových materiálů.

Předmětným vynálezem se otevírá možnost dalšího zpracování vzorku, například při izolaci RNA pomocí organických rozpouštědel, chaotropních solí nebo vysolením nukleových kyselin nebo použitím magnetických částic nebo přes způsob zachycení hybridu.

Ve srovnání s dosavadními, ze známého stavu techniky známými RNA-extrakčními způsoby, jako je TRIzol nebo RNeasy, se použitím směsí podle vynálezu z kationtového detergentu obecného vzorce Y⁺RiR₂R₃R4X· a donoru protonů, ve formě aditivu, s výhodou ve formě alifatické karboxylové kyseliny, zejména s výhodou dikarboxylové kyseliny, přičemž zvláště výhodná je kyselina vinná, dosahuje výtěžku, který například dvakrát až třikrát překračuje výtěžky výše uvedených známých způsobů.

Tento vysoký výtěžek RNA je zvláště výhodný u analýzy nízko exprimovaných RNA-transkriptů nebo takových RNA-transkriptů, které se exprimují jenom z jedné podskupiny analyzované populace bakterií. K tomu dosud neexistuje žádný praktikovatelný způsob k izolaci mRNA z bakterií, takže se při analýze bakteriální mRNAs pracuje se silným pozadím jiných typů RNA (rRNA, tRNA, snRNPs). Stojí-li otázka takto, je třeba vyjít ze zvyšování citlivosti analytických způsobů na základě stoupajícího výtěžku.

Výhody vynálezu se dostavují zejména u všech použití, u kterých se mají provádět analýzy genexpresivních vzorů v mikroorganismech (prokaryonty, protozoa, houby, řasy). To zahrnuje například vědecké otázky, které přispívají k základnímu porozumění regulace prokaryontických genových expresí, jakož i studie, ve kterých se například analyzuje vztah mezi expresí zvolených genů a patogenitou bakterií. Poslední otázky jsou zvláště relevantní v diagnostice a léčení bakteriálních infekcí.

Další důležitá oblast použití vynálezu spočívá v genexpresivní analýze prokaryontů, protozoí a hub ve farmaceutickém výzkumu a vývoji. Stabilizace například prokaryontických RNA-expresních vzorků zjednodušuje výrazně analýzu transkripčních zrcadel nebo komplexního expresního

• · ··· ·

- 22 vzorku zhruba v rámci experimentů, ve kterých má být znázorněna časová závislost genové exprese. Dále se podstatně usnadňuje identifikace a kvantifikace druhů v komplexních populacích, například bakterií ve vzorku půdy nebo původců nemocí ve vzorcích odebraných z pacientů. Kromě toho se potenciál použitelnosti vztahuje také na další analytické oblasti, jako například na analytiků potravin.

Stabilizací nukleových kyselin s pomocí směsí podle vynálezů z jedné nebo více kationtových sloučenin á jednoho nebo více aditiv se dosahuje toho, aby se nukleové kyseliny ve vzorku nezměnily i při delším skladování nebo během dopravy. Tím se později podstatně zvýší přesnost prováděných testů. V určitých případech, když se například materiál vzorku musí dopravovat na delší vzdálenost nebo skladovat déle, umožňuje teprve způsob podle vynálezu vůbec tyto testy po této době provádět.

Výhody tohoto vynálezu spočívají zejména jak v oblasti výzkumu, například pro analýzu transkripčních zrcadel, které se musí fixovat ihned po odběru, tak i v oblasti klinických analýz, jako například molekulární diagnostiky, kdy se musí vzorky odebrané z pacientů po odběru během skladování a dopravy také stabilizovat.

Vedle toho nalézá izolace a stabilizace nukleových kyselin použití v diagnostice tumorů, v diagnostice dědičně podmíněných nemocí, jakož i v diagnostice viru a sledování virů a diagnóze a sledování jiných původců infekcí, jakož i v analýze genexpresních vzorků.

