FR2877343A1 - Procede destine a stabiliser ou a isoler des acides nucleiques - Google Patents

Abstract

La présente invention propose un procédé destiné à stabiliser ou à isoler des acides nucléiques (a), (b) ou (c) avec des tensioactifs amino. Les mécanismes permettant la stabilisation ou l'isolement des acides nucléiques de la présente invention diffèrent des procédés traditionnels. Des tensioactifs avec des amines primaires, des amines secondaires et des amines tertiaires ou des mélanges avec divers rapports de tensioactifs sont utilisés dans la présente invention, afin de stabiliser ou d'isoler des acides nucléiques en formant des complexes ioniques insolubles entre des acides nucléiques et un tensioactif. Le procédé de la présente invention peut même être automatisé afin d'augmenter le débit et de développer l'utilisation du test de diagnostic moléculaire avec un acide nucléique.

Description

PROCÉDÉ DESTINÉ À STABILISER OU À ISOLER DES ACIDES

NUCLÉIQUES La présente invention concerne un procédé destiné à stabiliser ou à isoler des biomatériaux issus d'un échantillon, et plus particulièrement un procédé destiné à stabiliser ou à isoler des acides nucléiques provenant d'un échantillon biologique.

Il est connu que les acides nucléiques portent l'information génétique d'un organisme. De nos jours, les acides nucléiques jouent également un rôle important dans le domaine de recherche de la biologie moléculaire. Des résultats récents de recherche nous apprennent que le développement d'anomalies ou de maladies génétiques d'un patient peut être déduit de l'anormalité ou de sequences spéciales d'acides nucléiques de ce patient selon une pratique clinique.

Par conséquent, il est possible d'empêcher la survenue des maladies en détectant l'anormalité des acides nucléiques et en prenant, pour y remédier, les mesures nécessaires pour le traitement avant que les maladies se déclarent. Afin de détecter efficacement l'anormalité ou les séquences spéciales d'acides nucléiques, l'isolement des acides nucléiques ainsi que les étapes servant à conserver intacte l'information génétique sont de la plus grande importance pour les applications connexes.

Les acides nucléiques sont des molécules actives, en particulier l'ARN. Les procédés traditionnels permettant d'isoler les molécules actives d'ARN sont généralement mis en uvre avec des anticoagulants, par exemple l'EDTA, dans le sang total phlébotomisé, puis l'échantillon est conservé à 4 C jusqu'à ce que les étapes d'isolement soient réalisées. Les niveaux d'expression de l'ARN pourraient être altérés par l'ajout d'anticoagulants, le changement de température, les temps de conservation et le procédé d'isolement des leucocytes; ces facteurs rendent plus difficile la prédiction de la survenue d'une maladie par l'expression de l'ARN. Afin d'obtenir de meilleurs résultats, l'isolement de l'ARN provenant d'échantillons de sang total doit être réalisé dans les 24 heures. Cependant, ce temps de traitement impératif impose aux techniciens de laboratoire médical une charge de travail qui est généralement inacceptable, en particulier quand un grand nombre d'échantillons sont à traiter.

Afin d'éviter la contamination par des protéines ou d'autres organelles, les étapes d'isolement des acides nucléiques purs s'accompagnant de l'utilisation du mélange phénol/chloroforme sont répandues dans les procédés traditionnels. Cependant, l'utilisation du mélange phénol/chloroforme dans les étapes d'isolement d'acides nucléiques provenant de matériels biologiques nécessite des opérations délicates et des techniciens qualifiés afin d'exclure les organelles et les substances non désirées (par exemple, les protéines) des acides nucléiques. De plus, le phénol et le chloroforme sont dangereux à manipuler et très polluants pour l'environnement. En outre, le phénol et le chloroforme ne sont pas capables de condenser directement les acides nucléiques. Par conséquent, de nombreux produits chimiques sont nécessaires pour aider le phénol et le chloroforme à condenser les acides nucléiques. De plus, les phénols ne sont pas faciles à stocker et à utiliser car ils s'oxydent facilement. A la vue des inconvénients mentionnés ci-dessus, le mélange phénol/chloroforme n'est pas le meilleur produit chimique à utiliser dans le but d'isoler des acides nucléiques, en particulier car il n'est pas approprié pour l'isolement à haut débit des acides nucléiques pour des applications biomédicales cliniques.

De nombreuses recherches concernant l'isolement des acides nucléiques sans avoir recours à l'utilisation du mélange phénol/chloroforme ont été rapportées. Qiagen Company décrit un procédé dans le brevet PCT No. WO03084976 permettant d'isoler des acides nucléiques avec de l'ammoniac ou un ammonium afin de surmonter les inconvénients mentionnés ci-dessus. Dans ce procédé, une phase solide jouant le rôle d'un substrat de fixation se liant aux acides nucléiques est utilisée. De plus, un agent chaotropique est présent à la toute première étape de l'isolement afin de dissoudre les oligonucléotides à double brin. En outre, le rendement de liaison entre les acides nucléiques dénaturés et la phase solide est amélioré en présence d'ammoniac ou d'une amine primaire. En conséquence, la mise en contact de l'échantillon avec la phase solide se liant aux acides nucléiques est de préférence réalisée en présence d'un ammonium ou d'ammoniac à un pH situé dans la gamme de 8,5 à 9, 5.

Le document US 6 265 168 au nom de Gjerde et al. décrit un procédé qui permet de retirer d'un mélange de fragments d'ADN un fragment d'ADN cible ayant une longueur de paire de bases prédéterminée. Le mélange de fragments d'ADN qui contient le fragment d'ADN cible se trouve dans un premier mélange de solvants avec un contre-ion et un solvant d'entraînement à une concentration permettant la liaison de l'ADN, et le mélange de fragments d'ADN est ensuite appliqué sur une colonne de séparation contenant un milieu ayant une surface non polaire et non poreuse. Les fragments d'ADN cible sont séparés du milieu en mettant en contact la surface avec une seconde solution de solvants. Le contre-ion utilisé dans ce cas est choisi parmi des amines primaires, des amines secondaires, des amines tertiaires inférieures et des sels d'alkylammonium quaternaire. Les facteurs importants du procédé du document US 6 265 168 permettant de purifier un fragment d'ADN cible sont la colonne avec la surface non polaire et non poreuse, et les complexes contre-ion/ ADN, qui sont facilement absorbés sur la surface.

Cette description fournit un procédé permettant d'isoler des fragments d'ADN cibles provenant d'un échantillon d'ADN purifié. Cependant, son utilisation dans le but de purifier directement des acides nucléiques à partir du sang n'est pas encore décrite dans cet art antérieur du fait de l'obstruction possible de la colonne.

Dans le document WO2004013155, Goldsborough et al. décrivent un procédé permettant de stabiliser des acides nucléiques dans un échantillon biologique. Les étapes principales de ce procédé servant à stabiliser des acides nucléiques consistent, dans un premier temps, d'un acide nucléique avec un groupe protecteur, dont la présence permet d'éviter la digestion des acides nucléiques par une nucléase, puis à traiter les acides nucléiques modifiés avec des amines primaires afin d'éliminer le groupe protecteur. L'amine primaire est utilisée dans ce cas seulement pour déprotéger le groupe protecteur plutôt que pour former un complexe avec les acides nucléiques.

