JP6096774B2 - 核酸を単離するための方法 - Google Patents
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Description
a)少なくとも1種の陽イオン性界面活性剤の使用によって、安定化されている試料を得るステップであって、陽イオン性界面活性剤が、核酸と複合体を形成しているステップ、
b)場合によって、安定化されている試料由来の他の試料成分と一緒に複合体を得るステップであって、前記複合体が、単離されるべき核酸を含むステップ、
c)複合体を再懸濁させ、場合によって、1種または複数の添加剤を、再懸濁前、再懸濁中および/または再懸濁後に加えることによって、少なくとも
i)単離されるべき核酸、
ii)少なくとも1種のカオトロピック剤および
iii)少なくとも1種のキレート剤
を含む、再懸濁させた試料を得るステップ、
ならびに
d)再懸濁させた試料から、核酸を単離するステップ
を含む、方法を提供する。
a)少なくとも1種の陽イオン性界面活性剤の使用によって、安定化されている試料を得るステップであって、陽イオン性界面活性剤が、核酸と複合体を形成しているステップ、
b)場合によって、安定化されている試料由来の他の試料成分と一緒に複合体を得るステップであって、前記複合体が、単離されるべき核酸を含むステップ、
c)複合体を再懸濁させ、場合によって、1種または複数の添加剤を、再懸濁前、再懸濁中および/または再懸濁後に加えることによって、少なくとも
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を含む、再懸濁させた試料を得るステップ、
ならびに
d)再懸濁させた試料から、核酸を単離するステップ
を含む、方法を提供する。
a)加熱、
b)撹拌、
c)塩の存在、
d)6から9の間のpH値および/または
e)少なくとも3分、好ましくは少なくとも5分、最も好ましくは少なくとも10分間のインキュベーション期間
のうちの1つまたは複数を含む。
a)結合が、少なくとも1種のカオトロピック剤の存在下で行われる、
b)結合が、少なくとも1種のアルコールの存在下で行われる、
c)結合が、少なくとも1種の界面活性剤の存在下で行われる、
d)結合が、核酸、特にRNAの結合を促進する条件下で行われる、および/または
e)結合が、小さい核酸、特に小さいRNA種の結合を促進する条件下で行われる
のうちの、1つまたは複数、好ましくは少なくとも2つを有する条件下で行われる。
a)10%v/vから90%v/vまで、15%v/vから90%v/vまで、20%v/vから85%v/vまで、30%v/vから80%v/vまで、40%v/vから85%v/vまで、40%v/vから80%まで、40%v/vから70%まで、50%v/v以上から80%v/v以下までおよび60%v/v以上から80%v/v以下までからなる群から選択されるアルコール濃度を使用する、
b)0.05Mから飽和限界まで、0.1Mから6Mまでおよび1Mから4Mまでからなる群から選択される、1種または複数のカオトロピック剤の濃度を使用する、および/または、
c)小さいRNAを含むRNAを固相に結合させるために、少なくとも30%v/v、好ましくは少なくとも40%v/vのアルコール濃度および少なくとも1種のカオトロピック剤を使用する
のうちの1つまたは複数を有する結合条件を使用して行われる。
i)DNAを第1の固相に結合させ、前記第1の固相に結合されたDNAを、RNAを含む残りの試料から分離することによって、再懸濁させ好ましくは消化された試料から、少なくとも一部のDNAを除去するステップ、
ii)少なくとも1種のカオトロピック剤および30%v/v以上の濃度の少なくとも1種のアルコールが、この結合ステップii)中に使用される、RNAを第2の固相に結合させるステップ、
− 場合によって、前記第2の固相に結合されているRNAを洗浄するために、少なくとも1つの洗浄ステップを行うステップ、ならびに
− 場合によって、RNAを前記第2の固相から溶出するステップ
を含む。
a)安定化させる組成物は、
a)一般式
Y+R1R2R3R4X-
の陽イオン性(cationic)化合物
[式中、Yは、窒素またはリン、好ましくは窒素を表し、
R1R2R3およびR4は、独立して、分枝または非分枝のC1〜C20−アルキル基、C6〜C20−アリール基および/またはC6〜C26アラルキル基を表し、
X-は、無機または有機の、一塩基酸または多塩基酸の陰イオン(anion)を表す]
