WO2023106189A1 - 核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤 - Google Patents

核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤 Download PDF

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WO2023106189A1
WO2023106189A1 PCT/JP2022/044333 JP2022044333W WO2023106189A1 WO 2023106189 A1 WO2023106189 A1 WO 2023106189A1 JP 2022044333 W JP2022044333 W JP 2022044333W WO 2023106189 A1 WO2023106189 A1 WO 2023106189A1
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WO
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structural unit
value
allylamine
group
nucleic acid
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Application number
PCT/JP2022/044333
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
尚宏 藤村
亜美 橘
智朗 内木
実 竹内
洋子 照内
晃司 渡邉
Original Assignee
日東紡績株式会社
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity

Definitions

  • the present invention relates to an agent for elevating the melting temperature (Tm value) of nucleic acids (hereinafter sometimes referred to as an agent for elevating the Tm value). More specifically, it relates to an agent for increasing the melting temperature (Tm value) of a nucleic acid (particularly a double-stranded nucleic acid) containing a (di)allylamine compound having a specific structure.
  • Nucleic acids are subjected to molecular biological analysis and used as active ingredients of therapeutic drugs in many fields such as the medical field, food field, agriculture or fishery field, and environmental analysis, but there are problems associated therewith.
  • One is to stabilize the nucleic acids in the sample.
  • Conventionally, as an attempt to stabilize nucleic acids it has been proposed to stabilize nucleic acids using, for example, a mixture of ethanol and acetone, ammonium sulfate, or tetradecyltrimethylammonium oxalate (see, for example, Patent Documents 1).
  • genomic nucleic acids are being detected in order to identify specific bacteria and viruses, and to determine disease susceptibility and drug responsiveness in humans.
  • One of the means is the use of the melting temperature (Tm value) of nucleic acids.
  • the melting temperature (Tm value) refers to the temperature at which 50% of a double-stranded nucleic acid is denatured into a single strand.
  • Tm value refers to the temperature at which 50% of a double-stranded nucleic acid is denatured into a single strand.
  • a double strand that is not in a completely complementary relationship has a lower melting temperature (Tm value). Therefore, such a phenomenon can be used to detect mutations of sample nucleic acids with respect to reference nucleic acids, or to detect target sequences through differences in nucleic acid amplification efficiency caused by this phenomenon.
  • the change in melting temperature (Tm value) caused by a single base mismatch is said to be about 1 to 3°C. , it is necessary to devise ways to increase the sensitivity.
  • Non-Patent Document 1 if it becomes possible to design primers with reduced dependence on GC content, flexible primer design will become possible.
  • Patent Document 2 a method has been developed that enables the detection of slight mutations by analyzing the melting curve.
  • this method requires a highly accurate constant temperature device capable of strict temperature control, and a practically simpler method is desired. It also does not address the issue of primer design dependent on GC content.
  • This cationic polymer is a polymer obtained by graft polymerizing a cationic polymer such as polylysine or polyarginine as a main chain and dextran or polyethylene glycol as a side chain.
  • Patent Document 3 shows the difference in Tm values of nucleic acid molecules having single nucleotide mutations in the presence and absence of this cationic polymer.
  • the increase in Tm due to the addition of this cationic polymer is 15° C. or less for 20-mer DNA, and the method of detecting mutations using the Tm value cannot sufficiently improve the detection sensitivity.
  • the annealing temperature cannot be raised sufficiently.
  • JP 2015-212273 A Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-58107 WO03/018841A1 JP-A-2001-78769 JP-A-2008-278779
  • An object of the present invention is to provide a novel agent for increasing the melting temperature (Tm value) of nucleic acids that can address the problems in the prior art as described above.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising the nucleic acid-increasing agent for Tm value together with the nucleic acid.
  • the present inventors found that when a specific (di)allylamine-based compound satisfying a specific relationship between a numerical value calculated from specific parameters related to the chemical structure and the molecular weight M is added to a nucleic acid solution, nucleic acid
  • Tm value melting temperature
  • the present invention provides, as one embodiment, the following nucleic acid melting temperature (Tm value) elevating agent.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a hydroxyl group, a cycloalkyl group having 5 to 10 carbon atoms, or an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms.
  • An agent for increasing the melting temperature (Tm value) of nucleic acids comprising a (di)allylamine-based compound having a relationship that satisfies the following formula (2).
  • n represents the number of structural unit species constituting the (di)allylamine compound
  • mi represents the molar ratio of structural unit i
  • aij represents the j-class amine (or ammonium salt)
  • o i indicates the number of carbonyl groups in structural unit i
  • s i indicates the number of sulfonyl groups in structural unit i).
  • the present invention also provides other embodiments described in [2] to [19] below.
  • [2] The agent for increasing the melting temperature (Tm value) of nucleic acid according to [1], which contains a (di)allylamine compound in which the P and M satisfy the following formula (3).
  • [3] The agent for increasing the melting temperature (Tm value) of nucleic acid according to [1], which contains a (di)allylamine compound in which the P and M satisfy the following formula (4).
  • [5] The agent for increasing the melting temperature (Tm value) of nucleic acid according to any one of [1] to [4], wherein the nucleic acid is DNA.
  • a method for stabilizing nucleic acids comprising adding the agent for increasing the melting temperature (Tm value) of nucleic acids according to any one of [1] to [5] to an aqueous solution containing nucleic acids.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a hydroxyl group, a cycloalkyl group having 5 to 10 carbon atoms, or an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms.
  • n represents the number of structural unit species constituting the (di)allylamine compound
  • mi represents the molar ratio of structural unit i
  • aij represents the j-class amine (or ammonium salt)
  • o i indicates the number of carbonyl groups in structural unit i
  • s i indicates the number of sulfonyl groups in structural unit i.
  • Tm value melting temperature
  • n represents the number of structural unit species constituting the (di)allylamine compound
  • mi represents the molar ratio of structural unit i
  • aij represents the j-class amine (or ammonium salt)
  • o i indicates the number of carbonyl groups in structural unit i
  • s i indicates the number of sulfonyl groups in structural unit i.
  • the agent for increasing the Tm value of nucleic acids of the present invention significantly increases the Tm value of nucleic acids by containing the (di)allylamine compound having the specific structure described above. Utilizing this, it is expected that mutations in genomic nucleic acids can be detected with higher sensitivity. Moreover, it is expected to stabilize the nucleic acid by adding it to a composition containing the nucleic acid.
  • the “melting temperature (Tm value)” means the temperature at which 50% of the double-stranded nucleic acid is denatured into single strands.
  • Tm value means the temperature at which 50% of the double-stranded nucleic acid is denatured into single strands.
  • 40 ° C. (However, if the Tm value cannot be measured when the temperature is raised from 40 ° C., or 10 ° C. when the Tm value is less than 50 ° C.), the temperature rises by 0.3 ° C. to 95 ° C.
  • a double-strand melting curve is prepared by measuring the fluorescence intensity every time, and the Tm value is obtained from the double-strand melting curve by a differential method.
  • the agent for increasing the Tm value of nucleic acids of the present invention is a (di)allylamine-based compound having a (di)allylamine-based constitutional unit of a specific structure, wherein parameters calculated from its chemical structure and its molecular weight M are specified Including those that satisfy the relationship (hereinafter also referred to as "specific compounds").
  • the agent for increasing the Tm value of a nucleic acid of the present invention may be composed only of the specific compound, or may contain other components in addition to the specific compound.
  • the specific compound has a (di)allylamine-based structural unit with a specific structure as described above, and is a (co)polymer having a plurality of (di)allylamine-based structural units (hereinafter referred to as "specific (co- ) polymer”), or a monomer having a single (di)allylamine-based structural unit (hereinafter also referred to as “specific monomer”).
  • a diallylamine (co)polymer (specific (co)polymer) having a plurality of (di)allylamine structural units is preferable from the viewpoint of storage stability, Tm value increasing effect, and the like.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a hydroxyl group, a cycloalkyl group having 5 to 10 carbon atoms, or an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms.
  • a structural unit (A1) having a structure represented by or a structure that is an acid addition salt thereof, general formula (Id) or general formula (Ie) (wherein R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms which may have a hydroxyl group, a cycloalkyl group having 5 to 20 carbon atoms, or a is an aralkyl group, X a- represents a counter ion, and a represents the valence of the counter ion.), and
  • n represents the number of structural unit species constituting the (co)polymer
  • mi represents the molar ratio of structural unit i
  • aij represents j-class amine (or ammonium salt) in structural unit i
  • o i indicates the number of carbonyl groups in structural unit i
  • s i indicates the number of sulfonyl groups in structural unit i.
  • the "j-class amine” is calculated as an apparent "j-class amine”.
  • the "carbonyl group” is calculated to correspond to the "carbonyl group” apparently.
  • the nitrogen atom in the amide group is calculated as a primary amine
  • the oxygen atom in the amide group is calculated as one carbonyl group.
  • the molar ratio of each structural unit constituting the copolymer is determined by reconstituting the copolymer with an organic solvent such as isopropyl alcohol or acetone when the structure of the structural unit constituting the copolymer is known. Sedimentation and reprecipitation are analyzed using a Perkin Elmer 2400II CHNS/O fully automatic elemental analyzer or an apparatus with equivalent performance in an appropriate mode according to the structure of the structural units constituting the copolymer.
  • helium gas is used as a carrier gas, and a solid sample is weighed into a tin capsule, dropped into a combustion tube, and burned at a combustion temperature of 1800°C or higher in pure oxygen gas. It can be performed by detecting each measurement component by a frontal chromatography method using a device and quantifying the content of each element using a calibration factor. Further, when the structures of the cationic constitutional units and the anionic constitutional units in the copolymer are unknown, the above Identify the structure of the constituent units that make up the copolymer. It can also be calculated from the amount of each monomer supplied in the production (copolymerization) of the copolymer and the amount of each monomer remaining without being incorporated into the copolymer.
  • the ratio (molar ratio) of the structural units derived from each monomer in the copolymer is almost the same as the charged composition (molar ratio) of each structural unit, the monomer blending is used herein for convenience. The ratio is sometimes treated as the proportion (molar ratio) of the constituent units.
  • the specific (co)polymer used in the present invention has a (di)allylamine structural unit of a specific structure (hereinafter also referred to as "(di)allylamine structural unit ( ⁇ )").
  • the specific (co)polymer may be composed only of the (di)allylamine-based structural unit ( ⁇ ), or may have a structural unit other than the (di)allylamine-based structural unit ( ⁇ ).
  • Examples of structural units other than the (di)allylamine-based structural unit ( ⁇ ) include various cationic structural units other than the (di)allylamine-based structural unit ( ⁇ ), various nonionic structural units, and various anionic structural units. can be done.
  • the ratio of the (di)allylamine-based constitutional units of the specific structure to the total constitutional units of the specific (co)polymer is not particularly limited, but is usually 40 mol% or more, preferably 50 to 100 mol%. more preferably 70 to 100 mol %, particularly preferably 80 to 100 mol %.
  • the (di)allylamine-based structural unit ( ⁇ ) and the nonionic structural unit are the total of the specific structure (di )
  • the ratio of the allylamine-based structural units to the total structural units of the specific (co)polymer is usually 50 mol% or more, preferably 70 to 100 mol%, more preferably 80 to 100 mol%, Particularly preferably, it is 90 to 100 mol %.
  • the (di)allylamine-based structural unit ( ⁇ ) constituting the specific (co)polymer used in the present invention includes the following structural unit (A1), structural unit (B1), and structural unit ( It is at least one cationic constitutional unit selected from the group consisting of C1).
  • the specific (co)polymer may contain only one type of (di)allylamine-based structural unit ( ⁇ ), or may contain two or more types of (di)allylamine-based structural unit ( ⁇ ). When two or more types of (di)allylamine-based structural units ( ⁇ ) are included, the two or more types of (di)allylamine-based structural units ( ⁇ ) are two or more types of constituents that are both classified as structural units (A1).
  • each of the structural units (A1) to (C1) that can constitute the specific (co)polymer has an amino group. It preferably has a primary, tertiary or quaternary amino group, more preferably a tertiary or quaternary amino group, and particularly preferably a quaternary amino group. From this point of view, the specific (co)polymer preferably has at least one (di)allylamine-based structural unit ( ⁇ ) corresponding to the structural unit (B1).
  • the structural unit (A1) is a structural unit having a structure represented by the following general formula (Ia) or general formula (Ib), or a structure that is an acid addition salt thereof.
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a hydroxyl group, a cycloalkyl group having 5 to 10 carbon atoms, or an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms.
  • R 1 is preferably an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a hydroxyl group, a cycloalkyl group having 5 to 10 carbon atoms, or an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms.
  • At least a part of the structural unit (A1) preferably has a tertiary amino group from the viewpoint of increasing the value of the chemical structure parameter P.
  • the proportion of those having a tertiary amino group in all structural units (A1) is preferably 50 mol% or more, more preferably 70 to 100 mol%, and 90 to 100 mol%. is more preferable.
  • the structural unit (A1) has a structure that is an inorganic acid salt or an organic acid salt of the structure represented by the above structural formula (Ia) or (Ib), that is, a structure that is an acid addition salt.
  • a diallylamine monomer having an addition salt in the production of the specific (co)polymer from the viewpoint of production cost.
  • a process for removing an addition salt such as HCl from a polymer is complicated and causes an increase in cost. Therefore, an addition salt-type structural unit (A1) that can be produced without such a process. is a preferred embodiment from the viewpoint of cost and the like.
  • the inorganic acid salt or organic acid salt in the structural unit (A1) of this embodiment is hydrochloride, carboxylate, sulfonate, or alkyl sulfate salt. is preferred, and hydrochloride is particularly preferred.
  • the structural unit (B1) is a structural unit having a structure represented by general formula (Id) or general formula (Ie) below.
  • R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms which may have a hydroxyl group, a cycloalkyl group having 5 to 20 carbon atoms, or an aralkyl group having 7 to 20 carbon atoms.
  • X a- represents a counter ion
  • a represents the valence of the counter ion.
  • At least one of R 2 and R 3 is preferably other than a hydrogen atom, and both are preferably other than a hydrogen atom.
  • R 2 and R 3 are each independently preferably a methyl group, an ethyl group, or a benzyl group, more preferably a methyl group or an ethyl group, and particularly preferably a methyl group.
  • At least part of the structural unit (B1) preferably has a tertiary or quaternary amino group or an ammonium salt from the viewpoint of increasing the value of the chemical structure parameter P.
  • the proportion of those having a tertiary or quaternary amino group or ammonium salt in all structural units (B1) is preferably 50 mol% or more, more preferably 70 to 100 mol%, It is more preferably 90 to 100 mol %.
  • the counter ion X a- is not particularly limited, it is preferably a chloride ion, a carboxylate ion, a sulfonate ion, or an alkyl sulfate ion from the viewpoint of availability, controllability of the reaction, and the like. or ethyl sulfate ion is particularly preferred.
  • a diallylamine monomer having a counterion from the viewpoint of production cost and the like.
  • a counterion-type structural unit (B1) that can be produced without requiring a process for removing counterions from a (co)polymer is complicated and causes an increase in cost. Using a (co)polymer having is a preferred embodiment from the viewpoint of cost and the like.
  • the structural unit (C1) is a structural unit having a structure represented by the following general formula (Ig) or a structure that is an acid addition salt thereof.
  • R 4 and R 5 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms which may have a hydroxyl group, an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 5 to 6 carbon atoms. indicates a group.
  • At least one of R 4 and R 5 is preferably other than a hydrogen atom, more preferably both are other than a hydrogen atom.