De même, le document US 20040048384 au nom de Franck A. Augello et al. décrit un récipient de collecte et un procédé de collecte d'échantillon biologique dans un volume prédéterminé, dans lequel l'échantillon de sang total comprend au moins un agent bloquant l'induction des gènes selon une quantité efficace afin de stabiliser et d'inhiber l'induction des gènes. L'agent stabilisant de l'agent bloquant l'induction des gènes décrit dans ce cas est une amine quaternaire. De plus, un procédé apparenté permettant la stabilisation et/ou l'isolement d'acides nucléiques est décrit dans la description du document CA 2299119. Le procédé décrit dans ce document utilise au moins deux amines quaternaires ou des polymères cationiques ayant un groupe phosphoré afin de précipiter et de protéger les acides nucléiques.

En outre, une nouvelle composition servant à isoler et/ou à stabiliser des acides nucléiques provenant de matériels biologiques est décrite dans le document US 2004014703. L'objet du procédé du document US 2004014703 est de fournir une composition permettant de stabiliser l'ARN en présence de tissu, de sang, de plasma ou de sérum. La composition comprend un composé cationique tel qu'une amine quaternaire afin de stabiliser les acides nucléiques.

Deux produits, le PAXgene Blood RNA Tube et le PAXgene Blood RNA Isolation Kit , sont développés et commercialisés par Qiagen Company, et ils sont utilisés conjointement afin de stabiliser et d'isoler les acides nucléiques se trouvant dans du sang total. Cependant, les kits sont coûteux ce qui ne permet pas d'envisager leur utilisation de manière routinière.

Il n'existe pas de description concernant la stabilisation ou l'isolement des acides nucléiques avec une amine primaire, une amine secondaire ou une amine tertiaire. Par conséquent, il est souhaitable de proposer un procédé amélioré dans le but d'atténuer et/ou d'éviter les problèmes mentionnés précédemment.

La présente invention fournit un procédé permettant de stabiliser ou d'isoler des acides nucléiques dans un échantillon biologique avec des tensioactifs amino. Les mécanismes de la présente invention permettant la stabilisation ou l'isolement des acides nucléiques sont différents des mécanismes des procédés traditionnels. Des tensioactifs avec des amines primaires, des amines secondaires et des amines tertiaires ou des mélanges avec divers rapports de tensioactifs sont utilisés dans la présente invention, afin de stabiliser ou d'isoler des acides nucléiques en formant des complexes ioniques insolubles entre les acides nucléiques et un tensioactif. Par exemple, les complexes protègent l'ARN à l'intérieur afin d'empêcher la dégradation de l'ARN par une RNase, ainsi que la

transcription de l'ARN, par conséquent les acides

nucléiques dans l'échantillon biologique sont stabilisés et préservés, et de plus l'ARN est facile à isoler avec les complexes.

Le procédé de la présente invention peut même être automatisé afin d'augmenter le débit et de développer l'utilisation du test de diagnostic moléculaire avec un acide nucléique.

Pour atteindre cet objectif, le réactif et le procédé de la présente invention, permettant la stabilisation ou l'isolement des acides nucléiques en formant un complexe ionique insoluble entre des acides nucléiques et un tensioactif dans un échantillon biologique, comprend une étape de mise en contact de l'échantillon biologique avec une composition ou un réactif de stabilisation ou d'isolement, la composition ou réactif de stabilisation ou d'isolement comprenant des tensioactifs amino de formule (I) . R1R?R.3N(0);:, (I), dans laquelle, R1 et R2 chacun indépendamment est un H, un groupe alkyle en C, un groupe aryle en CE à C12, ou un groupe aralkyle en C. à C12; R3 est un groupe alkyle en Cl à C20, un groupe aryle en Cc à C2E ou un groupe aralkyle en CE à C2E; et x est un entier prenant comme valeur 0 ou 1. Dans un des meilleurs modes de réalisation de la présente invention, R1 et R2 chacun indépendamment est un H ou un groupe alkyle en C1 à CE dans la formule (I) ci-dessus, et R3 est un groupe alkyle en C1 à C20 quand x vaut O. Le tensioactif amino de la présente invention peut être n'importe quel tensioactif traditionnel amino. De préférence, le tensioactif amino de la présente invention est choisi dans le groupe constitué par la dodécylamine, la N-méthyldodécylamine, la N,N- diméthyldodécylamine, le N-oxyde de N,Ndiméthyldodécylamine et la 4-tétradécyl-aniline.

Le réactif de stabilisation ou d'isolement peut être ajouté en solution ou sous la forme d'un solide.

Le fait de pouvoir l'ajouter sous forme solide apporte les avantages supplémentaires suivants: les solides ont la plupart du temps une meilleure stabilité chimique et leur ajout à l'échantillon est généralement plus facile à réaliser. La manière de mettre en contact l'échantillon biologique et le réactif de stabilisation ou d'isolement de la présente invention n'est ainsi pas limitée, il peut être dans une solution liquide ou sous la forme d'un solide. Cependant, afin que l'échantillon et le réactif se mélangent dans les meilleures conditions possibles, le mode de réalisation préféré du réactif de la présente invention est une solution liquide.

Si le réactif est ajouté sous la forme d'un solide, le pourcentage en poids des tensioactifs amino dans le 25 réactif n'est pas limité, de préférence il est inférieur à 90 et de manière davantage préférée il est situé dans la gamme de 10 % à 90 Quand le réactif est ajouté sous la forme d'une solution, la concentration des tensioactifs amino dans la solution de réactif se situe de préférence dans la gamme de 0,001 à 20 %.

Le procédé de la présente invention peut être mis en oeuvre sans la présence de détergents non ioniques ou d'acides. Cependant, l'utilisation de détergents non ioniques, d'acides ou de leur mélange avec des tensioactifs spécifiques à base d'amine peut améliorer les résultats de stabilisation ou d'isolement. En conséquence, le réactif de stabilisation ou d'isolement avec des tensioactifs à base d'amino peut sélectivement comprendre en outre au moins un détergent non ionique.

Le ou chaque détergent non ionique peut être présent sous la forme d'un détergent liquide ou solide dans le réactif de stabilisation ou d'isolement.

La concentration dudit ou de chaque détergent non ionique se situe de préférence dans la gamme de 0,01 % à 20 % quand le réactif de stabilisation ou d'isolement est dans un état liquide; le pourcentage en poids du ou de chaque détergent se situe dans la gamme de 0,01 % à 40 % quand le réactif est dans un état solide. Le ou chaque détergent non ionique de la présente invention peut être n'importe quel détergent non ionique traditionnel; de préférence, le ou chaque détergent non ionique est le monolaurate de polyoxyéthylène sorbitane. De manière davantage préférée, le détergent non ionique est le Tween 20 ou le Triton X-100 .

Le réactif de stabilisation ou d'isolement contenant des tensioactifs amino de la présente invention peut sélectivement comprendre en outre au moins un acide. Le ou chaque un acide peut être des tampons acides ou des agents acides dans un état solide.

La concentration du ou de chaque tampon acide est inférieure à 1 M. De préférence, la concentration du ou de chaque tampon acide est située dans la gamme de 0,01 à 0,5 M. Le ou chaque acide peut être n'importe quel acide traditionnel. De manière davantage préférée, le ou chaque acide est choisi dans le groupe constitué par l'acide maléique, l'acide tartrique, l'acide citrique, l'acide oxalique, les acides carboxyliques et les acides minéraux. La valeur de pH du réactif de stabilisation ou d'isolement de la présente invention peut être n'importe quelle valeur située dans la gamme de 1 à 14. De préférence, la valeur de pH est située dans la gamme de 1 à 10.

