FR2721944A1 - Sequence d'adn specifique du genre dinophysis, procede de detection dan l'eau de mer de micro-organisme du genre dinophysis - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une séquence d'ADN spécifique du genre Dinophysis (représentée par SEQ ID N** o 3 dans la liste des séquences annexée). L'invention concerne également des oligocléotides spécifiques de l'espèce D. acuminata. L'invention a également pour objet une méthode et un nécessaire pour détecter la présence d'un micro-organisme du genre Dinophysis dans un échantillon d'eau de mer.

Description

La présente invention concerne le domaine de la contamination de l'eau de

mer par les micro-organismes du genre Dinophysis. Elle concerne plus particulièrement une séquence d'ADN spécifique du genre Dinophysis. L'invention concerne également des oligonucléotides spécifiques de l'espèce Dinophysis acuminata. L'invention a également pour objet une méthode et un nécessaire pour détecter la présence d'un micro-organisme du

genre Dinophysis dans un échantillon d'eau de mer.

Plusieurs espèces de Dinophysis (dinophyceae) ont été incriminées dans des contaminations de fruits de mer, provoquant un syndrome diarrhéique chez les sujets qui les ingèrent. En particulier, on a constaté ces dernières années une prolifération de Dinophysis acuminata, qui est une micro-algue toxique de la famille des dinoflagellés, le long des côtes françaises, nord-européennes, américaines et japonaises [World aquaculture 1991, 22(4), 49-54; Mar. Biol. 1977, 40(4), 327-336; Coll. Fr. Jap. Oceanogr., Marseille 16-21 sept. 1985, 2, 65-72]. La toxicité de ces espèces est due à la présence d'acide okadaique, qui

s'accumule dans l'hépatopancréas des coquillages, notamment les moules.

Différentes méthodes ont en conséquence été proposées pour détecter l'acide okadaique dans un échantillon d'eau de mer: on peut citer en particulier les biodosages sur des souris décrits par Le Déan et al. dans "Dinophysis acuminata toxin: status of toxicity bioassays in France", [publié dans "Toxic dinoflagellates" (D.M. Anderson et al. éditeurs), 1985, 485-488, Elsevier, New-York] ou bien encore les tests cytotoxiques et autres

dosages radioimmunologiques décrits par Van Vunakis et al. (Toxicon. 1988, 26, 1125-

1128).

Toutefois, ces différentes méthodes ne permettent pas d'obtenir rapidement les

résultats d'analyse des échantillons traités et sont peu ou pas reproductibles.

La Demanderesse a maintenant trouvé qu'il était possible de remédier à tous ces inconvénients et de déterminer ou contrôler la présence ou l'absence de micro-organismes du genre Dinophysis dans un échantillon d'eau de mer, et ce de manière simple, rapide,

fiable et reproductible.

La Demanderesse s'est tout d'abord intéressée à la détermination d'une partie d'une séquence d'acide nucléique d'un micro-organisme du genre Dinophysis, notamment de l'espèce Dinophysis acuminata, en utilisant la technique de la réaction de polymérisation en chaîne ou PCR ("Polymerase Chain Reaction"). Or, le génome de Dinophysis étant totalement inconnu à ce jour, le problème à résoudre a résidé dans le choix de la séquence d'acide nucléique susceptible d'être amplifiée par PCR. On a trouvé que la mise en oeuvre de la PCR à l'aide de deux amorces oligonucléotidiques universelles, choisies dans les régions conservées de la séquence de l'ARN ribosomnique 24 S de Prorocentrum micans, décrite par Herzog et al. (J. Mol. Evol. 1989, 29, 40-51), permet d'obtenir indirectement une séquence partielle du gène codant pour l'ARN ribosomique 24 S du micro-organisme considéré. Selon un premier aspect, l'invention concerne donc une séquence d'ADN spécifique du genre Dinophysis. Cette séquence d'ADN est la séquence partielle du gène codant pour l'ARN ribosomique 24 S de Dinophysis acuminata; elle a été déterminée par le procédé qui consiste à: (a) préparer une suspension de cellules dudit micro-organisme, (b) amplifier l'ADN génomique du surnageant cellulaire par la réaction de polymérisation en chaîne à l'aide de deux amorces oligonucléotidiques synthétisées à partir de séquences de l'ARNr 24S de Prorocentrum micans; et

(c) purifier et séquencer l'ADN ainsi amplifié.

Dans l'étape (a), la suspension cellulaire a été obtenue par triple triage de cellules de D. acuminata provenant d'un échantillon d'eau de mer, puis par resuspension de ces cellules

dans de l'eau de mer stérile, après le troisième triage.