• · · · ·· ··· ·

Přehled obrázků na výkrese

Vynález bude blíže osvětlen pomocí výkresu, znázorňuje:

na kterém obr. 1 v grafickém znázornění závislost výtěžku RNA na hodnotě pH detergentního roztoku a na objemovém poměru mezi kulturou a deťergentním roztokem, obr. 2 v grafickém znázornění závislost výtěžku RNA na různých variantách protokolu, obr. 3 v grafickém znázornění výtěžek RNA v závislosti na objemu vodného roztoku sloučeniny podle vynálezu, obr. 4 výsledek elektroforézy gelu denaturované agarózy a ompA Northern Blot analýzu RNA u E.coli izolované roztoky různých objemů směsí z kationtové sloučeniny a donoru protonů v různých koncentracích, obr. 5 ukazuje ompA(outer membrane protein A) Northern Blot analýzu RNA z E. coli, izolované po přídavku rifampicinu s resp. bez roztoku směsi podle vynálezu, obr. 6 ukazuje bia (β-lactamase) Northern Blot analýzu RNA z E. coli, izolované po přídavku rifampicinu s resp. bez přídavku směsi z kationtové sloučeniny a aditivu, resp. jejich vodného roztoku.

- 24 • ·· ···· ·· · to · « • * ··· • to · · · >

• · · · · · •••to ·· ·· ··· • · • ·· ·· ··

Příklady provedení vynálezu

Vynález je vysvětlen na následujících příkladech:

Příklad 1

Isolace RNA z E>coli

Vodný roztok skládající se z 4 % (w/v) tetradecyltrimethylamoniumoxalátu a 200 mM kyseliny vinné se louhem sodným nastaví na následující hodnoty pH: 2,2 (bez přídavku NaOH); 2,5; 3,0;

3,5; 4,0; 4,5 a 5,0.

K provedení pokusu se na násadu k 400 μΐ kultury E. coli v LB médiu přidají vždy 2, 3 respektive 4 objemy detergentního roztoku s rozdílnými hodnotami pH pipetováním a izolace RNA se provede podle následujícího protokolu:

přídavek 400 μΐ kultury E. coli k předloženému detergentnímu roztoku, rozvířit odstředění při 5000 x g 10 min při 4 °C, přesah dekantovat, peletu znovu suspendovat v 1 ml H₂O, přesah dekantovat, peletu resuspendovat v 100 μΐ TE-pufru^X) s 400 μς/ml lysozymu, ¹¹ TE pufr se skládá z 10 mM tris-HCl a 1 mM EDTA, který se pufruje při pH hodnotě 8.

inkubace 5 min při pokojové teplotě, přídavek 300 μΐ RLT pufru²⁾, rozvířit, • 0 0 0 0 0 0 · 0 • 0 0 0 0 0 0 0 • ♦ 000 0000 0

0 0000 0000

0000 «0 00 00 00

- 25 ²⁾ RLT-pufr je v obchodě běžný pufr (k dostání od firmy QIAGEN, Hilden) na bází guanidiniové soli, jako například guanidiniumisothiokyanátu, a alkalické soli vícesytné organické kyseliny, jakož i β-merkaptoethanolu, který pufruje při pH 7.

přídavek 260 μΐ H₂0, rozvířit, přídavek 40 μΐ proteinázy K (18 mg/ml), rozvířit inkubace 10 min 55 °C, odstřeďování 3 min 1400 x g, odebere se přesah, přidá se 350 μΐ 100% ethanolu, vířivě uložit roztok na RNeasy Mini spin koloně, další zpracování tak, jak je to známo ze známého stavu techniky, například popsáno v RNeasy® Mini protokolu firmy QIAGEN, Hilden, pro izolaci celé RNA z bakterií od kroku 5.

Obr. 1 ukazuje výtěžky RNA v závislosti na hodnotě pH detergentního roztoku a na objemovém poměru mezi kulturou a roztokem detergentu.

Obdržené výsledky ukazují kromě toho, že se nejvyšší výtěžky RNA dají docílit tehdy, když vodný roztok směsi podle vynálezu má hodnotu pH v rozmezí od 3,5 do 5,0.

Intaktnost RNA se analyzuje elektroforézou agarozového gelu. Ve všech případech byly nalezeny intaktní ribosomální RNA pásy.

