SK18022002A3 - Použitie zmesí z katiónových zlúčenín a donorov protónov na stabilizáciu alebo izoláciu nukleových kyselín v mikroorganizmoch alebo z mikroorganizmov, ako sú prokaryonty, huby, prvoky alebo riasy - Google Patents

Použitie zmesí z katiónových zlúčenín a donorov protónov na stabilizáciu alebo izoláciu nukleových kyselín v mikroorganizmoch alebo z mikroorganizmov, ako sú prokaryonty, huby, prvoky alebo riasy Download PDF

Info

Publication number
SK18022002A3
SK18022002A3 SK1802-2002A SK18022002A SK18022002A3 SK 18022002 A3 SK18022002 A3 SK 18022002A3 SK 18022002 A SK18022002 A SK 18022002A SK 18022002 A3 SK18022002 A3 SK 18022002A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
acid
acids
nucleic acids
rna
fungi
Prior art date
Application number
SK1802-2002A
Other languages
English (en)
Inventor
Uwe Oelm�Ller
Tanja Wille
Original Assignee
Qiagen Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qiagen Gmbh filed Critical Qiagen Gmbh
Publication of SK18022002A3 publication Critical patent/SK18022002A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C211/00—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
    • C07C211/62—Quaternary ammonium compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C211/00—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
    • C07C211/62—Quaternary ammonium compounds
    • C07C211/63—Quaternary ammonium compounds having quaternised nitrogen atoms bound to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C211/00—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
    • C07C211/62—Quaternary ammonium compounds
    • C07C211/64—Quaternary ammonium compounds having quaternised nitrogen atoms bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic System
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
    • C07F9/54—Quaternary phosphonium compounds