  • An alkyl group having 1 to 12 carbon atoms or an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms which are preferable as R 4 and R 5 may be linear or branched. Examples include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, pentyl group, hexyl group, octyl group, decyl group and dodecyl group. , benzyl group, and the like.
  • cycloalkyl groups having 5 to 6 carbon atoms as R 4 and R 5 include, but are not limited to, cyclopentyl and cyclohexyl groups.
  • At least part of the structural unit (C1) preferably has a tertiary amino group from the viewpoint of increasing the value of the chemical structure parameter P.
  • the proportion of those having a tertiary amino group in all structural units (C1) is preferably 50 mol% or more, more preferably 70 to 100 mol%, and 90 to 100 mol%. is more preferable.
  • the type of the addition salt is not particularly limited, but from the viewpoint of availability, ease of reaction control, etc. from, for example, hydrochlorides, sulfates, phosphates, nitrates, sulfites, phosphites, nitrites, hydrobromides, acetates, amidosulfates, methanesulfonates, trifluoroacetates, p - Toluene sulfonate and the like can be used.
  • hydrochlorides, sulfates, phosphates and amidosulfates are preferred, and hydrochlorides, sulfates, phosphates and amidosulfates having a structure derived from monoallylamine are particularly preferred.
  • the specific (co)polymer which is a preferred form of the specific compound used in the present invention, has a chemical structure parameter P calculated by the following formula (1) and a weight-average molecular weight M obtained by GPC measurement of the following formula ( It is a (di)allylamine (co)polymer having a relationship satisfying 2).
  • n represents the number of structural unit species constituting the (co)polymer
  • mi represents the molar ratio of structural unit i
  • aij represents j-class amine (or ammonium salt) in structural unit i.
  • o i indicates the number of carbonyl groups in structural unit i
  • s i indicates the number of sulfonyl groups in structural unit i.
  • the melting temperature The Tm value elevating agent can effectively elevate the Tm value of hybridized double-stranded nucleic acids.
  • the chemical structure parameter P of the specific (co)polymer is a value calculated by the following formula (1), and various groups including amine in the constituent units constituting the (co)polymer are It is a parameter that comprehensively expresses the degree of contribution to the effect of
  • n represents the number of structural unit species constituting the specific (co)polymer
  • mi represents the molar ratio of structural unit i
  • aij represents j-class amine (or ammonium salt) in structural unit i.
  • o i indicates the number of carbonyl groups in structural unit i
  • s i indicates the number of sulfonyl groups in structural unit i.
  • o i indicates the contribution of the carbonyl group in the structural unit species i, and the contribution equivalent to that of the same number of primary amines is added.
  • 2 ⁇ s i indicates the contribution of the sulfonyl group in the constituent unit species i, and the same contribution as the same number of secondary amines is added.
  • Contribution of the structural unit species i calculated in this way are weighted and averaged according to the formula (1) over all structural unit types i to n according to the molar ratio m i of the structural unit type i to calculate the chemical structure parameter P.
  • the value of the chemical structure parameter P itself is not particularly limited. From the viewpoint of satisfying the condition of the above formula (2) in some cases, and from the viewpoint of facilitating the satisfaction of the more preferable conditions of the following formulas (3) and (4), it is preferable that the range is 1.20 to 4.50. preferably 2.10 to 4.20, even more preferably 2.80 to 4.00, particularly preferably 3.00 to 4.00, and 3.40 to 4.00. 00 is particularly preferred, and 3.50 to 3.85 is most preferred.
  • the chemical structure parameter P can be appropriately adjusted by selecting and adjusting the chemical structure of the specific (co)polymer, particularly the type and ratio of each structural unit.
  • the value of the chemical structure parameter P can be increased by introducing a structural unit having a tertiary or quaternary amine or an ammonium salt and increasing its proportion.
  • the value of the chemical structure parameter P can be lowered by introducing a structural unit having neither an amine or an ammonium salt, a carbonyl group, or a sulfonyl group, and increasing the proportion thereof.
  • the specific (co)polymer preferably has a structural unit having a tertiary or quaternary amine or an ammonium salt, and (di)allylamine It is particularly preferred to have system building blocks ( ⁇ ) with tertiary or quaternary amines or ammonium salts.
  • the (di)allylamine-based structural unit ( ⁇ ) having a tertiary or quaternary amine or an ammonium salt accounts for 40 mol% or more of all structural units of the specific (co)polymer. is preferably 50 to 100 mol %, more preferably 70 to 100 mol %, and particularly preferably 80 to 100 mol %.
  • a nonionic structural unit is included as a structural unit other than a structural unit having a tertiary or quaternary amine or ammonium salt, a structural unit having a tertiary or quaternary amine or ammonium salt and a nonionic
  • the total ratio of the structural units to the total structural units of the specific (co)polymer is usually 50 mol% or more, 70 to 100 mol%, more preferably 80 to 100 mol%, and particularly preferably is 90 to 100 mol %.
  • the chemical structure parameter P and the weight average molecular weight M of the specific (co)polymer have a relationship defined by the following formula (2). That is, the ratio of the cubic of the chemical structure parameter P to the 1/4th power of the weight average molecular weight M, P 3 /M 1/4 , falls within the numerical range of 0.84 or more and 12.67 or less.
  • the melting temperature ( The Tm value elevating agent can effectively elevate the Tm value of hybridized double-stranded nucleic acids.
  • the present embodiment containing the specific (co)polymer
  • the Tm value of the hybridized double-stranded nucleic acid measured in the presence of the Tm value elevating agent for the nucleic acid of and the Tm value of the hybridized double-stranded nucleic acid measured under the same conditions except that the Tm value elevating agent was not present The difference from the value can be 20° C. or more.
  • the upper limit of the increase in Tm value is not particularly limited, it is, for example, 50°C.
  • the chemical structure parameter P and the weight average molecular weight M of the specific (co)polymer preferably have a relationship defined by the following formula (3). That is, the ratio of the cube of the chemical structure parameter P to the quarter power of the weight average molecular weight M, P 3 /M 1/4 , is preferably in the numerical range of 2.37 or more and 6.92 or less.
  • the melting temperature ( The Tm value elevating agent can further effectively elevate the Tm value of the hybridized double-stranded nucleic acid.
  • the present embodiment containing the specific (co)polymer
  • the Tm value of the hybridized double-stranded nucleic acid measured in the presence of the Tm value-increasing agent of the nucleic acid of the form, and the Tm value of the hybridized double-stranded nucleic acid measured under the same conditions except that the agent was not present The difference from the Tm value can be 30°C or more.
  • the chemical structure parameter P and the weight average molecular weight M of the specific (co)polymer have a relationship defined by the following formula (4). That is, the ratio of the cube of the chemical structure parameter P to the quarter power of the weight average molecular weight M, P 3 /M 1/4 , is preferably in the range of 2.60 or more and 3.00 or less.
  • the melting temperature ( The Tm value elevating agent can particularly effectively elevate the Tm value of hybridized double-stranded nucleic acids.
  • the present embodiment containing the specific (co)polymer
  • the Tm value of the hybridized double-stranded nucleic acid measured in the presence of the Tm value-increasing agent of the nucleic acid of the form, and the Tm value of the hybridized double-stranded nucleic acid measured under the same conditions except that the agent was not present The difference from the Tm value can be 35°C or more.
  • the weight average molecular weight M of the specific (co)polymer is not particularly limited as long as the condition of the above formula (2) is satisfied.
  • a specific (co)polymer having a suitable weight-average molecular weight M may be obtained or polymerized depending on the type of use and the relationship with other components.
  • the weight average molecular weight M (Mw) of the specific (co)polymer is preferably 400 to 400,000 from the viewpoints of easiness in forming a reaction solution with nucleic acids and the like and polymerization in a practically acceptable time and cost. .
  • the weight average molecular weight M (Mw) is more preferably 600 to 360,000, more preferably 700 to 300,000, particularly preferably 3,500 to 250,000, particularly preferably 8,000 to 240,000, and 100,000. ⁇ 200,000 is most preferred.
  • the weight average molecular weight M (Mw) of the specific (co)polymer is measured by gel permeation chromatography (GPC method) using a liquid chromatograph. More specifically, it can be measured, for example, by the method described in the Examples of the present application.
  • the weight average molecular weight M of the specific (co)polymer is adjusted by adjusting the type and composition of the monomers that contribute to the polymerization, the temperature, time and pressure in the polymerization process, the type and amount of the radical initiator used in the polymerization process, etc. , can be adjusted accordingly.
  • the rotational viscosity [ ⁇ ] of the specific (co)polymer there is no particular limitation on the rotational viscosity [ ⁇ ] of the specific (co)polymer, and it can be set as appropriate in consideration of the usage pattern, production cost, etc. of the nucleic acid Tm value increasing agent of the present embodiment. It is preferably from 1.0 to 1500.0 mPa ⁇ s (25° C.), particularly preferably from 1.5 to 1000.0 mPa ⁇ s (25° C.), in the state of a .0 mass % aqueous solution.
  • the rotational viscosity [ ⁇ ] can be measured by a method commonly used in the industry, and can be measured, for example, with a digital Brookfield viscometer DV-3T manufactured by AMETEK Brookfield.
  • a ULA adapter is used, and the liquid volume can be typically measured at 16 ml at a liquid temperature of 25°C.
  • Rotational viscosity [ ⁇ ] can also be adjusted by adjusting the dilution concentration during polymerization, the type and composition of monomers that contribute to polymerization, the temperature, time and pressure in the polymerization process, and the type and amount of radical initiator used in the polymerization process. , can be adjusted accordingly.
  • Other structural unit- specific (co)polymers may have other structural units in addition to the (di)allylamine-based structural unit ( ⁇ ).
  • Examples of other structural units include various cationic structural units other than the (di)allylamine-based structural unit ( ⁇ ), various anionic structural units, various nonionic structural units, and the like.
  • the specific (co)polymer preferably further contains a nonionic structural unit.
  • anionic Structural Unit having an anionic structural unit makes the specific (co)polymer a so-called amphoteric polymer.
  • the anionic structural unit in this embodiment preferably has a structure represented by the following structural formula (III), (IV), or (V).
  • a carbonyl group that can contribute to the chemical structure parameter P can be introduced into the structure of the specific (co)polymer.
  • R 6 is hydrogen or a methyl group
  • Y is independently hydrogen, Na, K , NH4 , 1/2Ca, 1/2Mg, 1/2Fe, 1/3Al, or 1/3Fe.
  • the anionic structural unit may have a structure that does not correspond to any of the above structural formulas (III), (IV), and (V), as long as it has an anionic group such as a carboxyl group. It may be a structural unit derived from methacrylic acid, acrylic acid, or the like.
  • the anionic structural unit adjusts the positive charge of the (di)allylamine-based structural unit ( ⁇ ). It is preferable not to include from the viewpoint of increasing the amount of increase in
  • the specific (co)polymer has an anionic structural unit
  • only one type of anionic structural unit may be used alone, or a plurality of types of anionic structural units having different structures may be used in combination. good too.
  • the specific (co)polymer has an anionic structural unit
  • the anionic structural unit is derived from an unsaturated dicarboxylic acid
  • At least part of the anionic structural units may be derived from unsaturated monocarboxylic acids such as acrylic acid and methacrylic acid.
  • unsaturated monocarboxylic acids such as acrylic acid and methacrylic acid.
  • the ratio of (di)allylamine-based structural unit ( ⁇ )/anionic structural unit) is preferably 2/1 to 0.1/1. , 1/1 to 0.5/1.
  • Nonionic Structural Unit a structural unit containing a carbonyl group or a sulfonyl group that can contribute to the chemical structure parameter P by having a nonionic structural unit can also be selected and introduced.
  • the nonionic structural unit in the present embodiment may be a structural unit derived from a nonionic monomer copolymerizable with the monomer leading to the (di)allylamine-based structural unit ( ⁇ ).
  • structural units derived from methacrylic acid ester-based monomers, acrylic acid ester-based monomers, methacrylamide-based monomers, acrylamide-based monomers, sulfur dioxide, etc. can be preferably used. .
  • More specific examples include methyl methacrylate, ethyl methacrylate, butyl methacrylate, methyl acrylate, ethyl acrylate, butyl acrylate, methacrylamide, N-methylmethacrylamide, dimethylmethacrylamide, N-(3- from dimethylaminopropyl)methacrylamide, acrylamide, dimethylacrylamide, hydroxyethylacrylamide, dimethylaminopropylacrylamide, dimethylaminopropylacrylamide methyl chloride quaternary salt, acryloylmorpholine, isopropylacrylamide, 4-t-butylcyclohexyl acrylate, or sulfur dioxide Derived building blocks can be mentioned. Among them, structural units derived from sulfur dioxide, acrylamide-based monomers and the like are particularly preferable.
  • a nonionic constitutional unit can be usually introduced into a polymer by using a nonionic monomer as a monomer.
  • the content of the nonionic structural unit is not particularly limited, and the preferred amount varies depending on the type of nonionic structural unit, but (di)allylamine
  • a person skilled in the art can appropriately set the chemical structure parameter P so as to obtain an appropriate chemical structure parameter P in relation to the type and amount of the system structural unit ( ⁇ ). For example, by introducing a structural unit derived from sulfur dioxide, a sulfonyl group that can contribute to the chemical structure parameter P can be introduced into the structure of a specific (co)polymer.
  • the nonionic structural unit is derived from a methacrylic acid ester-based monomer, an acrylic acid ester-based monomer, a methacrylamide-based monomer, or an acrylamide-based monomer
  • the ratio is 1/0.05 to It is preferably 1/0.5, particularly preferably 1/0.1 to 1/1.
  • the nonionic structural unit is derived from sulfur dioxide
  • the ratio is preferably 1/0.1 to 1/1.5, particularly preferably 1/0.25 to 1/1.
  • the method for producing the specific (co)polymer is not particularly limited, and it can be produced by a method known in the art. It can be produced by copolymerizing a (di)allylamine-based monomer having a structure corresponding to ⁇ ) and, if desired, a monomer corresponding to other structural units such as nonionic structural units.
  • the solvent for (co)polymerizing the (di)allylamine-based monomer having the structure corresponding to the (di)allylamine-based structural unit ( ⁇ ) is not particularly limited. , sulfoxide, amide and the like may be used, but aqueous solvents are preferred.
  • the monomer concentration depends on the type of monomer, and the (co)polymerization is Although it varies depending on the type of solvent used, it is usually 10 to 75% by mass in the case of an aqueous solvent.
  • This copolymerization reaction is usually a radical polymerization reaction and is carried out in the presence of a radical polymerization catalyst.
  • the type of the radical polymerization catalyst is not particularly limited, and preferred examples thereof include peroxides such as t-butyl hydroperoxide, persulfates such as ammonium persulfate, sodium persulfate, and potassium persulfate, azobis, Examples include water-soluble azo compounds such as diazo compounds.
  • the amount of the radical polymerization catalyst added is generally 0.1 to 20 mol%, preferably 1.0 to 10 mol%, relative to the total monomers.
  • the polymerization temperature is generally 0-100° C., preferably 5-80° C.
  • the polymerization time is generally 1-150 hours, preferably 5-100 hours.
  • the atmosphere for polymerization the atmosphere does not cause any serious problem in polymerizability, but the atmosphere can be carried out in an atmosphere of an inert gas such as nitrogen.
  • the specific monomer which is another form of the specific compound used in the present invention, is general formula (Ic)
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a hydroxyl group, a cycloalkyl group having 5 to 10 carbon atoms, or an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms.
  • A2 monomer structure that is an acid addition salt thereof
  • structural unit (A2) General formula (If)
  • R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms which may have a hydroxyl group, a cycloalkyl group having 5 to 20 carbon atoms, or a is an aralkyl group
  • X a- represents a counter ion
  • a represents the valence of the counter ion.
