JP2012135317A5

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Publication number: JP2012135317A5
Application number: JP2012038487A
Authority: JP
Filing date: 2012-02-24
Publication date: 2014-08-28

Description

適切な対イオンＸ^-には、ハロゲン化水素酸のすべてのアニオン、または酢酸塩もしくはシュウ酸塩、マロン酸塩もしくはコハク酸塩などの一塩基または二塩基有機酸のアニオンやクエン酸のアニオンが含まれることが好ましい。

無機酸およびその塩を、本発明に従って、更なる添加剤として使用することもできる。リン酸もしくは硫酸のような無機酸のアルカリ金属との塩又はアンモニウムとの塩を使用することが好ましい。リン酸および硫酸アンモニウムを使用することが最も好ましい。

ＲＮＡ、特に細胞中のｍＲＮＡを分析することによって、遺伝子の活性を直接決定することが可能である。分子生物学の最新方法、例えば実時間逆転写酵素ＰＣＲまたは遺伝子発現チップ分析による、細胞における転写パターン（ｍＲＮＡパターン）の定量分析によって、例えば異常に発現した遺伝子を検出し、それによって、代謝異常、感染、または癌の発生を検出することが可能となる。例えば、ＰＣＲ、ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ、ＳＮＰもしくはシークエンシングなどの分子生物学的方法による、細胞からのＤＮＡの分析によって、例えば遺伝的欠陥を検出すること、またはＨＬＡタイプおよび他の遺伝標識を決定することが可能となる。

従来技術では、凝固点を超える温度でＲＮＡを保存するための、硫酸アンモニウムの使用もまた記述されている［ＷＯ００／０６７８０］。この種の組成物は、ＲＮＡｌａｔｅｒの名称で従来技術に従って使用されている。しかしながら、この種の硫酸アンモニウム水溶液は、血液、血漿または血清中のＲＮＡを安定化するのには適していない。上記のサンプルは高いタンパク質濃度を有するため、この種のアンモニウム塩溶液と接触するとすぐに、限られた溶解度の沈殿物が形成する［ＭｅｓｓｒｓＡｍｂｉｏｎ（アメリカ、テキサス州オースティン）からのＲＮＡｌａｔｅｒ製品の情報］。

そこで、本発明の目的は、組織または血液、血漿または血清の存在下にてＲＮＡを安定化する組成物を提供することである。

驚くべきことに、特に米国特許第５０１０１８３号および同第５３００６３５号に開示されており、かつ本発明に従って上述の１種または複数種の添加剤と組み合わせられる化合物などのカチオン化合物と、生物サンプルの核酸を接触させた場合に、長時間にわたり核酸を安定化することができることが現在見出されている。本発明に従って問題を解決するのに適切な好ましい添加剤を表１に示す：

添加剤は、様々な濃度で安定化試薬中に存在することができる；例えば、添加剤は、安定化溶液と血液との混合物中に、容積比１：１、好ましくは３：１、濃度５０ｍＭ〜飽和、好ましくは１００ｍＭ〜１Ｍ、最も好ましくは２００〜５００ｍＭで存在することができる。添加剤の性質に応じて、他の濃度範囲が有利であることが証明される。異なる添加剤の組み合わせを使用することも可能である。

生物サンプルから核酸を精製するために、遊離核酸または核酸を含有する細胞もしくは粒子を、例えば遠心分離または濾過によって溶液の残りから分離し、米国特許第５，０１０，１８３号、同第５，３００，６３５号および欧州特許出願第９９１０３４５７．０号に記載されているように、少量で有利に行うことができる更なる精製にかける。