La séquence d'ADN selon l'invention ou des fragments de celle-ci est utile pour la

détection des algues du genre Dinophysis.

La technique de la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) est une méthode bien connue de l'homme de l'art qui permet de copier simultanément les deux brins d'une séquence d'ADN préalablement dénaturé en utilisant deux oligonucléotides comme amorces (cf. notamment le brevet EP 200 362 et l'ouvrage de HA. Erlich: "PCR Technology: Principles and Applications for DNA amplification" publié en 1989 par les éditions Macmillan Publishers Ltd, Royaume-Uni et celui de MA Innis et al. "PCR Protocols" publié en 1990 par Academic Press Inc. San Diego, Californie 92101, USA). Le

principe de cette technique est résumé ci-après.

La technique de la PCR est basée sur la répétition de trois étapes, permettant d'obtenir, après entre 10 et 30 cycles, des centaines de milliers de copies de la matrice originale, à l'aide d'une ADN polymérase de Thermus aquaticus, habituellement appelée polymérase Taq. Les trois étapes sont les suivantes: - Dénaturation de la matrice: L'ADN double brin est dénaturé en ADN simple brin par incubation à haute température (de 92' C à 96' C) pendant approximativement 2 min. - Hybridation des amorces: Ces amorces sont une paire d'oligonucléotides synthétiques qui s'hybrident avec les

extrémités de la région à amplifier. Les deux amorces s'hybrident avec les brins opposés.

Les amorces sont ajoutées en excès, de façon à ce que la formation du complexe amorce-

matrice soit favorisée.

- Extension des amorces: L'étape au cours de laquelle la polymérase Taq assure l'extension du complexe amorce-matrice de 5' vers 3' est effectuée à 70-72 C. Dans la technique de la PCR, le produit d'intérêt apparaît au troisième cycle et il est alors amplifié de manière significative. Au cours du déroulement des cycles, le produit

d'amplification devient rapidement la matrice avec laquelle les amorces s'hybrident.

Selon la présente invention, les amorces oligonucléotidiques utilisées à l'étape b) ont été préparés à l'aide d'un synthéthiseur d'ADN (DNA synthetizer, commercialisé par la Société Biosearch Inc., USA): Le premier oligonucléotide, appelé amorce 1, dont la séquence est la suivante:

' CCGTCTCGAA ACACGGACC 3' (SEQ ID N 1)

correspond aux nucléotides 711-729 de la séquence d'ADN déduite de l'ARN ribosomique

24 S de Prorocentrum micans.

Le deuxième oligonucléotide, appelé amorce 2, dont la séquence est la suivante:

5' TTGCTACTAC CACCATGATC TGC 3' (SEQ ID N 2)

correspond aux nucléotides complémentaires des nucléotides 1483-1505 de la séquence

d'ADN déduite de l'ARN ribosomique 24 S de Prorocentrum micans.

Lorsque le micro-organisme est Dinophysis acuminata, la séquence d'ADN partielle du gène codant pour l'ARN ribosomique 24 S dudit microorganisme est la séquence (SEQ ID N- 3) suivante:

CCGTCTTGAA ACACGGACCA AGGAGTCTAG CATATGTGCA TGCGCATGGG CTTTACACCT 60

GTGTGTGCAA CGAAAGTGAC TGCTGGGATA AGTGCGCCAC AACCCGACCA ATTGATTGAG 120

AAAGGITTGA GTATCAGCAT ATGTGTTAGG ACCCGAAATA TGGTGAACTA TGCTTGAGAA 180

GGGCCAAACTC AGGGGAAACTCTGATGGAGG CTCGTAGCGG TACTGACGCG CAAATCGTTC 240

GTCATACITG GGTATAGGGG CGAAAGACTA ATCGAACCAT CTAGTAGCTG GTTCCCTCTG 300

AAGTITCCCT CAGGCTAGCT GGAGT'TGAAC AGTTTTATCA GGTAAAGCGA ATGATTAGAG 360

GAATCGGGGG CGCGCCGTTC TCGACCTATT CTCAAACT TAACTGGGTA AGATCCAGTG 420

GTTAACTTGG GTGAACTTAT TGGGGCACAT T'ITACATCC AAGTGGGCCA TTTITGGTA 480

AGCAGAACTG GCGATGAGGG ATGAACCTAA CGTAGGCCTA AGGTGCCTTrA ACTGCTCGCT 540 CATTAGATAC CATAAAGGGT GTTGGTCCAT TrGACAGCA GGACGGTGGT CATGGAAGTT 600