  • R 4 and R 5 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms which may have a hydroxyl group, an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms, or a cyclo an alkyl group), or a monomer structure (C2) that is an acid addition salt thereof (hereinafter also referred to as "structural unit (C2)”), Having at least one (di)allylamine-based structure (constitutional unit) selected from the group consisting of It is a (di)allylamine-based compound ((di)allylamine-based monomer) in which the chemical structure parameter P calculated by the following formula (1) and the molecular weight M satisfy the following formula (2).
  • n indicates the number of constituent (unit) species constituting the (di)allylamine compound
  • mi indicates the molar ratio of the constituent unit i
  • aij indicates the j-class amine in the constituent unit i ( or ammonium salt)
  • o i indicates the number of carbonyl groups in structural unit i
  • s i indicates the number of sulfonyl groups in structural unit i).
  • Equation (1) can be simplified to Equation (1') below.
  • P j+o+2 ⁇ s (1′) (Wherein, j is the series of amino groups in the monomer structure, o is the number of carbonyl groups in the monomer structure, and s is the number of sulfonyl groups in the monomer structure.)
  • the value of the chemical structure parameter P itself of the specific monomer is not particularly limited, but the relationship with the realistic molecular weight M of the specific monomer is determined by the above formula (2). ), it is preferably 2.00 to 4.00, particularly preferably 2.00 to 3.00.
  • the chemical structure parameter P of the specific monomer can be appropriately adjusted by selecting and adjusting the chemical structure of the specific monomer, particularly the series of amino groups, the presence or absence and number of carbonyl groups and/or sulfonyl groups. is.
  • the specific monomer preferably has a secondary or tertiary amine or an ammonium salt from the viewpoint of increasing the value of the chemical structure parameter P.
  • the molecular weight M in the above formula (2) is the molecular weight of the specific monomer molecule and can be calculated from the chemical structure of the specific monomer.
  • the molecular weight M of the specific monomer is not particularly limited as long as the condition of the above formula (2) is satisfied. From the viewpoint of easiness, etc., it is preferably 100 to 700, particularly preferably 120 to 300.
  • the chemical structure parameter P and the molecular weight M preferably have a relationship that satisfies the above formula (3), and a relationship that satisfies the above formula (4). It is more preferable to have
  • the monomer structure (A2) (structural unit (A2)), which is one option for the structure of the specific monomer, is a structure represented by the following general formula (Ic), or a structure that is an acid addition salt thereof, is.
  • R 1 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a hydroxyl group, a cycloalkyl group having 5 to 10 carbon atoms, or an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms. indicate.
  • Preferred examples of R 1 are the same as those explained above for structural unit (A1).
  • examples of preferred acid addition salts are also the same as those described above for the structural unit (A1). is.
  • preferred monomer structures (A2) include diallylmethylamine hydrochloride, diallylamine, and diallylamine hydrochloride.
  • the monomer structure (B2) (structural unit (B2)), which is one option for the structure of the specific monomer, has a structure represented by the following general formula (If).
  • R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms which may have a hydroxyl group, a cycloalkyl group having 5 to 20 carbon atoms, or an aralkyl group having 7 to 20 carbon atoms. is a group, X a- represents a counter ion, and a represents the valence of the counter ion.
  • Preferred examples of R 2 and R 3 are the same as those explained above for structural unit (B1).
  • Preferred examples of the counter ion X a- are also the same as those explained above with respect to the structural unit (B1).
  • Specific examples of the preferred monomer structure (B2) include diallyldinonadecyl ammonium chloride and diallyl diicosyl ammonium chloride.
  • the monomer structure (C2) (structural unit (C2)), which is one option for the structure of the specific monomer, is a structure represented by the following general formula (Ih), or a structure that is an acid addition salt thereof, is.
  • R 4 and R 5 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 12 carbon atoms which may have a hydroxyl group, an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms, or a cycloalkyl group having 5 to 6 carbon atoms. indicates a group.
  • Preferred examples of R 4 and R 5 are the same as those explained above for structural unit (C1).
  • examples of preferred acid addition salts are also the same as those described above with respect to the structural unit (C1). is.
  • preferable monomer structure (C2) examples include N,N-dimethylallylamine, methoxycarbonylated allylamine, and the like.
  • the specific compound in the present invention is represented by general formula (Ia), general formula (Ib) or general formula (Ic)
  • R 1 represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms which may have a hydroxyl group, a cycloalkyl group having 5 to 10 carbon atoms, or an aralkyl group having 7 to 10 carbon atoms.
  • a structural unit (A) having a structure represented by or a structure that is an acid addition salt thereof, General formula (Id), general formula (Ie) or general formula (If) (wherein R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms which may have a hydroxyl group, a cycloalkyl group having 5 to 20 carbon atoms, or a is an aralkyl group, X a- represents a
  • n represents the number of structural unit species constituting the (di)allylamine compound
  • mi represents the molar ratio of structural unit i
  • aij represents the j-class amine (or ammonium salt)
  • o i indicates the number of carbonyl groups in structural unit i
  • s i indicates the number of sulfonyl groups in structural unit i).
  • the structural unit (A) is a generic term for the above structural unit (A1) and the structural unit (A2) (monomer structure (A2)), and the structural unit (B) is the above structural unit
  • the unit (B1) and the structural unit (B2) (monomer structure (B2)) are collectively called the structural unit (C), and the structural unit (C) is the above structural unit (C1) and the structural unit (C2) (monomer body structure (C2)).
  • the agent for increasing the Tm value of nucleic acids of the present invention significantly increases the Tm value of double-stranded nucleic acids. Due to the characteristics of the Tm value, for a double strand that is in a completely complementary relationship and a double strand that has a mismatch and is not in a completely complementary relationship, the Tm value when a nucleic acid Tm value increasing agent is added It is expected that there will be differences in the extent of increase. Therefore, it is expected that the Tm value can be used to detect mutations in the reference sequence with higher sensitivity.
  • nucleic acid amplification cycle when the nucleic acid amplification cycle is performed in a solution to which the agent for increasing the Tm value of the nucleic acid of the present invention is added, there is a completely complementary double strand and a mismatch, which is not completely complementary. Double strands are expected to result in greater differences in amplification efficiency. Therefore, nucleic acid amplification is expected to detect mutations more efficiently and with high sensitivity.
  • the annealing temperature can be increased in the nucleic acid amplification reaction, the dependence on the GC content can be reduced when designing the primers to be used, and it is expected that the degree of freedom in primer design will increase.
  • the nucleic acid amplification method is not particularly limited, and examples include the PCR method, TMA method, LAMP method, ICAN method, SDA method, LCR method, NASBA method, HDA method, RCA method, RPA method, and the like. , but not limited to these.
  • an increase in Tm value means stabilization of double-stranded nucleic acids. Therefore, the Tm-increasing agent of the present invention can be suitably used for stabilizing nucleic acid medicines and samples subjected to nucleic acid analysis. Specific examples of samples to be subjected to nucleic acid analysis include samples in medical and clinical diagnosis, development and evaluation of pharmaceutical compositions, food analysis, food manufacturing monitoring, agriculture, environmental analysis, and many other research fields. It can be, but is not limited to.
  • a method for stabilizing a nucleic acid comprising adding the Tm value increasing agent for a nucleic acid of the present invention to a solution containing a nucleic acid, and a nucleic acid containing the Tm value increasing agent for a nucleic acid of the present invention together with the nucleic acid.
  • An aqueous solution is provided.
  • the weight average molecular weight M (Mw) of the polymer was measured by gel permeation chromatography (GPC method) using a Hitachi L-6000 high performance liquid chromatograph.
  • the eluent channel pump was Hitachi L-6000
  • the detector was Shodex RI-101 differential refractive index
  • the columns were Shodex Asahipack aqueous gel filtration type GS-220HQ (exclusion limit molecular weight: 3,000) and GS-620HQ. (exclusion limit molecular weight: 2,000,000) connected in series.
  • the structural parameter P of the (co)polymer or monomer contained in the Tm value-increasing agent for nucleic acid of each Example or Comparative Example was determined by the following equation.
  • n represents the number of structural units constituting the (co)polymer or monomer
  • mi represents the molar ratio of structural unit i
  • aij represents the j-class amine (or ammonium salt) in structural unit i.
  • o i indicates the number of carbonyl groups in structural unit i
  • s i indicates the number of sulfonyl groups in structural unit i.
  • Aqueous polymer solution (agent for increasing the Tm value of nucleic acids)
  • diallyldimethylammonium chloride (monomer 1) and acrylamide (monomer 2) are copolymerized under the following polymerization conditions 1 to form structural unit 1 derived from monomer 1 and monomer 2. It contains 10.0% by mass of a diallyldimethylammonium chloride/acrylamide copolymer having a molar ratio of 8:1 to the derived structural unit 2 and a weight-average molecular weight M obtained by GPC measurement of 180,000. 0, 20.0 ⁇ L of aqueous polymer solution was prepared.
  • the structural parameter P was 3.78 and P 3 /M 1/4 was 2.62.
  • Polymerization conditions 1 119.39 g (0.48 mol) of 65.0% diallyldimethylammonium chloride and 4.26 g (0.06 mol) of acrylamide are placed in a 300 ml four-necked flask equipped with a thermometer, stirrer and condenser. , and 149.24 g of distilled water were charged, and the internal temperature was raised to 50°C.
  • V-50 (2,2'-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride
  • the amount of V-50 in the aqueous solution is 0.2% by mass with respect to the total amount of monomers was added to initiate polymerization.
  • the amount of V-50 is 0.2% by mass with respect to the total amount of monomers after 22 and 25 hours, respectively, and 0.3% by mass with respect to the total amount of monomers after 28, 46, and 53 hours. was added and allowed to react for 72 hours.
  • nucleic Acid Molecule In order to evaluate the increase in Tm value when a nucleic acid Tm value increasing agent is added, a 40-mer DNA oligomer derived from a portion of Exon 2 of the wild-type KRAS gene sense strand and an antibody comprising a sequence complementary thereto was prepared. A sense strand 40-mer DNA oligomer was used.
  • the base sequences of both nucleic acid molecules are as follows.
  • reaction liquids 1 and 2 were prepared using the aqueous polymer solution and the nucleic acid molecules (the concentration of the (co)polymer in the reaction liquid 2 was 1.0% by mass).
  • Tm Increase Value The obtained reaction mixtures 1 and 2 were set in a StepOnePlus real-time PCR system (manufactured by Thermo Fisher Scientific), heated at 95° C. for 15 seconds, then incubated at 40° C. for 1 minute, and then cooled to 0° C. While performing fluorescence measurement every 3 seconds, the temperature was raised to 95° C. to obtain a DNA melting curve, and then the temperature was maintained at 95° C. for 15 seconds. From the obtained DNA melting curve, the Tm value was obtained by differential method, and the Tm value of reaction solution 1 was subtracted from the Tm value of reaction solution 2 to determine the Tm increase value. The Tm value of reaction liquid 1 was 58.00°C, and the Tm value of reaction liquid 2 was 93.30°C. As a result, the Tm increase value was 35.3°C.
  • Example 2 As an agent for increasing the Tm value of nucleic acids, diallyldimethylammonium chloride (monomer 1) and acrylamide (monomer 2) are copolymerized under the following polymerization conditions 2 to obtain structural unit 1 derived from monomer 1 and monomer 2.
  • Example 1 except that an aqueous solution containing a diallyldimethylammonium chloride/acrylamide copolymer having a molar ratio of 8:1 to the derived structural unit 2 and a weight average molecular weight M obtained by GPC measurement of 10000 was used. Tm elevation values were determined in the same manner.
  • the structural parameter P of this copolymer was 3.78 and P 3 /M 1/4 was 5.40.
  • Tm increase value was 33.3°C.
  • Polymerization condition 2 124.37 g (0.50 mol) of 65.0% diallyldimethylammonium chloride and 4.44 g (0.06 mol) of acrylamide are placed in a 300 ml four-necked flask equipped with a thermometer, stirrer and condenser. , 0.85 g of sodium hypophosphite and 84.39 g of distilled water were charged, and the internal temperature was raised to 50°C.
  • a 28.5% by mass ammonium persulfate aqueous solution was added in such an amount that the amount of ammonium persulfate in the aqueous solution was 0.2% by mass relative to the total amount of the monomers to initiate polymerization.
  • the amount of ammonium persulfate is 0.3% by mass based on the total amount of monomers after 4 hours, 0.5% by mass based on the total amount of monomers after 23 hours, and 1.0% by mass based on the total amount of monomers after 28 hours. was added with the ammonium persulfate aqueous solution and reacted for 48 hours.
  • Example 3 As an agent for increasing the Tm value of nucleic acids, polydiallyldimethylammonium chloride (product name: : PAS-H-1L, manufactured by Nittobo Medical) was used to determine the increase in Tm in the same manner as in Example 1.
  • the structural parameter P of this copolymer was 4.00 and P 3 /M 1/4 was 6.67.
  • the Tm increase value was 33.3°C.
  • Example 4 As an agent for increasing the Tm value of nucleic acids, polydiallyldimethylammonium chloride (product name: : PAS-H-5L, manufactured by Nittobo Medical) was used to determine the increase in Tm in the same manner as in Example 1.
  • the structural parameter P of this copolymer was 4.00 and P 3 /M 1/4 was 4.86.
  • the Tm increase value was 33.5°C.
  • a structural unit 1 derived from monomer 1 and a structural unit 2 derived from monomer 2 are obtained by copolymerizing diallyldimethylammonium chloride (monomer 1) and sulfur dioxide (monomer 2) as an agent for increasing the Tm value of nucleic acids.
  • a diallyldimethylammonium chloride/sulfur dioxide copolymer (product name: PAS-A-5, manufactured by Nittobo Medical) having a molar ratio of 1:1 and a weight average molecular weight M obtained by GPC measurement of 4000.
  • the Tm increase value was determined in the same manner as in Example 1, except that an aqueous solution containing The structural parameter P of this copolymer was 3.00 and P 3 /M 1/4 was 3.40. Moreover, the Tm increase value was 33.8°C.
  • a structural unit 1 derived from monomer 1 and a structural unit derived from monomer 2 are obtained by copolymerizing diallylmethylamine hydrochloride (monomer 1) and sulfur dioxide (monomer 2) as an agent for increasing the Tm value of nucleic acids.
  • a diallylmethylamine hydrochloride/sulfur dioxide copolymer (product name: PAS-2201CL, manufactured by Nittobo Medical) having a molar ratio of 1:1 with 2 and a weight average molecular weight M obtained by GPC measurement of 3000.
  • the Tm increase value was determined in the same manner as in Example 1, except that an aqueous solution containing The structural parameter P of this copolymer was 2.50 and P 3 /M 1/4 was 2.11. Moreover, the Tm increase value was 24.0°C.
  • allylamine (monomer 1) and dimethylallylamine (monomer 2) are copolymerized under the following polymerization conditions 3.
  • an aqueous solution containing an allylamine/dimethylallylamine copolymer having a molar ratio with the structural unit 2 of 1:1 and a weight average molecular weight M obtained by GPC measurement of 1000 was used.
  • the Tm elevation was determined.
  • the structural parameter P of this copolymer was 2.00 and P 3 /M 1/4 was 1.42.
  • the Tm increase value was 24.6°C.
  • Polymerization condition 3 209.67 g (1.3 mol) of 58.01% by mass of allylamine hydrochloride and 63.61% by mass of dimethylallylamine hydrochloride were placed in a 1 L four-necked flask equipped with a thermometer, a stirrer and a condenser tube. 248.51 g (1.3 mol) of salt was charged and the temperature was raised to 60°C.
