JP5657847B2 - 原核生物、菌類、原生動物もしくは藻類などの微生物中で、または微生物から核酸を安定化および/または単離するための、カチオン化合物およびプロトン供与体からなる組成物の使用 - Google Patents
原核生物、菌類、原生動物もしくは藻類などの微生物中で、または微生物から核酸を安定化および/または単離するための、カチオン化合物およびプロトン供与体からなる組成物の使用 Download PDFInfo
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Description
【化2】
Y+R1R2R3R4X-
(式中、Yは、窒素またはリンを示すことができ、
R1、R2、R3およびR4は、互いに独立して、未分枝もしくは分枝C1−C20アルキル基および/またはC6−C20アリール基並びにC7−C26アラルキル基を示すことができ、かつ
X-は、無機もしくは有機の一塩基酸または多塩基酸のアニオンを示すことができる)のカチオン化合物と、添加剤として少なくとも1つのプロトン供与体とを含有する組成物の新規な使用に関する。
メチル、エチル、プロピル、1−メチルエチル(イソ−プロピル)、ブチル、1−メチルプロピル、2−メチルプロピル、1,1−ジメチルエチル、n−ペンチル、1−メチルブチル、2−メチルブチル、3−メチルブチル、1,1−ジメチルプロピル、1,2−ジメチルプロピル、2,2−ジメチルプロピル、1−エチルプロピル、ヘキシル、1−メチルペンチル、2−メチルペンチル、3−メチルペンチル、4−メチルペンチル、1,1−ジメチルブチル、1,2−ジメチルブチル、1,3−ジメチルブチル、2,2−ジメチルブチル、2,3−ジメチルブチル、3,3−ジメチルブチル、1−エチルブチル、2−エチルブチル、1,1,2−トリメチルプロピル、1,2,2−トリメチルプロピル、1−エチル−1−メチルプロピルおよび1−エチル−2メチル−プロピル
2−プロペニル(アリル)、2−ブテニル、3−ブテニル、1−メチル−2−プロペニル、2−メチル−2−プロペニル、2−ペンテニル、3−ペンテニル、4−ペンテニル、1−メチル−2−ブテニル、2−メチル−2−ブテニル、3−メチル−2−ブテニル、1−メチル−3−ブテニル、2−メチル−3−ブテニル、3−メチル−3−ブテニル、1,1−ジメチル−2−プロペニル、1,2−ジメチル−2−プロペニル、1−エチル−2−プロペニル、2−ヘキセニル、3−ヘキセニル、4−ヘキセニル、5−ヘキセニル、1−メチル−2−ペンテニル、2−メチル−2−ペンテニル、3−メチル−2−ペンテニル、4−メチル−2−ペンテニル、1−メチル−3−ペンテニル、2−メチル−3−ペンテニル、3−メチル−3−ペンテニル、4−メチル−3−ペンテニル、1−メチル−4−ペンテニル、3−メチル−4−ペンテニル、4−メチル−4−ペンテニル、1,1−ジメチル−2−ブテニル、1,1−ジメチル−2−ブテニル、1,1−ジメチル−3−ブテニル、1,2−ジメチル−2−ブテニル、1,2−ジメチル−3−ブテニル、1,3−ジメチル−2−ブテニル、1,3−ジメチル−3−ブテニル、2,2−ジメチル−3−ブテニル、2,3−ジメチル−2−ブテニル、2,3−ジメチル−3−ブテニル、1−エチル−2−ブテニル、1−エチル−3−ブテニル、2−エチル−1−ブテニル、2−エチル−2−ブテニル、2−エチル−3−ブテニル、1,1,2−トリメチル2−プロペニル、1−エチル−1−メチル−2−プロペニルおよび1−エチル−2−メチル−2−プロペニル
2−プロピニル(プロパルギル)、2−ブチニル、3−ブチニル、1−メチル−2−プロピニル、2−メチル−2−プロピニル、2−ペンチニル、3−ペンチニル、4−ペンチニル、1−メチル−2−ブチニル、2−メチル−2−ブチニル、3−メチル−2−ブチニル、1−メチル−3−ブチニル、2−メチル−3−ブチニル、3−メチル−3−ブチニル、1,1−ジメチル−2−プロピニル、1,2−ジメチル2−プロピニル、1−エチル−2−プロピニル、2−ヘキシニル、3−ヘキシニル、4−ヘキシニル、5−ヘキシニル、1−メチル−2−ペンチニル、2−メチル−2−ペンチニル、3−メチル−2−ペンチニル、4−メチル−2−ペンチニル、1−メチル−3−ペンチニル、2−メチル−3−ペンチニル、3−メチル−3−ペンチニル、4−メチル−3−ペンチニル、1−メチル−4−ペンチニル、3−メチル−4−ペンチニル、4−メチル−4−ペンチニル、1,1−ジメチル−2−ブチニル、1,1−ジメチル−2−ブチニル、1,1−ジメチル−3−ブチニル、1,2−ジメチル−2−ブチニル、1,2−ジメチル−3−ブチニル、1,3−ジメチル−2−ブチニル、1,3−ジメチル−3−ブチニル、2,2−ジメチル−3−ブチニル、2,3−ジメチル−2−ブチニル、2,3−ジメチル−3−ブチニル、1−エチル−2−ブチニル、1−エチル−3−ブチニル、2−エチル−1−ブチニル、2−エチル−2−ブチニル、2−エチル−3−ブチニル、1,1,2−トリメチル−2−プロピニル、1−エチル−1−メチル−2−プロピニルおよび1−エチル−2−メチル−2−プロピニル
例えば定量RT−PCR、NASBA、bDNA技術またはバイオチップおよびノーザンブロットなどの分子生物学的方法による微生物のRNA発現パターンの調査は、原核生物ならびに原生動物、菌類および藻類の遺伝子発現の分析で基礎研究に使用されており、例えば、医学的診断、微生物病原菌の同定、医薬組成物を開発および評価するための医薬品産業、研究および治療用用途のための組換えタンパク質の製造におけるバイオテクノロジー、生態学および集団生物学において、更に微生物による汚染を検出するための食品分析においても、重要性が増大している。