GAAATCCGCT AAGGAGTGTG TAACAACTCA CCTGCCGAAT GGACTAGCCC CGAAAATGGA 660

TGGCGCTCAA GCGGGTGACC GATGCCCAGC CATTGCTGCA AGTATGCTAC AACAATGAGT 720

AGGAGGGTGT GGTGATTGTG ATGAATCTCT AAATGTGAAT TTGGGTGAAG CAATTrCCAG 780

TCCAAGATCT TGGTGGTAGT AGCAA 805

Ce fragment amplifié a ensuite été aligné avec les séquences d'ADN déduites des séquences d'ARN ribosomique 24 S de Prorocentrum micans (dinoflagellés), Dictiostelium discoideum, Tetrahymena pyriformis, Mucor racemosus, Sacharromyces cerevisiae, obtenues de la Société Genbank, en utilisant le programme "clustal" mis au point par Sharp et al. (Gene 1988, 73, 237-244). Cet alignement, représenté sur la Figure 3, a permis de déterminer deux oligonucléotides spécifiques de Dinophysis acuminata, présentant une très faible homologie avec les séquences de P. micans, qui pourront être utilisés par la suite pour amplifier des séquences d'acide nucléique spécifiques de micro-organismes du genre Dinophysis. Selon un second aspect, l'invention concerne par conséquent deux oligonucléotides synthétiques, spécifiques de Dinophysis acuminata appelés amorces 3 et 4, préparés de manière analogue aux amorces 1 et 2: - le premier oligonucléotide, appelé amorce 3, dont la séquence est la suivante:

5' GCGCATGGGC TITACACC 3' (SEQ ID N 4)

correspond aux nucléotides 752-769 de la séquence d'ADN du gène codant pour l'ARN

ribosomal 24 S de Dinophysis acuminata.

- le second oligonucléotide, appelé amorce 4, dont la séquence est la suivante:

' TTGCTTCACC CAAAITCACA TITA 3'(SEQ ID N 5)

correspond aux nucléotides complémentaires des nucléotides 1450-1473 de la séquence

d'ADN du gène codant pour l'ARN ribosomal 24 S de Dinophysis acuminata.

Ces oligonucléotides spécifiques de Dinophysis acuminata seront utiles pour détecter la présence de tout micro-organisme du genre Dinophysis, en particulier des espèces D. acuminata et D. sacculus. En effet, D. sacculus est une des espèces les plus proches phylogéniquement de D. acuminata, et sa séquence d'ARNr 24S est fortement

homologue (au moins 70 %) de celle de D. acuminata.

Ainsi, selon un troisième aspect, l'invention concerne une méthode de détection ou de contrôle de la présence ou l'absence d'un micro- organisme du genre Dinophysis dans un échantillon d'eau de mer par détection d'une séquence d'acide nucléique spécifique dudit micro- organisme qui consiste à: (a) isoler l'ADN des cellules de l'échantillon; (b) soumettre ledit ADN, purifié ou non, à une réaction de polymérase en chaîne à l'aide des amorces nucléotidiques 3 et 4 décrites ci-dessus, à une température d'hybridation comprise entre 50 et 70- C, de façon à amplifier, si elle est présente, la séquence d'acide nucléique spécifique du micro-organisme; et (c) déterminer si la séquence d'acide nucléique spécifique du micro-organisme est présente

dans l'échantillon.

Selon cette méthode, l'ADN isolé peut être obtenu (i) soit tel quel, par filtration de l'échantillon de l'eau de mer et lyse des cellules filtrées, (ii) soit sous une forme purifiée par lyse enzymatique et/ou extraction au phénol/chloroforme des cellules filtrées selon des

techniques bien connues de l'homme de l'art.

La détermination de la présence de la séquence d'acide nucléique spécifique du micro-organisme pourra par exemple s'effectuer par comparaison de la séquence amplifiée à l'étape b) avec la séquence SEQ ID N 3 au moyen du logiciel "clustal" décrit

précédemment, ou bien par migration sur gel d'agarose, par référence à un témoin positif.

s La température d'hybridation utilisée au cours de la PCR est déterminée théoriquement par le % (G+C) de la séquence d'acide nucléique à détecter. Cette température varie suivant l'espèce de Dinophysis dont on recherche la présence et la pureté de l'ADN que l'on cherche à amplifier. Ainsi, par exemple comme expliqué plus en détail dans les exemples 2 et 3, une température d'hybridation de 50- C permet de mettre en évidence la présence du genre Dinophysis alors qu'une température d'hybridation de 60 C permet de mettre en évidence la présence de l'espèce D. acuminata seule, lorsqu'on utilise

de l'ADN non purifié.