  • Initiator V-50 (2,2′-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride) is added in three parts in an amount such that the amount of V-50 is 12 mol% with respect to the total amount of monomers, Polymerization was carried out for 72 hours. Then, it was thermally decomposed at 60° C.
  • Example 8 As an agent for increasing the Tm value of nucleic acids, allylamine (structural unit 1) and urea allylamine (structural unit 2) obtained under the following reaction conditions 1 are included, and the molar ratio of structural unit 1 to structural unit 2 is The Tm increase value was determined in the same manner as in Example 1, except that an aqueous solution containing 50 mol% urea polyallylamine having a ratio of 1:1 and a weight average molecular weight M obtained by GPC measurement of 15000 was used. . The structural parameter P of this copolymer was 2.50 and P 3 /M 1/4 was 1.41. Moreover, the Tm increase value was 22.8°C.
  • Reaction conditions 1 1.88 kg of 49.77 mass% allylamine hydrochloride polymer (product name: PAA-HCl-3L, manufactured by Nittobo Medical) in a 10 L four-necked flask equipped with a thermometer, a stirrer and a condenser tube. (10.00 mol) and 2.21 kg of dilution water were charged. Then, the temperature was raised to 50° C., 4.33 kg (5.00 mol) of a 7.50% by mass sodium cyanate aqueous solution was added dropwise, and the mixture was reacted overnight. After that, 800 g (5.00 mol) of sodium hydroxide having a concentration of 25% by mass was added under cooling to 30° C.
  • demonomerization 65° C., 20 hours was performed under reduced pressure. After the demonomerization, the concentration was adjusted to 15%, and desalting by electrodialysis was performed (about 20 hours, completed 1 hour after the conductivity had completely decreased).
  • Example 9 As an agent for increasing the Tm value of nucleic acids, polydiallylamine (product name: PAS-21, manufactured by Nittobo Medical Co., Ltd.), which is obtained by polymerizing diallylamine (constituent unit 1) and has a weight-average molecular weight M of 5000 obtained by GPC measurement, is used.
  • the Tm increase value was determined in the same manner as in Example 1, except that an aqueous solution containing The structural parameter P of this copolymer was 2.00 and P 3 /M 1/4 was 0.95. Moreover, the Tm increase value was 21.9°C.
  • ⁇ Comparative Example 1> As an agent for increasing the Tm value of nucleic acids, allylamine (structural unit 1) and methoxycarbonylated allylamine (structural unit 2) obtained under the following reaction conditions 2, and the molar ratio of structural unit 1 to structural unit 2: is 1:1 and the weight average molecular weight M obtained by GPC measurement is 15,000. Decided.
  • the structural parameter P of this copolymer was 2.00 and P 3 /M 1/4 was 0.72.
  • the Tm increase value was 15.2.
  • Reaction conditions 2 15.00 wt% allylamine polymer (product name: PAA-15C, manufactured by Nittobo Medical) 3.81 kg (10.00%) in a 10 L four-necked flask equipped with a thermometer, a stirrer, and a cooling tube. mol) was added. Then, the temperature was raised to 40°C, 0.45 kg (5.00 mol) of 99.00% by mass dimethyl carbonate was added dropwise, and the mixture was reacted at 45°C overnight. After that, the by-produced methanol was removed by reducing the pressure. (50°C, 20 hours) was performed. After that, the concentration was adjusted to 15% to obtain a 50% methoxycarbonylated polyallylamine aqueous solution.
  • ⁇ Comparative Example 2> As an agent for increasing the Tm value of nucleic acids, polydiallylamine hydrochloride (product name: PAS-21CL, Nittobo The Tm increase value was determined in the same manner as in Example 1, except that an aqueous solution containing (manufactured by Medical Co., Ltd.) was used. The structural parameter P of this copolymer was 2.00 and P 3 /M 1/4 was 0.53. Moreover, the Tm increase value was 18.1°C.
  • allylamine hydrochloride (structural unit 1) and diallylamine hydrochloride (structural unit 2) are copolymerized under the following polymerization conditions 4, and structural unit 1 and structural unit 2 are obtained.
  • an aqueous solution containing an allylamine hydrochloride/diallylamine hydrochloride copolymer having a molar ratio of 1:19 and a weight average molecular weight M obtained by GPC measurement of 40000 was used.
  • Tm elevation values were determined.
  • the structural parameter P of this copolymer was 1.95 and P 3 /M 1/4 was 0.52.
  • the Tm increase value was 18.2°C.
  • Polymerization condition 4 10.63 g (0.065 mol) of 57.22% by mass of allylamine hydrochloride and 65.22% by mass of diallylamine hydrochloride were placed in a 1 L four-necked flask equipped with a thermometer, stirrer and condenser. 253.02 g (1.235 mol) and 31.35 g of diluted water (an amount to give a concentration of 58% by mass) were charged, and the temperature was raised to 60°C. A 28.5% by mass aqueous ammonium persulfate solution was added in such an amount that the amount of ammonium persulfate in the aqueous solution was 0.25% by mass relative to the total amount of the monomers to initiate polymerization. 0.25% by mass was added after 3, 5 and 21 hours, and 0.50% by mass was added after 23, 25, 27 and 29 hours, and further reacted overnight.
  • Tm increasing value was obtained in the same manner as in Example 1, except that an aqueous solution containing a monomer of diallyldimethylammonium chloride (constituent unit 1) (molecular weight M: 161.5) was used as the agent for increasing the Tm value of nucleic acids. It was determined. The structural parameter P of this monomer was 4.00 and P 3 /M 1/4 was 17.95. Moreover, the Tm increase value was 15.4°C.
  • an aqueous solution containing a (di)allylamine compound having a P 3 /M 1/4 of 0.95 to 6.67 was used as an agent for increasing the Tm value of nucleic acids, and the Tm value was increased by 20°C or more.
  • Examples 1 to 5 in which an aqueous solution containing a (di)allylamine compound having a P 3 /M 1/4 ratio of 3.40 to 6.67 was used, showed an increase in Tm of 33° C. or higher.
  • Comparative Examples 1 to 3 in which the aqueous solution containing the (di)allylamine compound in which P 3 /M 1/4 was 0.72 or less, exhibited a Tm increase value of less than 20°C.

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Abstract

新規な核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤を提供する。　化学構造に関連する特定のパラメーターから算出される数値と分子量とが特定の関係を充足する特定の（ジ）アリルアミン系化合物を使用する。

Description

核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤
　本発明は、核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤（以下、Ｔｍ値上昇化剤ということもある）に関する。より具体的には、特定の構造を有する（ジ）アリルアミン系化合物を含む核酸（特に二本鎖核酸）の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤に関する。
　核酸は、医学分野、食品分野、農業若しくは漁業分野、および環境分析など多くの分野で分子生物学的分析に供されたり、治療薬の活性成分として用いられたりしているが、これに伴う課題の一つは、試料中の核酸を安定化することである。従来、核酸を安定化する試みとしては、例えば、エタノールおよびアセトンの混合液、硫酸アンモニウム、またはテトラデシルトリメチルシュウ酸アンモニウムなどを使用して、核酸を安定することが提案されている（例えば、特許文献１）。
　また、特定の細菌やウィルスを同定したり、ヒト対象の疾患易罹患性や薬剤反応性などを判定したりするために、ゲノム核酸中の変異を検出することが行われているが、その検出手段の１つとして、核酸の融解温度（Ｔｍ値）の利用がある。
　融解温度（Ｔｍ値）は、二本鎖核酸の５０％が一本鎖に変性する温度をいい、完全に相補的な関係にある二本鎖に比べ、二本鎖核酸間にミスマッチがあり、完全に相補的な関係にない二本鎖では、融解温度（Ｔｍ値）が低くなる。このため、このような現象を利用して、試料核酸の基準核酸に対する変異を検出したり、この現象により生じる核酸増幅効率の差を通じて標的配列を検出したりすることができる。ただし、一塩基のミスマッチによって生じる融解温度（Ｔｍ値）の変化は１～３℃程度であるとされ、融解温度（Ｔｍ値）を利用してゲノム核酸中のごく僅かな変異を検出するには、感度を高める工夫が必要になる。
　また、核酸増幅反応において、アニーリング温度が低い場合、非特異的な増幅を生じることがあるため、プライマーのＧＣ含量を検討しアニーリング温度が５５℃程度になるようにプライマーを設計する必要がある（非特許文献１）。しかし、ＧＣ含量への依存を低減してプライマー設計が可能となれば、柔軟なプライマー設計が可能となる。
　この点、融解曲線を解析して僅かな変異を検出可能とする方法がなされている（特許文献２）。しかし、この方法では、厳密な温度制御を可能な高精度な恒温装置が必要となり、実用上より簡便な方法が望まれる。また、ＧＣ含量に依存したプライマー設計の問題を取り扱うものではない。
　ところで、融解温度（Ｔｍ値）を利用して変異を検出する方法ではないが、基準遺伝子に対してミスマッチな短鎖核酸分子をフルマッチな短鎖核酸分子に置換する速度を促進するカチオン性高分子ポリマーを用いて、基準遺伝子に対するミスマッチを検出する方法が提案され、この方法では、一塩基のミスマッチでも検出できるとされる（特許文献３乃至５）。このカチオン性高分子ポリマーは、ポリリジンやポリアルギニンなどのカチオン性高分子を主鎖として、デキストランやポリエチレングリコール等を側鎖としてグラフト重合したポリマーであり、その具体的例として、α－ＰＬＬ－ｇ－Ｄｅｘ、ε－ＰＬＬ－ｇ－Ｄｅｘ、ＰＡＡ－ｇ－Ｄｅｘが開示されている。特許文献３には、このカチオン性高分子ポリマーの存在下および非存在下での一塩基変異を有する核酸分子のＴｍ値の差が示されている。残念ながら、このカチオン性高分子ポリマーの添加によるＴｍ上昇値は、２０ｍｅｒのＤＮＡで１５℃以下であり、Ｔｍ値を利用して変異を検出する方法で十分に検出感度を高めることができないし、核酸増幅反応において、アニーリング温度を十分に高めることができるものでもない。
特開２０１５－２１２２７３号 特開２００５－５８１０７号 ＷＯ０３／０１８８４１Ａ１ 特開２００１-７８７６９号 特開２００８-２７８７７９号
Dieffenbach et al., "General concepts for PCR primer design", PCR Methods Appl., 1993, 3(3), S30-37
　本発明は、以上のような従来技術における問題に対処し得る、新規な核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤を提供することを目的とする。また、当該核酸のＴｍ値上昇化剤を核酸と共に含む医薬組成物を提供することも目的とする。
　本発明者らは鋭意検討の結果、化学構造に関連する特定のパラメーターから算出される数値と分子量Ｍとが特定の関係を充足する特定の（ジ）アリルアミン系化合物を核酸溶液に添加すると、核酸の融解温度（Ｔｍ値）を効果的に上昇させ得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、一の実施形態として、以下の核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤を提供する。
[１]　一般式（Ｉ－ａ）、一般式（Ｉ－ｂ）若しくは一般式（Ｉ－ｃ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
（式中、Ｒ１は水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（Ａ）、