L'échantillon biologique contenant des acides nucléiques utilisé dans la présente invention peut être un échantillon de matériel exempt de cellules, du plasma, des fluides corporels tels que le sang, le sérum, des cellules, des fractions de leucocyte, des crachats, l'urine, le sperme, des fèces, des frottis, des aspirats, des échantillons de tissus de tous types, tels que des biopsies, par exemple, des parties de tissus ou d'organes, des échantillons de nourriture qui contiennent des acides nucléiques libres ou liés ou des cellules contenant des acides nucléiques tels qu'envisagés selon l'invention, comme des organismes (des organismes mono- ou pluri-cellulaires; des insectes, etc.), des plantes ou des parties de plantes, des bactéries, des virus, des levures et d'autres champignons, d'autres eucaryotes et procaryotes, etc. Le terme acides nucléiques dans le contexte de la présente invention a la définition d'acides nucléiques dans son sens le plus large, et comprend donc, par exemple, les acides ribonucléiques (ARN) et également les acides désoxyribonucléiques (ADN) de toutes longueurs et de toutes configurations, telles que mono brin, double brin, circulaire et linéaire, ramifié, etc., et toutes les sous-unités possibles de ceux-ci, comme les oligomères monomères de nucléotides, les plasmides, l'ADN et l'ARN viral et bactérien, ainsi que l'ADN et l'ARN génomiques et non génomiques provenant de cellules animales ou végétales ou d'autres eucaryotes, l'ARNm sous une forme transformée ou non transformée, l'ARNt, l'ARN-hn, l'ARNr, l'ADNc ainsi que tous les autres acides nucléiques concevables. De préférence, les acides nucléiques de la présente invention sont l'ADN ou l'ARN.

D'autres objets, avantages, et nouvelles caractéristiques de l'invention seront plus apparents à partir de la description détaillée suivante prise conjointement avec les dessins joints.

La figure 1 est un résultat d'électrophorèse d'un ARN purifié des exemples 1 à 3 de la présente 20 invention; la figure 2 est un résultat d'électrophorèse d'un ARN purifié des exemples 4 à 6 de la présente invention; la figure 3 est un résultat de RT-PCR quantitatif d'un ARN purifié des exemples 7 à 9 de la présente invention, qui représente les niveaux relatifs d'expression des gènes pour diverses périodes de conservation; la figure 4 est un résultat d'électrophorèse 30 d'acides nucléiques purifiés avec la dodécylamine provenant de sang total; la figure 5 est un résultat d'électrophorèse d'acides nucléiques purifiés avec la N,N-diméthyldodécylamine provenant de sang total; la figure 6 représente les résultats d'électrophorèse d'acides nucléiques provenant de sang total purifiés avec le N-oxyde de N,N- diméthyldodécylamine; et la figure 7 représente un résultat d'électrophorèse isolée d'acides nucléiques avec la 4-tétradécylaniline.

Les avantages de la présente invention seront illustrés par les exemples suivants et les figures. Les modes de réalisation du réactif de stabilisation ou d'isolement permettant de stabiliser des acides nucléiques dans un échantillon biologique sont décrits dans les exemples 1 à 11 suivants et les figures 1 à 3. De même, les exemples 12 à 18 et les figures 9 à 7 illustrent les modes de réalisation préférés permettant d'isoler des acides nucléiques dans un échantillon biologique.

Stabilisation des acides nucléiques: Le niveau d'expression de l'ARN est déterminé par la quantité et la qualité de l'ARN extrait des échantillons de sang total qui sont conservés pendant plusieurs jours en utilisant 3 procédés différents de conservation afin d'évaluer l'efficacité de la stabilisation des acides nucléiques.

Exemple 1: un tube Vacutainer (EDTA K3 , 30 Becton Dickinson) de 10 mL servant à la collecte de sang est utilisé pour collecter des échantillons de sang total. L'échantillon est stocké dans le Vacutainer à 4 C pendant 0 à 4 jours et l'ARN est ensuite isolé après un certain temps de stockage.

En suivant le manuel du fabriquant, 1 mL de Red Blood Cell Lysis Buffer (Roche Diagnostics GmbH) est ajouté à 500 pL de sang total afin de purifier les leucocytes; ensuite 150 pL de tampon RLT (QIAGEN GmbH) sont ajoutés aux leucocytes afin de lyser les cellules; 90 pL d'éthanol sont ensuite ajoutés à l'échantillon. L'échantillon est ensuite placé dans un tube de centrifugation (QIAGEN GmbH) ayant une membrane de silice et centrifugé.

La membrane de silice du tube de centrifugation est lavée avec 350 DL de tampon RW1 (QIAGEN GmbH), et les molécules d'ADN se trouvant sur le filtre sont retirées avec le RNase-free DNase Set (QIAGEN GmbH). La membrane de silice est ensuite lavée une nouvelle fois avec 350 pL de tampon RW1 , et deux fois avec 500 pL de tampon RPE (QIAGEN GmbH). Les molécules d'ARN se trouvant sur le filtre de silice sont ensuite finalement éluées deux fois avec 40 pL d'eau exempte de RNase.

Exemple 2: dans le présent exemple, la collecte du sang total et l'extraction de l'ARN sont réalisées en utilisant le PAXgene Blood RNA Validation Kit (QIAGEN GmbH). Les échantillons de sang sont réfrigérés à 4 C pendant 1 à 4 jours, et parmi ceux-ci, certains sont traités immédiatement sans réfrigération. Après différentes périodes de stockage, l'ARN est directement extrait selon le protocole décrit dans le manuel du fournisseur.

Exemple 3: dans le présent exemple, l'échantillon de sang total utilisé pour l'extraction de l'ARN est stocké avec de la N-méthyldodécylamine afin de stabiliser l'ARN.

333 pL de sang total frais sont mélangés à 1 mL d'une solution de stabilisation consistant en 3 % (poids/volume) de N-méthyldodécylamine, 5 % (en volume) de Triton X-100 et 100 mM d'acide tartrique et le mélange est réfrigéré à 4 C pendant 0 à 4 jours. Afin d'isoler l'ARN, les complexes formés entre les tensioactifs à base d'amine secondaire et l'ARN sont centrifugés à 5000 xg pendant 10 minutes. Le culot est dissout dans 50 HL d'eau distillée. 100 pL de tampon RLT (QIAGEN GmbH) et 10 pL de protéinase K (QIAGEN GmbH) sont ajoutés à l'échantillon et incubés à 55 C pendant 10 minutes. 200 pL de 1-bromo-3- chloropropane sont ajoutés à l'échantillon et mélangés par vortex. L'échantillon est ensuite centrifugé pendant 5 minutes à 10 000 xg.

Le surnageant est ensuite transféré dans un nouveau tube de 1,5 mL. L'échantillon est mélangé à 90 pL d'éthanol, puis déposé sur une colonne tournante contenant une membrane de silice. Le mélange d'échantillon est passé à travers la membrane sous 2.5 centrifugation. La membrane de silice est lavée avec 350 pL de tampon RW1 (QIAGEN GmbH) et les molécules d'ADN sont éliminées en utilisant le RNase-free DNase Set (QIAGEN GmbH). La membrane de silice est lavée avec une autre fraction de 350 pL de tampon RW1 et deux fois avec 500 pL de tampon RPE (QIAGEN GmbH). Finalement, les moléculaires d'ARN sont éluées deux fois avec la même fraction de 40 pL d'eau exempte de RNase.