例えば時間に対してｈなど、ここに列挙していない略語は、当業者にはよく知られているか、あるいは従来技術におけるそれらの使用から十分によく知られているだろう。
それらが基づく図および実験の説明
図１は、異なるｐＨレベルを有する様々なカルボン酸バッファー中のテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウム（ＴＴＡＯｘ）による、血液中のＲＮＡの安定化を示す。
図２は、様々な濃度の酒石酸（ｐＨ３）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる全血中のＲＮＡの安定化を示す。
図３は、２５０ｍＭ酒石酸（ｐＨ３）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる全血中のＲＮＡの安定化を示す。
図４は、ＧＡＰＤＨ遺伝子（Ａ）およびＩＦＮ−γ遺伝子（Ｂ）のｍＲＮＡの放射標識プローブとのノーザンハイブリダイゼーションの結果として、酒石酸（ｐＨ３．７）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる全血中のＲＮＡの安定化を示す。
図５は、酒石酸（ｐＨ３．７）で緩衝したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血液中のＤＮＡの安定化を示す。
細胞ＲＮＡの他に、白血球由来のゲノムＤＮＡもまた、ここで開発された方法によって安定化し、次いでシリカ膜に結合させることによって単離することができる。図５は、７２時間保存した後でさえ、高分子ＤＮＡ（長さ＞２０ｋＢ）が単離されることを示している。
図６は、ゲノムＤＮＡを酵素反応に使用した場合の結果を示す。２４時間または７２時間保存した後に単離したＤＮＡ（実施例５を参照のこと）を様々な酵素反応に使用する。
Ａ．制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｅ）またはＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）６Ｕを使用して、ＤＮＡ２μｇを３７℃にて３時間切断し、次いで０．８％アガロース／ＴＢＥゲル上で分離する。いずれの場合も対照として、未切断のＤＮＡを適用する。
Ｂ．ゲノムＤＮＡのアリコート１５０ｎｇおよび３００ｎｇをＰＣＲ反応に使用する（総容積５０μｌ）。その反応では、ｈｕｇｌ（巨大な幼虫のヒトホモローグ）遺伝子の長さ１．１ｋＢ断片を増幅する。そのＰＣＲ産物を１．２％アガロース／ＴＢＥゲル上で分離する。
図７は、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血漿中のＲＮＡの安定化を示す。サンプルはすべて、二重測定で調製する：溶出液のアリコート３０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表２に示す。
図８は、酒石酸またはタルトロン酸と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血漿中のＲＮＡの様々な期間にわたる安定化を示す。
サンプルはすべて、二重測定で調製する：溶出液のアリコート３０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表３に示す。
図９は、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる血漿１ｍｌ中のＲＮＡの安定化を示す。
サンプルはすべて、二重測定で調製する：溶出液のアリコート３０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表４に示す。
図１０は、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによるＬｅＬａ細胞中のＲＮＡの安定化を示す。
サンプルは、二重測定で調製し、サンプル１４、４０、６６および９２は一重測定で調製する：溶出液のアリコート２０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表５に示す。
図１１は、異なる量のＨｅＬａ細胞中のＲＮＡの安定化を示す。サンプルはすべて、二重測定で調製する：溶出液のアリコート２０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表７に示す。
図１２は、マクロファージ中のＲＮＡの安定化を示す。サンプルはすべて、二重測定で調製する：溶出液のアリコート２０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表９に示す。
図１３は、培養液を除去しない、Ｈｅｌａ付着細胞中のＲＮＡの安定化を示す。溶出液のアリコート２０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表１３に示す。
図１４は、様々な添加剤と混合したテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムによる腎組織中のＲＮＡの安定化を示す。
サンプルはすべて、二重測定で調製する：溶出液のアリコート２０μｌを１％アガロース−ホルムアルデヒド−ＭＯＰＳゲルで分離する。問題のサンプルを表１２に示す。
図１５は、ＲＮＡの安定化および単離と同様な、ＤＮＡの安定化および単離を示す。溶出液のアリコート４０μｌを０．８％アガロース−ＴＢＥゲルで分離する。問題のサンプルは実施例１５に記述する。

この実験に使用する溶液を調製するために、３０％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムの原液を、０．５Ｍ酒石酸（ｐＨ３または４）またはタルトロン酸（ｐＨ３または４）またはリン酸（ｐＨ３または４）の原液と混合して、４％テトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムおよび２００ｍＭ添加剤の最終濃度とする。
このように調製したすべての溶液のアリコート１ｍｌを２ｍｌエッペンドルフチューブに入れる。例えば、市販のＲＮＡ単離キット（例えば、ＱＩＡＧＥＮ社によりＲＮＡ単離キットとして市販のＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍａｘｉ−Ｋｉｔｓ）を用いて予め単離された、ＨｅＬａ細胞由来の全ＲＮＡ１５μｇをエッペンドルフチューブの蓋にピペッティングする。ヒト血漿１ｍｌをその溶液に添加し、チューブの蓋を閉め、チューブを迅速に５回反転して液体を混合する。そのサンプルを室温（約２０〜２５℃）で３日間保存する。すべての実験を二重測定で行う。