および
b)少なくとも1つのプロトン供与体
を含む。
a)一般式
Y+R1R2R3R4X-
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[式中、Yは、窒素またはリン、好ましくは窒素を表し、
R1R2R3およびR4は、独立して、分枝または非分枝のC1〜C20−アルキル基、C6〜C20−アリール基および/またはC6〜C26アラルキル基を表し、
X-は、無機または有機の、一塩基酸または多塩基酸の陰イオン(anion)を表す]
および
b)好ましくは、組成物中に、50mMを超えて飽和までの濃度で存在し、好ましくは、飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニル−カルボン酸、飽和および/または不飽和脂肪族C2〜C6−ジカルボン酸、脂肪族ヒドロキシル−ジ−およびトリカルボン酸、脂肪族ケトカルボン酸、アミノ酸もしくは無機酸またはその塩の、単独または組合せからなる群から選択される、少なくとも1つのプロトン供与体
を含む。
R1R2R3N(O)x (2)
[式中、
R1およびR2は、それぞれ独立して、H、C1〜C20アルキル残基、C6〜C26アリール残基またはC6〜C26アラルキル残基であり、好ましくはH、C1〜C6アルキル残基、C6〜C12アリール残基またはC6〜C12アラルキル残基であり、
R3、はC1〜C20アルキル基、C6〜C26アリール残基またはC6〜C26アラルキル残基であり、
Xは、0および1の整数である]
を有するアミノ界面活性剤は、安定化組成物中で界面活性剤として使用され、これは使用される安定化条件下で、陽イオン性であるまたは陽イオン性となり、それによって陽イオン性界面活性剤として機能する。
実施例
これから、本発明を以下の限定されない例によって説明する。
実施例1
24例の血液試料(2.5ml)を、バッチごとに、(安定化剤として陽イオン性界面活性剤を含む)パックスジーン ブロッド RNA チューブ(PAXgene Blood RNA Tube)に採取した。試料を24h間、室温で安定化させ、キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA キット(QIAsymphony PAXgene Blood RNA Kit),2008(キアゲン(QIAGEN))を用い、製造業者の使用説明書に従って処理した。
キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA キット(QIAsymphony PAXgene Blood RNA Kit)
キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)プロトコル(先行技術)において、陽イオン性界面活性剤および核酸を含む複合体を含むペレットを回収し、再懸濁させるために、安定化された試料を手動で調製する。前記ペレットを、遠心分離によって得、上清をデカンテーションする。その後、300μlの再懸濁緩衝液BR1(キアゲン(QIAGEN))をペレットに加え、ボルテックスした。次いで、それぞれ手動で調製した試料を、キアシンフォニー(QIAsymphony)ロボットシステム中に装填し、キアシンフォニー(QIAsymphony)のスクリプトに従って、再懸濁させた試料から核酸を単離した。
再懸濁中に、カオトロピック剤の追加を含む改変バージョン
RNAの完全性を保存するために、カオトロピック剤を再懸濁させた試料に加えることによって、キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)プロトコルを改変した。血液試料を、以上に記載されているように、手動で調製した。再懸濁緩衝液BR1をペレットに加え、ボルテックスした後、カオトロピック塩(GITC)を含むさらなる溶液(BR2、キアゲン(QIAGEN))200μlを加えた。カオトロピック塩を加えて、RNAの完全性を保存した。次いで、2つの異なるバージョンに従って、試料を処理した。バージョン1によると、緩衝液BR2を加えた後に、試料をキアシンフォニー(QIAsymphony)ロボット上に直ちに装填した。バージョン2によると、緩衝液BR2を加えた後に、試料をボルテックスし、次いでキアシンフォニー(QIAsymphony)ロボット上に装填した。次いで、キアシンフォニー(QIAsymphony)ロボットシステムにおいて、キアシンフォニー(QIAsymphony)のスクリプトに従って、再懸濁させた試料から核酸を単離した。