　一般式（Ｉ－ｄ）、一般式（Ｉ－ｅ）若しくは一般式（Ｉ―ｆ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
（式中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～２０のアルキル基、炭素数５～２０のシクロアルキル基、または炭素数７～２０のアラルキル基であり、Ｘａ－はカウンターイオンを示し、ａは該カウンターイオンの価数を示す。）で表される構造を有する構成単位（Ｂ）、並びに
一般式（Ｉ－ｇ）若しくは一般式（１―ｈ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（式中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１２のアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、又は炭素数５～６のシクロアルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（Ｃ）、
　からなる群の中から選ばれる少なくとも１種の（ジ）アリルアミン系の構成単位を有し、
　下記式（１）で算出される化学構造パラメーターＰと、分子量（（ジ）アリルアミン系化合物が（ジ）アリルアミン系（共）重合体である場合には、重量平均分子量により特定される。）Ｍとが下記式（２）を満たす関係を有する（ジ）アリルアミン系化合物を含む、核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000017
（式中、ｎは前記（ジ）アリルアミン系化合物を構成する構成単位種の数を示し、ｍｉは構成単位ｉのモル比を示し、aijは構成単位ｉ中のｊ級アミン（又はアンモニウム塩）の数を示し、oiは構成単位ｉ中のカルボニル基の数を示し、siは構成単位ｉ中のスルホニル基の数を示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000018
　本発明はまた、以下［２］から［１９］に記載する他の実施形態を提供する。
［２］　前記Ｐ及びＭが下記式（３）を満たす関係を有する（ジ）アリルアミン系化合物を含む、［１］に記載の核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000019
［３］　前記Ｐ及びＭが下記式（４）を満たす関係を有する（ジ）アリルアミン系化合物を含む、［１］に記載の核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000020
［４］　前記（ジ）アリルアミン系化合物が、（ジ）アリルアミン系（共）重合体である［１］～［３］のいずれか１項に記載の核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤。
［５］　前記核酸が、ＤＮＡである［１］～［４］のいずれか１項に記載の核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤。
［６］　［１］～［５］の何れか１項に記載する核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤を、核酸を含有する水溶液中に添加する核酸の安定化方法。
［７］　［１］～［５］の何れか１項に記載する核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤を、核酸と共に含む水溶液。
[８]　一般式（Ｉ－ａ）、一般式（Ｉ－ｂ）若しくは一般式（Ｉ－ｃ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
（式中、Ｒ１は水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（Ａ）、
　一般式（Ｉ－ｄ）、一般式（Ｉ－ｅ）若しくは一般式（Ｉ―ｆ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
（式中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～２０のアルキル基、炭素数５～２０のシクロアルキル基、または炭素数７～２０のアラルキル基であり、Ｘａ－はカウンターイオンを示し、ａは該カウンターイオンの価数を示す。）で表される構造を有する構成単位（Ｂ）、並びに
一般式（Ｉ－ｇ）若しくは一般式（１―ｈ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
（式中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１２のアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、又は炭素数５～６のシクロアルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（Ｃ）、
　からなる群の中から選ばれる少なくとも１種の（ジ）アリルアミン系の構成単位を有し、
　下記式（１）で算出される化学構造パラメーターＰと、分子量（（ジ）アリルアミン系化合物が（ジ）アリルアミン系（共）重合体である場合には、重量平均分子量により特定される。）Ｍとが下記式（２）を満たす関係を有する（ジ）アリルアミン系化合物の、核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤を製造するための使用。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000027
（式中、ｎは前記（ジ）アリルアミン系化合物を構成する構成単位種の数を示し、ｍｉは構成単位ｉのモル比を示し、aijは構成単位ｉ中のｊ級アミン（又はアンモニウム塩）の数を示し、oiは構成単位ｉ中のカルボニル基の数を示し、siは構成単位ｉ中のスルホニル基の数を示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000028
［９］　前記（ジ）アリルアミン系化合物は、前記Ｐ及びＭが下記式（３）を満たす関係を有する化合物である、［８］に記載の使用。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000029
［１０］　前記（ジ）アリルアミン系化合物は、前記Ｐ及びＭが下記式（４）を満たす関係を有する化合物である、［８］に記載の使用。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000030
［１１］　前記（ジ）アリルアミン系化合物が、（ジ）アリルアミン系（共）重合体である、［８］～［１０］のいずれか１項に記載の使用。
［１２］　前記核酸が、ＤＮＡである［８］～［１１］のいずれか１項に記載の使用。
［１３］　［１］～［４］の何れか１項に記載する（ジ）アリルアミン系化合物を、核酸を含有する水溶液中に添加する、核酸の安定化方法。
［１４］　［１］～［４］の何れか１項に記載する（ジ）アリルアミン系化合物を、核酸と共に含む、水溶液。
[１５]　一般式（Ｉ－ａ）、一般式（Ｉ－ｂ）若しくは一般式（Ｉ－ｃ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
（式中、Ｒ１は水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（Ａ）、
　一般式（Ｉ－ｄ）、一般式（Ｉ－ｅ）若しくは一般式（Ｉ―ｆ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
（式中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～２０のアルキル基、炭素数５～２０のシクロアルキル基、または炭素数７～２０のアラルキル基であり、Ｘａ－はカウンターイオンを示し、ａは該カウンターイオンの価数を示す。）で表される構造を有する構成単位（Ｂ）、並びに
一般式（Ｉ－ｇ）若しくは一般式（１―ｈ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
（式中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１２のアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、又は炭素数５～６のシクロアルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（Ｃ）、
　からなる群の中から選ばれる少なくとも１種の（ジ）アリルアミン系の構成単位を有し、
　下記式（１）で算出される化学構造パラメーターＰと、分子量（（ジ）アリルアミン系化合物が（ジ）アリルアミン系（共）重合体である場合には、重量平均分子量により特定される。）Ｍとが下記式（２）を満たす関係を有する（ジ）アリルアミン系化合物を、核酸と溶液中で混合して、前記核酸の融解温度（Ｔｍ値）を上昇させる方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000037
（式中、ｎは前記（ジ）アリルアミン系化合物を構成する構成単位種の数を示し、ｍｉは構成単位ｉのモル比を示し、aijは構成単位ｉ中のｊ級アミン（又はアンモニウム塩）の数を示し、oiは構成単位ｉ中のカルボニル基の数を示し、siは構成単位ｉ中のスルホニル基の数を示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000038
［１６］　前記（ジ）アリルアミン系化合物は、前記Ｐ及びＭが下記式（３）を満たす関係を有する化合物である、［１５］に記載の方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000039
［１７］　前記（ジ）アリルアミン系化合物は、前記Ｐ及びＭが下記式（４）を満たす関係を有する化合物である、［１５］に記載の方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000040
［１８］　前記（ジ）アリルアミン系化合物が、（ジ）アリルアミン系（共）重合体である、［１５］～［１７］のいずれか１項に記載の方法。
［１９］　前記核酸が、ＤＮＡである、［１５］～［１８］のいずれか１項に記載の方法。
　本発明の核酸のＴｍ値上昇化剤は、上述の特定の構造の有する（ジ）アリルアミン系化合物を含むことで、核酸のＴｍ値を顕著に上昇させる。これを利用して、ゲノム核酸中の変異の検出をより高感度で実施可能にすることが期待される。また、核酸を含む組成物に添加することで核酸を安定化することが期待される。
　ここで、「融解温度（Ｔｍ値）」は、二本鎖核酸の５０％が一本鎖に変性する温度を意味するが、本願明細書において、Ｔｍ値は、インターカレーターを用いて、リアルタイムＰＣＲシステムにて、４０℃（ただし、４０℃から昇温させて、Ｔｍ値が測定できない場合、又は、Ｔｍ値が５０℃未満の場合には１０℃）から、９５℃まで０．３℃上昇する毎に蛍光強度を計測して二本鎖融解曲線を作成し、この二本鎖融解曲線から微分法により求められるＴｍ値を意味する。
　本発明の核酸のＴｍ値上昇化剤は、特定構造の（ジ）アリルアミン系構成単位を有する（ジ）アリルアミン系化合物であって、その化学構造から算出されるパラメーターとその分子量Ｍとが特定の関係を充足するもの（以下「特定化合物」ともいう。）を含む。
　本発明の核酸のＴｍ値上昇化剤は、上記特定化合物のみで構成されていてもよく、特定化合物に加えて、それ以外の成分を含んでいてもよい。
　特定化合物
　上記特定化合物は、上述の様に特定構造の（ジ）アリルアミン系構成単位を有するものであり、複数の（ジ）アリルアミン系構成単位を有する（共）重合体（以下、「特定（共）重合体」ともいう。）であってもよく、単独の（ジ）アリルアミン系構成単位を有する単量体（以下、「特定単量体」ともいう。）であってもよい。保存安定性やＴｍ値上昇効果等の観点からは、複数の（ジ）アリルアミン系構成単位を有するジアリルアミン（共）重合体（特定（共）重合体）であることが好ましい。
　特定（共）重合体
　本発明において用いられる特定化合物の好ましい形態である特定（共）重合体は、
　一般式（Ｉ－ａ）若しくは一般式（Ｉ－ｂ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
（式中、Ｒ１は水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（Ａ１）、
　一般式（Ｉ－ｄ）若しくは一般式（Ｉ－ｅ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
（式中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～２０のアルキル基、炭素数５～２０のシクロアルキル基、または炭素数７～２０のアラルキル基であり、Ｘａ－はカウンターイオンを示し、ａは該カウンターイオンの価数を示す。）で表される構造を有する構成単位（Ｂ１）、並びに
一般式（１－ｇ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
（式中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１２のアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、又は炭素数５～６のシクロアルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（Ｃ１）、
　からなる群の中から選ばれる少なくとも１種の（ジ）アリルアミン系構成単位（α）を有し、
　下記式（１）で算出される化学構造パラメーターＰと、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍとが下記式（２）を満たす関係を有する（ジ）アリルアミン（共）重合体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000044
　式中、ｎは前記（共）重合体を構成する構成単位種の数を示し、ｍｉは構成単位ｉのモル比を示し、aijは構成単位ｉ中のｊ級アミン（又はアンモニウム塩）の数を示し、oiは構成単位ｉ中のカルボニル基の数を示し、siは構成単位ｉ中のスルホニル基の数を示す。ここで、「ｊ級アミン」は、見かけ上、「ｊ級アミン」に該当するものを計算する。また、「カルボニル基」は、見かけ上、「カルボニル基」に該当するものを計算する。例えば、アクリルアミドが構成単位である場合において、アミド基中の窒素原子は、１級アミンとして計算し、アミド基中の酸素原子は、１つのカルボニル基として計算する。
　ここで、前記共重合体を構成する各構成単位のモル比は、前記共重合体を構成する構成単位の構造が既知である場合、前記共重合体をイソプロピルアルコール又はアセトン等の有機溶媒で再沈し、再沈物について、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　２４００ＩＩ　ＣＨＮＳ／Ｏ全自動元素分析装置又は同等の性能の装置を用いて、前記共重合体を構成する構成単位の構造に応じた適宜のモードで分析することで特定することができる。なお、測定は、キャリアーガスとしてヘリウムガスを使用し錫カプセルに固体試料を量りとり、燃焼管内に落下して純酸素ガス中で燃焼温度１８００℃以上で試料を燃焼し、分離カラム及び熱伝導検出器によるフロンタルクロマトグラフィー方式で各測定成分を検出し、校正係数を用いて各元素の含有率を定量することで行うことができる。また、前記共重合体におけるカチオン性構成単位及びアニオン性構成単位の構造が未知である場合、上記元素分析装置による測定の前に、１Ｈ－ＮＭＲ又は１３Ｃ－ＮＭＲを用いた公知の方法により、前記共重合体を構成する構成単位の構造を特定する。また、前記共重合体の製造（共重合）において供給した各単量体の量、及び前記共重合体に取り込まれずに残留した各単量体の量から計算することもできる。なお、前記共重合体における各単量体から導かれる構成単位の割合（モル比）は、各構成単位の仕込み組成（モル比）とほぼ一致するため、本明細書では便宜的にモノマーの配合比を構成単位の割合（モル比）として取り扱う事がある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000045
　（ジ）アリルアミン系構成単位（α）
　上述の様に、本発明で使用される特定（共）重合体は、特定構造の（ジ）アリルアミン系構成単位（以下、「（ジ）アリルアミン系構成単位（α）」ともいう。）を有する。
　特定（共）重合体は、（ジ）アリルアミン系構成単位（α）のみで構成されていてもよく、（ジ）アリルアミン系構成単位（α）以外の構成単位を有していてもよい。（ジ）アリルアミン系構成単位（α）以外の構成単位としては、（ジ）アリルアミン系構成単位（α）以外の各種カチオン性構成単位、各種ノニオン性構成単位、各種アニオン性構成単位等を挙げることができる。
　上記の特定構造の（ジ）アリルアミン系構成単位が特定（共）重合体の全構成単位に占める割合には特に制限は無いが、通常４０モル％以上であり、好ましくは５０～１００モル％であり、より好ましくは７０～１００モル％であり、特に好ましくは８０～１００モル％である。
　また、（ジ）アリルアミン系構成単位（α）以外の構成単位としてノニオン性構成単位を含む場合、（ジ）アリルアミン系構成単位（α）とノニオン性構成単位とが合計で前記特定構造の（ジ）アリルアミン系構成単位が特定（共）重合体の全構成単位に占める割合は、通常５０モル％以上であり、好ましくは７０～１００モル％であり、より好ましくは８０～１００モル％であり、特に好ましくは９０～１００モル％である。
　本発明において用いられる特定（共）重合体を構成する（ジ）アリルアミン系構成単位（α）は、より具体的には、下記の構成単位（Ａ１）、構成単位（Ｂ１）、及び構成単位（Ｃ１）からなる群の中から選ばれる少なくとも１種のカチオン性の構成単位である。
　特定（共）重合体は、（ジ）アリルアミン系構成単位（α）を１種類のみを含んでいてもよく、２種類以上の（ジ）アリルアミン系構成単位（α）を含んでいてもよい。２種類以上の（ジ）アリルアミン系構成単位（α）を含む場合の当該２種類以上の（ジ）アリルアミン系構成単位（α）は、ともに構成単位（Ａ１）に分類される２種類以上の構成単位の組み合わせ、ともに構成単位（Ｂ１）に分類される２種類以上の構成単位の組み合わせ、又はともに構成単位（Ｃ１）に分類される２種類以上の構成単位の組み合わせであってもよく、構成単位（Ａ１）から（Ｃ１）のうち互いに異なるものに分類される構成単位同士の組み合わせであってもよい。
　特定（共）重合体を構成し得る構成単位（Ａ１）から（Ｃ１）は、いずれもアミノ基を有するものであるが、高い融解温度（Ｔｍ値）上昇効果を実現するという観点から、第二級、第三級又は第四級のアミノ基を有することが好ましく、第三級又は第四級のアミノ基を有することがより好ましく、第四級のアミノ基を有することが特に好ましい。この観点から、特定（共）重合体は、（ジ）アリルアミン系構成単位（α）として構成単位（Ｂ１）に該当するものを少なくとも１種有することが好ましい。
　構成単位（Ａ１）
　構成単位（Ａ１）は、下記一般式（Ｉ－ａ）若しくは一般式（Ｉ－ｂ）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
　式中、Ｒ１は水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基を示す。Ｒ１は、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基であることが好ましく、炭素数１～４のアルキル基であることがより好ましく、メチル基又はエチル基であることがさらに好ましく、メチル基であることが特に好ましい。