Exemple 4: dans le présent exemple, l'échantillon de sang total utilisé pour l'extraction de l'ARN est stocké avec de la dodécylamine afin de stabiliser l'ARN. Une solution de stabilisation consistant en 0,3 % (poids/volume) de dodécylamine, 1 % (en volume) de Triton X-100 et 250 mM d'acide tartrique est préparée, et la valeur du pH est ajustée à 3 avec du NaOH. 1 mL de sang total frais est mélangé à 3 mL de la solution de stabilisation, puis l'échantillon est stocké à 4 C pendant 0 à 4 jours.

Afin d'isoler l'ARN, les complexes formés entre le tensioactif à base d'amine et l'ARN sont collectés par centrifugation. Le culot est dissout dans 150 pL d'eau distillée. 300 pL de tampon RLT (QIAGEN GmbH) et 30 pL de protéinase K (QIAGEN GmbH) sont ajoutés à l'échantillon et incubés à 55 C pendant 10 minutes. 200 pL de 1-bromo-3-chloropropane sont ajoutés à l'échantillon et mélangés par vortex. L'échantillon est ensuite centrifugé pendant 5 minutes à 10 000 xg. Le surnageant est ensuite transféré dans un nouveau tube de 1,5 mL. L'échantillon est mélangé à 270 pL d'éthanol, puis déposé sur une colonne tournante contenant une membrane de silice.

Le protocole se poursuit comme dans l'exemple 3.

Exemple 5: dans le présent exemple, l'échantillon de sang total utilisé pour l'extraction de l'ARN est stocké avec de la N,N-diméthyldodécylamine afin de stabiliser l'ARN. Une solution de stabilisation consistant en 5 ô (poids/volume) de N,N- diméthyldodécylamine, 2 % (en volume) de Triton X-100 et 140 mM d'acide tartrique est préparée. 333 pL de sang total frais sont mélangés à 1 mL de la solution de stabilisation, et le mélange est congelé à -20 c pendant 0 à 14 jours. Le protocole permettant d'isoler l'ARN est le même que celui décrit dans l'exemple 3.

Exemple 6: dans le présent exemple, l'échantillon de sang total utilisé pour l'extraction de l'ARN est stocké avec une solution de stabilisation qui est constituée de 3 (poids/volume) de N-oxyde de N,N-diméthyldodécylamine, de 1 (en volume) de Triton X-100 et de 125 mM d'acide tartrique. Le mélange est stocké à - 20 C pendant 0 à 14 jours. L'ARN des échantillons stockés pendant diverses périodes de temps est isolé en suivant le protocole décrit dans l'exemple 3.

Exemple 7: un bio-analyseur Agilent 2100 (Agilent Technologies) est utilisé pour analyser les rapports d'ARNr 28S/18S de l'ARN isolé des exemples 1 à 3. Selon le rapport standard homologué par l'homme du métier, un rapport ARNr 28S/18S supérieur à 1,5 indique que les molécules d'ARN sont intactes; de plus, les molécules d'ARN isolées sont dans un bon état quand le rapport ARNr 28S/18S est aux alentours de 2,0. En outre, un échantillon d'ARN de bonne qualité à un rapport 0D260/280 situé dans la gamme de 1,9 à 2,1, qui est déterminé à l'aide d'un spectrophotomètre. Les procédés décrits ci-dessus sont utilisés afin d'analyser la qualité et la quantité des échantillons d'ARN, et les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1

Echantillons Rendement en Qualité de Rapport ARNr ARN l'ARN 28S/18S (pg/mL) (0D260/280) Exemple 1 2,39 0,69 2,00 0,07 0,77 0,08 Exemple 2 4, 68_+0,68 1,94 0,03 1,57 0,13 Exemple 3 7,20_+0,48 1,98 0,14 1,83 0,17 Apparemment, les résultats de l'exemple 3 dans le tableau 1 montrent un rendement en ARN supérieur à l'exemple 1 ou à l'exemple 2. Un rendement moyen en ARN de 7,20 0,48 pg peut être isolé avec la solution de stabilisation de la présente invention dans l'exemple 3. De plus, le rapport OD 260/280 est de 1,98 0,14 et le rapport ARNr 28S/18S est de 1, 83 0,17, et ces deux valeurs se rapprochent de 2,0, valeur qui représente la plus grande qualité.

La figure 1 représente les résultats d'électrophorèse obtenus à partir de l'ARN purifié des exemples 1 à 3, sur laquelle (a) est l'ARN obtenu dans l'exemple 1; (b) est obtenu dans l'exemple 2 et (c) est obtenu dans l'exemple 3. Le nombre 0 à 4 inscrits au-dessus de la figure représentent les jours de stockage. Dans les résultats d'électrophorèse, la première bande de chaque couloir représente l'ARNr 28S et la seconde bande représente l'ARNr 18S. Bien évidemment, l'ARN isolé selon le procédé de la présente invention dans l'exemple 3 a la meilleure qualité et la meilleure quantité par rapport aux deux autres procédés de l'exemple 1 ou 2. Il n'y a pas de différences de quantité et de qualité entre les échantillons d'ARN stockés pendant 4 jours et le sang frais (0 jour de stockage).

La figure 2 représente les résultats d'électrophorèse obtenus à partir de l'ARN purifié des exemples 4 à 6, sur laquelle (a) est l'ARN obtenu dans l'exemple 4 avec 0 à 2 jours de stockage; (b) est obtenu dans l'exemple 5 avec 0 à 14 jours de stockage et (c) est obtenu dans l'exemple 6 avec 0 à 14 jours de stockage. Les données obtenues à partir du bio- analyseur Agilent 2100 (Agilent Technologies) sont présentées dans le tableau 2 ci-dessous. Selon les résultats présentés dans le tableau 2 et sur la figure 2, l'ARN isolé à partir du sang total a un état acceptable même après 14 jours de stockage.

Tableau 2

Echantillons Jour de stockage Rapport ARN 28S/18S 0 jour 1,60 0,14 Exemple 4 1 jour 1,60 0,00 2 jours 1,50 0,00 0 jour 1,90 0,26 Exemple 5 7 jours 1,80 0,35 14 jours 2,00 0,36 0 jour 1,70 0,44 Exemple 6 7 jours 1,53+0,15 14 jours 2,10 0,26 Exemple 8: tous les protocoles de l'exemple sont réalisés selon la description de l'exemple 1, dans lequel le sang total est stocké à 4 C pendant 0 à 2 jours.

Exemple 9_: tous les protocoles de l'exemple sont réalisés selon la description de l'exemple 2, dans lequel le sang total est stocké à 4 C pendant 0 à 2 jours.

Exemple 10: dans le présent exemple, 1 mL d'échantillon de sang total utilisé pour l'extraction de l'ARN est stocké avec 3 mL de solution de stabilisation consistant en 5 % (poids/volume) de N,N-diméthyldodécylamine et 225 mM d'acide tartrique (la valeur du pH est ajustée 3,0 avec du NaOH). Le mélange est stocké à 4 C pendant 0 à 2 jours. Leprotocole permettant d'isoler l'ARN est réalisé après diverses périodes de stockage en suivant la description de l'exemple 4.

Exemple 11: des molécules d'ADNc mono-brin sont synthétisées à partir des molécules d'ARN isolées des exemples 8 à 10 au moyen de SuperScript II RNase H- Reverse Transcriptase (Invitrogen) selon les protocoles décrits dans le manuel du fournisseur. Les molécules d'ADNc mono-brin synthétisées sont ensuite traitées avec TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) et Assays-on-Demand Gene Expression Products (Applied Biosystems), puis un procédé PCR en temps réel est réalisé au moyen de l' ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Les niveaux d'expression de 4 gènes ( ADORA2A , CREB5 , NFKB1 et IFNGR1 ) sont déterminés pour différentes périodes de stockage en suivant le procédé décrit ci-dessus, et les résultats sont présentés sur la figure 3.