保存後、サンプルを１００００×ｇで３分間遠心分離し、上清を除去する。例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＴＬバッファーなどの標準市販のイソチオシアン酸グアニジウムバッファー６００μｌ中に、ボルテックスすることによってペレットを溶解する。次いで、７０％エタノール１容積（６００μｌ）を添加し、繰り返しピペットで取り、移すことによって、または約５秒間にわたりボルテックスすることによって、成分を混合する。次いで、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＲＮｅａｓｙカラムなどのシリカ膜を含有する標準市販のスピンカラムにライセートを適用し、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。ＲＮＡはその膜に結合した状態であり、次いで、実施例１４に記載のように単離することができる。スルーフロー（ｔｈｒｏｕｇｈｆｌｏｗ）（約１２００μｌ）を回収し、１００％エタノール２００μｌと合わせて、ボルテックスすることによって混合する。これらのサンプルを再度、例えばＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡａｍｐカラムなどのシリカ膜を含有する標準市販のスピンカラムに適用し、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。ＤＮＡは膜に結合した状態であり、次いで、標準市販のイソチオシアン酸グアニジウム含有第１洗浄バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＲＷ１で洗浄し、次いでアルコール含有第２洗浄バッファー、例えばＱＩＡＧＥＮ社製バッファーＲＰＥで洗浄する。洗浄バッファーをそれぞれ、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通す。アルコール含有第２洗浄バッファーでの洗浄を少量で繰り返し、遠心することによって（最大２分の回転数、この場合では２００００×ｇ）膜を同時に乾燥させる。溶出液については、膜から精製ＤＮＡを引き離すために、水２００μｌを膜上にピペッティングし、室温で１分間インキュベートする。その溶出液を、遠心することによって（１００００×ｇで１分）膜に通し、溶出段階をもう一度繰り返し、溶出を完了する。

単離されたＤＮＡを、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル上で分析する。これを行うために、例えば、０．８％アガロース−ＴＢＥゲルを調製する。サンプル１〜４のアリコート４０μｌを使用し、サンプル５〜９のアリコート２０μｌを使用する。その結果を図１５に示す。

レーン１および２は、実施例１５に従って単離した全ＤＮＡを表す。レーン３および４は、参照としての全ＤＮＡ０．１μｇおよび０．５μｇをそれぞれ表し、使用したアガロースゲルにおいてインタクトなゲノムＤＮＡの流れ特性を示している。レーン５は、予め保存することなく、市販の単離キット（ＭｅｓｓｒｓＱＩＡＧＥＮＧｍｂＨのＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＭｉｎｉＫｉｔｓ）を用いて、凍結ラット腎臓１０ｍｇから単離した全ＤＮＡを表している（＝ポジティブコントロール）。使用したネガティブコントロールは、１日保存した後、溶媒を添加していない、つまり乾いた腎臓組織、または蒸留水中の腎臓組織１０ｍｇから、ＱＩＡＧＥＮ社製ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＭｉｎｉＫｉｔｓを用いて単離された全ＤＮＡであった。このＤＮＡは、レーン６および７（乾燥保存）において、かつレーン８および９（Ａ．ｄｅｓｔ中で保存）において示される。