結果
結果を図1に示す。
1:キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)−第1のバッチ
2:キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)−第2のバッチ
3:改変キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)(カオトロピック剤の追加)−第2のバッチ(ボルテックスなし)
4:改変キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)(カオトロピック剤の追加)−第2のバッチ(ボルテックスあり)
図1は、先行技術のプロトコルに従って処理した第1のバッチの試料については、RNA完全性が卓越していることを示す。しかし、試料の再懸濁と核酸抽出との間の待機時間がより長かった第2のバッチにおいて、RNA完全性は減少している。したがって、待機時間がより長いと、RNA完全性が減少し、よってRNAの質が減少する。
実施例2
実施例2において、上記のキアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)プロトコルおよび改変バージョン(カオトロピック剤を再懸濁中に加える)を、核酸収量に関して分析した。実施例2で試験した前記改変バージョン3において、核酸単離もキアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)プロトコルに従って、キアシンフォニー(QIAsymphony)上で行ったが、核酸結合、特に小さいRNAの結合を向上させるために、改変結合緩衝液を使用して行った。キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)プロトコルで使用する結合緩衝液QSB1の代わりに、実施例2で使用した改変結合緩衝液は、60%を超えるイソプロパノールおよび0.2Mトリクロロ酢酸ナトリウムを含んだ。特に小さい核酸の結合の向上を達成するために、それぞれ改変された結合緩衝液および相当する核酸単離プロトコルは、参照することにより本明細書に援用されている、欧州特許出願公開第10000432.4号明細書(EP10000432.4)に記載されている。試料の再懸濁は、実施例1(改変バージョン)に記載されているように行い、よって、カオトロピック剤(GITC)を、RNAの完全性を保存するために、緩衝液BR2の形で加えた。
1:キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)
2:改変キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)(カオトロピック剤の追加)−第1のバッチ
3:改変キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)(カオトロピック剤の追加)−第2のバッチ
4:改変キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)(カオトロピック剤の追加)−第3のバッチ
5:パックスジーン ブロッド RNA(PAXgene Blood RNA)(IVD)
図2から導かれるように、改変バージョンの第1のバッチは、良好な収量を達成しており、先行技術の方法と比較して向上もしている。しかし、改変バージョンの第2および第3のバッチについては、高RIN値を保証するために、カオトロピック剤を再懸濁させた試料に加えているにもかかわらず、収量が減少していることが観察される(実施例1および図1を参照のこと)。収量は、20までから30%に減少している。核酸収量におけるこの損失の理由は、待機時間中に、沈殿が形成され、それが管のプラスチック壁にしっかり固着するためである。
実施例3
高いRNA完全性および高い核酸収量の両方を保証するために、本発明の教示に従って、プロトコルを改変した。したがって、EDTAを追加的に含めた、改変された再懸濁緩衝液を加えることによって、ペレットを再懸濁した。この目的のために、25mM EDTAを、先行技術のプロトコルでは再懸濁用に使用する再懸濁緩衝液BR1(キアゲン(QIAGEN))に加えた。この改変された再懸濁緩衝液BR1の280μlを、パックスジーン(PAXgene)で安定化された血液試料(実施例1を参照のこと)から得られたペレットに加えた。さらに、再懸濁のために、20μlのプロテイナーゼKを試料ごとに加えた。試料をボルテックスすることによって再懸濁し、カオトロピック剤(BR2、キアゲン(QIAGEN)−3Mを超えるGITCを含む)を含む緩衝液200μlを加えた。