Sur la figure 3, les valeurs d'expression relative représentent le rapport des niveaux d'expression des ARN isolés provenant d'échantillons stockés à 4 C pendant 24 heures ou 48 heures sur le niveau d'expression des ARN qui n'ont pas été stockés. Par exemple, une valeur d'expression relative de 1 indique que le niveau d'expression des gènes des molécules d'ARN isolées après un certain temps de stockage est le même que le niveau d'expression des gènes des moléculaires d'ARN isolées sans période de stockage. Al à A4 sur la figure 3 sont les résultats obtenus à partir de l'exemple 8, dans lequel Al est le gène ADORA2A, A2 est le gène CREB5, A3 est le gène IFNGR1 et A4 est le gène NFKB1. Bl à B4 sur la figure 3 sont les résultats obtenus à partir de l'exemple 9, dans lequel B1 est le gène ADORA2A, B2 est le gène CREB5, B3 est le gène IFNGR1 et B4 est le gène NFKB1. Cl à C4 sur la figure 3 sont les résultats obtenus à partir de l'exemple 10, dans lequel Cl est le gène ADORA2A, C2 est le gène CREB5, C3 est le gène IFNGR1 et C4 est le gène NFKB1. D'après les données de la figure 3, la valeur d'expression relative est proche de 1 pour l'exemple 10 et les niveaux d'expression des gènes pour les quatre gènes varient légèrement. Par conséquent, parmi ces exemples, l'exemple 10 est celui qui préserve le mieux les acides nucléiques dans le sang total.

Isolement des acides nucléiques.

Exemple 12: Purification de l'ARN total provenant de sang total Trois protocoles différents ont été utilisés afin d'isoler l'ARN total provenant de sang total frais. Dans le premier, l'ARN a été isolé en utilisant le Red Blood Cell Lysis Buffer (Roche Diagnostics GmbH) et avec un réactif ( Trizol Reagent , Life Technologies) contenant du phénol selon les protocoles décrits dans le manuel du fournisseur. Dans le deuxième, le PAXgene Blood RNA Validation Kit (QIAGEN GmbH) a été utilisé en se conformant au manuel du fournisseur.

Finalement, la purification de l'ARN total a été réalisée avec un tensioactif à base d'amine primaire comme décrit ci-dessous.

Tout d'abord, un tampon de lyse consistant en 1 % (poids/volume) de dodécylamine, 50 mM d'acide maléique, et 3 % (en volume) de Tween 20 a été préparé. Du sang total frais provenant d'un humain (333 pL) a été mélangé à 1 mL du tampon de lyse préparé, puis le mélange a été mis sous agitation à une vitesse de 11 tr/min pendant 20 minutes dans le but d'homogénéiser la solution. Le mélange a été centrifugé à 5000 xg pendant 10 minutes, et le surnageant a été mis au rebut; le culot a été lavé avec 333 pl d'eau bidistillée. Ensuite, la solution contenant le culot a été centrifugée à 5000 xg pendant 10 minutes et le surnageant a été totalement mis au rebut.

147 pL de tampon RLT (QIAGEN GmbH) ont été ajoutés et parfaitement mélangés avec l'échantillon.

Ensuite, 200 pL de 1-bromo-3-chloropropane ont été ajoutés et mélangés par vortex pendant 10 secondes.

L'échantillon a été centrifugé à 10 000 xg pendant 5 minutes puis le surnageant a été transféré dans un nouveau tube. 90 pL d'éthanol à 100 % ont été ajoutés et mélangés en pipetant trois fois, puis la solution a été transférée sur une mini colonne RNeasy (QIAGEN GmbH).

L'échantillon a été centrifugé à 13 000 tr/min pendant 30 secondes, puis l'écoulement a été mis au rebut; 350 pL de tampon RW1 ont été ajoutés sur la colonne, et le mélange a été centrifugé une nouvelle fois à 13 000 tr/min pendant 30 secondes supplémentaires. L'écoulement a ensuite été mis au rebut. 10 pL de solution mère de DNase I (QIAGEN GmbH) ont été ajoutés à 70 pL de tampon RDD . Le mélange d'incubation à base de DNase I a été directement ajouté sur une mini colonne RNeasy , et a été incubé à 2030 C pendant 15 minutes; 350 pL de tampon RW1 ont été ajoutés sur la colonne, puis centrifugés à 13 000 tr/min pendant 30 secondes, et l'écoulement a été mis au rebut.

500 pL de tampon RPE (QIAGEN GmbH) ont été ajoutés sur la colonne, puis l'échantillon a été centrifugé à 13 000 tr/min pendant 30 secondes, et l'écoulement a été mis au rebut. 500 pL supplémentaires de tampon RPE ont été ajoutés sur la colonne RNeasy . La colonne a été centrifugée à 13 000 tr/min pendant 30 secondes, puis l'écoulement a été mis au rebut. La colonne vide a été centrifugée à 13 000 tr/min pendant 1 minute, puis la colonne a été transférée dans un tube propre de 1,5 mL. 40 pL d'eau exempte de RNase ont été ajoutés sur la colonne, et la colonne a été centrifugée à 13 000 tr/min pendant 1 minute. Une autre fraction de 40 pL d'eau exempte de RNase a été ajoutée, et la colonne a été centrifugée à 13 000 tr/min pendant 1 minute. 80 pL de la solution éluée ont été transférés dans un nouveau tube de 1,5 mL.

Exemple 13. Purification de l'ADN génomique dans le sang total Trois protocoles différents ont été utilisés afin d'isoler l'ADN génomique provenant de sang total frais dans un but comparatif. Dans le premier protocole, l'ADN a été isolé en utilisant le Red Blood Cell Lysis Buffer (Roche Diagnostics GmbH) et avec un réactif ( Trizol Reagent , Life Technologies) contenant du phénol selon les protocoles décrits dans le manuel du fournisseur. Le deuxième protocole utilise le QlAamp DNA Blood Kit (QIAGEN GmbH) en se conformant au manuel du fournisseur. Finalement, dans le troisième protocole, la purification de l'ADN total a été réalisée avec un tensioactif à base d'amine primaire comme décrit cidessous.

333 pL de sang total frais ont été mélangés à 1 mL d'une solution consistant en 1 % (poids/volume) de dodécylamine, 3 (en volume) de Tween 20 et 50 mM d'acide maléique. Afin d'isoler l'ADN, les complexes formés par le tensioactif à base d'amine primaire et l'ADN ont été centrifugés à 5000 xg pendant 10 minutes.

Le culot a été dissout dans un mélange de 200 pL de tampon AL (QIAGEN GmbH) et de 2.0 pL de Proteinase K. Après une incubation à 55 C pendant 10 minutes, l'échantillon a été mélangé à 200 pL d'éthanol, puis appliqué sur une colonne tournante contenant une membrane de silice. Le mélange a été passé à travers la membrane sous centrifugation. La membrane de silice a été lavée avec 500 pL de tampon AW1 (QIAGEN GmbH), puis avec 500 pL de tampon AW2 (QIAGEN GmbH), et finalement avec 200 pL d'eau distillée afin d'éluer les molécules d'ADN.

Exemple 14. Qualité et quantités des acides nucléiques Afin d'évaluer les concentrations en acides nucléiques isolés, des mesures d'OD260/280 ont été réalisées au moyen d'un spectrophotomètre. En se rapportant au tableau 3, un tableau comparant la qualité et les quantités obtenues au moyen de 3 procédés d'isolement différents est présenté. Les trois procédés sont: A. Isolement avec une amine primaire de la présente invention, B. Kit commercial de PAXgene Blood RNA Validation Kit ou de QIAamp DNA Blood Kit , et C. Isolement avec un procédé traditionnel utilisant la lyse RBC et le Trizol Reagent .