Description

Použitie zmesi z katiónových zlúčenín a donorov protónov na stabilizáciu alebo izoláciu nukleových kyselín v mikroorganizmoch alebo z mikroorganizmov ako sú prokaryonty, huby, prvoky alebo riasy
Oblasť techniky
Vynález sa týka použitia zmesí z katiónových zlúčenín a donorov protónov na stabilizáciu alebo izoláciu nukleových kyselín v mikroorganizmoch alebo z mikroorganizmov ako sú prokaryonty (bezjadrové organizmy), huby, prvoky (protozoa) alebo riasy.
Doterajší stav techniky
K úlohe predkladaného vynálezu:
Všeobecná úloha predmetného vynálezu spočíva v tom, odstrániť opísané a zo stavu techniky známe nedostatky.
Ďalšou úlohou predmetného vynálezu je zabrániť pri izolácii nukleovej kyseliny z mikroorganizmov, ako sú baktérie, huby, ako
I .
napr. kvasinky, prvoky alebo riasy, zmene ge'nexpresívneho vzoru, spôsobeného spracovaním, takže génexpresívny vzor buniek odráža definované kultúrne podmienky alebo podmienky v pôvodnej vzorke, ako napríklad vzorke odoberanej z pacienta alebo z potraviny, a nie zmeny vyvolané podmienkami zberu buniek, resp. spôsobom izolácie nukleovej kyseliny, aby sa tým zaistila validita prípadných nasledujúcich analýz.
Ďalšia úloha existujúceho vynálezu spočíva v tom, umožniť časovo paralelné spracovanie väčších počtov vzoriek na izoláciu RNA a DNA.
Úlohou predmetného vynálezu je popri tom úloha pripraviť zmes vo forme stabilizačného roztoku, ktorého zložky nie sú zdravotne závadné a tým napríklad môžu byť použité tiež na stabilizáciu RNA alebo DNA v biologickom materiále vzorky počas dopravy z miest odberu do laboratória bez zdravotných nebezpečí, aké vznikajú napríklad pri používaní fenolu, pre osoby zaoberajúce sa spracovaním vzoriek.
Podstata vynálezu
Vynález sa týka nového použitia zmesí, ktoré majú ako podstatné zložky:
katiónovú zlúčeninu všeobecného vzorca Y+R1R2R3R4X', v ktorom Y je dusík alebo fosfor, R1, R2, R3 a R4 sú nezávisle od seba nerozvetvené alebo rozvetvené alkylové zvyšky s 1 až 20 atómami uhlíka alebo arylové zvyšky s 6 až 20 atómami uhlíka alebo aralkylové zvyšky s 6 až 26 atómami uhlíka a X“ je anión anorganickej alebo organickej jednosýtnej alebo viacsýtnej kyseliny a aspoň jeden donor protónov ako aditivum na stabilizáciu alebo izoláciu RNA alebo DNA z mikroorganizmov, ako sú prokaryonty (bezjadrové organizmy), huby, prvoky (protozoa) alebo riasy.
Výhodné sú zmesi, v ktorých sa katiónové zlúčeniny skladajú z amóniovej soli, v ktorej R1 znamená zvyšok vyššieho alkylu, s výhodou s 12, 14 alebo 16 atómami uhlíka a R2, R3 a R4 znamenajú vždy metylovú skupinu.
Výhodné sú ďalej zmesi, v ktorých R1 znamená aralkylovú skupinu, s výhodou benzylovú skupinu, R2 zvyšok vyššieho alkylu, s výhodou s 12, 14 alebo 16 atómami uhlíka a R3 a R4 metylovú skupinu.
Ako anióny sa s výhodou používajú bromid, chlorid, fosfát, sulfát, formiát, acetát, propionát, oxalát, malonát, sukcinát alebo citrát.
Alkyl s 1 až 6 atómami uhlíka znamená všeobecne rozvetvený alebo nerozvetvený uhlovodíkový zvyšok s 1 až 6 atómami uhlíka, ktorý môže byť prípadne substituovaný jedným alebo viacerými atómami halogénu, s výhodou fluórom, pričom alkyly môžu byť navzájom rovnaké alebo rozdielne. Ako príklady sa uvádzajú nasledujúce uhlovodíkové zvyšky:
, 1-etylpropyl, hexyl, metylpentyl, 4-metylpentyl, yl, 1,3-dimetylbutyl, yl, 3,3-dimetylbutyl, trimetylpropyl, metyl, etyl, propyl, 1-metyletyl (izopropyl), butyl, 1-metylpropyl, 2-metylpropyl, 1,1-dimetyletyl, n-pentyl, 1-metylbutyl, 2-metylbutyl, 3-metylbutyl, 1,1-dimetylpropyl, 1,2dimetylpropyl, 2,2-dimetylpropyl
1-metylpentyl, 2-metylpentyl, 3-:
1.1- dimetylbutyl, 1,2-dimetylbut
2.2- dimetylbutyl, 2,3-dimetylbut
1-etylbutyl, 2-etylbutyl, 1,1,2-
1.2.2- trimetylpropyl, 1-etyl-l-metylpropyl a l-etyl-2-metylpropyl.
Vyšší alkylový zvyšok znamená rozvetvený alebo nerozvetvený alkylový zvyšok so 7 až 20 atómami uhlíka, ktorý môže byť pripadne substituovaný jedným alebo viacerými halogénovými atómami, s výhodou fluórom, pričom alkylové zvyšky môžu byť rovnaké alebo rozdielne. Ako príklady sa uvádzajú nasledujúce uhlovodíkové zvyšky: rozvetvený alebo nerozvetvený heptyl, oktyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tetradecyl, hexadecyl, dodekadecyl a eikozyl.
.Alkenyl s 3 až 6 atómami uhlíka znamená všeobecne rozvetvený alebo nerozvetvený uhľovodíkový zvyšok s 3 až 6 atómami uhlíka s jednou alebo pripadne viacerými dvojnými väzbami, ktorý môže byť prípadne substituovaný jedným alebo viacerými atómami halogénu, s výhodou fluóru, pričom alkenyly môžu byť rovnaké alebo rozdielne. Ako príklady sa uvádzajú nasledujúce uhľovodíkové zvyšky:
2-propenyl (alyl), 2-butenyl, 3-butenyl, l-metyl-2-propenyl,
2-metyl-2-propenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 4-pentenyl, l-metyl-2-butenyl, 2-metyl-2-butenyl, 3-metyl-2-butenyl, l-metyl-3-butenyl, 2-metyl-3-butenyl, 3-metyl-3-butenyl,
1,l-dimetyl-2-propenyl, 1,2-dimetyl-2-propenyl, 1-etyl-2-propenyl, 2-hexenyl, 3-hexenyl, 4-hexenyl, 5-hexenyl,
1-metyl-2-pentenyl,
4-mety1-2-pentenyl,
3-mety1-3-pentenyl,
3-metyl-4-pentenyl,
2-mety1-2-pentenyl,
1-metyl-3-pentenyl,
4-metyl-3-pentenyl,
4-mety1-4-pentenyl,
3-metyl-2-pentenyl,
2-metyl-3-pentenyl,
1-metyl-4-pentenyl,
1,l-dimetyl-2-butenyl,
1,l-dimetyl-2-butenyl, 1,l-dimetyl-3-butenyl, 1,2-dimetyl-2-butenyl, 1,2-dimetyl-3-butenyl, 1,3-dimetyl-2-butenyl,
1,3-dimetyl-3-butenyl, 2,2-dimetyl-3-butenyl, 2,3-dimetyl-2-butenyl, 2,3-dimetyl-3-butenyl, l-etyl-2-butenyl, l-etyl-3-butenyl, 2-etyl-l-butenyl, 2-etyl-2-butenyl, 2-etyl-3-butenyl, 1,1,2-trimetyl-2-propenyl, l-etyl-l-metyl-2-propenyl a l-etyl-2-metyl-2-propenyl.
Alkinyl s 3 až 6 atómami uhlíka znamená všeobecne rozvetvený alebo nerozvetvený uhľovodíkový zvyšok s 3 až 6 atómami uhlíka s jedným alebo prípadne viacerými trojitými väzbami, ktorý môže byť prípadne substituovaný jedným alebo viacerými atómami halogénu, s výhodou fluóru, pričom alkinyly môžu byť navzájom rovnaké alebo rozdielne. Ako príklady sa uvádzajú nasledujúce uhľovodíkové zvyšky:
2- propinyl (propagryl), 2-butinyl, 3-butinyl, l-metyl-2-propinyl, 2-metyl-2-propinyl, 2-pentinyl, 3-pentinyl, 4-pentinyl, l-metyl-2-butinyl, 2-metyl-2-butinyl,
3- metyl-2-butinyl, l-metyl-3-butinyl, 2-metyl-3-butinyl,
3- metyl-3-butinyl, 1,l-dimetyl-2-propinyl, 1,2-dimetyl-2-propinyl, l-etyl-2-propinyl, 2-hexinyl, 3-hexinyl,
4- hexinyl, 5-hexinyl, l-metyl-2-pentinyl, 2-metyl-2-pentinyl,
3-metyl-2-pentinyl, 4-metyl-2-pentinyl, l-metyl-3-pentinyl,
2-metyl-3-pentinyl, 3-metyl-3-pentinyl, 4-metyl-3-pentinyl, l-metyl-4-pentinyl, 3-metyl-4-pentinyl, 4-metyl-4-pentinyl,
1,l-dimetyl-2-butinyl, 1,l-dimetyl-3-butinyl, 1,2-dimetyl-2-butinyl, 1,2-dimetyl-3-butinyl, 1,3-dimetyl-2-butinyl,
1,3-dimetyl-3-butinyl, 2,2-dimetyl-3-butinyl, 2,3-dimetyl-2-butinyl, 2,3-dimetyl-3-butinyl, l-etyl-2-butinyl,
1- etyl-3-butinyl, 2-etyl-l-butinyl, 2-etyl-2-butinyl,
2- etyl-3-butinyl, 1,1,2-trimetyl-2-propinyl, 1-etyl-l-metyl-2-propinyl a l-etyl-2-metyl-2-propinyl.
Aryl znamená, pokiaľ nie je definované niečo iné, aromatický zvyšok s jedným alebo viacerými jadrami s 4 až 22 atómami uhlíka, ktorý môže prípadne obsahovať jeden alebo dva heteroatómy. Ako príklad je možné uviesť fenyl, naftyl, antracyl respektíve pyrol, furán, tiofén, pyridín, pyridazín, pyrimidín alebo pyrazín a môže byť prípadne navzájom nezávisle raz alebo viackrát substituovaný halogénom (F, Cl, Br, J) s výhodou fluórom alebo alkylovou skupinou.
Aralkyl znamená arylový zvyšok s jedným alebo viacerými jadrami v zmysle hore uvedenej definície, ktorý je cez Ci až C6 alkylénový, C3 až C6 alkenylový alebo C3 až Cg alkinylénový mostík, pre ktorý platí zodpovedajúcim spôsobom definícia Ci až C6 alkylových, C3 až C6 alkenylových a C3 až Cg alkinylových skupín, viazaný na katiónovú parciálnu štruktúru. V zmysle predkladaného vynálezu sa uprednostňuje benzylová skupina.
Ako protiióny X’ sa hodia halogenovodíkových kyselín alebo dvojsýtnych organických kyselín, malonát, sukcinát alebo citrát.
s výhodou všetky anióny aniónov jednosýtnych alebo ako acetát alebo oxalát,
Ako donory protónov sú v zmysle predkladaného vynálezu vhodné v prvom rade nasýtené alifatické monokarboxylové kyseliny, nenasýtené alkenylové karboxylové kyseliny, nasýtené alebo nenasýtené atómami uhlíka, alifatické alifatické kyseliny, ketodikarboxylové kyselinách alebo
Pritom sa môžu všetky nesubstituovanej forme uprednostňujú, minerálnych kombinácii.
dikarboxylové kyseliny s 2 ketokarboxylové ako ich až 6 alebo popri alebo v kyseliny tiež aminokyseliny solí samotných menované organické kyseliny alebo ako substituované použiť v deriváty, pričom sa iné, nesubstituované alebo raz respektíve viackrát hydroxylovými pokiaľ nie je uvedené nič skupinami substituované deriváty.
Ako nasýtené alifatické monokarboxylové kyseliny v zmysle predkladaného vynálezu sa popri kyseliny mravčej rozumejú s výhodou alkylové karboxylové kyseliny s 1 až 6 atómami uhlíka, z ktorých sa uprednostňujú kyselina octová, kyselina propiónová, kyselina n-maslová, kyselina n-valérová, kyselina izovalérová, kyselina etylmetyloctová (kyselina 2-metylmaslová) , kyselina
2,2-dimetylpropiónová (kyselina pivalínová), kyselina nhexánová, kyselina n-oktánová, kyselina n-dekánová, ako tiež kyselina n-dodekánová (kyselina laurinová). Popri tom sa môžu tiež použiť od uvedených kyselín odvodené ketónkarboxylové kyseliny.
Ako nenasýtené alkenylkarboxylové kyseliny v zmysle vynálezu sa uvádza napríklad kyselina akrylová (kyselina propénová), kyselina metakrylová, kyselina krotónová, kyselina izokrotónová, ako tiež kyselina vinyloctová.