1.試料の消化
40μlのプロテイナーゼKを、再懸濁させた試料に加え、10分間、加熱および振盪下でインキュベートした。
2.DNAの除去
マグ アトラクス G ビーズ(Mag Attract G beads)(キアゲン(QIAGEN))を、消化された試料に加え、DNAをビーズに結合させた。次いで、ビーズを試料から除去した。
3.RNAの結合
マグ アトラクス G ビーズ(Mag Attract G beads)(キアゲン(QIAGEN))を加え、65%を超えるイソプロパノール、トリクロロ酢酸ナトリウムおよびTris緩衝液を含む結合緩衝液1500μl。
4.洗浄
洗浄緩衝液QSB1およびBR4(キアゲン(QIAGEN))を使用して、2つの洗浄ステップを行った。
5.DNaseおよびプロテイナーゼKによる消化
RNAを溶出し、DNaseIを使用して、微量のDNAを消化した。その後、2回目のプロテイナーゼK消化を行った(参照することにより本明細書に援用されている、欧州特許出願公開第10007346.9号明細書(EP10007346.9)を参照のこと)。
6.RNAの再結合
1400μlの結合緩衝液(上記を参照のこと)を加えた。
7.洗浄
4回の最終洗浄ステップを行った(緩衝液QSB1、QSW5およびBR4、すべてのキアゲン(QIAGEN)を使用する)。
8.溶出および加熱変性
RNAを200μlのBR5(キアゲン(QIAGEN))を使用して溶出し、溶出された核酸を10分間加熱変性させた。
1:キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)−第1のバッチ
2:本発明による改変キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)−第1のバッチ
3:キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)−第2のバッチ
4:本発明による改変キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)−第2のバッチ
5:キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)−第3のバッチ
6:本発明による改変キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)−第3のバッチ
7:パックスジーン ブロッド RNA(PAXgene Blood RNA)(IVD)
図4は、本発明の方法に従って処理される試料が、種々のバッチ間でのより長い待機時間にもかかわらず、一定の高い核酸収量を達成することを実証している。核酸収量は、かなり向上している。
1:キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)−第1のバッチ
2:本発明による改変キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)−第1のバッチ
3:キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)−第2のバッチ
4:本発明による改変キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)−第2のバッチ
5:キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)−第3のバッチ
6:本発明による改変キアシンフォニー パックスジーン ブロッド RNA(QIAsymphony PAXgene Blood RNA)−第3のバッチ
7:パックスジーン ブロッド RNA(PAXgene Blood RNA)(IVD)
図6は、種々の試験プロトコルを用いて得られた溶出液を分析する際に、miScript(登録商標)プライマー(Primer)アッセイ(hsa−miR 30b)を用いて得られた平均CTを示す。確認できるように、この方法は、小さいRNAの良好な収量を達成しており、先行技術の方法と比較してかなり向上もしている。
実施例4
実施例4において、再懸濁中のEDTAの追加が、RNA収量に及ぼす効果をさらに分析した。場合によって、タンパク質分解化合物(プロテイナーゼK)を加えた。