- 26 • 9999 9« 9999 99 ···· ·· · 9 9 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 · • 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 ·· 9 9 9 · · 9

Příklad 2

Izolace RNA z E.coli s různými variantami protokolu:

Výchozím materiálem pro v tomto příkladu shrnuté experimenty je opět v LB-médiu napěstovaná E. coli kultura. Všechny různé varianty protokolu se provádějí s použitím vždy 1,5 x 10⁸ jakož i 3 x 10⁸ buněk. Pro tuto řadu pokusů se použije vodný roztok směsi podle vynálezu s následujícím složením:

4% (w/v) tetradecyl-trimethyl-amoniumoxalát, 200 mM kyseliny vinné s pH hodnotou 4,0

Vycházeje z následujících parciálních řezů protokolu o izolaci RNA se zhotovují rozličné varianty protokolu:

1) Sběr buněk

Přídavek 3 objemů detergentního roztoku ke kultuře E. coli, rozvířit, odstřeďovat při 5000 x g 10 min při 4 °C, přesah dekantovat,

2) praní pelet peletu resuspendovat v 1 ml H₂O, odstřeďování při 5000 x g 10 min při 4 °C, přesah dekantovat,

3) trávení lysozymem peletu v 100 μΐ TE pufru resuspendovat se 400 gg/ml lysozymu, inkubace 5 min při pokojové teplotě,

4) nastavit vazební podmínky přídavek 350 μΐ RTL pufru, rozvířit, přídavek 250 μΐ 100% ethanolu,

5) trávení proteinázou K • « ·· ·♦ «·· · ·· · ·· · • · · · ♦ · · · · • * ·«· 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 • · · 9 9 9 9 9 9 9 •99 9 99 99 99 99

- 27 přídavek 300 μΐ RTL pufru, rozvířit, přídavek 260 μΐ H₂O, přídavek 40 μΐ proteinázy K (18 mg/ml), rozvířit, inkubace 10 min 55 °C, odstřeďování 3 min 14000 x g, přesah odebrat, přídavek 350 μΐ 100% ethanolu, rozvířit,

6) trávení lysozymem a trávení proteinázou K v rozředěném RLT pufru přídavek 300 μΐ RTL pufru, rozvířit, přídavek 160 μΐ H₂O, rozvířit, přídavek 100 μΐ TE-pufru s 400 μΙ/ml lysozymu, inkubace 5 min při pokojové teplotě, přídavek 40 μΐ proteinázy K (18 mg/ml), rozvířit, inkubace 10 min při 55 °C, odstřeďování 3 min při 14000 x g, přesah odebrat, přídavek 350 μΐ 100% ethanolu, rozvířit,

7) Zpracování pomocí popřípadě modifikované křemičitanové kolony - jako např. RNeasy Mini spin kolony (k dostání u firmy QIAGEN, Hilden)

Naplněni roztoku do kolony, jeho další zpracování podle Rneasy Mini protokolu k izolování celkové RNA z bakterií, krok 5.

Výstupní protokol se srovná s následujícími variantami protokolu:

varianta 1: kroky 1, 3, 4 a 7 varianta 2: kroky 1, 2, 3, 4 a 7 varianta 3: kroky 1, 2, 3, 5 a 7 (výstupní protokol jako v příkladu 1) varianta 4: kroky 1, 6 a 7

Obr. 2 ukazuje výtěžek RNA různých variant protokolu

Výsledky těchto experimentů zřetelně ukazpjí, že provedení varianty 1 protokolu co se týče výtěžku RNA je srovnatelné s výstupním protokolem (varianta 3). V této variantě protokolu se • 444 • 4 ·4· ·

4444 • * 444 444 • 4 444 4444 4 • 4 4444 4444

444 4 44 44 44 44

- 28 neprovádí praní., jakož i trávení proteinázou K. Celkem se tak procedura zpracování podstatně zkrátí, takže tato varianta protokolu je v dalších příkladech použita jako standardní způsob.

Příklad 3

Izolace RNA z E. coli s různými objemovými poměry kultury a vodného roztoku směsi podle vynálezu

Použijí se vodné roztoky směsi podle vynálezu s následujícími složeními:

Roztok QCX 1

Roztok QCX 2

Roztok QCX 3

Roztok QCX 4

4% (w/v) tetradecyltrimethylamoniumoxalát 200 mM kyseliny vinné pH 4,0

6% (w/v) tetradecyltrimethylamoniumoxalát 300 mM kyseliny vinné pH 4,0

8% (w/v) tetradecyltrimethylamoniumoxalát 400 mM kyseliny vinné pH 4,0

15% (w/v) tetradecyltrimethylamoniumoxalát 750 mM kyseliny vinné pH 4,0

Vždy 400 μΐ E. coli kultury vyrostlé v LB médiu (10 g trypton, 5 g extraktu kavasinek, 10 g NaCl, H₂O do 1000 ml) se rozředilo se 2, 3 resp. 4 objemy příslušných roztoků a zpracovalo podlé standardního protokolu definovaného v příkladu 2.