V zmysle predkladaného vynálezu sú osobitne výhodné nasýtené alifatické dikarboxylové kyseliny s 2 až 6 atómami uhlíka, ako napríklad kyselina oxalová, kyselina malónová, kyselina jantárová, kyselina glutárová alebo kyselina adipínová, pričom osobitne výhodné sú kyselina oxalová a kyselina jantárová.
Na riešenie úlohy podlá vynálezu sú predovšetkým výhodné alifatické hydroxy-di-trikarboxylové kyseliny, pričom osobitne výhodné sú kyselina tartrónová, D-( + )-, kyselina L-(-)- alebo DL-jablčná, kyselina (2R, 3R)-( + )-vínna, kyselina (2S, 3S) —( —) — vínna, kyselina mezo-vínna a kyselina citrónová.
Na riešenie predkladanej úlohy sa hodia popri tom tiež nenasýtené dikarboxylové kyseliny, ako je kyselina maleínová i alebo kyselina fumarová alebo nenasýtené 'kyseliny trikarboxylové, ako napríklad kyselina akonitová.
V zmysle prekladaného vynálezu sa môžu ale tiež používať alifatické ketodikarboxylové kyseliny ako aditivá, ako napríklad kyselina mezoxalová a kyselina oxaloctová, pričom najvýhodnejšia je kyselina oxaloctová.
Ďalej sa môžu v zmysle predkladaného vynálezu používať kyseliny aminové, pričom osobitne výhodné sú α-amínové kyseliny, ako napríklad kyselina aminooctová (glycín), a-aminopropiónová (alanín), α-aminoizovalérová (valín), a-aminoizokaprónová (leucín) a kyselina a-amino-p-metylvalérová (izoleucín). Osobitne výhodné je pritom použitie glycínu.
Uvedené donory protónov sa môžu používať ako jednotlivé látky, prípadne vo forme čistých stereoizomérov, ako tiež v zmesiach.
Ako ďalšie aditivá sa môžu v zmysle predkladaného vynálezu tiež používať minerálne kyseliny a ich soli. S výhodou sa pritom používajú soli minerálnych kyselín, ako je kyselina fosforečná alebo kyselina sírová s alkalickými kovmi alebo ich amónne soli. Osobitne výhodné pritom je použitie kyseliny fosforečnej a síranu amónneho.
Tabulka 1
Označenie Vzorec
Kyselina octová CH3-COOH
Kyselina oxalová HOOC-COOH
Kyselina malónová HOOC-CH2-COOH
Kyselina tartónová HOOC-CHOH-COOH
Kyselina jantárová HOOC-CH2-CH2-COOH
Kyselina jablčná HOOC-CHOH-CH2-COOH
Kyselina vínna HOOC-CHOH-COOH-COOH
Kyselina glutárová HOOC-CH2-CH2-CH2-COOH
Kyselina adipínová HCOOH-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH
Kyselina citrónová HOOC-CH2-COHCOOH-CH2-COOH
Kyselina maleínová HOOC-CH=CH-COOH
Kyselina oxaloctová HOOC-CO-CH2-COOH
Glycín H2N-CH2-COOH
Aditivá môžu byť v zmesi v rôznych koncentráciách. Tiež je možné použitie kombinácii rôznych aditiv. Pritom sa môžu v závislosti od povahy aditiva ako výhodné ukázať tiež iné koncentračné oblasti. Popri tom je možné aj použitie kombinácií rôznych aditiv.
Katiónová zlúčenina má vo vodnom roztoku zmesi koncentráciu v oblasti od 0,01 % (w/v) do nasýtenosti, s výhodou medzi 0,1 % a 10 % (w/v) a predovšetkým s výhodou v rozmedzí od 0,5 do '8 % (w/v) a najvýhodnejšie v rozmedzí medzi 2 a 6 % (w/v).
Také zmesi sa uvádzajú v opise nemeckej zverejnenej prihlášky DOS 100 31 236, ktorá tvorí prioritnú prihlášku k predmetnej prihláške, ako tiež v nárokoch 1 až 17.
Prirodzene sa pri pridaní roztoku katiónových zlúčenín a aditiv 1 určujú príslušné optimálne koncentrácie príslušným objemom biologickej vzorky a určuje sa objemový pomer objemom stabilizačného roztoku a objemom biologickej vzorky.
Ako nukleové kyseliny sa v zmysle predkladaného vynálezu, pokial nie je uvedené niečo iné, rozumejú nukleové kyseliny v širšom zmysle slova, takže zahŕňajú napríklad ribonukleové kyseliny (RNA), ktoré zahŕňajú tiež desoxyribonukleové (DNA) kyseliny vo všetkých dĺžkach alebo konfiguráciách, ako je DNA s dvojitým prameňom, jedným prameňom, cirkulárna DNA a lineárna DNA, ako tiež všetky možné poddruhy, ako napríklad monomérne nukleotidy, oligomery, plazmidy, bakteriálne DNA a RNA v spracovanej a nespracovanej forme.
Ako biologická vzorka sa môžu použiť vzorky potravín alebo vzorky z životného prostredia, ako sú volné alebo viazané nukleové kyseliny alebo mikroorganizmy obsahujúce nukleové kyseliny v zmysle vynálezu, ako napríklad organizmy (jednobunkové alebo viacbunkové, hmyz apod.), rastliny a časti rastlín, baktérie, vírusy, kvasinky a iné huby alebo prokaryonty.
Ďalej môže ako východiskový materiál pre biologickú vzorku, ktorá obsahuje mikroorganizmy v zmysle predmetného vynálezu, slúžiť plazma, telesné tekutiny, ako napríklad krv, sérum, bunky, frakcie leukocytov, crusta phlogistica, sputum, moč, sperma, faeces, výtery, punktáty, vzorky tkanív všetkých druhov, ako napr. biopsie, časti tkanív a orgány, vzorky potravín, ktoré obsahujú volné alebo viazané nukleové kyseliny alebo bunky obsahujúce nukleové kyseliny.
Okrem toho je možné stabilizovať nukleové kyseliny, ktoré pochádzajú z hore uvedených biologických vzoriek a ktoré majú eukaryontový pôvod, so zmesami podlá vynálezu. Tak je možné izolovať respektíve stabilizovať materiály eukaryontového charakteru, ktoré sú uvedené v DOS 100 31 236 (str. 6, druhý odsek pôvodne podaných podkladov), podľa predmetného vynálezu. Týmto spôsobom sa dajú podľa predmetného vynálezu úspešne stabilizovať nukleové kyseliny eukaryontového pôvodu, ako napríklad z krvi, spúta alebo morku kostí tak, ako je to uvedené v príkladoch 1 až 15, ako tiež na obr. 1 až 15 v DOS 100 31 236.
Aditivá môžu byť v stabilizačnej reagencii v rozdielnych koncentráciách, napríklad sa môžu pridávať do zmesí stabilizačného roztoku s krvou v objemovom pomere 1:1, s výhodou 3:1 v koncentrácii 50 mM až do nasýtenia, s výhodou 100 až 1 M a osobitne výhodne v koncentrácii 200 až 500 mM. Pritom sa môžu v závislosti od povahy aditiv ako výhodné ukázať tiež iné koncentračné oblasti. Popri tom je možné tiež použitie kombinácií rôznych aditiv.
Katiónová zlúčenina má vo vodnom roztoku zmesi koncentráciu v oblasti od 0,01 % hmotn. do nasýtenia s výhodou od 0,1 % hmotn. do nasýtenia a osobitne výhodne medzi 0,5 % hmotn. a 15 % hmotn. a najvýhodnejšie medzi 2 % hmotn. a 10 % hmotn.
Prirodzene budú pri pridaní roztoku katiónových zlúčenín a aditiv príslušné optimálne koncentrácie určované objemom biologickej vzorky a objemovým pomerom stabilizačného roztoku k biologickej vzorke.
Hodnota pH zmesi z katiónovej zlúčeniny a aditiva pred zmiešaním so vzorkou sa môže v závislosti od vzorky všeobecne meniť v širokom rozsahu pH (pH 2 až 12) a leží s výhodou v intervale pH 2 až pH 10 a osobitne s výhodou v intervale od pH 3 do 8. Pritom výhodná oblasť pH závisí od použitej biologickej vzorky, pre krv, plazmu a sérum je pH hodnota v rozsahu medzi pH 2 a pH 6 a najmä v rozmedzí pH 3 a pH 4.
Hodnota pH zmesi z katiónovej zlúčeniny a aditiva sa môže meniť v závislosti od vzorky, v ktorej sa uskutočňuje stabilizácia alebo izolácia nukleových kyselín napr. z mikroorganizmov, ako sú prokaryonty, huby, protozoa (prvoky) alebo riasy, v širokom rozsahu pH (pH 2 až 12) a je s výhodou v intervale od pH 2 do pH 8 a predovšetkým v intervale od pH 2 do pH 5. Pritom výhodná oblasť pH závisí od použitej vzorky.
Pre biologické vzorky, ako pre iné bunkové telesné tekutiny, okrem krvi, plazmy a séra, alebo napr. baktérie, punktáty, bunky, tkanivá a ďalšie biologické vzorky, ako je to opísané hore, leží hodnota pH v stabilizačnom roztoku, skladajúcom, sa z katiónovej zlúčeniny a aditiva, s výhodou v oblasti pH 3 až pH 10 a osobitne s výhodou v intervale pH 4 až pH 8. Pritom sa rozumie pri všetkých údajoch pH hodnota pH pred miešaním s biologickou vzorkou.
Na stabilizovanie nukleových kyselín v biologických vzorkách sa môže vzorka zmiešať s roztokom, ktorý obsahuje katiónovú zlúčeninu alebo zlúčeniny a aditivum. Pritom je možný objem prídavku 0,1 až 10 000 objemov biologickej vzorky, s výhodou bude objem prídavku v oblasti od 1 do 1000 a osobitne výhodne v intervale od 1 do 100 objemov. V závislosti od druhu vzorky, ako napríklad vzorky z jemných ihlových biopsií alebo nízkobunkových kultúr môžu ale za určitých okolností prichádzať do úvahy i podstatne vyššie objemy.
Okrem toho sa môžu hore menované katiónové zlúčeniny a aditivá pridávať i ako pevná látka, keď biologická vzorka samotná obsahuje kvapalinu na rozpustenie pevnej látky (ako napríklad bunky obsahujúce telesné kvapaliny, bunky v médiu, moč) alebo sa pridáva kvapalina, napríklad voda na rozpustenie pevnej látky. Prídavok ako pevné látky ponúka výhodu, že sú pevné látky väčšinou chemicky stabilné a ich pridanie k vzorke je často jednoduchšie uskutočniteľné.
Okrem toho je najmä pri veľmi kompaktných biologických vzorkách, ako napríklad tkanivách, možné rozmletie resp.
homogenizácia vzorky v stabilizačnom roztoku, resp. pred miešaním so stabilizačným roztokom, aby sa napríklad mechanickým, chemickým, fyzikálnym alebo enzymatickým pôsobením na vzorku podporovalo uvoľnenie nukleových kyselín alebo jednotlivých buniek resp. zväzov buniek rozrušením kompaktnej vzorky. Mechanické pôsobenie môže nastať napríklad elektrickým nožom, guľovým mlynom alebo stlačením striekačkou, zatiaľ čo sa ponúkajú vhodné enzýmy na pôsobenie na vzorku, napríklad hydrolázy, proteázy alebo lipázy.
Popri tom sa môže vzorka vopred upraviť čisto fyzikálnym spôsobom, napríklad pomocou ultrazvuku.
Predbežná úprava sa môže vykonať ďalej chemickým spôsobom, buď len týmto spôsobom alebo v kombinácii s čisto fyzikálnymi spôsobmi. napríklad
Ako prostriedok na podporu lýzy alifatické alkoholy, resp. dialdehydy, ako aldehydy, alebo fenolové deriváty, obojaké a redukujúce fenoly iónové, alebo β-merkaptoetanol sa môžu použiť najmä izopropanol, alebo napríklad glyoxal alebo tiež ako napríklad 2-bifenol alebo neiónové zlúčeniny, ako napríklad sulfhydryl reagencie, ako napríklad ditiotreitol a alebo deriváty kyseliny fosforečnej, ako napríklad tributylfosfát alebo chaotropné reagencie, ako napr. močovina, guanidínium-tiokyanát alebo guanidínium-hydrochlorid alebo soli jednotlivo alebo v kombinácii.