− 280μlBR1(キアゲン(QIAGEN))、20μlプロテイナーゼK溶液(キアゲン(QIAGEN))および200μlのGITCを含有する緩衝液(BR2、キアゲン(QIAGEN))、
− 280μlBR1(キアゲン(QIAGEN))+10mM EDTA、20μlプロテイナーゼK溶液(キアゲン(QIAGEN))および200μlのGITCを含有する緩衝液(BR2、キアゲン(QIAGEN))、
− 280μlBR1(キアゲン(QIAGEN))+25mM EDTA、20μlプロテイナーゼK溶液(キアゲン(QIAGEN))および200μlのGITCを含有する緩衝液(BR2、キアゲン(QIAGEN))、
− 280μlBR1(キアゲン(QIAGEN))+50mM EDTA、20μlプロテイナーゼK溶液(キアゲン(QIAGEN))および200μlのGITCを含有する緩衝液(BR2、キアゲン(QIAGEN))、
− 280μlBR1(キアゲン(QIAGEN))+25mM EDTA、20μlプロテイナーゼK溶液(キアゲン(QIAGEN))および200μlのGITCを含有する緩衝液(BR2、キアゲン(QIAGEN))または300μlBR1(キアゲン(QIAGEN))+25mM(プロテイナーゼKなし)および200μlのGITCを含有する緩衝液(BR2、キアゲン(QIAGEN))
中でボルテックスすることによって再懸濁した。
実施例5
以上に説明されているように、再懸濁させた試料は、特にカオトロピック剤を再懸濁中に加える場合、より長い待機時間中に沈殿を形成する。沈殿した凝集体は、RNA−処理後、試験管に固着したままであり、それ故、精製手法中には含まれていない。結果として、後のバッチの血液試料は、より早いバッチからの試料に比べてより顕著な沈殿を示す。実施例5は、RNA収量を減少させる、沈殿形成および容器壁への付着が(上記を参照のこと)、容器の材質に関わりなく生じ、したがって、プラスチック管のみならずガラス管にも生じることを示している。
Claims (14)
- 試料から、核酸を単離するための方法であって、以下のステップ、
a)少なくとも1種の陽イオン性界面活性剤の使用によって、安定化されている試料を得るステップであって、前記陽イオン性界面活性剤が、前記核酸と複合体を形成しているステップ;
b)前記安定化されている試料由来の他の試料成分と一緒に前記複合体を得るステップであって、前記複合体が、単離されるべき前記核酸を含むステップ;
c)前記複合体を再懸濁させ、1種または複数の添加剤を、再懸濁前、再懸濁中および/または再懸濁後に加えることによって、少なくとも
i)単離されるべき前記核酸;
ii)少なくとも1種のカオトロピック剤;および
iii)少なくとも1種のキレート剤;
を含む、再懸濁させた試料を得るステップ、
ならびに
d)前記再懸濁させた試料から、核酸を単離するステップ、
を含み、
複数の試料がステップa)からステップc)に従って調製され、それによって、複数の再懸濁させた試料を得、前記再懸濁させた試料がバッチに分けられ、前記核酸がステップd)に従って前記バッチから単離され、ステップc)とd)との間の前記待機時間が、少なくとも2つのバッチ間で異なる、
方法。 - 前記再懸濁させた試料が、ステップc)とステップd)との間で、少なくとも0.2時間、待機状態である、請求項1に記載の方法。
- ステップc)において行われる前記再懸濁が、以下の特徴、
a)非カオトロピック塩を含む再懸濁溶液が加えられる;
b)前記キレート剤が、再懸濁前、再懸濁中または再懸濁後に加えられる;
c)前記キレート剤が、再懸濁溶液とは別個に加えられる;
d)前記キレート剤が、再懸濁溶液中に含まれる;
e)前記再懸濁させた試料が前記キレート剤を、0.5mMから75mMまで、1mMから50mMまで、2.5mMから25mMまでおよび5から15mMまでから選択される濃度で含むような濃度で、前記キレート剤が加えられる;
f)前記キレート剤が、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、エチレンジニトリロ四酢酸(EDTA)、エチレングリコール四酢酸(EGTA)およびN,N−ビス(カルボキシメチル)グリシン(NTA)からなる群から選択される、および/または
g)少なくとも1種の添加剤が、再懸濁前、再懸濁中および/または再懸濁後に加えられ、前記添加剤が、カオトロピック剤、タンパク質分解化合物および緩衝剤からなる群から選択され、それによって前記再懸濁させた試料中に含まれる、