Tableau 3

Quantité Qualité de Quantité Qualité de Procédé d'ARN (gg/mL l'ARN d'ADN (pg/mL l'ADN d'isolement de sang) (OD260/280) de sang) (OD260/280) A 9,60 2,01 7,80 1,75 B 4, 56 1, 74 37, 00 1, 66 C 3,76 2,06 27,52 2,00 En se basant sur les données du tableau 3, l'isolement de l'ARN avec l'amine primaire de la présente invention permet d'obtenir la quantité la plus élevée par rapport aux autres procédés, et la qualité se trouve également dans une gamme de mesure idéale de 1,9 à 2,1. Les données montrent que le tensioactif à base d'amine primaire de la présente invention était également utile pour isoler l'ADN. Les échantillons résultants ont encore été étudiés au moyen d'une électrophorèse sur gel d'agarose.

Comme on peut le voir sur la figure 4, la piste Dl correspond à l'ADN isolé au moyen d'un procédé traditionnel utilisant la lyse RBC et le Trizol Reagent ; la piste D2 correspond à l'ADN isolé en utilisant le QlAamp DNA Blood Kit ; et la piste D3 correspond à l'ADN isolé en utilisant le tensioactif à base d'amine primaire de la présente invention. La piste R1 correspond à l'ARN isolé au moyen d'un procédé traditionnel utilisant la lyse RBC et le Trizol Reagent ; la piste R2 correspond à l'ARN isolé en utilisant le PAXgene RNA Blood Kit ; et la piste R3 correspond à l'ARN isolé en utilisant le tensioactif à base d'amine primaire de la présente invention. Chaque couloir a été chargé avec une quantité de 100 ng d'ADN et 200 ng d'ARN. Les résultats de la piste D3 et de la piste R3 indiquent que les acides nucléiques isolés sont de meilleure qualité quand le tensioactif à base d'amine primaire est utilisé qu'avec les deux autres procédés traditionnels.

Les résultats montrent que l'utilisation d'un tensioactif à base d'amine primaire permet d'isoler des molécules d'ADN avec une bonne qualité. La quantité d'ARN isolé dans la piste R3 étaient à peu près la même que celle des deux autres couloirs. En se basant sur la piste R3, on peut clairement voir que le procédé d'isolement d'ARN utilisant un tensioactif à base d'amine primaire permet d'obtenir des molécules d'ARN pures non contaminées par de l'ADN génomique.

Exemple 15. Purification de l'ARN total avec un tensioactif à base d'amine secondaire: 18 solutions contenant 1 2 ou 3 % de tensioactif Nméthyldodécylamine et diverses concentrations d'acide tartrique (25, 50, 75, 100, 125, ou 150 mM) ont été préparées. 1 mL de chaque tensioactif a été ajouté à 333 pL de sang total séparé, et les mélanges ont été mis sous agitation à une vitesse 11 tr/min pendant 20 minutes à température ambiante.

La solution a été centrifugée pendant 10 minutes à 5000 xg. Le surnageant a ensuite été éliminé par décantation ou par pipetage. 666 pL d'eau bidistillée ont ensuite été ajoutés au culot, et le culot a été complètement resuspendu sous vortex. L'échantillon a été centrifugé pendant 10 minutes à 5000 xg. La totalité du surnageant a ensuite été éliminée et mise au rebut.

Le culot a été complètement resuspendu dans 50 pL d'eau exempte de RNase par pipetage jusqu'à ce qu'aucune particule ne soit visible. Ensuite, 100 pL de tampon RLT (Qiagen, RNeasy mini kit ) et 40 pL de Proteinase K ont été ajoutés et mélangés de manière uniforme par pipetage. La solution a été incubée pendant 10 minutes à 55 C dans un incubateuragitateur ou un bain d'eau. 200 pL de 1-bromo-3-chloropropane ont été ajoutés à l'échantillon et mélangés sous vortex.

L'échantillon a ensuite été centrifugé pendant 5 minutes à 10 000 xg. Le surnageant a été transféré dans un nouveau tube de 1,5 mL.

pL d'éthanol à 100 % ont été ajoutés à l'échantillon, et mélangés sous vortex. Le mélange a ensuite été brièvement centrifugé (moins de 2 secondes) à faible vitesse afin d'éliminer les gouttes se trouvant à l'intérieur du couvercle du tube.

Les solutions d'échantillon ont été appliquées sur une mini colonne RNeasy et centrifugées pendant 30 secondes à 13 000 tr/min. Ensuite, 350 pL de tampon RW1 ont été ajoutés à la colonne et centrifugés pendant 1 minute à 13 000 tr/min. L'ancien tube ayant servi au traitement et contenant l'écoulement a été mis au rebut.

10 pL d'une solution mère de DNase I ont été ajoutés et mélangés à 70 pL de tampon RDD . Les 80 pL résultants du mélange d'incubation à base de DNase I ont ensuite été directement transférés sur une membrane de colonne tournante, et l'échantillon a été placé à température ambiante pendant 15 minutes. 350 pL de tampon RW1 ont été appliqués sur la colonne, et la colonne tournante a ensuite été centrifugée pendant 30 secondes à 13 000 tr/min. L'ancien tube ayant servi au traitement et contenant l'écoulement a été mis au rebut. 500 pL de tampon RPE ont été appliqués sur la colonne, et la colonne a été centrifugée pendant 30 secondes à 13 000 tr/min. L'ancien tube ayant servi au traitement et contenant l'écoulement a été mis au rebut.

500 pL supplémentaires de tampon RPE ont été ajoutés sur la colonne. La colonne a ensuite été centrifugée pendant 1 minute à 13 000 tr/min. L'ancien tube ayant servi au traitement et contenant l'écoulement a été mis au rebut. La colonne a été centrifugée une nouvelle fois pendant 2 minutes à 13 000 tr/min.

La colonne a été transférée dans un nouveau tube d'élution de 1,5 mL, puis 40 pL d'eau exempte de RNase ont été directement pipetés sur la membrane de la colonne, et le tube d'échantillon a été centrifugé pendant 1 minute à 13 000 tr/min. 40 pL supplémentaires d'eau exempte de RNase ont été appliqués sur la colonne et centrifugés une nouvelle fois, et le produit d'ARN s'est écoulé dans le tube d'élution après la centrifugation.

La taille des culots ( ) des produits d'ARN isolés 15 obtenus au moyen des protocoles illustrées précédemment est présentée dans le tableau 4A.

Tableau 4A Acide

mM 50 mM 75 mM 100 mM 125 mM 150 mM tartrique (mM) 1 % 9 21 18 15 18 30 2 % 45 9 9 6 4, 5 6 3 % 60 30 7, 5 6 4, 5 3 La taille des culots a été définie comme le rapport du volume des culots sur le volume sanguin. Plus la valeur de la taille des culots est élevée, plus il y a d'impuretés ou de contaminants dans les culots.

Le tableau 4B présente le rendement en ARN (pg/mL de sang) après que l'ARN a été isolé en suivant les protocoles ci-dessus.