Odborníkovi sú známe ďalšie možnosti mechanického, chemického, fyzikálneho alebo enzymatického pôsobenia na vzorky a rozumie sa, že sú tu tiež zahrnuté.
Materiál vzoriek sa môže skladovať podľa príslušných potrieb dlhší čas, ako napríklad 1 až 14 dní alebo dlhšie pri izbovej teplote, ale tiež pri zvýšenej teplote, ako napríklad 40 °C alebo viac a tiež pri znížených teplotách, ako napr. 4 °C alebo -20 °C alebo nižších.
V nadväznosti na skladovanie biologickej vzorky v. roztoku hore uvedených zlúčenín sa môžu napojiť buď priamo spôsoby analýzy nukleových kyselín alebo môže dôjsť k vyčisteniu nukleových kyselín z vzorky.
K technologickému pozadiu vynálezu:
Prešetrovanie RNA-expresných vzoriek pri mikroorganizmoch pomocou molekulárne biologických metód, ako je napr. kvantitatívna RT-PCR, NASBA, bDNA technológia alebo biočipy a Northern Blotting, nachádza použitie v základnom výskume pri analýze génových expresií pri prokaryontoch, ako tiež pri prvokoch, hubách a riasach a nadobúda navyše narastajúci význam napríklad pri lekárskej diagnostike pri identifikovaní mikrobiologických pôvodcov chorôb, vo farmaceutickom odvetví pri vývoji a vyhodnocovaní liekov, v biotechnológii pri výrobe rekombinantných proteínov pre výskum a terapeutické použitie, v ekológii a populačnej biológii alebo tiež v analytike potravín pri dôkazu zamorenia mikroorganizmami.
Pritom existuje problém, že sa organizmy musia za účelom izolácie nukleových kyselín odstráni z ich prirodzeného prostredia na získanie skúmaných buniek a že sa musia dopraviť na miesto izolácie nukleových kyselín. Pritom existuje veľké nebezpečie, že sa profily RNA, ale tiež DNA zmenia. To by viedlo k chybným diagnózam, alebo analýzam génových experesií v kultúrach baktérií alebo napríklad tiež v medicínskej a klinickej diagnostike pri vyšetrovaní infikovaného materiálu pacienta (napríklad vzoriek z ložísk zápalu) spočívajúcom v analýze nukleových kyselín alebo tiež pri potravinách infikovaných baktériami, hubami, prvokmi alebo riasami. Pri vzorkách potravín alebo klinických vzoriek odoberaných z pacientov môžu mikroorganizmy dokonca odumrieť a tým sa môžu nukleové kyseliny, predovšetkým RNA úplne odbúrať. Preto má najvyšší význam, aby nukleové kyseliny, najmä RNA, boli stabilizované ihneď pri odbere vzorky.
Zvláštnosťou baktérií je, že sa ich génová expresia extrémne rýchlo prispôsobuje podmienkam prostredia. Z toho vyplývajúce krátkodobé zmeny vzoru génovej expresie sú možné na základe velmi krátkych polčasov bunkových mRNA v baktériách, ako tiež ich schopnosti počas niekoľkých sekúnd alebo minút syntetizovať nové transkripty RNA. Tieto mechanizmy prispôsobenia predstavujú pri analýze prokaryontických RNA-experesných vzorov ťažkosti, pretože už počas zberania buniek a procedúry prípravy RNA môže dôjsť k zmene RNA-experesných vzorov. Tým by sa v nasledujúcich analýzach už nepozoroval expresný vzor za definovaných podmienok kultúry, ale RNA-expresný vzor, ktorý odráža podmienky počas zberu, lýzy alebo nasledujúceho bunkového lyzátu.
Popri tom sa dá podstata predkladaného vynálezu použiť tiež na iné druhy RNA, ako je mRNA, ako sú napríklad rRNA, snRNA, tRNA, RNA druhy s nízkomolekulárnou hmotnosťou, ale tiež na DNA, ako je napríklad genomická DNA (gDNA).
z mikroorganizmov, ako sú prokaryonty, v použití (trichlórmetán), v riasy spočívajú ako je fenol a napríklad chloroform kombinácií týchto látok. Pri nukleovej kyseliny
Klasické spôsoby izolácie RNA huby, prvoky alebo organických rozpúšťadiel, použití chaotropných solí alebo všetkých dosiaľ známych spôsoboch izolácie z prokaryontov, húb, prvokov alebo rias musia byť bunky najskôr obohatené odstreďovaním alebo filtráciou z média kultúry pred ďalším spracovaním. Počas tohto prvého pracovného kroku dochádza vo veľmi veľkom počte prípadov v bunkách na základe zmenených podmienok prostredia (napr. zmeny teploty, mechanického zaťaženia odstredením, prípadne filtráciou, zmenenej atmosféry plynu apod.) k zmene génexpresného vzoru, takže génexpresný vzor buniek neodráža definované podmienky kultúry, ale podmienky procedúry izolácie nukleovej kyseliny. Tým sa validita nasledujúcich analýz stane sporná.
Za zmenu expresného vzoru je v prvom rade zodpovedné nešpecifické odbúravanie RNA RNázami alebo chemickými vplyvmi, ako je deprotonácia, alebo sekvenčne špecifické odbúravanie RNA RNázami, ktoré odbúravajú špeciálne sekvencie. Popri tom má nová syntéza RNA rovnako nevýhodný a preto nežiadúci vplyv.
Často je snaha tento vplyv minimalizovať veľmi rýchlym zberom buniek a rýchlym otvorením buniek, ale touto cestou nie je možné celkom prerušiť zmenu génexpresného vzoru. Tým je ďalej nemožné súčasné spracovanie väčších počtov vzoriek. K tomu bolo enzymatickému otvoreniu buniek často zabránené, pretože to bolo možné len pred pridaním organických rozpúšťadiel alebo koncentrovaných chaotropných roztokov solí a vyžadovalo to čas najmenej 3 minúty. Tak bola počas enzymatického otvárania buniek súčasne možná i enzymatická degradácia RNA, ako tiež nová syntéza RNA, čím by sa zmenil génexpresný vzor buniek. Z tohto dôvodu bolo pre následné génexpresné analýzy vždy nevýhodné uskutočnenie enzymatického otvárania buniek.
Ďalší problém pri izolácii nukleovej kyseliny (RNA a DNA) z prokaryontov, húb, rias a prvokov spočíva v lýze buniek, pretože na to sa musí otvoriť stena buniek. Rozšírený spôsob spočíva napríklad v strávení mureínu v prokaryontickej stene buniek enzýmom lyzozym; alternatívne sa môžu tiež použiť tiež iné enzýmy, ako napr. lyzostafin alebo proteinázy. Počas strávenia sa musia v spracovávanej vzorke vytvoriť podmienky, ktoré zabezpečujú enzymatickú aktivitu zodpovedajúceho enzýmu. Súčasne také podmienky dovoľujú väčšinou ale tiež štiepenie bakteriálnej mRNA RNázami alebo chemickou hydrolýzou nukleových kyselín, takže často degradované nukleové kyseliny vyplývajú zo zodpovedajúcich preparátov. Ďalej nemôže byť vylúčené, že počas tohto enzymatického otvárania buniek dochádza k syntéze nukleových kyselín, čím by sa navyše zmenil RNA-expresný vzor.
Vynález je použiteľný pri prokaryontoch, popri archaebaktérií (ako je napríklad Methanothermobacter marbirgensis) , predovšetkým pri eubaktérií. Do eubaktérií spadajú gram-pozitívne, ako tiež gram-negatívne baktérie, a tiež fototropné baktérie, resp. kmene Clamydia, Mycoplasma (ako napríklad Mycoplasma penetrans) , Rickettsiae, Spirillum a Spirochaeta (ako napríklad Borrelia burgdorferi} , na ktoré sa vzťahuje vynález.
predovšetkým
Medzi gram-pozitívnymi eubaktériami je nutné
Bacillus (ako napríklad Bacillus subtilis), menovať kmene
Staphylococcus (ako napríklad Staphylococcus aureus alebo
Staphylococcus
Streptomyces (ako napríklad
Streptomyces coelicotor alebo
Streptomyces
Flavobacterium (ako napríklad Flavobacterium johnsoniae) ,
Mycobacterium (ako napríklad Mycobacterium avium) alebo
Streptococcus.
Ďalej sa dá vynález použiť pri nasledujúcich grampozitivnych kmeňoch eubaktérii: Clostridium (ako napr. C. difficile, C. tetan a C. perfringens), Lysteria, Peptococcus, Peptostreptococcus, Enterococcus, Corynebacterium (ako napríklad C. diphteriae alebo C. glutamicum}, Propionibacterium, Lactobacillus.
Pri gram-negativnych eubaktérii je vynález použiteľný najmä pri Escherichia (ako napr. Escherichia coli}, Pseudomonas (ako napr. Pseudomonas aeroginosa, Pseudomonas putida alebo Pseudomonas syringae) , Klebsiella (ako napr. Klebsiella pneumoniae}, Salmonella (ako napr. Salmonella typhimurium), Sinorhizobium (ako napr. Sinorhizobium meliloti} alebo Camphylobacter.
Popri tom sa dá vynález použiť pri nasledujúcich gram-negativnych baktériách: Neisseria (ako napr. Neisseria gonorrhoae alebo N. meningitidis} , Vibrio (ako napr. Vibrio cholerae), Shigella, Serratia, Enterobacter, Acinetobacter, Proteus, Yersinia, Brucella (ako napr. B. abortus}, Haemophilus (ako napríklad H. influenza} , Bacteroides, Campylobacter, Helicobacter (ako napr. H. pylori}, Bordetella, Legionella, Pasteurella.
Medzi eukaryontmi je potrebné menovať predovšetkým huby, z nich skupinu húb dermatofytov, kvasinky, plesňové huby a bifázne huby.
Medzi kvasinkami je potrebné najmä uviesť rody Saccharomyces (ako napríklad Saccharomyces cerevisiae) , Candida (ako napríklad Candida albicans), Cryptococcus (ako napríklad Cryptococcus neoformans}. Medzi plesňovými hubami je potrebné predovšetkým uviesť rody Aspergillus (ako napríklad Aspergillus fumigatus) alebo Penicillium alebo Mucor.
Ďalej je potrebné ako príklady eukaryontov menovať riasy a protozoa, ako napríklad trypanozómy, toxoplazmy, ameoby, plazmodia, flageláty, na ktoré sa dá vynález použiť.
Riešenie úlohy podľa vynálezu:
Hore uvedené úlohy predkladaného vynálezu sa riešia tým, že sa definovaná kultúra baktérií, húb, prvokov alebo rias alebo vzorka, ktorá obsahuje baktérie alebo huby alebo prvoky alebo riasy uvedie do styku so zmesou, prípadne s jej vodným roztokom, ktorá obsahuje katiónovú zlúčeninu všeobecného vzorca 1 a aspoň jeden donor protónov.
K následnému zberu buniek a ďalšiemu spracovaniu vzorky je možné enzymatické strávenie bunkovej steny, napríklad základnej mureínovej stavby bakteriálnej bunkovej steny lyzozymom, pričom nukleové kyseliny vo vzorke nepodliehajú žiadnej enzymatickej alebo chemickej degradácii, resp. nekoná sa žiadna nová syntéza nukleových kyselín, takže sa zabráni zmene vzorky RNA-expresie.
I
I