• ···· ·« ··· • · · 9 · · 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 «

999 9 99 99

9999

9 9

Obr. 3 ukazuje výtěžek RNA v závislosti na objemu vodného roztoku kationtové sloučeniny podle vzorce 1 a aditivu.

Jak to vyplývá z experimentálních nálezů, jsou výtěžky RNA při použití 2 resp. 3 objemů různých detergentních roztoků v srovnatelné. Při použití 4 objemů výše popsaných roztoků dochází k určité ztrátě výtěžku RNA. V rámci násad s použitím 2 resp. 3 objemů detergentního roztoku se dosáhnou s roztoky 1, 2 a 3 srovnatelně vysoké výtěžky.

Aby bylo možno posoudit netknutost izolované RNA, natře se RNA na denaturující agaroplachty a následně se provede Northern Blot analýza (srovnej obr. 4!).

Vizuální analýza rRNA pásů ukazuje většinou intaktní ribosomální RNA pásy na agaroplachtě. Pouze pásy obdržené při použití roztoku 4 svědčí o částečné degradaci RNA. Tento nález se potvrzuje analýzou Northern Blot, u které se hybridizuje z E. coli sondou nasměrovanou proti ompA (outer membrane protein A*) mRNA.

* U ompA mRNA se jedná s poločasem 15 min o relativně dlouho žijící RNA-transkript (Nátuře 1984, 312: 75-77).

Opět se ukazuje degradování RNA, která se izoluje roztokem 4. při srovnání ostatních vzorků RNA se ukazují nejostřejší ompA mRNA pásy ve stopách, ve kterých se RNA isoluje roztokem 1. Celkem vykazují vzorky RNA, které se izolovaly roztoky 1 až 3, ale jen velmi malé rozdíly co se týče kvality RNA.

Obr. 4 uvádí výsledek elektroforézy gelu denaturované agarózy a ompA Northern Blot analýzu RNA u E. coli izolované roztoky různého objemu a koncentrací.

999 •9 ♦···

9999 • * 999 999 • * 999 9999 9 • · 9999 9999

999 9 99 99 99 99

- 30 Příklad 4

Stabilizace RNA z E. coli

K posouzení účinnosti stabilizace se v tomto příkladu provádějí experimenty, ve kterých se k buňkám E. coli v kultivačním médiu přidává inhibitor RNA-polymerázy, rifampicin (FEBS Letters 1998, 172 až 174) . Tím se zabrání nové syntéze

RNA-transkriptů, čímž se usnadňuje analýza degradování RNAtranskriptů. V definovaných časových okamžicích po přidání inhibitoru proběhne isolace RNA z buněk. Jako kontroly slouží násady u kterých se postupuje analogicky, ale RNA se izoluje bez přísady roztoku (Rneasy Standard-Protokoll). K posouzení netknutosti mRNA se po izolaci RNA provedou Northern Blot experimenty.

Obr. 5 ukazuje ompA (outer membrane protein A) Northern Blot analýzu RNA z E. coli izolované po přídavku rifampicinu s roztokem a nebo bez roztoku směsi podle vynálezu.

U ompA mRNA se jedná o transkript E. coli, který má za zvolených kulturních podmínek poločas 15 minut (nátuře 1984, 312: 75-77). Northern Blot analýza (obr. 5) ukazuje že se ve vzorcích, které se ošetřují roztokem podle vynálezu, po celou vyšetřovanou dobu (do 15 minut) detekuje stejnoměrně intenzivní signál pro ompA mRNA. Naproti tomu je pro ompA mRNA ve vzorcích bez přísady detergentu již po 0 až 15 minutách dosaženo výrazné ztráty transkriptu.