本発明の一般的な目的は、従来技術から知られている上述の欠点を避けることである。
クロストリディウム属(例えば、クロストリディウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、破傷風菌、およびクロストリディウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)など)
リステリア属
ペプトコッカス属(Peptococcus)
ペプトストレプトコッカス属(Peptostreptococcus)
腸球菌
コリネバクテリア(例えば、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)またはコリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)など)
プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium)
乳酸桿菌属
にも適用される。
ナイセリア属(例えば、淋菌または髄膜炎菌など)
ビブリオ属(例えば、コレラ菌(Vibrio cholerae)など)
赤痢菌属
セラチア属
エンテロバクター属
アシネトバクター属
プロテウス属
エルシニア属(Yersinia)
ブルセラ属(例えば、ブルセラ・アボルタス(Brucella abortus)など)
ヘモフィルス属(Haemophilus)(例えば、インフルエンザ菌(Haemophilus influenza)など)
バクテロイデス属
カンピロバクター属
ヘリコバクター属(例えば、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)など)
ボルデテラ属
レジオネラ属
パスツレラ属
にも適用される。
本発明の上記課題は、細菌、菌類、原生動物若しくは藻類の定義された培養物、または、細菌および/若しくは菌類および/若しくは原生動物および/若しくは藻類を含有するサンプルを、一般式1のカチオン化合物と少なくとも1種類のプロトン供与体とを含有する組成物と、またはその水溶液と接触させることによって解決される。
図1は、界面活性剤溶液のpHおよび培養液と界面活性剤の容積比に対するRNA収量の依存性を図示する。
図2は、方法の様々な変形に対するRNA収量の依存性を図示する。
図3は、本発明による化合物の水溶液の容積の関数として、RNA収量を図示する。
図4は、様々な濃度でのカチオン化合物とプロトン供与体との組成物の溶液の異なる容積の溶液を用いて単離された、大腸菌RNAの変性アガロースゲル電気泳動およびompAノーザンブロット分析の結果を示す。
図5は、本発明による組成物を溶解して、および溶解することなく、リファンピシン(rifanpicin)を添加した後に単離された大腸菌RNAのompA(“外膜タンパク質A”)ノーザンブロット分析を示す。
図6は、カチオン化合物と添加剤との組成物、またはその水溶液を使用して、および使用することなく、リファンピシンを添加した後に単離された大腸菌RNAのbla(β−ラクタマーゼ)ノーザンブロット分析を示す。
大腸菌からのRNAの単離
4%(w/v)テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレートおよび200mM酒石酸からなる水溶液を、水酸化ナトリウム溶液で以下のpH値:
2.2(NaOHの添加なし);2.5;3.0;3.5;4.0;4.5および5.0、25
に調整する。
−調製した界面活性剤溶液に大腸菌培養液400μlを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し(vortexing)、
−5000×gにて、4℃で10分間遠心分離し、
−上清をデカントし、
−ペレットを1ml H2O中に再懸濁し、
−5000×gにて、4℃で10分間遠心分離し、
−上清をデカントし、
−400μg/mlのリゾチームを含有するTEバッファー1)100μl中にペレットを再懸濁し、
−室温で5分間インキュベートし、
−RLTバッファー2)300μlを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、
−H2O 260μlを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、
−プロテイナーゼK 40μl(18mg/ml)を添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、
−55℃で10分間インキュベートし、
−14000×gにて、3分間遠心分離し、
1)TEバッファーは、10mMトリス−HClおよび1mM EDTAからなり、pH8で緩衝作用をする。
2)RLTバッファーは、イソチオシアン酸グアニジウムなどのグアニジウム塩、および多塩基有機酸のアルカリ金属塩ならびにβ−メルカプトエタノールに基づく、市販の標準バッファー(キアゲン社(Messrs. QIAGEN)(ヒルデン(Hilden))から入手可能)を意味し、pH7で緩衝作用をする。
−上清を除去し、100%エタノール350μlを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、
−RNeasyミニスピンカラム上に溶液を充填し、