Alternatívne sú mysliteľné aj iné enzymatické spôsoby otvorenia bunky, napríklad pri použití lyzostafinu, proteinázy K alebo tiež detergentne sprostredkované otvorenie bunky, resp. kombinácia uvedených spôsobov otvorenia aj s mechanickými spôsobmi otvorenia.
Pritom enzymatické otvorenie ponúka oproti mechanickým spôsobom otvorenia, ako napríklad pri použití guľového mlyna alebo mažiaru v kvapalnom dusíku, principiálne tu výhodu, že sa dá relatívne dobre automatizovať. Ďalej umožňuje enzymatické otvorenie buniek vysoké presadenie vzoriek a minimalizuje, v porovnaní so spôsobmi otvorenia buniek mechanicky podlá známeho stavu techniky, nebezpečie krížových kontaminácií.
Popri enzymatickom otvorení buniek baktérií sa ponúka tiež otvorenie buniek kvasiniek pomocou zymolázy alebo lytikázy alebo tiež iné otvorenie eukaryontických buniek proteinázou alebo inými enzýmami, respektíve pomocou detergencií po stabilizácii buniek zmesami podľa vynálezu.
Hoci z uvádzaných dôvodov je principiálne výhodné enzymatické otváranie buniek, tento spôsob sa sotva používa na analýzy génexpresných vzoriek, pretože počas tohto pracovného kroku sa pri vykonávaní bežných preparačných spôsobov musí rátať so zmenou RNA-expresných vzoriek. Použitie tu opísaného spôsobu ponúka možnosť riešenia tohto problému tým, že sa RNA v bunkách stabilizuje už pred zberom buniek. V nasledujúcom pracovnom kroku je možné otvorenie buniek, pričom sa preruší enzymatické alebo chemická degradácia RNA, ako tiež nová syntéza.
Alternatívne k enzymatickému otvoreniu buniek tiež môže dôjsť k mechanickému, tepelnému alebo chemickému otvoreniu buniek, ako tiež ku kombinácii jedného alebo viacerých uvedených spôsobov otvorení.
Po stabilizácii a otvorení buniek sa môžu použiť na ďalšie spracovanie vzorky spôsoby známe zo stavu techniky na izoláciu nukleových kyselín na báze modifikovaných kremičitanových materiálov.
Predmetným vynálezom sa otvára možnosť ďalšieho spracovania vzorky, napríklad pri izolácii RNA pomocou organických rozpúšťadiel, chaotropných solí alebo vysolením nukleových kyselín alebo použitím magnetických častíc alebo cez spôsob zachytenia hybridu.
V porovnaní s doterajšími, zo známeho stavu techniky známymi RNA-extrakčnými spôsobmi, ako je TRIzol alebo RNázy, sa použitím zmesí podľa vynálezu z katiónového detergentu všeobecného vzorca Y+R1R2R3R4X_ a donoru protónov, vo forme aditiva, s výhodou vo forme alifatickej karboxylovej kyseliny, predovšetkým s výhodou dikarboxylovej kyseliny, pričom osobitne výhodná je kyselina vínna, dosahuje výťažok, ktorý napríklad dvakrát až trikrát prekračuje výťažky hore uvedených známych spôsobov.
Tento vysoký výťažok RNA je osobitne výhodný pri analýze nízko exprimovaných RNA-transkriptov alebo takých RNAtranskriptov, ktoré sa exprimujú iba z jednej podskupiny analyzovanej populácie baktérií. K tomu dosiaľ neexistuje žiadny praktikovateľný spôsob izolácie mRNA z baktérií, takže sa pri analýze bakteriálnej mRNA pracuje sa silným pozadím iných typov . RNA (rRNA, tRNA, snRNPs). Keď takto stojí otázka, je potrebné vyjsť zo zvyšovania citlivosti analytických spôsobov na základe stúpajúceho výťažku.
vynálezu
Výhody použitiach, génexpresívnych vzorov protozoa, huby, riasy). ktoré prispievajú k prokaryontických génových sa napríklad analyzuje vzťah medzi expresiou zvolených génov a pri sa dostavujú predovšetkým pri všetkých sa majú vykonávať analýzy ktorých mikroorganizmoch (prokaryonty, zahŕňa napríklad vedecké otázky, základnému porozumeniu regulácie expresii, ako tiež štúdie, v ktorých
To patogenickosťou baktérii. Posledné otázky sú osobitne relevantné v diagnostike a liečení bakteriálnych infekcií.
Ďalšia dôležitá oblasť použitia vynálezu spočíva v génexpresívnej analýze prokaryontov, protozoí a húb vo farmaceutickom výskume a vývoji. Stabilizácia napríklad prokaryontických RNA-expresných vzoriek zjednodušuje výrazne analýzu transkripčných zrkadiel alebo komplexnej expresnej vzorky zhruba v rámci experimentov, v ktorých má byť znázornená časová závislosť génovej expresie. Ďalej sa podstatne uľahčuje identifikácia a kvantifikácia druhov v komplexných populáciách, napríklad baktérií vo vzorke pôdy alebo pôvodcov chorôb vo vzorkách odoberaných z pacientov. Okrem toho sa potenciál použiteľnosti vzťahuje tiež na ďalšie analytické oblasti, ako napríklad na analytiku potravín.
Stabilizáciou nukleových kyselín pri pomoci zmesí podľa vynálezu z jednej alebo viacerých katiónových zlúčenín a jedného alebo viacerých aditív sa dosahuje ,to, aby sa nukleové kyseliny vo vzorke nezmenili i pri dlhšom skladovaní alebo počas dopravy. Tým sa neskoršie podstatne zvýši presnosť vykonávaných testov. V určitých prípadoch, keď sa napríklad materiál vzorky musí dopravovať na dlhšiu vzdialenosť alebo skladovať dlhšie, umožňuje až spôsob podľa vynálezu vôbec tieto testy po tomto čase realizovať.
Výhody tohto vynálezu spočívajú predovšetkým ako v oblasti výskumu, napríklad na analýzu transkripčných zrkadiel, ktoré sa musia fixovať ihneď po odberu, tak aj v oblasti klinických analýz, ako napríklad molekulárnej diagnostiky, keď sa musia vzorky odoberané z pacientov po odberu počas skladovania a dopravy tiež stabilizovať.
Popri tom nachádza izolácia a stabilizácia nukleových kyselín použitie v diagnostike tumorov, v diagnostike dedične podmienených chorôb, ako tiež v diagnostike vírusov a sledovaní vírusov a diagnóze a sledovaní iných pôvodcov infekcií, ako tiež v analýze génexpresných vzoriek.
Prehľad obrázkov na výkrese
Vynález bude bližšie objasnený pomocou výkresu, na ktorom znázorňuje:
obr. 1 v grafickom znázornení závislosť výťažku RNA od hodnoty pH detergentného roztoku a od objemového pomeru medzi kultúrou a detergentným roztokom, obr. 2 v grafickom znázornení závislosť výťažku RNA od rôznych variantov protokolu, obr. 3 v grafickom znázornení výťažok RNA v závislosti od objemu vodného roztoku zlúčeniny podľa vynálezu, obr. 4 výsledok elektroforézy gélu denaturovanej agarózy a ompA Northern Blot analýzu RNA pri E.coli izolovanej roztokmi rôznych objemov zmesí z katiónovej zlúčeniny a donoru protónov v rôznych koncentráciách, obr. 5 ukazuje ompA (outer membráne protein A) Northern Blot analýzu RNA z E. coli, izolovanej po prídavku rifampicínu s resp. bez roztoku zmesi podľa vynálezu, obr. 6 ukazuje bla (β-laktamáza) Northern Blot analýzu RNA z E. coli, izolovanej po prídavku rifampicínu s resp. bez prídavku zmesi z katiónovej zlúčeniny a aditiva, resp. ich vodného roztoku.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Vynález je vysvetlený na nasledujúcich príkladoch:
Príklad 1
Izolácia RNA z E.coli
Vodný roztok skladajúci sa z 4 % (w/v) tetradecyltrimetylamóniumoxalátu a 200 mM kyseliny vínnej sa lúhom sodným nastaví na nasledujúce hodnoty pH: 2,2 (bez prídavku NaOH); 2,5; 3,0;
3,5; 4,0; 4,5 a 5,0.
Pri realizácii pokusu sa na násadu k 400 μΐ kultúry E. coli v LB médiu pridajú vždy 2, 3 respektíve 4 objemy detergentného roztoku s rozdielnymi hodnotami pH pipetovaním a izolácia RNA sa uskutoční podía nasledujúceho protokolu:
prídavok 400 μΐ kultúry E. coli k predloženému detergentnému roztoku, rozvíriť odstredenie pri 5000 x g 10 min pri 4 °C, presah dekantovať, peletu opäť suspendovať v 1 ml H2O, presah dekantovať, peletu resuspendovať v 100 μΐ TE-tlmivého roztoku11 s 400 μg/ml lyzozymu, υ TE-tlmivý roztok sa skladá z 10 mM tris-HCl a 1 mM EDTA, ktorý sa nastaví na pH hodnotu 8.
inkubácia 5 min pri izbovej teplote, prídavok 300 μΐ RLT-tlmivého roztoku2), rozvíriť, 21 RLT-tlmivý roztok je obchodne bežný tlmivý roztok (získateľný od firmy QIAGEN, Hilden) na báze guanidíniovej soli, ako napríklad guanidíniumizotiokyanátu, a alkalickej soli viacsýtnej organickej kyseliny, ako tiež βmerkaptoetanolu, ktorý pufruje pri pH 7.
prídavok 260 μΐ H2O, rozvíriť, prídavok 40 μΐ proteinázy K (18 mg/ml), rozvíriť inkubácia 10 min 55 °C, odstreďovanie 3 min 1400 x g, odoberie sa presah, pridá sa 350 μΐ 100% etanolu, vírivo uložiť roztok na RNeasy Mini spin kolóne, ďalšie spracovanie tak, ako je to známe zo známeho stavu techniky, napríklad ako je opísané v RNeasy® Mini protokole firmy QIAGEN, Hilden, na izoláciu celej RNA z baktérií od kroku 5.
Obr. 1 ukazuje výťažky RNA v závislosti od hodnoty pH detergentného roztoku a od objemového pomeru medzi kultúrou a roztokom detergentu.
Získané výsledky ukazujú okrem toho, že sa najvyššie výťažky RNA dajú dosiahnuť vtedy, keď má vodný roztok zmesi podía vynálezu hodnotu pH v rozmedzí od 3,5 do 5,0.
Intaktnosť RNA sa analyzuje elektroforézou agarózového gélu. Vo všetkých prípadoch boli nájdené intaktné ribozomálne RNA pásy.
Príklad 2
Izolácia RNA z E. coli s rôznymi variantmi protokolu:
Východiskovým materiálom pre v tomto príklade zhrnuté experimenty je opäť v LB-médiu napestovaná kultúra E. coli. Všetky rôzne varianty protokolu sa vykonávajú pri použití vždy
1,5 x 108 ako tiež 3 x 108 buniek. Pre túto radu pokusov sa použije vodný roztok zmesi podlá vynálezu s nasledujúcim zložením:
4% (w/v) tetradecyl-trimetyl-amóniumoxalát, 200 mM kyseliny vínnej s pH hodnotou 4,0
Vychádzajúc z nasledujúcich parciálnych častí protokolu o izolácii RNA sa zhotovujú rozličné varianty protokolu:
1) Zber buniek
Prídavok 3 objemov detergentného roztoku ku kultúre E. coli, rozvíriť, odstreďovať pri 5000 x g 10 min pri 4 °C, presah dekantovať,
2) Pranie peliet peletu resuspendovať v 1 ml H20, odstreďovať pri 5000 x g 10 min pri 4 °C, presah dekantovať,
3) Trávenie lyzozymom peletu v 100 μΐ TE tlmivého roztoku resuspendovať so 400 μg/ml lyzozymu, inkubácia 5 min pri izbovej teplote,
4) Nastaviť väzbové podmienky prídavok 350 μΐ RTL tlmivého roztoku, rozvíriť, prídavok 250 μΐ
100% etanolu,