Obr. 6 ukazuje Northern Blot analýzu pro bia(β-laktamázy) u RNA z E. coli, izolované po přídavku rifampicinu, s resp. bez • ·*· ·* +·· · ·· · ·© · • · · · © · © « · • * · · · « © · ·· · · · © · · · © • · ♦ · · · ···· ·*· · ·* ·· «© ·©

- 31 použití směsi, resp. vodného roztoku, z kationtové sloučeniny a aditivu.

U Northern Blot analýzy pro β-laktamázu mRNA (bia) je týž účinek prokázán ještě výrazněji. Tento transkript mRNA má ža zvolených podmínek kultury poločas 2 až 5 minut (Nátuře 1984, 312: 75-77). Jak je to patrné z obr. 6, je tento transkript prokázán se srovnatelnou intenzitou signálu v celém vyšetřovaném období u vzorků RNA, které se izolovaly s přísadou roztoku. U kontrolních násad bez roztoku detergentu se zaznamenává naproti tomu již při okamžitém zpracování RNA (0 minut) téměř úplná ztráta transkriptu bia mRNA. Rozdíl intenzit signálu bia mRNA mezi oběma izolačními způsoby RNA reflektuje bezprostřední stabilizaci mRNA odpovídajícím vodným roztokem směsi podle vynálezu.

Tyto pokusy dokládají, že se směsí podle vynálezu otevírá možnost fixovat RNA-expresní profily bakterií ve stavu kapalné kultury, aniž by přitom artefakty z izolační procedury vedly k zkreslení expresního vzorku.

Příklad 5

Stabilizace RNA tetradecyltrimethylamoniumbromidem (TTAB)

V následujících experimentech se používá TTAB-řešení následujícího složení:

% (w/v) TTAB

200 mM kyseliny vinné pH 4,0 ···« ** ···« ·· ··*· * · · · » ·»· · * · *·· « · · Α φ ·· · · · · · · « · ··« · «· ·· »e »·

- 32 Různé druhy bakterií se liší mimo jiné co do uspořádání své buněčné stěny. Při použití rozdílných druhů je otevření buňky kritickým krokem k isolaci RNA. Oproti enzymatickému otevření buňky, které zejména pro gram-negativní druhy bakterií vede k dobrým výsledkům, nabízí mechanické otevření buněk potenciálně možnost otevírat nej různější druhy.

Níže uvedená tabulka ukazuje srovnání různých výtěžků, které byly připraveny zčásti podle způsobů dle stavu techniky (RNeasy za provádění lysozymem zprostředkovaného otevírání buněk), za použití směsi podle vynálezu a RNeasy, včetně trávení lysozymem, jakož i za použití směsi podle vynálezu a RNeasy, přičemž enzymatické otevření buňky bylo podporováno použitím kulového mlýnu. Při použití kulového mlýnu (MM 300 firmy QIAGEN)se na násadu 50 mg kyseliny použily vyprané skleněné kuličky (průměr 150 až 600 pm) .Otevření buněk v kulovém mlýnu došlo za 5 minut při maximální vibrační rychlosti (30 Hz).

Tabulka 2

Výtěžky RNA z 1 x 10⁸ buněk B. subtilis za různých způsobů otevírání buněk a následné izolaci RNA s RNeasy®

Otevírání buněk	Lysozymové trávení	roztok TTAB a lysozymové trávení	Roztok TTAB a kulový mlýn a lysozymové trávení
B. subtilis v LB médiu		15 μρ	19 μρ
B. subtilis v minerálním médiu	3 vg	8 μο	10 gg

frfrfrfr fr* frfrfrfr fr * • ·

999 fr frfr · » · » frfr frfrfrfr > · · · » 9 9 9 ·· ·· • fr • frfr • · • frfr • fr frfr

Jak je to ze srovnání zřetelně patrné, vede izolace RNA s roztokem směsi podle vynálezu v kombinaci s mechanickým otevíráním buněk k asi 25% zvýšení ve srovnání s enzymatickým otevíráním buněk za použití roztoku (tabulka 2) . Ve srovnání s izolací RNA podle protokolu normy RNeasy bylo dosaženo mechanickým otevřením buněk za použití detergentního roztoku v průřezu ztrojnásobení výtěžku.

Tyto výsledky ukazují zřetelně, že enzymatické otevření buňky za použití detergentního roztoku probíhá účinně také u grampozitivních buněk B. subtilis, takže nemusí být případně používáno mechanické otevírání buněk.