のうちの1つまたは複数を有する、請求項1または2に記載の方法。 - 前記再懸濁させた試料中に存在する前記キレート剤が、
a)沈殿した試料の、前記試料を含む容器への結合を減少させる;
b)前記単離された核酸の収量を増加させる;および/または
c)ステップc)とd)との間の待機時間が異なることに起因する、前記核酸単離の効率および/または量における変動を減少させる、
請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記再懸濁させた試料中に含まれる前記カオトロピック剤に関して、以下の特徴、
a)前記再懸濁させた試料中の前記カオトロピック剤の濃度が、0.1Mから4Mまで、0.5Mから3Mまでおよび0.75Mから2.5Mまでからなる群から選択され;
b)前記カオトロピック剤が、ステップc)において、別個の溶液の形で加えられる;
c)前記カオトロピック剤が、ステップc)において、前記複合体の再懸濁後に加えられ、それによって前記再懸濁させた試料中に含まれる;および/または
d)ステップc)において存在する前記カオトロピック剤が、カオトロピック塩、グアニジン塩酸塩、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジンイソチオシアン酸塩、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウム、トリフルオロ酢酸ナトリウム、尿素からなる群から選択され、
のうちの1つまたは複数を有する、請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。 - タンパク質分解化合物が、ステップc)において加えられる、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- ステップc)において加えられる前記タンパク質分解化合物に関して、以下の特徴、
a)前記タンパク質分解化合物が、タンパク質分解酵素である;および/または
b)前記タンパク質分解化合物が、プロテイナーゼ、プロテアーゼ、スブチリシンおよびサブチラーゼからなる群から選択されるタンパク質分解酵素である、
のうちの1つまたは複数を有する、請求項6に記載の方法。 - ステップc)が、
aa)非カオトロピック塩およびキレート剤を含み、カオトロピック剤を含まない再懸濁溶液が加えられ、前記複合体が再懸濁されること、
bb)カオトロピック剤が、前記複合体の再懸濁後に加えられ、それによって前記再懸濁させた試料中に含まれるようになること、
cc)場合によって、タンパク質分解酵素が、前記複合体の再懸濁後に加えられ、それによって前記再懸濁させた試料中に含まれること、
を含む、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。 - ステップd)において行われる前記単離が、以下のステップ、
i)前記再懸濁させた試料を、タンパク質分解酵素の存在下で加熱および/または撹拌することによって、前記再懸濁させた試料を消化するおよび/または変性させるステップ;
ii)適切な結合条件を使用して、前記核酸を固相に結合させるステップ、ならびに
iii)場合によって、前記核酸を洗浄するステップ;
iv)場合によって、前記核酸を溶出するステップ、
を含む、請求項1から8のいずれか1項に記載の方法。 - 前記試料が血液試料であり、ステップa)において、前記血液試料を、
i)一般式:
Y+R1R2R3R4X-
の陽イオン性(cationic)化合物
[式中、Yは、窒素またはリンを表し、
R1R2R3およびR4は、独立して、分枝または非分枝のC1〜C20−アルキル基、C6〜C20-アリール基および/またはC6〜C26アラルキル基を表し、
X-は、無機または有機の、一塩基酸または多塩基酸の陰イオン(anion)を表す]およびii)少なくとも1つのプロトン供与体、
を含む、安定化させる組成物と接触させることによって、前記血液試料が安定化される、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。 - 前記試料が血液試料であり、ステップa)において、前記血液試料を、
(i)下記式(2)
R1R2R3N(O)x (2)
[式中、
R1およびR2は、それぞれ独立して、H、C1〜C6アルキル残基、C6〜C12アリール残基またはC6〜C12アラルキル残基であり、