5) Trávenie proteinázou K prídavok 300 μΐ RTL tlmivého roztoku, rozvíriť, prídavok 260 μΐ H2O, prídavok 40 μΐ proteinázy K (18 mg/ml), rozvíriť, inkubácia 10 min 55 °C, odstreďovanie 3 min 14000 x g, presah odobrať, prídavok 350 μΐ 100% etanolu, rozvíriť,
6) Trávenie lyzozymom a trávenie proteinázou K v rozriedenom RLT tlmivom roztoku prídavok 300 μΐ RTL tlmivého roztoku, rozvíriť, prídavok 160 μΐ H20, rozvíriť, prídavok 100 μΐ TE-tlmivého roztoku s 400 μΙ/ml lyzozymu, inkubácia 5 min pri izbovej teplote, prídavok 40 μΐ proteinázy K (18 mg/ml), rozvíriť, inkubácia 10 min pri 55 °C, odstreďovanie 3 min pri 14000 x g, presah odobrať, prídavok 350 μΐ 100% etanolu, rozvíriť,
7) Spracovanie pomocou prípadne modifikovanej kremičitanovej kolóny - ako napr. RNeasy Mini špín kolóny (získatelnej od firmy QIAGEN, Hilden)
Naplnenie roztoku do kolóny, jeho ďalšie spracovanie podľa Rneasy Mini protokolu na izolovanie celkovej RNA z baktérií, krok 5.
Výstupný protokol sa porovná s
protokolu:
variant 1: kroky 1, 3, 4 a 7
variant 2: kroky 1, 2, 3, 4a 7
variant 3: kroky 1, 2, 3, 5 a 7
príklade 1)
variant 4: kroky 1, 6 a 7 nasledujúcimi variantmi (výstupný protokol ako v
Obr. 2 ukazuje výťažok RNA rôznych variantov protokolu.
Výsledky týchto experimentov zreteľne ukazujú, že
uskutočnenie variantu 1 protokolu čo sa týka výťažku RNA je
porovnateľné s výstupným protokolom (variant 3). V tomto
variante protokolu sa nevykonáva pranie, ako tiež trávenie proteinázou K. Celkovo sa tak procedúra spracovania podstatne skráti, takže tento variant protokolu je v ďalších príkladoch použitá braný ako štandardný spôsob.
Príklad 3
Izolácia RNA z E. coli s rôznymi objemovými pomermi kultúry a vodného roztoku zmesi podľa vynálezu
Použijú sa vodné roztoky zmesi podľa vynálezu s
nasledujúcimi zloženiami:
Roztok QCX 1 4% (w/v) tetradecyltrimetylamóniumoxalát 200 mM kyseliny vínnej pH 4,0
Roztok QCX 2 6% (w/v) tetradecyltrimetylamóniumoxalát 300 mM kyseliny vínnej pH 4,0
Roztok QCX 3 8% (w/v) tetradecyltrimetylamóniumoxalát 400 mM kyseliny vínnej pH 4,0
Roztok QCX 4 15% (w/v) tetradecyltrimetylamóniumoxalát 750 mM kyseliny vínnej pH 4,0
Vždy 400 μΐ E. coli kultúry narastanej v LB médiu (10 g
tryptón, 5 g kvasničného extraktu, 10 g NaCl, H2O do 1000 ml) sa
rozriedilo s 2, 3 resp. 4 objemami príslušných roztokov a spracovalo podľa štandardného protokolu definovaného v príklade 2.
Obr. 3 ukazuje výťažok RNA v závislosti od objemu vodného roztoku katiónovej zlúčeniny podľa vzorca 1 a aditiva.
Ako to vyplýva z experimentálnych nálezov, sú výťažky RNA pri použití 2 resp. 3 objemov rôznych detergentných roztokov porovnateľné. Pri použití 4 objemov hore opísaných roztokov dochádza k určitej strate výťažku RNA. V rámci násad pri použití 2 resp. 3 objemov detergentného roztoku sa dosiahnu s roztokmi 1, 2 a 3 porovnateľne vysoké výťažky.
Aby bolo možné posúdiť nedotknutosť izolovanej RNA, natrie sa RNA na denaturujúce agarózové plochy a následne sa uskutoční Northern Blot analýza (porovnaj obr. 4!).
Vizuálna analýza rRNA pásov ukazuje väčšinou intaktné ribozomálne RNA pásy na agarózovej ploche. Iba pásy získané pri použití roztoku 4 svedčí o čiastočnej degradácii RNA. Tento nález sa potvrdzuje analýzou Northern Blot, pri ktorej sa hybridizuje z E. coli sondou nasmerovanou proti ompA (outer membráne protein A”*) mRNA.
' , 1 * Pri ompA mRNA ide s polčasom 15 min o relatívne dlho žijúci RNA-transkript (Náture 1984, 312: 75-77).
Opäť sa ukazuje degradovanie RNA, ktorá sa izoluje roztokom
4. Pri porovnaní ostatných vzoriek RNA sa ukazujú najostrejšie ompA mRNA pásy v stopách, v ktorých sa RNA izoluje roztokom 1. Celkom vykazujú vzorky RNA, ktoré sa izolovali roztokmi 1 až 3, ale len veľmi malé rozdiely čo sa týka kvality RNA.
Obr. 4 uvádza výsledok elektroforézy gélu denaturovanej agarózy a ompA Northern Blot analýzu RNA pri E. coli izolovanej roztokmi rôzneho objemu a koncentrácií.
Príklad 4
Stabilizácia RNA z E. coli
Na posúdenie účinnosti stabilizácie sa v tomto príklade vykonávajú experimenty, v ktorých sa k bunkám E. coli v kultivačnom médiu pridáva inhibítor RNA-polymerázy, rifampicín (FEBS Letters 1998, 172 až 174) . Tým sa zabráni novej syntéze RNA-transkriptov, čím sa uľahčuje analýza degradovania RNAtranskriptov. V definovaných časových okamihoch po pridaní inhibítoru prebehne izolácia RNA z buniek. Ako kontroly slúžia násady pri ktorých sa postupuje analogicky, ale RNA sa izoluje bez prísady roztoku (Rneasy Standard-Protokol). Na posúdenie nedotknutosti mRNA sa po izolácii RNA vykonajú Northern Blot experimenty.
Obr. 5 ukazuje ompA (outer membráne protein A) Northern Blot analýzu RNA z E. coli izolovanej po prídavku rifampicínu s roztokom a alebo bez roztoku zmesi podľa vynálezu.
Pri ompA mRNA ide o transkript E. coli, ktorý má za zvolených kultivačných podmienok polčas 15 minút (Náture 1984, 312: 75-77). Northern Blot analýza (obr. 5) ukazuje že sa vo vzorkách, ktoré sa ošetrujú roztokom podľa vynálezu, po celý vyšetrovaný čas (do 15 minút) detekuje rovnomerne intenzívny signál pre ompA mRNA. Naproti tomu je pre ompA mRNA vo vzorkách bez prísady detergentu už po 0 až 15 minútach dosiahnutá výrazná strata transkriptu.
Obr. 6 ukazuje Northern Blot analýzu pre bla(β-laktamázy) pre RNA z E. coli, izolovanej po prídavku rifampicinu, s resp. bez použitia zmesi, resp. vodného roztoku, z katiónovej zlúčeniny a aditiva.
Pri Northern Blot analýze pre β-laktamázu mRNA (bla) je rovnaký účinok preukázaný ešte výraznejšie. Tento transkript mRNA má za zvolených podmienok kultúry polčas 2 až 5 minút (Náture 1984, 312: 75-77). Ako je to patrné z obr. 6, je tento transkript preukázaný s porovnateľnou intenzitou signálu v celom vyšetrovanom období pri vzorkách RNA, ktoré sa izolovali s prísadou detergentu spracovaní mRNA. Rozdiel roztoku. Pri kontrolných násadách bez roztoku zaznamenáva naproti tomu už takmer úplná strata signálu bla mRNA sa
RNA (0 minút) intenzít pri okamžitom transkriptu bla medzi obidvoma reflektuje bezprostrednú stabilizáciu izolačnými spôsobmi RNA mRNA zodpovedajúcim vodným roztokom zmesi podlá vynálezu.
Tieto pokusy dokladajú, že sa zmesou podľa vynálezu otvára možnosť fixovať RNA-expresné profily baktérii v stave kvapalnej kultúry, bez toho, aby pritom artefakty z izolačnej procedúry viedli k skresleniu expresnej vzorky.
Príklad 5
Stabilizácia RNA tetradecyltrimetylamóniumbromidom (TTAB)
V nasledujúcich experimentoch sa používa TTAB roztok nasledujúceho zloženia:
% (w/v) TTAB
200 mM kyseliny vínnej pH 4,0
Rôzne druhy baktérií sa líšia okrem iných usporiadaním svojej bunkovej steny. Pri použití rozdielnych druhov je otvorenie bunky kritickým krokom pri izolácii RNA. Oproti enzymatickému otvoreniu bunky, ktoré predovšetkým pri gramnegatívnych druhov baktérií vedie k dobrým výsledkom, ponúka mechanické otvorenie buniek potenciálne možnosť otvárať najrôznejšie druhy.
Ďalej uvedená tabulka ukazuje porovnanie rôznych výťažkov, ktoré boli pripravené sčasti podía spôsobov podlá stavu techniky (RNázy pri vykonaní lyzozymom sprostredkovaného otvárania buniek), pri použití zmesi podía vynálezu a RNázy, vrátane trávenia lyzozymom, ako tiež pri použití zmesi podľa vynálezu a RNázy, pričom enzymatické otváranie bunky bolo podporované použitím guľového mlynu. Pri použití guľového mlynu (MM 300 firmy QIAGEN) sa na násadu 50 mg kyseliny použili vyprané sklenené guľôčky (priemer 150 až 600 μιη) . K Otváraniu buniek v guľovom mlyne došlo za 5 minút pri maximálnej vibračnej rýchlosti (30 Hz).
Tabuľka 2
Výťažky RNA z 1 x 108 buniek B. subtilis pri rôznych spôsoboch otvárania buniek a následnej izolácii RNA s RNeasy®
Otváranie buniek Lyzozymové trávenie Roztok TTAB a lyzozymové trávenie Roztok TTAB a guľový mlyn a lyzozymové trávenie
B. subtilis v LB médiu 7 μ9 15 μg 19 μς
B. subtilis v minerálnom médiu 3 pg 8 pg 10 H9
Ako je z porovnania zreteľne patrné, vedie izolácia RNA s roztokom zmesi podľa vynálezu v kombinácii s mechanickým otváraním buniek k asi 25% zvýšeniu v porovnaní s enzymatickým otváraním buniek pri použití roztoku (tabuľka 2) . V porovnaní s izoláciou RNA podľa protokolu normy RNeasy bolo dosiahnuté mechanickým otváraním buniek pri použití detergentného roztoku v priemere trojnásobné zvýšenie výťažku.
Tieto výsledky ukazujú zreteľne, že enzymatické otváranie bunky pri použití detergentného roztoku prebieha účinne tiež pri gram-pozitívnych bunkách B. subtilis, takže nemusí byť prípadne používané mechanické otváranie buniek.
Použitie mechanického spôsobu otvárania buniek, ako je to pomocou guľového mlyna, otvára ale navyše možnosť dosiahnuť za zrieknutia sa enzymatického otvárania buniek zhruba šeťnásobné zvýšenie výťažku v porovnaní s izoláciou RNA bez enzymatického alebo mechanického otvárania buniek, ako to jasne ukazuje ďalej uvedený experimentálny postup:
Ako východiskový materiál slúži kultúra Bacillus subtilis vyrastená v LB médiu. Výťažky RNA sa porovnávajú vždy z 1,8 x 108 buniek na násadu (tabuľka 3). V časti vzoriek došlo k otváraniu buniek pomocou guľového mlynu (MM300 firmy QIAGEN) pri použití 50 mg kyselinou vypraných sklenených guľôčok (priemer 150 až 600 μπι) na násadu. K otváraniu buniek v guľovom mlyne došlo za 5 minút pri maximálnej frekvencii vibrácií (30 Hz) . V druhej časti vzorky sa nevykonávalo ani enzymatické, ani mechanické otváranie buniek. (Literatúra: J. Microbiol. Methods 44 (2001): 235 - 238) Promega SV Total RNA Isolation Systém.
Tabuľka 3
Výťažok RNA z Bacillus subtilis v závislosti od spôsobu otvárania buniek a prídavku roztoku TTAB
Bez enzymatického alebo mechanického otvárania buniek Mechanické otváranie buniek
Použitie roztoku TTAB 3 μς 18 μρ