Použití mechanického způsobu otevírání buněk, jako je pomocí kulového mlýna, otevírá ale navíc možnost dosáhnout za zřeknutí se enzymatického otevírání buněk zhruba šetinásobného stoupnutí výtěžku ve srovnání k izolaci RNA bez enzymatického nebo mechanického otevírání buněk, jak to jasně ukazuje níže uvedený experimentální nález:

Jako výchozí materiál slouží kultura Bacillus subtilis vyrostlá v LB médiu. Výtěžky RNA se srovnávají vždy z 1,8 x 10⁸ buněk na násadu (tabulka 3) . V části vzorků došlo k otevření buněk za pomoci kulového mlýnu (MM300 firmy QIAGEN) za použití 50 mg kyselinou vypraných skleněných kuliček (průměr 150 až 600 pm) na násadu. K otevření buněk v kulovém mlýnu došlo za 5 minut při maximální frekvenci vibrací (30 Hz) . V druhé části vzorků se neprovádělo ani enzymatické, ani mechanické otevírání buněk. (Literatura: J.Microbíol. Methods 44 (2001): 235 - 238) Promega SV Total RNA Isolation Systém.

Claims (39)

1. Použití směsi obsahující jako složky kationtovou sloučeninu obecného vzorce Y+RiRžRsRíX', ve kterém Y je dusík nebo fosfor, Ri, R2, R3 a R4 jsou nezávisle na sobě nerozvětvené nebo rozvětvené alkylové zbytky s 1 až 20 atomy uhlíku ahebo arylové zbytky s 6 až 20 atomy uhlíku nebo aralkylové zbytky se 6 až 26 atomy uhlíku a X” je aniont anorganické nebo organické jednosytné nebo vícqsytné kyseliny, a alespoň jeden donor protonů jako aditivum k stabilizaci anebo izolaci nukleových kyselin v respektive z mikroorganismů, jako jsou prokaryonta, houby, prvoci nebo řasy.

2. Použití směsi podle nároku 1, vyznačující se tím, že Y znamená dusík.

3. Použití směsi podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že Ri znamená zbytek vyššího alkylu, s výhodou s 12, 14 nebo 16 atomy uhlíku a R₂, R3 a R4 znamenají vždy methylovou skupinu.

4. Použití směsi podle nároků 1 až 3 vyznačující se tím, že aniont X^- je zvolen ze skupiny aniontů halogenovodíkových kyselin nebo aniontů jednosytných nebo dvojsytných organických kyselin.

5. Použití směsi podle nároku 4 vyznačující se tím, že aniont X“ je zvolen ze skupiny aniontů obsahující bromid, chlorid, fosfát, sulfát, formiát, acetát, propionát, oxalát, malonát sukcinát nebo citrát.

• · ·

- 36

6. Použití směsi podle nároků 1 až 5 vyznačující se tím, že je donor protonů zvolen ze skupiny nasycených monokarboxylových kyselin, nenasycených karboxylových kyselin, nasycených anebo alifatických dikarboxylových anebo trikarboxylových kyselin s 2 až 6 atomy uhlíku, alifatických ketokarboxylových nebo ketodikarboxylových kyselin, aminokyselin nebo ze skupiny minerálních kyselin nebo jejich solí samotných nebo v kombinaci.

alifatických alkenylových nenasycených

7. Použití směsi podle nároku 6 vyznačující se tím, že se jako alifatická monokarboxylová kyselina použije alkylkarboxylová kyselina s alkylem s 1 až 6 atomy uhlíku, s výhodou kyselina octová, kyselina propionová, kyselina n-máselná, kyselina n-valerová, kyselina išovalerová, kyselina ethyl-methyl-octová (kyselina 2-methyl-máselná), kyselina 2,2-dimethylpropionová (kyselina pivalinová), kyselina n-hexanová, kyselina n-oktanová, n-dodekanová kyselina (kyselina n-dekanová, jakož kyselina laurinová) nebo směsi uvedených kyselin.

8. Použití směsi podle nároku 6 vyznačující se tím, že se jako alifatická alkenylkarboxylová kyselina (kyselina propenová) použije kyselina methakrylová, kyselina krotonová, kyselina isokrotonová nebo kyselina vinyloctová nebo směsi z uvedených kyselin.