　化学構造パラメーターＰの値を高いものとする等の観点から、構成単位（Ａ１）の少なくとも一部は、第３級のアミノ基を有することが好ましい。全構成単位（Ａ１）に占める、第３級のアミノ基を有するものの割合は、５０モル％以上であることが好ましく、７０～１００モル％であることがより好ましく、９０～１００モル％であることがより好ましい。
　構成単位（Ａ１）は、上記の構造式（Ｉ－ａ）、又は（Ｉ－ｂ）で示される構造の無機酸塩、若しくは有機酸塩等である構造、すなわち酸付加塩である構造を有していてもよい。
　特定（共）重合体が構成単位（Ａ１）を有する場合、特定（共）重合体の製造にあたっては、製造コスト等の観点からは、付加塩を有するジアリルアミンモノマーを用いることが好ましい。重合体からＨＣｌ等の付加塩を除去するプロセスは煩雑であり、コスト増大の原因ともなることから、その様なプロセスを要さずして製造可能である、付加塩型の構成単位（Ａ１）を用いることは、コスト等の観点からも好ましい実施形態である。
　入手の容易さや反応の制御性等の観点から、この実施形態の構成単位（Ａ１）における無機酸塩、又は有機酸塩は、塩酸塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩、又はアルキルサルフェート塩であることが好ましく、塩酸塩であることが特に好ましい。
　構成単位（Ｂ１）
　構成単位（Ｂ１）は、下記一般式（Ｉ－ｄ）若しくは一般式（Ｉ－ｅ）で表される構造を有する構成単位である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
　式中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～２０のアルキル基、炭素数５～２０のシクロアルキル基、又は炭素数７～２０のアラルキル基であり、Ｘａ－はカウンターイオンを示し、ａは該カウンターイオンの価数を示す。
　Ｒ２及びＲ３の少なくとも一方は水素原子以外であることが好ましく、両方が水素原子以外であることが好ましい。
　Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に、メチル基、エチル基、又はベンジル基であることが好ましく、メチル基又はエチル基であることがより好ましく、メチル基であることが特に好ましい。
　化学構造パラメーターＰの値を高いものとする等の観点から、構成単位（Ｂ１）の少なくとも一部は、第３級又は第４級のアミノ基又はアンモニウム塩を有することが好ましい。全構成単位（Ｂ１）に占める、第３級又は第４級のアミノ基又はアンモニウム塩を有するものの割合は、５０モル％以上であることが好ましく、７０～１００モル％であることがより好ましく、９０～１００モル％であることがより好ましい。
　カウンターイオンＸａ－には特に限定はないが、入手の容易さや反応の制御性等の観点から、塩素イオン、カルボン酸イオン、スルホン酸イオン、又はアルキルサルフェートイオンであることが好ましく、塩素イオン、又はエチルサルフェートイオンであることが特に好ましい。
　特定（共）重合体の製造にあたっては、製造コスト等の観点からは、カウンターイオンを有するジアリルアミンモノマーを用いることが好ましい。（共）重合体からカウンターイオンを除去するプロセスは煩雑であり、コスト増大の原因ともなることから、その様なプロセスを要さずして製造可能である、カウンターイオン型の構成単位（Ｂ１）を有する（共）重合体を使用することは、コスト等の観点からも好ましい実施形態である。
　構成単位（Ｃ１）
　構成単位（Ｃ１）は、下記一般式（Ｉ－ｇ）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
　式中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１２のアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、又は炭素数５～６のシクロアルキル基を示す。
　Ｒ４及びＲ５の少なくとも一方は水素原子以外であることが好ましく、両方が水素原子以外であることがより好ましい。
　Ｒ４及びＲ５として好ましい炭素数１～１２のアルキル基又は炭素数７～１０のアラルキル基は、直鎖状、枝分かれ状のいずれであってもよい。その例としてはメチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、デシル基、ドデシル基、ベンジル基などが挙げられる。また、Ｒ４及びＲ５として好ましい炭素数５～６のシクロアルキル基としては、シクロペンチル基およびシクロヘキシル基が挙げられるが、これらには限定されない。
　化学構造パラメーターＰの値を高いものとする等の観点から、構成単位（Ｃ１）の少なくとも一部は、第３級のアミノ基を有することが好ましい。全構成単位（Ｃ１）に占める、第３級のアミノ基を有するものの割合は、５０モル％以上であることが好ましく、７０～１００モル％であることがより好ましく、９０～１００モル％であることがより好ましい。
　構成単位（Ｃ１）が一般式（Ｉ－ｅ）で表される構造の酸付加塩である場合の付加塩の種類には特に制限はないが、入手性や反応の制御の容易さ等の観点から、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、亜硫酸塩、亜リン酸塩、亜硝酸塩、臭化水素酸塩、酢酸塩、アミド硫酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩等を使用することができる。
　中でも、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、及びアミド硫酸塩が好ましく、モノアリルアミンから導かれる構造の塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、及びアミド硫酸塩が特に好ましい。
　本発明において使用される特定化合物の好ましい形態である特定（共）重合体は、下記式（１）で算出される化学構造パラメーターＰと、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍとが下記式（２）を満たす関係を有する（ジ）アリルアミン（共）重合体である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000049
　式中、ｎは前記（共）重合体を構成する構成単位種の数を示し、ｍｉは構成単位ｉのモル比を示し、aijは構成単位ｉ中のｊ級アミン（又はアンモニウム塩）の数を示し、oiは構成単位ｉ中のカルボニル基の数を示し、siは構成単位ｉ中のスルホニル基の数を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000050
　特定（共）重合体の化学構造パラメーターＰと重量平均分子量Ｍとが上記式（２）に規定される関係を有することで、特定（共）重合体を含む本実施形態の核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤は、ハイブリダイゼーションした二本鎖核酸のＴｍ値を効果的に上昇させることができる。
　化学構造パラメーターＰ
　特定（共）重合体の化学構造パラメーターＰは、下式（１）により算出される値であり、（共）重合体を構成する構成単位中のアミンをはじめとする各種の基が本実施形態の効果に寄与する度合いを合算し総合的に表すパラメーターである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000051
　式中、ｎは特定（共）重合体を構成する構成単位種の数を示し、ｍｉは構成単位ｉのモル比を示し、aijは構成単位ｉ中のｊ級アミン（又はアンモニウム塩）の数を示し、oiは構成単位ｉ中のカルボニル基の数を示し、siは構成単位ｉ中のスルホニル基の数を示す。
　ここで、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000052
は、当該構成単位種ｉ中のアミン又はアンモニウム塩の寄与の合計を示し、アミン又はアンモニウム塩の級数ｊが大きい程大きな寄与が加算される。oiは、当該構成単位種ｉ中のカルボニル基の寄与を示し、同数の第１級アミンと同等の寄与が加算される。２×siは、当該構成単位種ｉ中のスルホニル基の寄与を示し、同数の第２級アミンと同等の寄与が加算される。
　この様にして計算される当該構成単位種ｉの寄与
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000053
を、当該構成単位種ｉのモル比miに応じ全構成単位種ｉからｎに亘って（１）式に従い加重平均して、化学構造パラメーターＰを算出する。
　上記式（２）の条件を満たす限りにおいて、化学構造パラメーターＰの値自体には特に制限は無いが、特定（共）重合体の重量平均分子量Ｍが製造、使用が比較的容易となる範囲にある場合に上記式（２）の条件を満たす観点や、一層好ましい下記式（３）や（４）の条件を満たすことを容易にする観点などから、１.２０～４.５０であることが好ましく、２.１０～４.２０であることがより好ましく、２.８０～４.００であることがさらに好ましく、３．００～４．００であることがとりわけ好ましく、３．４０～４．００の範囲であることが特に好ましく、３．５０～３．８５であることが最も好ましい。
　化学構造パラメーターＰは、特定（共）重合体の化学構造、特に各構成単位の種類及び割合を選択、調整することによって適宜調整することが可能である。例えば、第３級又は第４級のアミン又はアンモニウム塩を有する構成単位を導入し、その割合を増やすことで、化学構造パラメーターＰの値を高いものとすることができる。また、アミン若しくはアンモニウム塩、カルボニル基、又はスルホニル基のいずれをも有しない構成単位を導入し、その割合を増やすことで、化学構造パラメーターＰの値を低いものとすることができる。
　化学構造パラメーターＰの値を高いものとする等の観点から、特定（共）重合体は、第３級又は第４級のアミン又はアンモニウム塩を有する構成単位を有することが好ましく、（ジ）アリルアミン系構成単位（α）であって第３級又は第４級アミン又はアンモニウム塩を有するものを有することが特に好ましい。特定（共）重合体の全構成単位に占める、（ジ）アリルアミン系構成単位（α）であって第３級又は第４級アミン又はアンモニウム塩を有するものの割合は、４０モル％以上であることが好ましく、５０～１００モル％であることがより好ましく、７０～１００モル％であることがより好ましく、８０～１００モル％であることが特に好ましい。
　また、第３級又は第４級のアミン又はアンモニウム塩を有する構成単位以外の構成単位としてノニオン性構成単位を含む場合、第３級又は第４級のアミン又はアンモニウム塩を有する構成単位とノニオン性構成単位とが合計で特定（共）重合体の全構成単位に占める割合は、通常５０モル％以上であり、７０～１００モル％であり、より好ましくは８０～１００モル％であり、特に好ましくは９０～１００モル％である。
　特定（共）重合体の化学構造パラメーターＰと重量平均分子量Ｍとは、下記式（２）に規定される関係を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000054
　すなわち、化学構造パラメーターＰの三乗と重量平均分子量Ｍの１／４乗との比、Ｐ３／Ｍ１／４は、０．８４以上１２．６７以下の数値範囲内となる。
　特定（共）重合体の化学構造パラメーターＰと重量平均分子量Ｍとが上記式（２）に規定される関係を有することで、特定（共）重合体を含む本実施形態の核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤は、ハイブリダイゼーションした二本鎖核酸のＴｍ値を効果的に上昇させることができる。Ｔｍ値を効果的に上昇させることで、例えば、本実施形態の核酸のＴｍ値上昇化剤以外にＴｍ値に影響を与える物質が存在しない場合において、特定（共）重合体を含む本実施形態の核酸のＴｍ値上昇化剤の存在下で測定したハイブリダイゼーションした二本鎖核酸のＴｍ値と、当該上昇化剤が存在しない以外は同一の条件で測定したハイブリダイゼーションした二本鎖核酸のＴｍ値との差異を、２０℃以上とすることができる。なお、Ｔｍ値の上昇値の上限は特に限定されないが、例えば、５０℃である。
　特定（共）重合体の化学構造パラメーターＰと重量平均分子量Ｍとは、下記式（３）に規定される関係を有することが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000055
　すなわち、化学構造パラメーターＰの三乗と重量平均分子量Ｍの１／４乗との比、Ｐ３／Ｍ１／４は、２．３７以上６．９２以下の数値範囲内となることが好ましい。
　特定（共）重合体の化学構造パラメーターＰと重量平均分子量Ｍとが上記式（３）に規定される関係を有することで、特定（共）重合体を含む本実施形態の核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤は、ハイブリダイゼーションした二本鎖核酸のＴｍ値を更に効果的に上昇させることができる。Ｔｍ値を更に効果的に上昇させることで、例えば、本実施形態の核酸のＴｍ値上昇化剤以外にＴｍ値に影響を与える物質が存在しない場合において、特定（共）重合体を含む本実施形態の核酸のＴｍ値上昇化剤の存在下で測定したハイブリダイゼーションした二本鎖核酸のＴｍ値と、当該上昇化剤が存在しない以外は同一の条件で測定したハイブリダイゼーションした二本鎖核酸のＴｍ値との差異を、３０℃以上とすることができる。
　特定（共）重合体の化学構造パラメーターＰと重量平均分子量Ｍとは、下記式（４）に規定される関係を有することが特に好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000056
　すなわち、化学構造パラメーターＰの三乗と重量平均分子量Ｍの１／４乗との比、Ｐ３／Ｍ１／４は、２．６０以上３．００以下の数値範囲内となることが好ましい。
　特定（共）重合体の化学構造パラメーターＰと重量平均分子量Ｍとが上記式（４）に規定される関係を有することで、特定（共）重合体を含む本実施形態の核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤は、ハイブリダイゼーションした二本鎖核酸のＴｍ値を特に効果的に上昇させることができる。Ｔｍ値を特に効果的に上昇させることで、例えば、本実施形態の核酸のＴｍ値上昇化剤以外にＴｍ値に影響を与える物質が存在しない場合において、特定（共）重合体を含む本実施形態の核酸のＴｍ値上昇化剤の存在下で測定したハイブリダイゼーションした二本鎖核酸のＴｍ値と、当該上昇化剤が存在しない以外は同一の条件で測定したハイブリダイゼーションした二本鎖核酸のＴｍ値との差異を、３５℃以上とすることができる。
　上記式（２）の条件を満たす限りにおいて、特定（共）重合体の重量平均分子量Ｍには特に制限は無く、化学構造パラメーターＰとの関係や、本実施形態の核酸のＴｍ値上昇化剤の使用形態や他の成分等との関係で適宜好適な重量平均分子量Ｍの特定（共）重合体を入手又は重合すればよい。
　核酸等と反応液を形成する容易さや、実用上許容可能な時間及びコストで重合を行う観点からは、特定（共）重合体の重量平均分子量Ｍ（Ｍｗ）は４００～４０００００であることが好ましい。重量平均分子量Ｍ（Ｍｗ）は、６００～３６００００であることがより好ましく、７００～３０００００であることがさらに好ましく、３５００～２５００００であることがとりわけ好ましく、８０００～２４００００であることが特に好ましく、１０００００～２０００００であることが最も好ましい。
　特定（共）重合体の重量平均分子量Ｍ（Ｍｗ）は、液体クロマトグラフを使用し、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ法）によって測定したものである。より具体的には、例えば本願実施例に記載の方法によって測定することができる。
　特定（共）重合体の重量平均分子量Ｍは、重合に寄与するモノマーの種類及び組成、重合工程における温度、時間及び圧力、重合工程で用いるラジカル開始剤等の種類及び量等を調整することで、適宜調整することができる。
　特定（共）重合体の回転粘度［η］にも特に制限は無く、本実施形態の核酸のＴｍ値上昇化剤における使用形態や製造コスト等を考慮して適宜設定することができるが、２５．０質量％水溶液の状態で、１．０～１５００．０ｍＰａ・ｓ（２５℃）であることが好ましく、１．５～１０００．０ｍＰａ・ｓ（２５℃）であることが特に好ましい。
　回転粘度［η］は、当業界において慣用される方法により測定することができるが、例えば、ＡＭＥＴＥＫ　Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ製デジタルＢ型粘度計ＤＶ－３Ｔにより測定することができる。測定にあたっては、ＵＬＡアダプターを使用し、典型的には液量１６ｍｌ、液温２５℃で測定することができる。
　回転粘度［η］も、重合時の希釈濃度、重合に寄与するモノマーの種類及び組成、重合工程における温度、時間及び圧力、重合工程で用いるラジカル開始剤等の種類及び量等を調整することで、適宜調整することができる。
　それ以外の構成単位
　特定（共）重合体は、上記（ジ）アリルアミン系構成単位（α）に加えて、それ以外の構成単位を有していてもよい。
　それ以外の構成単位としては、（ジ）アリルアミン系構成単位（α）以外の各種カチオン性構成単位、各種のアニオン性構成単位、各種のノニオン性構成単位等を挙げることができる。
　化学構造パラメーターＰに寄与し得るカルボニル基やスルホニル基を含む構成単位を選択できるという観点から、特定（共）重合体はノニオン性構成単位を更に含むことが好ましい。
　アニオン性構成単位
　本実施形態においては、アニオン性構成単位を有することで、特定（共）重合体がいわゆる両性高分子となる。
　本実施形態におけるアニオン性構成単位は、下記の構造式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、又は（Ｖ）で示される構造を有することが好ましい。このとき、化学構造パラメーターＰに寄与し得るカルボニル基を特定（共）重合体の構造中に導入することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
　但し上記式（ＩＩＩ）中、Ｒ６は、水素又はメチル基であり、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、及び（Ｖ）中、Ｙは、結合するカルボキシ基ごとにそれぞれ独立に水素、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４、１／２Ｃａ、１／２Ｍｇ、１／２Ｆｅ、１／３Ａｌ、又は１／３Ｆｅである。
　アニオン性構成単位は、カルボキシル基等のアニオン性基を有する限りにおいて、上記の構造式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、及び（Ｖ）のいずれにも該当しない構造を有していてもよく、例えばメタクリル酸、アクリル酸等から導かれる構成単位であってもよい。
　アニオン性構成単位は、前記（ジ）アリルアミン系構成単位（α）のポジティブチャージを調整するため、Ｔｍ値の上昇量を所望の値に調整したい場合には、含まれることが好ましいが、Ｔｍ値の上昇量を高めるという観点からは含まれないことが好ましい。
　特定（共）重合体がアニオン性構成単位を有する場合には、１種類のみのアニオン性構成単位を単独で用いてもよいし、複数種類の互いに異なる構造のアニオン性構成単位を組み合わせて用いてもよい。
　特定（共）重合体がアニオン性構成単位を有する場合のアニオン性構成単位の含有量には特に制限はなく、（ジ）アリルアミン系構成単位（α）の種類及び量との関係において適切な化学構造パラメーターＰが得られる様に適宜設定すればよい。
　アニオン性構成単位が不飽和ジカルボン酸から導かれる場合には、（ジ）アリルアミン系構成単位（α）とのモル比が、（ジ）アリルアミン系構成単位（α）／アニオン性構成単位＝１／０．１～０．１／１であることが好ましく、１／０．５～２／１であることが特に好ましい。