Claims (18)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použitie zmesi obsahujúcej ako zložky katiónovú zlúčeninu všeobecného vzorca Y+R1R2R3R4X, v ktorom Y je dusík alebo fosfor, R1, R2, R3 a R4 sú nezávisle od seba nerozvetvené alebo rozvetvené alkylové zvyšky s 1 až 20 atómami uhlíka alebo arylové zvyšky s 6 až 20 atómami uhlíka alebo aralkylové zvyšky s 6 až 26 atómami uhlíka a X je anión anorganickej alebo organickej jednosýtnej alebo viacsýtnej kyseliny, a aspoň jeden donor protónov ako aditivum na stabilizáciu alebo izoláciu nukleových kyselín v respektíve z mikroorganizmov, ako sú prokaryonty, huby, prvoky alebo riasy.
  2. 2. Použitie zmesi podlá nároku 1, vyznačujúce sa tým, že
    Y znamená dusík.
  3. 3. Použitie zmesi podlá nároku 1 alebo 2, vyznačujúce sa tým, že R1 znamená zvyšok vyššieho alkylu, s výhodou s 12, 14 alebo 16 atómami uhlíka a R2, R3 a R4 znamenajú vždy metylovú skupinu.
  4. 4. Použitie zmesi podlá nárokov 1 až 3, vyznačujúce sa tým, že anión X’ je zvolený zo skupiny aniónov halogenovodíkových kyselín alebo aniónov jednosýtnych alebo dvojsýtnych organických kyselín.
  5. 5. Použitie zmesi podlá nároku 4, vyznačujúce sa tým, že anión X je zvolený zo skupiny aniónov obsahujúcej bromid, chlorid, fosfát, sulfát, formiát, acetát, propionát, oxalát, malonát sukcinát alebo citrát.
  6. 6.
    Použitie zmesi podľa nárokov 1 až 5, tým, že je alifatických vyznačujúce sa donor protónov zvolený zo skupiny nasýtených monokarboxylových kyselín, nenasýtených alebo karboxylových alifatických alkenylových nenasýtených trikarboxylových kyselín s alifatických ketokarboxylových kyselín, nasýtených dikarboxylových alebo až
    6 atómami uhlíka, alebo ketodikarboxylových kyselín, aminokyselín alebo zo alebo ich solí samotných alebo v skupiny kombinácii.
    minerálnych kyselín
  7. 7. Použitie zmesi podľa nároku 6, vyznačujúce sa tým, že sa ako alifatická monokarboxylová kyselina použije alkylkarboxylová kyselina s alkylom s 1 až 6 atómami uhlíka, s výhodou kyselina octová, kyselina propiónová, kyselina n-maslová, kyselina n-valérová, kyselina izovalérová, kyselina etylmetyloctová (kyselina 2-metylmaslová), kyselina
    2,2-dimetylpropiónová (kyselina pivalínová), kyselina nhexánová, kyselina n-oktánová, kyselina n-dekánová, ako tiež kyselina n-dodekánová (kyselina laurínová) alebo zmesi uvedených kyselín.
  8. 8. Použitie zmesi podľa nároku 6, vyznačujúce sa tým, že sa ako alifatická alkenylkarboxylová kyselina (kyselina propénová) použije kyselina metakrylová, kyselina krotónová, kyselina izokrotónová alebo kyselina vinyloctová alebo zmesi uvedených kyselín.
  9. 9. Použitie zmesi podľa nároku 6, vyznačujúce sa tým, že sa ako nasýtená alifatická dikarboxylová kyselina s 2 až 6 atómami uhlíka použije dikarboxylová kyselina zo skupiny kyselina oxalová, kyselina malónová, kyselina jantárová, kyselina glutárová alebo kyselina adipínová alebo zmesi uvedených kyselín.
  10. 10. Použitie zmesi podľa nároku 9, vyznačujúce sa tým, že sa ako donory protónov použijú alifatické dikarboxylové kyseliny, s výhodou kyselina oxalová alebo kyselina jantárová alebo zmesi uvedených kyselín.
  11. 11. Použitie zmesi podľa nároku 6, vyznačujúce sa tým, že sa ako donory protónov použijú alifatické hydroxy-di- a trikarboxylové kyseliny, s výhodou kyselina tartrónová, D-(+)-, kyselina L-(-)- alebo DL-jablčná, kyselina (2R, 3R)-(+)-vínna, kyselina (2S, 3S)-(-)-vínna, kyselina mezovínna a kyselina citrónová alebo zmesi , uvedených kyselín.
  12. 12. Použitie zmesi podľa nároku 6 vyznačujúce sa tým, že sa ako donory protónov použijú nenasýtené dikarboxylové kyseliny, s výhodou kyselina maleínová alebo kyselina fumarová alebo zmesi uvedených kyselín.
  13. 13. Použitie zmesi podľa nároku 6, vyznačujúce sa tým, že sa ako donory protónov použijú nenasýtené trikarboxylové kyseliny, s výhodou kyselina akonitová alebo zmesi týchto kyselín.
  14. 14. Použitie zmesi podľa nároku 6, vyznačujúce sa tým, že sa ako donory protónov použijú alifatické ketodikarboxylové kyseliny, s výhodou kyselina mezoxalová alebo kyselina oxaloctová alebo zmesi uvedených kyselín.
  15. 15. Použitie zmesi podía nároku 6, vyznačujúce sa tým, že sa ako donory protónov použijú aminokyseliny, s výhodou aminooctová kyselina (glycin), α-aminopropiónová (alanin), α-aminizovalérová (valin), α-aminoizokaprónová (leucín) a kyselina a-amino-p-metylvalérová (izoleucin) alebo zmesi uvedených kyselín.
  16. 16. Použitie zmesi podía nárokov 1 až 15, vyznačujúce sa tým, že sa zmes používa vo forme vodného roztoku.
  17. 17. Použitie zmesi podía nároku 16, vyznačujúce sa tým, že katiónová zlúčenina v zmesi je v koncentrácii v intervale od 0,01 % (w/v) do nasýtenosti, s výhodou medzi 0,1 % a 10 % (w/v) a osobitne s výhodou v rozmedzí od 0,5 do 8 % (w/v) a najvýhodnejšie v rozmedzí medzi 2 a 6 % (w/v).
  18. 18. Použitie zmesi podía nárokov 1 až 17, vyznačujúce sa tým, že nukleové kyseliny pochádzajú z prokaryontov, archaebaktérií, predovšetkým z Methanothermobacter marbirgensis) alebo eubaktérií.
    19. Použitie podľa nároku 18, vyznačujúce sa tým, že nukleové kyseliny pochádzajú z gram-pozitívnych baktérií. 20. Použitie podľa nároku 19, vyznačujúce sa tým, že
    nukleové kyseliny pochádzajú z kmeňov Bacillus, s výhodou Bacillus subtilis, Staphylococcus, s výhodou Staphylococcus aureus alebo Staphylococcus epidermis, Streptomyces, s výhodou Streptomyces coelicotor alebo Streptomyces lividans, Flavobacterium, s výhodou Flavobacterium johnsoniae, Mycobacterium, s výhodou Mycobacterium avium, Streptococcus, Clostridium, s výhodou Clostridium difficile, Clostridium tetani a Clostridium perfringens, Lysteria, Peptococcus, Peptostreptococcus, Enterococcus, Corynebacterium, s výhodou Corynebacterium diphteriae alebo Corynebacterium glutamicum, Propionibacterium, Lactobacillus.
    21.
    Použitie nukleové podľa nároku 18, kyseliny pochádzajú vyznačujúce sa tým, že z gram-negativnych baktérií.
    22.
    podľa nároku 21, kyseliny pochádzajú z Escherichia
    Použitie nukleové čujúce sa Escherichia, tým, že s výhodou coli, Pseudomonas, s výhodou
    Pseudomonas aeroginosa,
    Pseudomonas putida alebo Pseudomonas syringae,
    Klebsiella, s výhodou Klebsiella pneumoniae, Salmonella, s výhodou Salmonella typhimurium, Sinorhizobium, s výhodou Sinorhizobium meliloti alebo Camphylobacter, Neisseria, s výhodou Neisseria gonorrhoae alebo Neisseria meningitidis, Vibrio, s výhodou Vibrio cholerae, Shigella, Serratia,
    Enterobacter, Acinetobacter, Proteus, Yersinia, Brucella, s výhodou Brucella abortus, Haemophilus, s výhodou Haemophilus influenza, Bacteroides, Campylobacter, výhodou Helicobacter pylori,
    Helicobacter, s
    Bordetella,
    Legionella alebo
    Pasteurella.
    23. Použitie nukleové podľa nároku 18, kyseliny pochádzajú vyznačuj úce z kmeňa Clamydia. sa tým, že 24 . Použitie podľa nároku 18, vyznačujúce sa tým, že nukleové kyseliny pochádzajú z fototropných baktérií. 25. Použitie podľa nároku 18, vyznačujúce sa tým, že nukleové kyseliny pochádzajú z kmeňa Mycoplasma, s výhodou z
    Mycoplasma penetrans.
    26. Použitie nukleové podía nároku 18, kyseliny pochádzajú vyznačujúce sa z kmeňa Rickettsiae. tým, že 27. Použitie podlá nároku 18, vyznačujúce sa tým, že nukleové kyseliny pochádzajú z kmeňa Spirochaeta. 28. Použitie podía nároku 18, vyznačujúce sa tým, že nukleové kyseliny pochádzajú z kmeňa Spirillum. 29. Použitie podľa nárokov 1 až 17, vyznačujúce sa tým,
    že nukleové kyseliny pochádzajú z eukaryotických mi kroorgani zmov.
    30. Použitie podlá nároku 29, vyznačujúce sa tým, že nukleové kyseliny pochádzajú z húb skupiny dermatofytov, kvasiniek, plesňových húb a bifáznych húb.
    31. Použitie podlá nároku 30, vyznačujúce sa tým, že nukleové kyseliny pochádzajú z kvasiniek rodu Saccharomyces, s výhodou Saccharomyces cerevisiae, Candida, s výhodou Candida albicans alebo Cryptococcus s výhodou Cryptococcus neoformans.
    32. Použitie podľa nároku 30, vy z n a č u j ú c e s a tým, že nukleové kyseliny pochádzajú z plesňových húb skupiny Aspergillus, s výhodou Aspergillus fumigatus. 33. Použitie podľa nároku 30, vy z n a č u j ú c e s a tým, že nukleové kyseliny pochádzajú z plesňových húb skupiny Penicillium.
    34. Použitie podľa nároku 30, vyznačujúce s a tým, že nukleové kyseliny pochádzajú z plesňových húb skupiny Mucor. 1 35. Použitie podľa nároku 29, vyznačujúce s a tým, že nukleové kyseliny pochádzajú z rias. 36. Použitie podľa nároku 29, vyznačujúce s a tým, že nukleové kyseliny pochádzajú z prvokov, s výhodou sú to
    trypanozómy, toxoplazmy, amoeby, plazmodia, flageláty.
    37. Použitie zmesi podľa nárokov 1 až 36, vyznačujúce sa tým, že dochádza k enzymatickému, mechanickému, tepelnému alebo chemickému otvoreniu baktérií alebo húb alebo prvokov alebo rias alebo že sa použije kombinácia spôsobov otvárania.
    38. Použitie zmesí podľa nárokov 1 až 37, vyznačujúce sa tým, že hodnota pH zmesi leží v rozsahu od 2 do 12, s výhodou od 2 do 8 a najvýhodnejšie v intervale od 2 do 5.
    39. Spôsob výroby jednej zo zmesí podľa nárokov 1 až 17, vyznačujúci sa tým, že sa dajú dohromady a zmiešajú jednotlivé súčasti, prípadne vo vodnom roztoku.
    40. Diagnostická zostava obsahujúca zmes podľa jedného z nárokov
    1 až 17.
    41. Súprava na stabilizáciu nukleových kyselín obsahujúca zmes podľa jedného z nárokov 1 až 17.
    42. Zmes obsahujúca biologickú vzorku podlá jedného z nárokov 18 až 36 a zmes podlá jedného z nárokov 1 až 17, prípadne popri ďalších pomocných látkach.
SK1802-2002A 2000-06-27 2001-06-26 Použitie zmesí z katiónových zlúčenín a donorov protónov na stabilizáciu alebo izoláciu nukleových kyselín v mikroorganizmoch alebo z mikroorganizmov, ako sú prokaryonty, huby, prvoky alebo riasy SK18022002A3 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10031236A DE10031236A1 (de) 2000-06-27 2000-06-27 Verwendung von Carbonsäuren und anderen Additiven in Kombination mit kationischen Verbindungen zur Stabilisierung von Nukleinsäuren in biologischen Materialien
PCT/EP2001/007281 WO2002000600A1 (de) 2000-06-27 2001-06-26 Verwendung von kompositionen aus kationischen verbindungen und protonendonoren zur stabilisierung und/oder isolierung von nukleinsäuren in bzw. aus mikroorganismen - wie prokaryonten, pilzen, protozoen oder algen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK18022002A3 true SK18022002A3 (sk) 2003-07-01