9. Použití směsi podle náfoku 6 vyznačující se tím, že se jako nasycené alifatické dikarboxylové kyseliny s 2 až 6 atomy uhlíku použije dikarboxylové kyselina ze skupiny kyselina oxalová, kyselina malpnová, kyselina jantarová, • · · · • · • ·

- 37 kyselina glutarová nebo kyselina adipinová nebo směsi z uvedených kyselin.

10. Použití směsi podle nároku 9 vyznačující se tím, že se jako donory protonů použijí alifatické dikarboxylové kyseliny, s výhodu kyselina oxalová nebo kyselina jantarová nebo směsi uvedených kyselin.

11. Použití směsi podle nároku 6 vyznačující se tím, že se jako donory protonů použijí alifatické hydroxy-di- a trikarboxylové kyseliny, s výhodou kyselina tartronová, D—(+)—, kyselina L—(—)— nebo DL-jablečná, kyselina (2R, 3R)-(+)-vinná, kyselina (2S, 3S)-(-)-vinná, kyselina meso-vinná a kyselina citrónová nebo směsi z uvedených kyselin.

12. Použití směsi podle nároku 6 vyznačující se tím, že se jako donory protonů použijí nenasycené dikarboxylové kyseliny, s výhodou kyselina maleinová anebo kyselina fumarová nebo směsi uvedených kyselin.

13. Použití směsi podle nároku 6 vyznačující se tím, že se jako donory protonů použijí nenasycené trikarboxylové kyseliny, s výhodu kyselina akonitová nebo směsi těchto kyselin.

14. Použití směsi podle nároku 6 vyznačující se tím, že se jako donory protonů použijí alifatické ketodikarboxylové kyseliny, s výhodou kyselina mesoxalová nebo kyselina oxaloctová nebo směsi uvedených kyselin.

• · • · · ·

- 38

15. Použití směsi podle nároku 6 vyznačující se tím, že se jako donory protonů použijí aminokyseliny, s výhodu aminooctová kyselina (glycin), α-aminopropionová (alanin), α-amino-iso-valerová (valin), α-amino-iso-kapronová (leucin) a kyselina a-amino-fi-methylvalerová (isoleucin) nebo směsi uvedených kyselin.

16. Použití směsi podle nároků 1 až 15 vyznačující se tím, že se směs používá ve formě vodného roztoku.

17. Použití směsi podle nároku 16 vyznačující se tím, že kationtová sloučenina ve směsi je v koncentraci v intervalu od 0,01 % (w/v) do nasycenosti, s výhodou mezi 0,1 % a 10 % (w/v) a zvláště s výhodou v rozmezí od 0,5 do 8 % (w/v) a nejvýhodněji v rozmezí mezi 2 a 6 % (w/v).

18. Použití směsi podle nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že nukleové kyseliny pocházejí z prokaryontů, archaebakterií, zejména z Methanothermobacter marbirgensis) nebo eubakterií.

19.

Použití podle nároku 18, vyznačující se tím, ze nukleove ky^Tselmy^r pocházejí z gram pozitivních bakterii.

20. Použití podle nároku 19 vyznačující se tím, že nukleové kyseliny pocházejí z kmenů Bacillus, s výhodu Bacillus subtilis, Staphylococcus, s výhodu Staphylococcus aureus nebo Staphylococcus epidermis, Streptomyces, s výhodu Streptomyces coelicotor nebo Streptomyces lividans, Flavobakterium, s výhodu Flavobakterium johnšoniae, Mycobakterium, s výhodou Mycobakterium avium, Streptococcus, Clostridium, s výhodu Clostridium difficile, Clostridium • ·

- 39 tetani a Clostridium perfringens, Lysteria, Peptococcus, Peptostreptococcus, Enterococcus, Corynebacterium, s výhodu Corynebacterium diphteriae nebo Corynebacterium glutamicum, Propionibakterium, Lactobacillus.

21.

22.

Použití podle nároku 18 vyznačující se tím, že nukleové kyseliny pocházejí z gram-negativních bakterií.