−細菌から全RNAを単離するために、例えばキアゲン社(Messrs. QIAGEN)、ヒルデン(Hilden)によるRNeasy(登録商標)ミニの手順と同様に、従来技術から知られているように更に処理する、段階5以降。
異なる代替手順による大腸菌からのRNAの単離
この実施例において回収された実験のための出発原料は、再度、LB培地中で成長した大腸菌培養物である。異なる代替手順すべてを、1.5×108個および3×108個の細胞を用いて行う。この一連の実験では、以下の組成:
4%(w/v)テトラデシル−トリメチル−アンモニウムオキサレート
200mM酒石酸
を有する、pH4.0の、本発明による組成物の水溶液が使用される。
1)細胞採取
大腸菌培養液に界面活性剤溶液3容積を添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、5000×gにて4℃で10分間遠心分離し、上清をデカントする。
2)ペレットの洗浄
ペレットをH2O 1m1中に再懸濁し、5000×gにて4℃で10分間遠心分離し、上清をデカントする。
3)リゾチームによる消化
400μg/mlのリゾチームを含有するTEバッファー100μl中にペレットを再懸濁し、室温で5分間インキュベートする。
4)結合条件の確立
RLTバッファー350μlを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、100%エタノール250μlを添加する。
5)プロテイナーゼKによる消化
RLTバッファー300μlを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、H2O 260μlを添加し、プロテイナーゼK 40μl(18mg/ml)を添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、55℃で10分間インキュベートし、14000×gにて3分間遠心分離し、上清を除去し、100%エタノール350μlを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌する。
6)希釈RLTバッファー中でのリゾチームによる消化およびプロテイナーゼKによる消化
RLTバッファー300μlを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、H2O 160μlを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、400μg/mlのリゾチームを含有するTEバッファー100μlを添加し、室温で5分間インキュベートし、プロテイナーゼK 40μl(18mg/ml)を添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、55℃で10分間インキュベートし、14000×gにて3分間遠心分離し、上清を除去し、100%エタノール350μlを添加し、ボルテックスミキサーで攪拌する。
7)例えば、RNeasyミニスピンカラム(キアゲン社(Messrs QIAGEN)(ヒルデン(Hilden))から入手可能)など、任意に改質されたシリカカラムを用いたワークアップ
溶液をカラムに充填し、細菌から全RNAを単離するRNeasyミニ方法に従ってさらに処理する(段階5)。
変形1:段階1);3);4)および7)
変形2:段階1);2);3);4)および7)
変形3:段階1);2);3);5)および7)(実施例1と同様の初期手順)
変形4:段階1);6)および7)
と比較する。
培養液と本発明による組成物の溶液の異なる容積比による、大腸菌からのRNAの単離
以下の組成を有する、本発明による組成物の水溶液を使用する:
溶液 QCX 4% (w/v) テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレート
200mM 酒石酸
pH 4.0
溶液 QCX 2 6% (w/v) テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレート
300mM 酒石酸
pH 4.0
溶液 QCX 3 8% (w/v) テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレート
400mM 酒石酸
pH 4.0
溶液 QCX 4 15% (w/v) テトラデシルトリメチルアンモニウムオキサレート
750mM 酒石酸
pH 4.0
大腸菌RNAの安定化
安定化効率を評価するために、この実施例では、RNAポリメラーゼ阻害剤リファンピシンを培養培地中の大腸菌細胞に添加する実験を行う(FEBS Letters 1998,440:172−174)。これは、RNA転写物の新たな合成を防ぎ、それにより、RNA転写物分解の分析がより容易になる。阻害剤を添加した後、所定時間に、RNAを細胞から単離する。使用する対照は、同様のプロセスに付される混合物であるが、そあ中で、RNAは溶液を添加することなく単離される(RNeasy標準法)。mRNAの完全性を評価するために、RNAの単離後にノーザンブロット実験を行う。
テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド(TTAB)によるRNAの安定化
以下の実験において、以下の組成を有するTTAB溶液を使用する:
4%(w/v)TTAB
200mM酒石酸
pH4.0
Claims (26)