Tableau 4B Acide

mM 50 mM 75 mM 100 mM 125 mM 150 mM tartrique (mM) 1 % 1 4,26 3,82 2,74 2,86 1,25 2 % N/D 3,61 3,42 2,24 2,57 2,25 3 % N/D N/D 3,69 3,36 2,9 2,24 En se basant sur les données présentées dans les tableaux 4A et 4B, on peut voir que les formulations composées de 2 ô ou de 3 5 de N-méthyldodécylamine et de 75 à 150 mM d'acide tartrique ont permis d'éliminer de plus grandes quantités d'impuretés ou de contaminants dans le produit d'ARN isolé, et les rendements étaient satisfaisants.

Exemple 16. Purification de l'ARN total avec un tensioactif à base d'amine tertiaire solutions contenant 1 % ou 3 5 de N,N- diméthyldodécylamine et diverses concentrations d'acide tartrique (50, 75, 100, 125, ou 150 mM) ont été préparées. 333 pL de sang total frais ont ensuite été mélangés à 1 mL de chaque solution de tensioactif préparée, et le mélange résultant contenant l'échantillon a été mis sous agitation à une vitesse de 11 tr/min pendant 20 minutes à température ambiante afin de l'homogénéiser. La solution a ensuite été centrifugée pendant 10 minutes à 5000 xg. Le surnageant a été éliminé par décantation ou par pipetage. 666 pL d'eau bi-distillée ont ensuite été ajoutés au culot, et le culot a été complètement resuspendu sous vortex. Le mélange a été centrifugé pendant 10 minutes à 5000 xg.

La totalité du surnageant a ensuite été éliminée et mise au rebut.

Le culot a été complètement resuspendu dans 167 pL de tampon RLT (Qiagen, RNeasy mini kit ) jusqu'à ce qu'aucune particule ne soit visible. 200 pL de 1-bromo-3-chloropropane ont été ajoutés à l'échantillon et mélangés sous vortex. L'échantillon a ensuite été centrifugé pendant 5 minutes à 10 000 xg, et le surnageant a été transféré dans un nouveau tube de 1,5 mL.

pL d'éthanol à 100 % ont été ajoutés à l'échantillon et mélangés sous vortex. Le mélange a ensuite été brièvement centrifugé (moins de 2 secondes) à faible vitesse afin d'éliminer les gouttes se trouvant à l'intérieur du couvercle du tube.

Les solutions d'échantillon ont été appliquées sur une mini colonne RNeasy et centrifugées pendant 30 secondes à 13 000 tr/min. Ensuite, 350 pL de tampon RW1 ont été ajoutés à la colonne et centrifugés pendant 1 minute à 13 000 tr/min. L'ancien tube ayant servi au traitement et contenant l'écoulement a été mis au rebut.

pL d'une solution mère de DNase I ont été ajoutés à 70 pL de tampon RDD . Le mélange d'incubation à base de DNase I (80 pL) a ensuite été directement transféré sur la membrane de la colonne tournante, et l'échantillon a été placé à température ambiante pendant 15 minutes. 350 pL de tampon RW1 ont été appliqués sur la colonne et la colonne tournante a été centrifugée pendant 30 secondes à 13 000 tr/min. L'ancien tube ayant servi au traitement et contenant l'écoulement a été mis au rebut. 500 pL de tampon RPE ont été appliqués sur la colonne, et la colonne a été centrifugée pendant 30 secondes à 13 000 Tr/min. L'ancien tube ayant servi au traitement et contenant l'écoulement a été mis au rebut.

500 pL supplémentaires de tampon RPE ont été ajoutés sur la colonne. La colonne a ensuite été centrifugée pendant 1 minute à 13 000 tr/min, puis l'ancien tube ayant servi au traitement et contenant l'écoulement a été mis au rebut. La colonne a été centrifugée une nouvelle fois pendant 2 minutes à 13 000 tr/min.

La colonne a ensuite été transférée dans un nouveau tube d'élution de 1,5 mL, puis 40 pL d'eau exempte de RNase ont été directement appliqués sur la membrane de la colonne, et le tube d'échantillon a été centrifugé pendant 1 minute à 13 000 tr/min. 40 pL supplémentaires d'eau exempte de RNase ont été appliqués sur la colonne et centrifugés une nouvelle fois.

La taille des culots (%) et les rendements des produits d'ARN isolés obtenus au moyen des protocoles illustrés ci-dessus sont présentés dans le tableau 5A et le tableau 5B, respectivement.

Tableau 5A

Acide tartrique (mM) 50 mM 75 mM 100 mM 125 mM 150 mM 1% 7, 5 6 10, 5 7, 5 9 3% 2 1 1 1 1

Tableau 5B

Acide tartrique (mM) 50 mM 75 mM 100 mM 125 mM 150 mM 1 % 5,16 5,07 3,07 2,5 1,94 3 % 1,75 5,24 3,05 2,4 2,84 En se basant sur les données présentées dans les tableaux 5A et 5B, la formulation composée de 3 % de N,N- diméthyldodécylamine et de 75 mM d'acide tartrique éliminent efficacement les impuretés ou les contaminants dans l'ARN isolé, ce qui a pour conséquence de données une plus grande qualité aux produits d'ARN.

L'efficacité d'isolement peut être observée sur la figure 5 qui présente le résultat d'une électrophorèse, les pistes 1 à 5 étant les pistes où 1 % de N,N-diméthyldodécylamine a été utilisé, et les couloirs 6 à 10 étant les pistes où 3 % de N,N-diméthyldodécylamine ont été utilisés. Les pistes 1 et 6, 2 et 7, 3 et 8, 4 et 9, 5 et 10 ont été formulées séparément avec 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM et 150 mM d'acide tartrique.

Exemple 17: Purification de l'ARN total avec un tensioactif à base d'oxyde d'amine tertiaire 16 solutions ont été préparées, chacune contenant 1 % de N-oxyde de N,N- diméthyldodécylamine et diverses quantités d'acide maléique, d'acide citrique, d'acide tartrique, ou d'acide oxalique à des concentrations de 25, 50, 75 ou 100 mM. Ensuite, l'ARN a été isolé à partir d'échantillon de sang total en suivant les étapes décrites dans l'exemple 16 ci-dessus.

Le tableau 6 présente les rendements en ARN (pg/mL de sang) obtenus après que l'ARN a été isolé en suivant les protocoles ci-dessus.

Tableau 6

Rendement en ARN 25 mM 50 mM 75 mM 100 mM Acide maléique 4,32 3,12 3,84 2, 40 Acide citrique 3,84 3,12 4,56 3,36 Acide tartrique 2,64 4,08 3,60 3,84 Acide oxalique 5,28 4,56 3,36 3,60 L'efficacité d'isolement peut être observée à partir du résultat d'une électrophorèse sur la figure 6, sur laquelle la partie A est le résultat obtenu avec l'acide maléique; la partie B est le résultat obtenu avec l'acide citrique; la partie C est le résultat obtenu avec l'acide tartrique, et la partie D est le résultat obtenu avec l'acide oxalique. La piste 1 correspond à une concentration de 25 mM, la piste 2 correspond à une concentration de 50 mM, la piste 3 correspond à une concentration de 5 mM, et la piste 4 correspond à une concentration de 100 mM.

En se basant sur les données du tableau 6 et sur le résultat de l'électrophorèse de la figure 6, on peut voir que les échantillons d'ARN isolés avec 1 % de N-oxyde de N,N-diméthyldodécylamine et l'acide citrique, l'acide tartrique ou l'acide oxalique sont tous de bonne qualité et sont obtenus en quantités acceptables.