　アニオン性構成単位の少なくとも一部は、アクリル酸、メタクリル酸等の不飽和モノカルボン酸から導かれるものであってもよい。アニオン性構成単位が不飽和モノカルボン酸から導かれる場合には、（ジ）アリルアミン系構成単位（α）／アニオン性構成単位）の比率は２／１～０．１／１であることが好ましく、１／１～０．５／１であることが特に好ましい。
　ノニオン性構成単位
　本実施形態においては、ノニオン性構成単位を有することで、化学構造パラメーターＰに寄与し得るカルボニル基やスルホニル基を含む構成単位を選択して導入することもできる。
　本実施形態におけるノニオン性構成単位は、（ジ）アリルアミン系構成単位（α）を導く単量体と共重合可能な非イオン性の単量体から導かれる構成単位であればよく、特にそれ以外の制限はないが、メタクリル酸エステル系単量体、アクリル酸エステル系単量体、メタクリルアミド系単量体、アクリルアミド系単量体、二酸化硫黄等から導かれる構成単位を、好ましく用いることができる。より具体的な例としては、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ブチル、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、メタクリルアミド、Ｎ－メチルメタクリルアミド、ジメチルメタクリルアミド、Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）メタクリルアミド、アクリルアミド、ジメチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド塩化メチル４級塩、アクリロイルモルフォリン、イソプロピルアクリルアミド、４-ｔ-ブチルシクロヘキシルアクリレート、又は二酸化硫黄から導かれる構成単位を挙げることができる。中でも、二酸化硫黄、アクリルアミド系単量体等から導かれる構成単位が特に好ましい。
　ノニオン性構成単位は、通常、単量体として非イオン性の単量体を用いることで、高分子中に導入することができる。特定（共）重合体がノニオン性構成単位を有する場合のノニオン性構成単位の含有量には特に制限はなく、またノニオン性構成単位の種類によってもその好適な量は異なるが、（ジ）アリルアミン系構成単位（α）の種類及び量との関係において適切な化学構造パラメーターＰが得られる様に、当業者において適宜設定することができる。例えば、二酸化硫黄から導かれる構成単位を導入することで、化学構造パラメーターＰに寄与し得るスルホニル基を特定（共）重合体の構造中に導入することができる。
　例えば、（ジ）アリルアミン系構成単位（α）とのモル比が、（ジ）アリルアミン系構成単位（α）／ノニオン性構成単位＝１／０．０５～１／０．０５であることが好ましく、１／０．１～０．１／１であることが特に好ましい。
　ノニオン性構成単位がメタクリル酸エステル系単量体、アクリル酸エステル系単量体、メタクリルアミド系単量体、又はアクリルアミド系単量体から導かれる場合には、上記比率は１／０．０５～１／０．５であることが好ましく、１／０．１～１／１であることが特に好ましい。
　ノニオン性構成単位が二酸化硫黄から導かれる場合には、上記比率は１／０．１～１／１．５であることが好ましく、１／０．２５～１／１であることが特に好ましい。
　特定（共）重合体の製造方法
　特定（共）重合体の製造方法には特に制限はなく、従来当該技術分野において公知の方法で製造することができるが、例えば（ジ）アリルアミン系構成単位（α）に対応する構造の（ジ）アリルアミン系単量体、及び所望によりノニオン性構成単位等のそれ以外構成単位に対応する単量体を共重合することにより製造することができる。
　（ジ）アリルアミン系構成単位（α）に対応する構造の（ジ）アリルアミン系単量体等を（共）重合する場合の溶媒は特に限定されず、水系の溶媒であっても、アルコール、エーテル、スルホキシド、アミド等の有機系の溶媒であってもよいが、水系の溶媒であることが好ましい。
　（ジ）アリルアミン系構成単位（α）に対応する構造の（ジ）アリルアミン系単量体等を（共）重合する場合の単量体濃度は単量体の種類により、また（共）重合を行う溶媒の種類により、異なるが、水系の溶媒の場合通常１０～７５質量％である。この共重合反応は、通常、ラジカル重合反応であり、ラジカル重合触媒の存在下に行なわれる。ラジカル重合触媒の種類は特に限定されるものでなく、その好ましい例として、ｔ－ブチルハイドロパーオキサイドなどの過酸化物、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウムなどの過硫酸塩、アゾビス系、ジアゾ系などの水溶性アゾ化合物が挙げられる。
　ラジカル重合触媒の添加量は、一般的には全単量体に対して０．１～２０モル％、好ましくは１．０～１０モル％である。重合温度は一般的には０～１００℃、好ましくは５～８０℃であり、重合時間は一般的には１～１５０時間、好ましくは５～１００時間である。重合雰囲気は、大気中でも重合性に大きな問題を生じないが、窒素などの不活性ガスの雰囲気で行なうこともできる。
　特定単量体
　本発明において用いられる特定化合物の他の一形態である特定単量体は、
　一般式（Ｉ－ｃ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
（式中、Ｒ１は水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である単量体構造（Ａ２）（以下、「構成単位（Ａ２）」ともいう。）、
　一般式（Ｉ－ｆ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
（式中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～２０のアルキル基、炭素数５～２０のシクロアルキル基、または炭素数７～２０のアラルキル基であり、Ｘａ－はカウンターイオンを示し、ａは該カウンターイオンの価数を示す。）で表される構造である単量体構造（Ｂ２）（以下、「構成単位（Ｂ２）」ともいう。）、並びに
　一般式（Ｉ－ｈ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
（式中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１２のアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、又は炭素数５～６のシクロアルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である単量体構造（Ｃ２）（以下、「構成単位（Ｃ２）」ともいう。）、
　からなる群の中から選ばれる少なくとも１種の（ジ）アリルアミン系の構造（構成単位）を有し、
　下記式（１）で算出される化学構造パラメーターＰと、分子量Ｍとが下記式（２）を満たす関係を有する（ジ）アリルアミン系化合物（（ジ）アリルアミン系単量体）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000063
（式中、ｎは前記（ジ）アリルアミン系化合物を構成する構成（単位）種の数を示し、ｍｉは構成単位ｉのモル比を示し、aijは構成単位ｉ中のｊ級アミン（又はアンモニウム塩）の数を示し、oiは構成単位ｉ中のカルボニル基の数を示し、siは構成単位ｉ中のスルホニル基の数を示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000064
　特定単量体においては、上記式（１）中、単量体であるためにｎ＝１であり、したがって分母と分子とのｍｉは相殺される。また、式（Ｉ－ｃ）、（Ｉ－ｆ）及び（Ｉ－ｈ）で表される構造のいずれにおいても１個のアミノ基しか存在しないので、aijは１である。したがって、式（１）は、下記式（１’）に簡略化することができる。
　Ｐ＝ｊ+ｏ+２×ｓ　・・・　（１’）
（式中、ｊは単量体構造中のアミノ基の級数、ｏは単量体構造中のカルボニル基の数、ｓは単量体構造中のスルホニル基の数を示す。）
　上記式（２）の条件を満たす限りにおいて、特定単量体の化学構造パラメーターＰの値自体には特に制限は無いが、現実的な特定単量体の分子量Ｍとの関係において上記式（２）の条件を満たす観点などから、２．００～４．００であることが好ましく、２．００～３．００であることが特に好ましい。
　特定単量体の化学構造パラメーターＰは、特定単量体の化学構造、特にアミノ基の級数や、カルボニル基及び／又はスルホニル基の有無及び数を選択、調整することによって適宜調整することが可能である。
　化学構造パラメーターＰの値を高いものとする等の観点から、特定単量体は、第２級又は第３級のアミン又はアンモニウム塩を有することが好ましい。
　特定単量体においては、上記式（２）中の分子量Ｍは、当該特定単量体分子の分子量であり、特定単量体の化学構造から計算することができる。
　上記式（２）の条件を満たす限りにおいて、特定単量体の分子量Ｍには特に制限は無いが、化学構造パラメーターＰとの関係において上記式（２）の条件を容易に満たすことや、取り扱いの容易さ等の観点から、１００～７００であることが好ましく、１２０～３００であることが特に好ましい。
　特定単量体についても、上記特定（共）重合体と同様に、化学構造パラメーターＰと分子量Ｍとが、上記式（３）を満たす関係を有することが好ましく、上記式（４）を満たす関係を有することがより好ましい。
　単量体構造（Ａ２）
　特定単量体の構造の一選択肢である単量体構造（Ａ２）（構成単位（Ａ２））は、下記一般式（Ｉ－ｃ）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
　式（Ｉ－ｃ）中、Ｒ１は水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基を示す。Ｒ１の好ましい例は、構成単位（Ａ１）に関して上記にて説明したものと同様である。
　単量体構造（Ａ２）が一般式（Ｉ－ｃ）で表される構造の酸付加塩である場合の好ましい酸付加塩の例も、構成単位（Ａ１）に関して上記にて説明したものと同様である。
　好ましい単量体構造（Ａ２）の具体例として、ジアリルメチルアミン塩酸塩、ジアリルアミン、ジアリルアミン塩酸塩等を挙げることができる。
　単量体構造（Ｂ２）
　特定単量体の構造の一選択肢である単量体構造（Ｂ２）（構成単位（Ｂ２））は、下記一般式（Ｉ－ｆ）で表される構造である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
　式中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～２０のアルキル基、炭素数５～２０のシクロアルキル基、または炭素数７～２０のアラルキル基であり、Ｘａ－はカウンターイオンを示し、ａは該カウンターイオンの価数を示す。
　Ｒ２及びＲ３の好ましい例は、構成単位（Ｂ１）に関して上記にて説明したものと同様である。
　カウンターイオンＸａ－の好ましい例も、構成単位（Ｂ１）に関して上記にて説明したものと同様である。
　好ましい単量体構造（Ｂ２）の具体例として、ジアリルジノナデシルアンモニウムクロリド、ジアリルジイコシルアンモニウムクロリド等を挙げることができる。
　単量体構造（Ｃ２）
　特定単量体の構造の一選択肢である単量体構造（Ｃ２）（構成単位（Ｃ２））は、下記一般式（Ｉ－ｈ）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
　式中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１２のアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、又は炭素数５～６のシクロアルキル基を示す。
　Ｒ４及びＲ５の好ましい例は、構成単位（Ｃ１）に関して上記にて説明したものと同様である。
　単量体構造（Ｃ２）が一般式（Ｉ－ｈ）で表される構造の酸付加塩である場合の好ましい酸付加塩の例も、構成単位（Ｃ１）に関して上記にて説明したものと同様である。
　好ましい単量体構造（Ｃ２）の具体例として、Ｎ，Ｎ－ジメチルアリルアミン、メトキシカルボニル化アリルアミン等を挙げることができる。
　以上説明した特定（共）重合体及び特定単量体を総合して、本発明において用いられる特定化合物を、以下の様に特定することもできる。
　すなわち、本発明における特定化合物は、一般式（Ｉ－ａ）、一般式（Ｉ－ｂ）若しくは一般式（Ｉ－ｃ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
（式中、Ｒ１は水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（Ａ）、
　一般式（Ｉ－ｄ）、一般式（Ｉ－ｅ）若しくは一般式（Ｉ―ｆ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
（式中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～２０のアルキル基、炭素数５～２０のシクロアルキル基、または炭素数７～２０のアラルキル基であり、Ｘａ－はカウンターイオンを示し、ａは該カウンターイオンの価数を示す。）で表される構造を有する構成単位（Ｂ）、並びに
一般式（Ｉ－ｇ）若しくは一般式（１―ｈ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
（式中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１２のアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、又は炭素数５～６のシクロアルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（Ｃ）、
　からなる群の中から選ばれる少なくとも１種の（ジ）アリルアミン系の構成単位を有し、
　下記式（１）で算出される化学構造パラメーターＰと、分子量Ｍとが下記式（２）を満たす関係を有する（ジ）アリルアミン系化合物、である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000074
（式中、ｎは前記（ジ）アリルアミン系化合物を構成する構成単位種の数を示し、ｍｉは構成単位ｉのモル比を示し、aijは構成単位ｉ中のｊ級アミン（又はアンモニウム塩）の数を示し、oiは構成単位ｉ中のカルボニル基の数を示し、siは構成単位ｉ中のスルホニル基の数を示す。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000075
　ここで、構成単位（Ａ）は、上記の構成単位（Ａ１）と構成単位（Ａ２）（単量体構造（Ａ２））とを総称したものであり、構成単位（Ｂ）は、上記の構成単位（Ｂ１）と構成単位（Ｂ２）（単量体構造（Ｂ２））とを総称したものであり、構成単位（Ｃ）は、上記の構成単位（Ｃ１）と構成単位（Ｃ２）（単量体構造（Ｃ２））とを総称したものである。
　用途等
　本発明の核酸のＴｍ値上昇化剤は、二本鎖核酸に対して顕著なＴｍ値の上昇をもたらす。Ｔｍ値の特性上、完全に相補的な関係にある二本鎖と、ミスマッチがあり、完全に相補的な関係にない二本鎖では、核酸のＴｍ値上昇化剤を添加した際のＴｍ値上昇幅に相違が生じることが予想される。このため、Ｔｍ値を利用して、基準配列に対する変異をより高感度で検出し得ることが期待される。また、本発明の核酸のＴｍ値上昇化剤を添加した溶液中で核酸増幅サイクルを実施すると、完全に相補的な関係にある二本鎖と、ミスマッチがあり、完全に相補的な関係にない二本鎖では、増幅効率の差がより大きくなることが予想される。従って、核酸増幅でより効率的に高感度で変異を検出することが期待される。また、核酸増幅反応において、アニーリング温度を高めることができるため、用いるプライマーを設計する際に、ＧＣ含量への依存を低減することができ、プライマー設計の自由度が大きくなることが期待される。
　核酸増幅方法としては、特に限定は無く、例えば、ＰＣＲ法、ＴＭＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＳＤＡ法、ＬＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＨＤＡ法、ＲＣＡ法、ＲＰＡ法等を例示することが出来るが、これらには限定されない。
　また、Ｔｍ値の上昇は、二本鎖核酸の安定化を意味する。したがって、本願発明のＴｍ上昇化剤は、核酸医薬品や核酸分析に供する試料を安定化させるために好適に使用することが可能である。
　具体的な核酸分析に供する試料としては、医学及び臨床診断、医薬組成物の開発及び評価、食品分析、食品製造のモニタリング、農業、並びに環境分析及び多くの研究分野等における試料を例示することが出来るが、これらには限定されない。
　従って、本発明の一実施形態では、本発明の核酸のＴｍ値上昇化剤を核酸を含む溶液中に添加する核酸の安定化方法、ならびに核酸と共に本発明の核酸のＴｍ値上昇化剤を含む水溶液が提供される。
　以下、実施例を参照しながら、本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明の技術的範囲は、いかなる意味においても、これらの実施例により限定されるものではない。
重量平均分子量Ｍの測定ならびに構造パラメーターＰの決定
（重量平均分子量Ｍ）
　重合体の重量平均分子量Ｍ（Ｍｗ）は、日立Ｌ－６０００型高速液体クロマトグラフを使用し、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ法）によって測定した。
　溶離液流路ポンプは日立Ｌ－６０００、検出器はショーデックスＲＩ－１０１示差屈折率、カラムはショーデックスアサヒパックの水系ゲル濾過タイプのＧＳ－２２０ＨＱ（排除限界分子量３，０００）とＧＳ－６２０ＨＱ（排除限界分子量２００万）とを直列に接続したものを用いた。サンプルは溶離液で０．５ｇ／１００ｍｌの濃度に調製し、２０μＬを用いた。溶離液には、０．４ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム水溶液を使用した。カラム温度は３０℃で、流速は１．０ｍｌ／分で実施した。
　標準物質として、分子量１０６、１９４、４４０、６００、１４７０、４１００、７１００、１０３００、１２６００、２３０００、４８２９０、６６２００、１１７９００、２０５５００などのポリエチレングリコールを用いて較正曲線を求め、その較正曲線を基に重合体の重量平均分子量（Ｍｗ）を求めた。
（構造パラメーターＰ）
　各実施例または比較例の核酸のＴｍ値上昇化剤に含まれる（共）重合体又は単量体の構造パラメーターＰは、下式により決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000076
　式中、ｎは（共）重合体又は単量体を構成する構成単位数を示し、ｍｉは構成単位ｉのモル比を示し、ａｉｊは構成単位ｉ中のｊ級アミン（又はアンモニウム塩）の数を示し、ｏｉは構成単位ｉ中のカルボニル基の数を示し、ｓｉは構成単位ｉ中のスルホニル基の数を示す。
［実施例１］
１－１．ポリマー水溶液（核酸のＴｍ値上昇化剤）
　核酸のＴｍ値上昇化剤として、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド（モノマー１）と、アクリルアミド（モノマー２）とを以下の重合条件１で共重合してなり、モノマー１に由来する構成単位１とモノマー２に由来する構成単位２とのモル比が８：１であり、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍが１８００００である、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド・アクリルアミド共重体を１０．０質量％含み、ｐＨが７．０である、ポリマー水溶液２０．０μＬを調製した。構造パラメーターＰは３．７８であり、Ｐ３／Ｍ１／４は２．６２であった。