Family

ID=7646943

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1802-2002A SK18022002A3 (sk) 2000-06-27 2001-06-26 Použitie zmesí z katiónových zlúčenín a donorov protónov na stabilizáciu alebo izoláciu nukleových kyselín v mikroorganizmoch alebo z mikroorganizmov, ako sú prokaryonty, huby, prvoky alebo riasy

Country Status (17)

Country Link
US (3) US7270953B2 (sk)
EP (3) EP1294676B1 (sk)
JP (5) JP5795455B2 (sk)
CN (1) CN1250520C (sk)
AT (3) ATE524431T1 (sk)
AU (4) AU2001269031B2 (sk)
BR (1) BR0112002A (sk)
CA (2) CA2412534C (sk)
CZ (1) CZ20024129A3 (sk)
DE (3) DE10031236A1 (sk)
DK (2) DK1294676T3 (sk)
ES (2) ES2295177T3 (sk)
HU (1) HUP0301342A2 (sk)
MX (1) MXPA02012261A (sk)
PL (1) PL360705A1 (sk)
SK (1) SK18022002A3 (sk)
WO (2) WO2002000599A1 (sk)

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080064108A1 (en) * 1997-12-10 2008-03-13 Tony Baker Urine Preservation System
US7569342B2 (en) * 1997-12-10 2009-08-04 Sierra Molecular Corp. Removal of molecular assay interferences
DE10031236A1 (de) * 2000-06-27 2002-01-10 Qiagen Gmbh Verwendung von Carbonsäuren und anderen Additiven in Kombination mit kationischen Verbindungen zur Stabilisierung von Nukleinsäuren in biologischen Materialien
US6602718B1 (en) * 2000-11-08 2003-08-05 Becton, Dickinson And Company Method and device for collecting and stabilizing a biological sample
CN100386441C (zh) * 2000-11-08 2008-05-07 贝克顿迪肯森公司 收集和稳定生物样品的装置、抑制体外基因诱导的方法和制备全血样品的方法
DE10147439B4 (de) * 2001-09-26 2014-01-30 Qiagen Gmbh Verfahren zur Isolierung von DNA aus biologischen Proben
EP1329506A1 (en) 2002-01-18 2003-07-23 Cypro S.A. Method to quantify in vivo RNA levels
DE10208005A1 (de) * 2002-02-26 2003-09-04 Qiagen Gmbh Verfahren zur Änderung der Transkriptkonzentration in ribonukleinsäurehaltigen biologischen Proben
US7482116B2 (en) 2002-06-07 2009-01-27 Dna Genotek Inc. Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum
DE10336177B4 (de) * 2002-08-09 2010-02-11 Alexander Cherkasky Verwendung von Zellorganellen zur Stabilisierung von Nukleinsäuren und Zellen
WO2004020626A1 (de) * 2002-08-09 2004-03-11 Alexander Cherkasky Verwendung von zellorganellen zur stabilisierung von biomolekülen und zellen
CN1852765A (zh) * 2002-10-18 2006-10-25 普罗梅加公司 用于分离分子的组合物
US20060281092A1 (en) * 2003-07-24 2006-12-14 Tanja Wille Method for the reverse transcription and/or amplification of nucleic acids
US20050059024A1 (en) 2003-07-25 2005-03-17 Ambion, Inc. Methods and compositions for isolating small RNA molecules
GB0327319D0 (en) * 2003-11-24 2003-12-24 Pfizer Ltd Novel pharmaceuticals
EP1736542A4 (en) * 2004-03-23 2008-10-29 Hiroyuki Ohno SOLVENTS FOR SOLVING NUCLEIC ACID, NUCLEIC ACIDIC SOLUTION, AND METHOD FOR PRESERVING NUCLEIC ACID
US20060099567A1 (en) * 2004-04-08 2006-05-11 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
US20080176209A1 (en) * 2004-04-08 2008-07-24 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
EP1737573A2 (en) 2004-04-08 2007-01-03 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
DE102004023417A1 (de) * 2004-05-12 2005-12-08 Clariant Gmbh Verfahren zur Herstellung von langkettigen quaternären Ammonium-oxalaten und -hydrogenoxalaten
JP4810164B2 (ja) * 2004-09-03 2011-11-09 富士フイルム株式会社 核酸分離精製方法
US20060094023A1 (en) * 2004-11-02 2006-05-04 Industrial Technology Research Institute Method for isolating nucleic acid by using amino surfactants
TWI294460B (en) * 2004-12-23 2008-03-11 Ind Tech Res Inst Method for stabilizing nucleic acids
DE102005015005A1 (de) * 2005-04-01 2006-10-05 Qiagen Gmbh Verfahren zur Behandlung einer Biomoleküle enthaltenden Probe
US20060234251A1 (en) * 2005-04-19 2006-10-19 Lumigen, Inc. Methods of enhancing isolation of RNA from biological samples
US20070015165A1 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Sigma-Aldrich Co. Method for the isolation of RNA from biological sources
US20070190526A1 (en) * 2006-02-16 2007-08-16 Nexgen Diagnostics Llc Methods of extracting nucleic acids
EP2022853A4 (en) * 2006-05-17 2010-03-10 Yoshiyuki Koyama FREEZERED PRODUCT FOR THE TRANSFER OF NUCLEIC ACID, OLIGONUCLEIC ACID OR DERIVATIVES THEREOF
DE102007016707A1 (de) * 2007-04-04 2008-10-09 Qiagen Gmbh Verfahren zur Aufreinigung von Biomolekülen
DE102007025275A1 (de) 2007-05-31 2008-12-04 Qiagen Gmbh Butendisäure oder deren Derivate zur Behandlung einer biologischen Probe
DE102007025277A1 (de) 2007-05-31 2008-12-04 Qiagen Gmbh Verfahren zur Stabilisierung einer biologischen Probe
DE102007025276A1 (de) 2007-05-31 2008-12-04 Qiagen Gmbh Aromatische Alkohole zur Behandlung einer biologischen Probe
US20090053704A1 (en) * 2007-08-24 2009-02-26 Natalia Novoradovskaya Stabilization of nucleic acids on solid supports
US7687027B2 (en) * 2008-02-27 2010-03-30 Becton, Dickinson And Company Cleaning compositions, methods and materials for reducing nucleic acid contamination
EP2411805A1 (en) 2009-03-27 2012-02-01 Université Libre de Bruxelles New marker for diagnosis of active multiple sclerosis
WO2011051402A1 (en) 2009-11-02 2011-05-05 Universite Libre De Bruxelles New biomarkers for determining allergy status
EP2345719A1 (en) 2010-01-18 2011-07-20 Qiagen GmbH Method for isolating small RNA
US8932809B2 (en) * 2010-01-19 2015-01-13 Opgen, Inc. Methods and kits for isolating nucleic acid from an organism
US20130095473A1 (en) 2010-06-14 2013-04-18 Qiagen Gmbh Method for determination of target cells or tissue for extraction of biomolecules from fixed biological samples
EP2407540A1 (en) 2010-07-15 2012-01-18 Qiagen GmbH Method for purifying a target nucleic acid
EP2598661B1 (en) 2010-07-26 2017-09-27 Biomatrica, INC. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
US9376709B2 (en) 2010-07-26 2016-06-28 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing DNA and RNA in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
CN102146422B (zh) * 2011-01-24 2013-08-07 南京工业大学 一种丁二酸的发酵生产工艺
US9476095B2 (en) 2011-04-15 2016-10-25 The Johns Hopkins University Safe sequencing system
EP2721140B1 (en) 2011-06-19 2016-11-23 Abogen, Inc. Devices, solutions and methods for sample collection
JP6096774B2 (ja) 2011-08-12 2017-03-15 キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 核酸を単離するための方法
AU2012314515B2 (en) 2011-09-26 2018-03-15 Preanalytix Gmbh Stabilisation and isolation of extracellular nucleic acids
US11021733B2 (en) 2011-09-26 2021-06-01 Qiagen Gmbh Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids
WO2013119956A1 (en) 2012-02-09 2013-08-15 Life Technologies Corporation Conjugated polymeric particle and method of making same
EP2647709B1 (en) 2012-04-05 2016-02-24 F. Hoffmann-La Roche AG Amine compounds for the selective preparation of biological samples
WO2014029792A1 (en) 2012-08-21 2014-02-27 Qiagen Gmbh Virus particle stabilisation and method for isolating viral nucleic acids
US20150225712A1 (en) 2012-08-21 2015-08-13 Qiagen Gmbh Method for isolating nucleic acids from a formaldehyde releaser stabilized sample
JP6440616B2 (ja) * 2012-09-03 2018-12-19 キアゲン ゲーエムベーハー 高収量で小型ｒｎａを含むｒｎａを単離するための方法
ES2614247T3 (es) 2012-09-25 2017-05-30 Qiagen Gmbh Estabilización de muestras biológicas
CN104956225B (zh) 2012-10-29 2018-10-02 约翰·霍普金斯大学 卵巢和子宫内膜癌的帕帕尼科拉乌测试
US9725703B2 (en) 2012-12-20 2017-08-08 Biomatrica, Inc. Formulations and methods for stabilizing PCR reagents
US10564150B2 (en) 2012-12-28 2020-02-18 Cellestis Limited Cell mediated immune response assay
GB201303666D0 (en) 2013-03-01 2013-04-17 Goldsborough Andrew S Sample fixation and stabilisation
CN105121643A (zh) 2013-03-18 2015-12-02 凯杰有限公司 细胞外核酸的稳定化和分离
EP2976424B1 (en) 2013-03-18 2018-10-03 Qiagen GmbH Stabilisation of biological samples
GB201305414D0 (en) 2013-03-25 2013-05-08 Arcis Biotechnology Holdings Ltd Method and composition
DK3114225T3 (da) 2014-03-07 2021-07-26 Dna Genotek Inc Sammensætning og fremgangsmåde til stabilisering af nukleinsyrer i biologiske prøver
JP6664332B2 (ja) 2014-03-18 2020-03-13 キアゲン ゲーエムベーハー 細胞外核酸の安定化および単離
JP6661554B2 (ja) 2014-06-10 2020-03-11 バイオマトリカ，インク． 周囲温度における血小板の安定化
EP3194563B1 (en) 2014-09-17 2023-05-10 Hologic, Inc. Method of partial lysis and assay
KR20180012266A (ko) 2015-05-27 2018-02-05 키아겐 게엠베하 조직 물질을 붕괴시키기 위한 조성물 및 방법
US10144968B2 (en) 2015-07-02 2018-12-04 Life Technologies Corporation Conjugation of carboxyl functional hydrophilic beads
US10150992B2 (en) 2015-07-06 2018-12-11 Life Technologies Corporation Substrates and methods useful in sequencing
US11286531B2 (en) 2015-08-11 2022-03-29 The Johns Hopkins University Assaying ovarian cyst fluid
CN108291250B (zh) 2015-11-20 2022-05-27 凯杰有限公司 用于稳定细胞外核酸的已灭菌组合物的制备方法
SG11201804776SA (en) 2015-12-08 2018-07-30 Biomatrica Inc Reduction of erythrocyte sedimentation rate
JP7274748B2 (ja) * 2016-11-08 2023-05-17 クヴェッラ コーポレーション 核酸の安定化及び分離を行う方法
EP3568475B1 (en) 2017-01-16 2023-03-08 Spectrum Solutions L.L.C. Nucleic acid preservation solution and methods of use
EP3665308A1 (en) 2017-08-07 2020-06-17 The Johns Hopkins University Methods and materials for assessing and treating cancer
CN110012899A (zh) * 2019-04-12 2019-07-16 南京科佰生物科技有限公司 细胞用rna稳定剂及其使用方法

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1289426A (sk) 1970-06-22 1972-09-20
US4900677A (en) * 1986-09-26 1990-02-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for rapid isolation of high molecular weight DNA
US5010183A (en) 1989-07-07 1991-04-23 Macfarlane Donald E Process for purifying DNA and RNA using cationic detergents
IT1240870B (it) 1990-02-14 1993-12-17 Talent Procedimento per l'estrazione e la purificazione di dna genomico umano
US5260048A (en) 1991-05-08 1993-11-09 Streck Laboratories, Inc. Tissue fixative solution and method
US5196182A (en) 1991-05-08 1993-03-23 Streck Laboratories, Inc. Tissue fixative
US5275708A (en) * 1992-03-20 1994-01-04 Thomas Jefferson University Cetyltrimethylammonium bromide gel electrophoresis
CA2107939C (en) * 1993-01-13 2001-01-30 Stephen B. Kong Acidic aqueous cleaning compositions
WO1994018156A1 (en) * 1993-02-01 1994-08-18 University Of Iowa Research Foundation Quartenary amine surfactants and methods of using same in isolation of rna
US5300635A (en) * 1993-02-01 1994-04-05 University Of Iowa Research Foundation Quaternary amine surfactants and methods of using same in isolation of nucleic acids
US5300645A (en) 1993-04-14 1994-04-05 Eli Lilly And Company Tetrahydro-pyrido-indole
US5641726A (en) 1993-06-09 1997-06-24 Lonza, Inc. Quaternary ammonium carboxylate and borate compositions and preparation thereof
ZA943999B (en) * 1993-06-09 1995-02-03 Lonza Ag Quaternary ammonium and waterproofing/preservative compositions
WO1995021849A1 (de) 1994-02-11 1995-08-17 Qiagen Gmbh Verfahren zur trennung von doppelstrang/einzelstrangnukleinsäurestrukturen
WO1999029904A2 (en) 1997-12-10 1999-06-17 Sierra Diagnostics, Inc. Methods and reagents for preservation of dna in bodily fluids
US6238888B1 (en) * 1997-12-22 2001-05-29 Human Genone Sciences, Inc. Keratinocyte growth factor-2 formulations
US6204375B1 (en) 1998-07-31 2001-03-20 Ambion, Inc. Methods and reagents for preserving RNA in cell and tissue samples
CA2299119C (en) 1999-02-23 2013-02-05 Qiagen Gmbh A method of stabilizing and/or isolating nucleic acids
DE10031236A1 (de) * 2000-06-27 2002-01-10 Qiagen Gmbh Verwendung von Carbonsäuren und anderen Additiven in Kombination mit kationischen Verbindungen zur Stabilisierung von Nukleinsäuren in biologischen Materialien

Also Published As

Publication number Publication date
US6861213B2 (en) 2005-03-01
JP5795455B2 (ja) 2015-10-14
AU783922B2 (en) 2005-12-22
CN1438988A (zh) 2003-08-27
CZ20024129A3 (cs) 2003-06-18
US20080071072A1 (en) 2008-03-20
HUP0301342A2 (hu) 2003-08-28
US20040014703A1 (en) 2004-01-22
ATE524431T1 (de) 2011-09-15
US20030165943A1 (en) 2003-09-04
US7682790B2 (en) 2010-03-23
ATE394363T1 (de) 2008-05-15
AU7568501A (en) 2002-01-08
AU6903101A (en) 2002-01-08
WO2002000599A1 (de) 2002-01-03
CA2410388C (en) 2014-12-09
ES2295177T3 (es) 2008-04-16
JP2012135317A (ja) 2012-07-19
CN1250520C (zh) 2006-04-12
EP1820793B1 (de) 2011-09-14
AU2001269031B2 (en) 2007-01-11
MXPA02012261A (es) 2004-09-06
ES2373784T3 (es) 2012-02-08
DK1820793T3 (da) 2012-01-02
EP1296932A1 (de) 2003-04-02
EP1294676B1 (de) 2007-10-03
JP2004501621A (ja) 2004-01-22
CA2412534C (en) 2011-08-09
EP1294676A1 (de) 2003-03-26
PL360705A1 (en) 2004-09-20
DE50113941D1 (de) 2008-06-19
CA2412534A1 (en) 2002-12-17
DE50113086D1 (de) 2007-11-15
WO2002000600A1 (de) 2002-01-03
JP2004501622A (ja) 2004-01-22
ATE374743T1 (de) 2007-10-15
DK1294676T3 (da) 2008-02-04
EP1296932B1 (de) 2008-05-07
JP2015027310A (ja) 2015-02-12
DE10031236A1 (de) 2002-01-10
EP1820793A1 (de) 2007-08-22
AU2007201583A1 (en) 2007-05-03
JP5657847B2 (ja) 2015-01-21
CA2410388A1 (en) 2002-11-28
AU2007201583B2 (en) 2010-06-03
US7270953B2 (en) 2007-09-18
JP2015212273A (ja) 2015-11-26
BR0112002A (pt) 2003-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK18022002A3 (sk) Použitie zmesí z katiónových zlúčenín a donorov protónov na stabilizáciu alebo izoláciu nukleových kyselín v mikroorganizmoch alebo z mikroorganizmov, ako sú prokaryonty, huby, prvoky alebo riasy
EP2256196B1 (de) Verfahren zur Behandlung einer Biomoleküle enthaltenden Probe
JP4809967B2 (ja) 核酸の安定化及び／又は単離の方法
JP2005501523A (ja) 界面活性剤およびプロテアーゼを使用して核酸を単離するための組成物、方法およびキット
US20060286557A1 (en) Combined lysis and PCR buffer
JP2012135317A5 (sk)
JP4918037B2 (ja) 陽イオン洗浄剤を使用した核酸を洗浄および単離するための方法
JP5514307B2 (ja) リボヌクレアーゼ活性阻害用化合物及びこれを含む核酸保存容器

Legal Events

Date Code Title Description
FB9A Suspension of patent application procedure