Použití podle nároku 21 vyznačující se tím, že nukleové kyseliny pocházejí z Escherichia, s výhodou Escherichia coli, Pseudomonas, s výhodou Pseoudomonas aeroginosa, Pseudomonas putida nebo Pseeudomonas syringae, Klebsiella, s výhodou Klebsiella pneumoniae, Salmonella, s výhodou Salmonella typhimurium, Sinorhizobium, s výhodou Sinorhizobium meliloti nebo Camphylobacter, Neisseria, s výhodou Neisseria gonorrhoae nebo Neisseria meningitidis, Vibrio, s výhodou Vibrio cholerae, Shigella, Serratia, Enterobacter, Acinetobacter, Próteus, Yersinia, Brucella, s výhodou Brucella abortus, Haemophilus, s výhodou Haemophilus influenza, Bacteroides, Campylobacter, Helicobacter, s výhodou Helicobacter pylori, Bordetella, Legionella nebo Pasteurella.

23.

Použití podle nároku 18 nukleové kyseliny pocházejí vyznačuj ící z kmene Clamydia tím, že

24.

Použití podle nároku 18 nukleové kyseliny pocházejí vyznačující se tím, z fototropních bakterií.

že

25.

Použití podle nároku 18 vyznačující se tím, že nukleové kyseliny pocházejí z kmene Mycoplazma, s výhodou z Mycoplasma penetrans.

• · · · ·· · · tím, že

- 40

26. Použití podle nároku 18 vyznačující se nukleové kyseliny pocházejí z kmene Rickettsiae.

27. Použití podle nároku 18 vyznačující se nukleové kyseliny pocházejí z kmene Spirochaeta.

tím, že

28. Použití podle nároku 18 vyznačující se tím, že nukleové kyseliny pocházejí z kmene Spirillum.

29. Použití podle nároků 1 až 17 vyznačující se tím, že nukleové kyseliny pocházejí z eukaryotických mikroorganismů.

30. Použití podle nároku 29 vyznačující se tím, že nukleové kyseliny pocházejí z hub skupiny dermatofytů, kvasinek, plísňových hub a bifázních hub.

31. Použití podle nároku 30 vyznačující se tím, že nukleové kyseliny pocházejí z kvasinek rodu Saccaromyces, s výhodou Saccaromyces cerevisiae, Candida, s výhodou Candida albicans nebo Cryptococcus s výhodou Cryptococcus neoformans.

32. Použití podle nároku 30 vyznačující se tím, že nukleové kyseliny pocházejí z plísňových hub skupiny

Aspergillus, s výhodou Aspergillus fumigatus.

33. Použití podle nároku 30 vyznačující se tím, že nukleové kyseliny pocházejí z plísňových hub skupiny Penicillium.

34. Použití podle nároku 30 vyznačující se tím, že nukleové kyseliny pocházejí z plísňových hub skupiny Mucor.

9 9999 99 9999 99 9999

99 999 99φ 9

9 9 999 999

9 9 999 9999 9

9999 99 9 9 9 9 9 9 - 41 - 35. Použití podle nároku 29 vyznačující se tím, že nukleové kyseliny pocházejí z řas. 36. Použití podle nároku 29 vyznačující se tím, že nukleové kyseliny pocházejí z prvoků, s výhodou jsou to trypanosomy, toxoplasmy, ameoby, plasmodia, flageláty. 37. Použití směsi podle nároků 1 až 36 vyznačující se

tím, že dochází k enzymatickému, mechanickému, tepelnému nebo chemickému otevření bakterií nebo hub nebo prvoků nebo řas nebo že se použije kombinace způsobů otevření.

38. Použití směsí podle nároků 1 až 37, vyznačující se tím, že hodnota pH směsi leží v rozsahu od 2 do 12, s výhodou od 2 do 8 a nejvýhodněji v intervalu od 2 do 5.

39. Způsob výroby jedné ze směsí podle nároků 1 až 17 vyznačující se tím, že se dají dohromady a směšují jednotlivé součásti, popřípadě ve vodném roztoku.

40. Diagnostická sestava obsahující směs podle jednoho z nároků 1 až 17.

41. Souprava k stabilizaci nukleových kyselin obsahující směs podle jednoho z nároků 1 až 17.

42. Směs obsahující biologický vzorek podle jednoho z nároků 18 až 36 a směs podle jednoho z nároků 1 až 17, popřípadě vedle dalších pomocných látek.