　重合条件１：温度計、撹拌機、冷却管を備えた３００ｍｌの四つ口フラスコに６５．０％ジアリルジメチルアンモニウムクロリド１１９．３９ｇ（０．４８モル）、アクリルアミド４．２６ｇ（０．０６モル）、蒸留水１４９．２４ｇを仕込み、内温を５０℃に昇温した。１５質量％のＶ－５０（２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩）水溶液を、当該水溶液中のＶ－５０の量がモノマー全量に対して０．２質量％となる量だけ添加し重合を開始した。Ｖ－５０の量がそれぞれ２２、２５時間後にモノマー全量に対して０．２質量％、２８、４６、５３時間後にモノマー全量に対して０．３質量％となる量だけ、前記Ｖ－５０水溶液を添加し、７２時間反応させた。
１―２．核酸分子
　核酸のＴｍ値上昇化剤を添加した際のＴｍ値上昇値を評価するために、野生型ＫＲＡＳ遺伝子センス鎖のＥｘｏｎ２の一部に由来する４０ｍｅｒＤＮＡオリゴマーおよびこれに相補的な配列からなるアンチセンス鎖４０ｍｅｒＤＮＡオリゴマーを用いた。両核酸分子の塩基配列は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000077
１－３．反応液の調製
　上記ポリマー水溶液および核酸分子を用いて、以下の反応液１および２を調製した（反応液２における（共）重合体の濃度は１．０質量％であった）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000078
１－４．Ｔｍ上昇値の測定
　得られた反応液１および２を、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にセットし、９５℃で１５秒間加熱した後、４０℃で１分間保温し、次いで、０．３秒毎に蛍光計測を実施しながら、９５℃まで昇温させＤＮＡ融解曲線を得た後、９５℃で１５秒間保持した。
　得られたＤＮＡ融解曲線から、微分法によりＴｍ値を求め、反応液２のＴｍ値から反応液１のＴｍ値を引いてＴｍ上昇値を決定した。反応液１のＴｍ値は、５８．００℃であり、反応液２のＴｍ値は、９３．３０℃であった。この結果、Ｔｍ上昇値は３５．３℃であった。
　＜実施例２＞
　核酸のＴｍ値上昇化剤として、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド（モノマー１）と、アクリルアミド（モノマー２）とを以下の重合条件２で共重合してなり、モノマー１に由来する構成単位１とモノマー２に由来する構成単位２とのモル比が８：１であり、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍが１００００である、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド・アクリルアミド共重体を含む水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｍ上昇値を決定した。この共重合体の構造パラメーターＰは３．７８であり、Ｐ３／Ｍ１／４は５．４０であった。また、Ｔｍ上昇値は３３．３℃であった。
　重合条件２：温度計、撹拌機、冷却管を備えた３００ｍｌの四つ口フラスコに６５．０％ジアリルジメチルアンモニウムクロリド１２４．３７ｇ（０．５０モル）、アクリルアミド４．４４ｇ（０．０６モル）、次亜リン酸ナトリウム０．８５ｇ、蒸留水８４．３９ｇを仕込み、内温を５０℃に昇温した。２８．５質量％過硫酸アンモニウム水溶液を、当該水溶液中の過硫酸アンモニウムの量がモノマー全量に対して０．２質量％となる量だけ添加し重合を開始した。過硫酸アンモニウムの量がそれぞれ４時間後にモノマー全量に対して０．３質量％、２３時間後にモノマー全量に対して０．５質量％、２８時間後にモノマー全量に対して１．０質量％となる量だけ前記過硫酸アンモニウム水溶液を添加し４８時間反応させた。
　＜実施例３＞
　核酸のＴｍ値上昇化剤として、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド（構成単位１に対応するモノマー）を重合してなり、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍが８５００である、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド（製品名：ＰＡＳ－Ｈ－１Ｌ、ニットーボーメディカル製）を含む水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｍ上昇値を決定した。この共重合体の構造パラメーターＰは４．００であり、Ｐ３／Ｍ１／４は６．６７であった。また、Ｔｍ上昇値は３３．３℃であった。
　＜実施例４＞
　核酸のＴｍ値上昇化剤として、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド（構成単位１に対応するモノマー）を重合してなり、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍが３００００である、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド（製品名：ＰＡＳ－Ｈ－５Ｌ、ニットーボーメディカル製）を含む水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｍ上昇値を決定した。この共重合体の構造パラメーターＰは４．００であり、Ｐ３／Ｍ１／４は４．８６であった。また、Ｔｍ上昇値は３３．５℃であった。
　＜実施例５＞
　核酸のＴｍ値上昇化剤として、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド（モノマー１）と、二酸化硫黄（モノマー２）とを共重合してなり、モノマー１に由来する構成単位１とモノマー２に由来する構成単位２とのモル比が１：１であり、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍが４０００である、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド・二酸化硫黄共重合体（製品名：ＰＡＳ－Ａ－５、ニットーボーメディカル製）を含む水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｍ上昇値を決定した。この共重合体の構造パラメーターＰは３．００であり、Ｐ３／Ｍ１／４は３．４０であった。また、Ｔｍ上昇値は３３．８℃であった。
　＜実施例６＞
　核酸のＴｍ値上昇化剤として、ジアリルメチルアミン塩酸塩（モノマー１）と、二酸化硫黄（モノマー２）とを共重合してなり、モノマー１に由来する構成単位１とモノマー２に由来する構成単位２とのモル比が１：１であり、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍが３０００である、ジアリルメチルアミン塩酸塩・二酸化硫黄共重合体（製品名：ＰＡＳ－２２０１ＣＬ、ニットーボーメディカル製）を含む水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｍ上昇値を決定した。この共重合体の構造パラメーターＰは２．５０であり、Ｐ３／Ｍ１／４は２．１１であった。また、Ｔｍ上昇値は２４．０℃であった。
　＜実施例７＞
　核酸のＴｍ値上昇化剤として、アリルアミン（モノマー１）と、ジメチルアリルアミン（モノマー２）とを以下の重合条件３で共重合してなり、モノマー１に由来する構成単位１とモノマー２に由来する構成単位２とのモル比が１：１であり、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍが１０００である、アリルアミン・ジメチルアリルアミン共重合体を含む水溶液を用いた以外は、実施例１同様にして、Ｔｍ上昇値を決定した。この共重合体の構造パラメーターＰは２．００であり、Ｐ３／Ｍ１／４は１．４２であった。また、Ｔｍ上昇値は２４．６℃であった。
　重合条件３：温度計、撹拌機、冷却管を備えた１Ｌの四つ口フラスコに５８．０１質量％のアリルアミン塩酸塩２０９．６７ｇ（１．３モル）と６３．６１質量％のジメチルアリルアミン塩酸塩２４８．５１ｇ（１．３モル）を仕込み、６０℃に昇温した。開始剤Ｖ－５０（２，２’－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩）を、Ｖ－５０の量がモノマー全量に対して１２モル％となる量だけ３分割して添加し、７２時間重合を行った。その後、４８時間６０℃で加熱分解処理した。その後、３０℃以下の冷却下で濃度２５質量％の水酸化ナトリウムを４４９．２８ｇ（２．８１モル）添加し、４０℃で２４時間反応させた。その後、エバポレーターによる脱モノマー（５０℃、３時間）を行った。脱モノマー後、濃度１５％に調整して電気透析による脱塩（約３時間、電導度が下がりきってから１時間後に終了）を行った。
　＜実施例８＞
　核酸のＴｍ値上昇化剤として、以下の反応条件１で得られる、アリルアミン（構成単位１）と、尿素化アリルアミン（構成単位２）とを含み、構成単位１と構成単位２とのモル比が１：１であり、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍが１５０００である、５０モル％尿素化ポリアリルアミンを含む水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｍ上昇値を決定した。この共重合体の構造パラメーターＰは２．５０であり、Ｐ３／Ｍ１／４は１．４１であった。また、Ｔｍ上昇値は２２．８℃であった。
　反応条件１：温度計、撹拌機、冷却管を備えた１０Ｌの四つ口フラスコに４９．７７質量％のアリルアミン塩酸塩重合体（製品名：ＰＡＡ－ＨＣｌ―３Ｌ、ニットーボーメディカル製）１．８８ｋｇ（１０．００モル）、希釈水２．２１ｋｇを仕込んだ。その後、５０℃に昇温し、７．５０質量％のシアン酸ナトリウム水溶液４．３３ｋｇ（５．００モル）を滴下し、一晩反応させた。その後、３０℃以下の冷却下で濃度２５質量％の水酸化ナトリウムを８００ｇ（５．００モル）添加し、減圧により脱モノマー（６５℃、２０時間）を行った。脱モノマー後、濃度１５％に調整して電気透析による脱塩（約２０時間、電導度が下がりきってから１時間後に終了）を行った。
　＜実施例９＞
　核酸のＴｍ値上昇化剤として、ジアリルアミン（構成単位１）を重合してなり、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍが５０００である、ポリジアリルアミン（製品名：ＰＡＳ－２１、ニットーボーメディカル製）を含む水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｍ上昇値を決定した。この共重合体の構造パラメーターＰは２．００であり、Ｐ３／Ｍ１／４は０．９５であった。また、Ｔｍ上昇値は２１．９℃であった。
　＜比較例１＞
　核酸のＴｍ値上昇化剤として、以下の反応条件２で得られる、アリルアミン（構成単位１）と、メトキシカルボニル化アリルアミン（構成単位２）とを含み、構成単位１と構成単位２とのモル比が１：１であり、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍが１５０００である、５０モル％メトキシカルボニル化ポリアリルアミンを含む水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｍ上昇値を決定した。この共重合体の構造パラメーターＰは２．００であり、Ｐ３／Ｍ１／４は０．７２であった。また、Ｔｍ上昇値は１５．２であった。
　反応条件２：温度計、撹拌機、冷却管を備えた１０Ｌの四つ口フラスコに１５．００質量％のアリルアミン重合体（製品名：ＰＡＡ－１５Ｃ、ニットーボーメディカル製）３．８１ｋｇ（１０．００モル）を仕込んだ。その後、４０℃に昇温し、９９．００質量％炭酸ジメチル０．４５ｋｇ（５．００モル）を滴下し、４５℃で一晩反応させた。その後、減圧により副生したメタノールを除去した。（５０℃、２０時間）を行った。その後、濃度１５％に調整して、５０％メトキシカルボニル化ポリアリルアミン水溶液を得た。
　＜比較例２＞
　核酸のＴｍ値上昇化剤として、ジアリルアミン塩酸塩（構成単位１）を重合してなり、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍが５００００である、ポリジアリルアミン塩酸塩（製品名：ＰＡＳ－２１ＣＬ、ニットーボーメディカル製）を含む水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｍ上昇値を決定した。この共重合体の構造パラメーターＰは２．００であり、Ｐ３／Ｍ１／４は０．５３であった。また、Ｔｍ上昇値は１８．１℃であった。
　＜比較例３＞
　核酸のＴｍ値上昇化剤として、アリルアミン塩酸塩（構成単位１）と、ジアリルアミン塩酸塩（構成単位２）とを以下の重合条件４で共重合してなり、構成単位１と構成単位２とのモル比が１：１９であり、ＧＰＣ測定により得られる重量平均分子量Ｍが４００００である、アリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体を含む水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｍ上昇値を決定した。この共重合体の構造パラメーターＰは１．９５であり、Ｐ３／Ｍ１／４は０．５２であった。また、Ｔｍ上昇値は１８．２℃であった。
　重合条件４：温度計、撹拌機、冷却管を備えた１Ｌの四つ口フラスコに５７．２２質量％のアリルアミン塩酸塩１０．６３ｇ（０．０６５モル）と６５．２２質量％のジアリルアミン塩酸塩２５３．０２ｇ（１．２３５モル）と希釈水３１．３５ｇ（濃度５８質量％となる量）を仕込み、６０℃に昇温した。２８．５質量％の過硫酸アンモニウム水溶液を、当該水溶液中の過硫酸アンモニウム量がモノマー全量に対して０．２５質量％となる量だけ添加し重合を開始させた。３、５、２１時間後に０．２５質量％、２３、２５、２７、２９時間後に０．５０質量％添加し、さらに一晩反応させた。
　＜比較例４＞
　核酸のＴｍ値上昇化剤として、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド（構成単位１）の単量体（分子量Ｍ：１６１．５）を含む水溶液を用いた以外は、実施例１と同様にして、Ｔｍ上昇値を決定した。この単量体の構造パラメーターＰは４．００であり、Ｐ３／Ｍ１／４は１７．９５であった。また、Ｔｍ上昇値は１５．４℃であった。
　各実施例および比較例で得られた結果を纏めて以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000079
　各実施例では、核酸のＴｍ値上昇化剤として、Ｐ３／Ｍ１／４が０．９５～６．６７の（ジ）アリルアミン化合物を含む水溶液が使用され、２０℃以上のＴｍ上昇値を示した。特に、Ｐ３／Ｍ１／４が３．４０～６．６７である（ジ）アリルアミン化合物を含む水溶液が使用された実施例１～５では、３３℃以上のＴｍ上昇値を示した。一方で、Ｐ３／Ｍ１／４が、０．７２以下であった（ジ）アリルアミン化合物を含む水溶液が使用された比較例１～３では、２０℃未満のＴｍ上昇値を示した。また、Ｐ３／Ｍ１／４が１７．９５である、ジアリルジメチルアンモニウムクロリドの単量体を用いた比較例４では、Ｔｍ上昇値は１５．４℃であり、ジアリルジメチルアンモニウムクロリドの重合体を用いた実施例３や４と比較してその値は低かった。

Claims (7)

  1. 　一般式（Ｉ－ａ）、一般式（Ｉ－ｂ）若しくは一般式（Ｉ－ｃ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    （式中、Ｒ１は水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１０のアルキル基、炭素数５～１０のシクロアルキル基、または炭素数７～１０のアラルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（Ａ）、
    　一般式（Ｉ－ｄ）、一般式（Ｉ－ｅ）若しくは一般式（Ｉ―ｆ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
    （式中、Ｒ２及びＲ３はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～２０のアルキル基、炭素数５～２０のシクロアルキル基、または炭素数７～２０のアラルキル基であり、Ｘａ－はカウンターイオンを示し、ａは該カウンターイオンの価数を示す。）で表される構造を有する構成単位（Ｂ）、並びに
    一般式（Ｉ－ｇ）若しくは一般式（１―ｈ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
    （式中、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に水素原子、水酸基を有していてもよい炭素数１～１２のアルキル基、炭素数７～１０のアラルキル基、又は炭素数５～６のシクロアルキル基を示す。）で表される構造、又はその酸付加塩である構造、を有する構成単位（Ｃ）、
    　からなる群の中から選ばれる少なくとも１種の（ジ）アリルアミン系の構成単位を有し、
    　下記式（１）で算出される化学構造パラメーターＰと、分子量Ｍとが下記式（２）を満たす関係を有する（ジ）アリルアミン系化合物を含む、核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
    （式中、ｎは前記（ジ）アリルアミン系化合物を構成する構成単位種の数を示し、ｍｉは構成単位ｉのモル比を示し、aijは構成単位ｉ中のｊ級アミン（又はアンモニウム塩）の数を示し、oiは構成単位ｉ中のカルボニル基の数を示し、siは構成単位ｉ中のスルホニル基の数を示す。）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
  2. 　前記Ｐ及びＭが下記式（３）を満たす関係を有する（ジ）アリルアミン系化合物を含む、請求項１に記載の核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
  3. 　前記Ｐ及びＭが下記式（４）を満たす関係を有する（ジ）アリルアミン系化合物を含む、請求項１に記載の核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
  4. 　前記（ジ）アリルアミン系化合物が、（ジ）アリルアミン系（共）重合体である請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤。
  5. 　前記核酸が、ＤＮＡである請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤。
  6. 　請求項１～５の何れか１項に記載する核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤を、核酸を含有する水溶液中に添加する核酸の安定化方法。
  7. 　請求項１～５の何れか１項に記載する核酸の融解温度（Ｔｍ値）上昇化剤を、核酸と共に含む水溶液。
     
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WO2003018841A1 (fr) * 2001-08-24 2003-03-06 The Circle For The Promotion Of Science And Engineering Procede de determination d'un mesappariement entre des molecules d'acide nucleique monobrin
JP2008278779A (ja) * 2007-05-09 2008-11-20 Asahi Kasei Corp 核酸ハイブリダイゼーション用溶液

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