Exemple 18. Purification d'ADN génomique dans du sang total avec la 4tétradécylaniline: 3 solutions composées de 1 % de 4-tétradécylaniline et de Tween 20 en diverses concentrations (3,4 % ou 5 %) ont été préparées. 333 pL de sang total frais ont été mélangés à 1 mL de chaque solution de tensioactif préparée. Le mélange a ensuite été centrifugé à 5000 xg pendant 10 minutes afin de précipiter les complexes de molécules d'ADN et de tensioactifs à base d'amine primaire. Le culot a été dissout dans 333 pL de tampon RLT (QIAGEN GmbH).

Ensuite, 200 pL de 1-bromo-3-chloropropane ont été ajoutés à l'échantillon et mélangés sous vortex. L'échantillon a ensuite été centrifugé pendant 5 minutes à 10 000 xg.

Le surnageant a été transféré dans un nouveau tube de 1,5 mL, puis mélangé à 160 pL d'éthanol, et appliqué sur une colonne tournante contenant une membrane de silice. L'échantillon a été passé à travers la membrane sous centrifugation. La membrane de silice a été lavée une fois avec 700 pL de tampon RW1 (QIAGEN GmbH), puis deux fois avec 500 pL de tampon RPE (QIAGEN GmbH), et finalement avec 80 pL d'eau distillée afin d'éluer les molécules d'ADN.

L'efficacité d'isolement peut être observée à partir du résultat de l'électrophorèse de la figure 7, sur laquelle les trois couloirs représentent différentes concentrations en Tween 20 . La piste 1 était avec une concentration de 3 la piste 2 était avec une concentration de 4 et la piste 3 était avec une concentration de 5 En se basant sur les résultats, les échantillons d'ADN isolés avec la 4-tétradécylaniline sont de bonne qualité et sont obtenus en quantités satisfaisantes. De plus, un ADN génomique intact peut être extrait.

Les modes de réalisation démontrent que des acides nucléiques issus d'un échantillon biologique peuvent être efficacement stabilisés ou isolés avec plusieurs solutions de stabilisation contenant une amine primaire, une amine secondaire ou une amine tertiaire de la présente invention. D'après les données obtenues à partir des exemples ci-dessus, la présente invention prolonge les périodes de stabilisation ou de préservation et augmente également la quantité de produit isolé au moyen de protocoles simples. Le procédé peut être automatisé afin d'augmenter le débit et de développer l'utilisation du test de diagnostic moléculaire avec des acides nucléiques.

Bien que la présente invention ait été expliquée en référant à son mode de réalisation préféré, il est entendu que de nombreuses autres modifications et variations possibles peuvent être réalisées sans s'écarter de l'esprit et de l'étendue de l'invention.

Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation ci-dessus décrits et représentés, à partir desquels on pourra prévoir d'autres modes et d'autres formes de réalisation, sans pour autant sortir du cadre de l'invention.

Claims (18)

REVENDICATIONS

1. Procédé destiné à stabiliser ou à isoler des acides nucléiques par la formation d'un complexe ionique insoluble entre des acides nucléiques et un tensioactif dans un échantillon biologique, comprenant une étape de mise en contact de l'échantillon biologique avec une composition de stabilisation ou d'isolement, caractérisé en ce que ladite composition comprend des tensioactifs amino de formule (I) . R1R2R3N (0) h, (1), dans laquelle, R1 et R2 chacun indépendamment est un H, un groupe alkyle en CI à CE, un groupe aryle en CE à C12, ou un groupe aralkyle en CE à CIO R3 est un groupe alkyle en C1 à CL0r un groupe aryle en C6 à C2E ou un groupe aralkyle en CE à C2E,; et x est un entier prenant comme valeur 0 ou 1.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que x vaut 1, RI et R2 chacun indépendamment est un alkyle en C1 à CE, et R3 est un alkyle en Cl à C20.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que x vaut O. 4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits tensioactifs amino sont choisis dans le groupe constitué par la dodécylamine, la N-méthyldodécylamine, la N,N-diméthyldodécylamine, le Noxyde de N,N-diméthyldodécylamine et la 4-tétradécylaniline.

5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la concentration en tensioactifs amino dans la composition est située dans la gamme de 0,001 % à 20 6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite composition comprend en outre au moins un détergent non ionique, au moins un sel d'acide, ou leur mélange.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit ou chaque détergent non ionique est le monolaurate de polyoxyéthylène sorbitane.

8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que au moins un détergent non ionique est présent dans la composition dans la gamme de 0, 01 % à 20 9. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit ou chaque détergent non ionique est le Tween 20 ou le Triton X-100 .

10. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit ou chaque sel d'acide est choisi dans le groupe constitué par l'acide maléique, l'acide tartrique, l'acide citrique, l'acide oxalique, les acides carboxyliques et les acides minéraux.

11. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la concentration totale desdits sels d'acide dans la composition est située dans la gamme de 0,01 M à 1 M. 12. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le pH de ladite composition est situé dans la gamme de 1 à 10.

13. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit échantillon biologique est choisi dans le groupe constitué par le sang total, le plasma, le sérum, l'urine, le tissu et les cellules.

14. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits acides nucléiques sont l'ADN et l'ARN.

15. Réactif destiné à stabiliser ou à isoler des acides nucléiques, tels que l'ADN et l'ARN, dans un échantillon biologique, tel qu'un échantillon choisi dans le groupe constitué par le sang total, le plasma, le sérum, l'urine, le tissu et les cellules, caractérisé en ce qu'il comprend des tensioactifs amino de formule (I) . R1R2R3N (0) x, (1), dans laquelle, R1 et R2 chacun indépendamment est un H, un groupe alkyle en C1 à C6r un groupe aryle en C6 à C12, ou un groupe aralkyle en C6 à C12 R3 est un groupe alkyle en C1 à C20r un groupe aryle en C6 à C26 ou un groupe aralkyle en C6 à C26; et x est un entier prenant comme valeur 0 ou 1.

16. Réactif selon la revendication 15, caractérisé en ce que x vaut 1, R1 et R2 chacun indépendamment est un alkyle en C1 à C6, et R3 est un alkyle en C1 à C20.

17. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que x vaut O. 18. Réactif selon la revendication 15, caractérisé en ce que lesdits tensioactifs amino sont choisis dans le groupe constitué par la dodécylamine, la N-méthyldodécylamine, la N,N-diméthyldodécylamine, le Noxyde de N,N-diméthyldodécylamine et la 4-tétradécylaniline.

19. Réactif selon la revendication 15, caractérisé en ce que la concentration en tensioactifs amino dans le réactif est située dans la gamme de 0,001 à 20 20. Réactif selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un détergent non ionique, au moins un sel d'acide, ou leur mélange.

21. Réactif selon la revendication 20, caractérisé en ce que ledit détergent non ionique est le monolaurate de polyoxyéthylène sorbitane.

22. Réactif selon la revendication 20, caractérisé en ce que les détergents non ioniques sont présents dans le réactif dans la gamme de 0, 01 % à 20 23. Réactif selon la revendication 20, caractérisé en ce que ledit détergent non ionique est le Tween 20 ou le Triton X-100 .

29. Réactif selon la revendication 20, caractérisé en ce que ledit ou chaque sel d'acide est choisi dans le groupe constitué par l'acide maléique, l'acide tartrique, l'acide citrique, l'acide oxalique, les acides carboxyliques et les acides minéraux.

25. Réactif selon la revendication 20, caractérisé en ce que la concentration totale desdits sels d'acide dans le réactif est située dans la gamme de 0,01 M à 1 M. 26. Réactif selon la revendication 15, caractérisé en ce que le pH dudit réactif est situé dans la gamme de 1 à 10.