Claims

（分割出願）
生物材料中の核酸を安定化するための核酸保存安定化組成物であって、
一般式：
Ｙ⁺Ｒ₁Ｒ₂Ｒ₃Ｒ₄Ｘ^-
（式中、Ｙは、窒素またはリンを示し、
Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は互いに独立して、分枝もしくは非分枝Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル基またはＣ₆〜Ｃ₂₀アリール基またはＣ₆〜Ｃ₂₆アラルキル基を示し、
Ｘ^-は、無機もしくは有機の一塩基酸または多塩基酸のアニオンを示す）で示されるカチオン化合物と、
有機酸から選ばれる少なくとも１種類のプロトン供与体と、を含有する組成物。
生物材料中の核酸を安定化するための核酸保存安定化組成物であって、
一般式：
Ｙ⁺Ｒ₁Ｒ₂Ｒ₃Ｒ₄Ｘ^-
（式中、Ｙは、窒素またはリンを示し、
Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃およびＲ₄は互いに独立して、分枝もしくは非分枝Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル基またはＣ₆〜Ｃ₂₀アリール基またはＣ₆〜Ｃ₂₆アラルキル基を示し、
Ｘ^-は、無機もしくは有機の一塩基酸または多塩基酸のアニオンを示す）で示されるカチオン化合物と、
リン酸もしくは硫酸、およびリン酸もしくは硫酸のアルカリ金属塩またはリン酸もしくは硫酸のアンモニウム塩からなる群より選ばれる少なくとも１種類のプロトン供与体と、を含有し、
前記プロトン供与体が硫酸のアンモニウム塩のときは濃度５０ｍＭ〜５００ｍＭで存在する組成物。
Ｙが窒素を示すことを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
Ｒ ₁ が、炭素原子１２個、１４個、もしくは１６個を有する高級アルキル基を示し、かつＲ ₂ 、Ｒ ₃ およびＲ ₄ がいずれの場合も、メチル基を示すことを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
アニオンＸ ^- が、ハロゲン化水素酸のアニオンまたは一塩基もしくは二塩基有機酸もしくはクエン酸のアニオンから選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
前記アニオンＸ ^- が、臭化物、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩またはクエン酸塩を含む群のアニオンから選択されることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
前記プロトン供与体が、飽和脂肪族モノカルボン酸、不飽和アルケニル−カルボン酸、飽和および／または不飽和脂肪族Ｃ ₂ 〜Ｃ ₆ ジカルボン酸、脂肪族ケトカルボン酸またはアミノ酸の中から、単独でまたは組み合わせて選択されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
Ｃ ₁ 〜Ｃ ₆ アルキルカルボン酸、ｎ−オクタン酸、ｎ−デカン酸、またはｎ−ドデカン酸（ラウリン酸）または前述の酸の混合物が、前記脂肪族モノカルボン酸として使用されることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
アクリル酸（プロペン酸）、メタクリル酸、クロトン酸、イソクロトン酸およびビニル酢酸または前述の酸の混合物が、脂肪族アルケニル−カルボン酸として使用されることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸またはアジピン酸または前述の酸の混合物の中から選択されるジカルボン酸が、飽和脂肪族Ｃ ₂ 〜Ｃ ₆ ジカルボン酸として使用されることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
脂肪族ジカルボン酸、または前述の酸の混合物が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
脂肪族ヒドロキシ−ジ−およびトリ−カルボン酸、または前述の酸の混合物が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
不飽和ジカルボン酸、または前述の酸の混合物が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
不飽和トリカルボン酸、またはこれらの酸の混合物が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
脂肪族ケトジカルボン酸、または前述の酸の混合物が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
アミノ酸、または前述の酸の混合物が、プロトン供与体として使用されることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
それが水溶液中に存在することを特徴とする、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
前記カチオン化合物が、０．０１重量％から飽和の範囲の濃度であることを特徴とする、請求項１７に記載の組成物。
前記の個々の成分が任意に、水溶液中で合わされ、かつ混合されることを特徴とする、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物のうちの１種類を調製する方法。
核酸を単離かつ／または安定化するための、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
核酸として、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が安定化されることを特徴とする、請求項２０に記載の使用。
核酸として、ヌクレオチドモノマー、オリゴマー、プラスミドの形で、ウイルスおよび／または細菌ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびに動物および植物細胞または他の真核生物由来のゲノムおよび非ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの形で、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が安定化されることを特徴とする、請求項２１に記載の使用。
核酸として、処理および未処理状態のｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｃＤＮＡが安定化されることを特徴とする、請求項２２に記載の使用。
請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物を含有する診断用組成物。
請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物を含む、核酸を安定化するためのキット。
任意に他の賦形剤と共に、核酸を含む生物サンプルと、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組成物とを含有する混合物。
前記混合物のｐＨが、２〜１２の範囲であることを特徴とする、請求項２６に記載の混合物。
ウイルスまたは細菌を含んでもよい前記生物サンプルが、血液、血漿または血清であることを特徴とする、請求項２６に記載の混合物。
前記混合物のｐＨが、２〜６の範囲であることを特徴とする、請求項２８に記載の混合物。
ウイルスまたは細菌を含んでもよい前記生物サンプルが、吸引液、細胞、組織または細菌の形をとることを特徴とする、請求項２６に記載の混合物。
前記混合物のｐＨが、３〜１０の範囲であることを特徴とする、請求項３０に記載の混合物。