R3は、C1〜C20アルキル基、C6〜C26アリール残基またはC6〜C26アラルキル残基であり、
Xは、0および1の整数である]
を有するアミノ界面活性剤および
(ii)酸または酸性塩、
を含む、安定化させる組成物と接触させることによって、前記血液試料が安定化される、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。 - 以下の特徴、
a)前記核酸がRNAである;
b)ステップd)が、自動化システムを使用して行われる;
c)複数の試料が、ステップc)まで手動で処理され、それによって、複数の再懸濁させた試料を得;
d)ステップd)において、前記再懸濁させた試料が、前記核酸を単離するための自動化システムを使用して処理される;
e)少なくともRNAが、少なくともRNAおよびDNAを含む試料から単離され、単離ステップd)が、以下のステップ、
− タンパク質分解酵素を含む前記再懸濁させた試料を得るステップおよび前記再懸濁させた試料の消化を続けるステップ;および、
− DNAを第1の固相に結合させ、前記第1の固相に結合された前記DNAを、前記RNAを含む残りの試料から分離することによって、前記再懸濁および消化された試料から少なくとも一部の前記DNAを除去するステップ、
− 少なくとも1種のカオトロピック剤および30%v/v以上の濃度の少なくとも1種のアルコールが、このRNA結合ステップ中に使用される、RNAを第2の固相に結合させるステップ、
− 場合によって、前記第2の固相に結合されているRNAを洗浄するために、少なくとも1つの洗浄ステップを行うステップ、
− 場合によって、DNase消化および/またはタンパク質分解酵素を使用した消化を行うステップ、
− 場合によって、前記RNAを溶出するステップ、および/または
f)再懸濁させた試料を、少なくとも5分間、室温を超える温度でインキュベートすることによって、再懸濁させた試料の消化を続けるステップ、
を含む、のうちの1つまたは複数を有する、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。 - 以下のステップ、
a)少なくとも1種の陽イオン性界面活性剤の使用によって、安定化されている試料を得るステップであって、前記陽イオン性界面活性剤が、前記核酸と複合体を形成しているステップ;
b)場合によって、前記安定化されている試料由来の他の試料成分と一緒に前記複合体を得るステップであって、前記複合体が、単離されるべき前記核酸を含むステップ;
c)前記複合体を再懸濁させ、場合によって、1種または複数の添加剤を、再懸濁前、再懸濁中および/または再懸濁後に加えるステップであって、ステップc)が、
aa)非カオトロピック塩およびキレート剤を含む再懸濁溶液を加えることであって、前記再懸濁溶液が、カオトロピック剤を含まないこと、ならびに前記複合体を再懸濁すること、
bb)カオトロピック剤を、前記複合体の再懸濁後に加えること、
cc)場合によって、タンパク質分解酵素を、前記複合体の再懸濁後に加えること、
それによって、少なくとも
i)単離されるべき前記核酸;
ii)少なくとも1種のカオトロピック剤;および
iii)少なくとも1種のキレート剤;および
iv)場合によって、タンパク質分解酵素;
を含む再懸濁させた試料を得ること、
を含むステップ、
ならびに
d)前記再懸濁させた試料からRNAを単離するステップ、
を含み、
複数の試料がステップa)からステップc)に従って調製され、それによって、複数の再懸濁させた試料を得、前記再懸濁させた試料がバッチに分けられ、前記核酸がステップd)に従って前記バッチから単離され、ステップc)とd)との間の前記待機時間が、少なくとも2つのバッチ間で異なる、血液試料からRNAを単離するための、請求項1から12のいずれか1項に記載の方法。 - 次の特性の一つまたは複数を有する、請求項13に記載の方法。
a)前記RNAが請求項12に記載の特徴に従って単離される;
b)磁性シリカ粒子が前記RNAと結合するために固相として使用される;
及び/または
c)自動化システムがRNAの単離のために使用される;
d)前記複合体の再懸濁後にタンパク質分解酵素を加えることで少なくとも次のi)〜iv)を含む再懸濁させた試料を得る
i)前記単離された核酸;
ii)少なくとも一つのカオトロピック試薬;及び
iii)少なくとも一つのキレート試薬;及び
iv)タンパク質分解酵素
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