- 真正細菌中の、または真正細菌からの、核酸を安定化するための方法であって、前記真正細菌に、一般式:
Y+R1R2R3R4X-
(式中、Yは、窒素を示し、
R 1 は、分枝もしくは非分枝C 1 〜C 20 アルキル基を示し、R 2 、R 3 およびR 4 は互いに独立して、分枝もしくは非分枝C 1 〜C 6 アルキル基を示し、かつ、
X-は、無機もしくは有機の一塩基酸または多塩基酸のアニオンを示す)のカチオン化合物および少なくとも1種類のプロトン供与体を成分として含有する組成物を施すことを含む方法であって、
前記プロトン供与体が、飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニル−カルボン酸、飽和脂肪族C2−C6ジカルボン酸、不飽和脂肪族C2−C6ジカルボン酸、飽和脂肪族C2−C6トリカルボン酸、不飽和脂肪族C2−C6トリカルボン酸、脂肪族ヒドロキシ−ジカルボン酸、脂肪族ヒドロキシ−トリ−カルボン酸、脂肪族ケトジカルボン酸、アミノ酢酸(グリシン)、α−アミノプロピオン酸(アラニン)、α−アミノ−イソ吉草酸(バリン)、α−アミノ−イソカプロン酸(ロイシン)およびα−アミノ‐β−メチル吉草酸(イソロイシン)から選択されるアミノ酸、リン酸およびそのアルカリ金属もしくはそのアンモニウム塩、ならびに硫酸およびそのアルカリ金属もしくはそのアンモニウム塩の中から、単独でまたは組み合わせて選択され、
前記プロトン供与体は濃度100mM〜500mMで存在する方法。
- R1が、12個、14個、または16個の炭素原子を有する高級アルキル基であり、かつ、R2、R3およびR4が、それぞれに、メチル基を示すことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- アニオンX-が、ハロゲン化水素酸のアニオンまたは一塩基もしくは二塩基有機酸のアニオン、リン酸塩のアニオン、または硫酸塩のアニオンの中から選択されることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- アニオンX-が、臭化物、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩およびクエン酸塩からなる群から選択されることを特徴とする、請求項3に記載の方法。
- 酢酸、プロピオン酸、n−酪酸、n−吉草酸、イソ吉草酸、エチル−メチル−酢酸(2−メチル−酪酸)、2,2−ジメチルプロピオン酸(ピバル酸)、n−カプロン酸、n−オクタン酸、n−デカン酸、もしくはn−ドデカン酸(ラウリン酸)または前述の酸の混合物から選択される脂肪族モノカルボン酸がプロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- アクリル酸(プロペン酸)、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸およびビニル酢酸または前述の酸の混合物から選択される不飽和アルケニル−カルボン酸がプロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸またはアジピン酸または前述の酸の混合物の中から選択される飽和脂肪族C2−C6ジカルボン酸が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- シュウ酸またはコハク酸または前述の酸の混合物から選択される飽和脂肪族C2−C6ジカルボン酸がプロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- タルトロン酸、D−(+)、L−(−)−またはDL−リンゴ酸、(2R,3R)−(+)−酒石酸、(2S,3S)−(−)−酒石酸、メソ−酒石酸およびクエン酸または前述の酸の混合物から選択される脂肪族ヒドロキシ−ジ−カルボン酸または脂肪族ヒドロキシ−トリ−カルボン酸がプロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- マレイン酸および/若しくはフマル酸または前述の酸の混合物から選択される不飽和脂肪族C2−C6ジカルボン酸がプロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- アコニット酸である不飽和脂肪族C2−C6トリカルボン酸が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- メソシュウ酸若しくはオキサロ酢酸、または前述の酸の混合物から選択される脂肪族ケトジカルボン酸が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 組成物が水溶液の状態で使用される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- カチオン化合物が、0.01%(W/V)〜飽和の範囲の濃度で組成物中に存在することを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 核酸が、グラム陽性菌に由来することを特徴とする、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸が、バチルス属(Bacillus)、ブドウ球菌属(Staphylococcus)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、フラボバクテリウム属(Flalvobacterium)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、連鎖球菌属(Streptococcus)、クロストリディウム属(Clostridiae)、リステア属(Listeria)、ペプトコッカス属(Peptococcus)、ペプトスレプトコッカス属(Peptostreptococcus)、腸球菌(Enterococcus)、コリネバクテリア(Corynebacterium)、プロピオニバクテリウム属(Propionibacterium)、または乳酸桿菌属(Lactobacillus
)に由来することを特徴とする、請求項15に記載の方法。
- 核酸が、枯草菌に由来することを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 核酸が、グラム陰性菌に由来することを特徴とする、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸が、エシェリキア属(Escherichia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、莢膜桿菌(Klebsiella)、サルモネラ属(Salmonella)、シノルヒゾビウム(Sinorhizobium)、カンピロバクター属(Campylobacter)、ナイセリア属(Neisseria)、ビブリオ属(Vibrio)、赤痢菌属(Shigella)、セラチア属(Serratia)、エンテロバクター属(Enterobacter)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、プロテウス属(Proteus)、エルシニア属(Yersinia)、ブルセラ属(Brucella)、ヘモフィルス属(Haemophilus)、バクテロイデス属(Bacteroides)、ヘリコバクター属(Helicobacter)、ボルデテラ属(Bordetella)、レジオネラ属(Legionella)、またはパスツレラ属(Pasteurella)に由来することを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 核酸が、大腸菌に由来することを特徴とする、請求項19に記載の方法。
- 核酸が、クラミジア属(Chlamydia)、屈光性菌、マイコプラズマ属(Mycoplasma)、リケッチア(Rickettsia)、スピロヘータ属(Spirochetes)または、らせん菌に由来することを特徴とする、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 真正細菌の酵素的、機械的、熱的若しくは化学的溶解を行うか、またはそれらの溶解方法の組み合わせを用いることをさらに含む請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 一般式:
Y+R1R2R3R4X-
(式中、Yは、窒素を示し、
R 1 は、分枝もしくは非分枝C 1 〜C 20 アルキル基を示し、R 2 、R 3 およびR 4 は互いに独立して、分枝もしくは非分枝C 1 〜C 6 アルキル基を示し、かつ、
X-は、無機もしくは有機の一塩基酸または多塩基酸のアニオンを示す)のカチオン化合物および少なくとも1種類のプロトン供与体を成分として含有する、真正細菌中の、または真正細菌からの、核酸を安定化するための核酸保存安定化組成物であって、前記プロトン供与体が、飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニル−カルボン酸、飽和脂肪族C2−C6ジカルボン酸、不飽和脂肪族C2−C6ジカルボン酸、飽和脂肪族C2−C6トリカルボン酸、不飽和脂肪族C2−C6トリカルボン酸、脂肪族ヒドロキシ−ジカルボン酸、脂肪族ヒドロキシ−トリ−カルボン酸、脂肪族ケトジカルボン酸、アミノ酢酸(グリシン)、α−アミノプロピオン酸(アラニン)、α−アミノ−イソ吉草酸(バリン)、α−アミノ−イソカプロン酸(ロイシン)およびα−アミノ‐β−メチル吉草酸(イソロイシン)から選択されるアミノ酸、リン酸およびそのアルカリ金属もしくはそのアンモニウム塩、ならびに硫酸およびそのアルカリ金属もしくはそのアンモニウム塩の中から、単独でまたは組み合わせて選択され、
前記プロトン供与体は濃度100mM〜500mMで存在する組成物。
- 診断用に用いられる請求項23に記載の組成物。
- 請求項23または24に記載の組成物を含む、真正細菌中の、または真正細菌からの、核酸を安定化するためのキット。
- 真正細菌を含む生物学的サンプルと、請求項23または24に記載の組成物とを含有する、前記真正細菌中の核酸が安定化されている混合物。
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JP2015027310A (ja) * | 2000-06-27 | 2015-02-12 | キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | 原核生物、菌類、原生動物もしくは藻類などの微生物中で、または微生物から核酸を安定化および/または単離するための、カチオン化合物およびプロトン供与体からなる組成物の使用 |
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