Une manière de détecter la présence de la séquence d'acide nucléique du micro-

organisme consiste à ajouter au produit de l'étape b) une sonde marquée capable de s'hybrider avec la séquence d'acide nucléique amplifiée puis de déterminer si la sonde s'est hybridée avec la séquence amplifiée. Par exemple, cette détermination peut être effectuée: - en faisant digérer le mélange d'hybridation avec une enzyme de restriction capable de reconnaître un site (de restriction) présent dans la séquence de la sonde; et - en détectant si le produit de digestion contient un fragment de restriction associé à la

présence de la séquence à détecter.

Selon un autre aspect, l'invention concerne également un nécessaire pour détecter ou

contrôler la présence ou l'absence d'une séquence d'acide nucléique spécifique d'un micro-

organisme du genre Dinophysis qui comprend: - les deux amorces nucléotidiques spécifiques de Dinophysis acuminata décrites précédemment; un agent de polymérisation et les quatre nucléotides triphosphates et éventuellement - une sonde marquée capable de s'hybrider avec la séquence d'acide nucléique à détecter, ainsi que des moyens de détection des hybrides formés entre la sonde et la séquence à détecter. Le nécessaire selon l'invention permet la détection très rapide et reproductible de la présence ou non dans un échantillon d'eau de mer d'un micro-organisme du genre Dinophysis: il s'écoule au plus 6 heures entre la prise en main de l'échantillon dans un laboratoire équipé de ce nécessaire, et le rendu des résultats. De plus, le nécessaire selon l'invention permet de détecter des concentrations en Dinophysis jusqu'à 10 fois inférieures à la valeur de seuil d'alerte (300 cellules/l. d'eau) fixée par le réseau REPHY (Réseau de

Surveillance du Phytoplancton).

L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples ci-après, donnés bien sûr à

titre purement illustratif.

Une grande partie de l'ensemble des techniques décrites dans ces exemples, bien connues de l'homme de l'art, est exposée en détail dans l'ouvrage de Sambrook, Fritsch et Maniatis: "Molecular Cloning: a laboratory manual", publié en 1989 par les éditions Cold

Spring Harbor Press à New-York (2nde édition).

La description ci-après sera mieux comprise à l'aide des Figures 1 à 5.

La figure 1 représente la carte d'assemblage de l'ARN ribosomique 24 S de Dinophysis acuminata, composé des domaines variables D1 à D7. L'amorce 3 fait partie du domaine variable D3 (nucléotides 752-769) et l'amorce 4 se trouve dans une région qui englobe les hélices 32-33 de la structure secondaire de l'ARNr 24S des dinoflagellés, et sa

séquence est complémentaire aux nucléotides 1450-1473.

La figure 2 représente l'amplification du fragment de 805 pb du gène codant pour l'ARNr 24 S de Dinophysis acuminata. La colonne 1 représente l'amplification obtenue par transcription inverse +PCR; les colonnes 2 et 3 représentent respectivement l'amplification obtenue par PCR directe sur 10 tl et 50 ul de lysat cellulaire; la colonne M représente

l'amplification de l'ADN du phage X digéré par Bst E II.

La figure 3 représente l'alignement selon la technique "clustal" (Gene 1988, 73, 237-244) d'un fragment de 805 bp du gène codant pour l'ARNr 24 S de Dinophysis acuminata (1) avec les séquences de Prorocentrumn micans (2), Dictiostelium discoideum

(3), Mucor racemosus (4), Saccharomyces cerevisiae (5) et Tetrahymena pyriformis (6).

La figure 4 représente l'amplification d'un fragment de 721 pb du gène codant pour l'ARNr 24 S de Dinophysis acuminata par les amorces 3 et 4. Les colonnes 1 et 2 représentent l'amplification obtenue par PCR sur 10 Yl de lysat; la colonne 3 représente l'amplification obtenue pour un témoin négatif (mélange réactif pour la PCR sans ADN); la colonne 4 représente l'amplification obtenue pour un témoin positif (mélange réactif pour la PCR avec ADN purifié de D. acuminata); la colonne M représente l'amplification de

l'ADN du phage X coupé par Hind III et Eco RI.

La figure 5 représente la détection de différents échantillons d'eau de mer contenant Dinophysis acuminata à diverses concentration: 0 cellule (colonne 1, témoin négatif); 30 cellules (colonne 2); 150 cellules (colonne 3); 300 cellules (colonne 4); 600 cellules (colonne 5); 1500 cellules (colonne 6); 3000 cellules (colonne 7); 7500 cellules (colonne

8); 15 000 cellules (colonne 9) et témoin positif (colonne 10).

Exemple 1: Clonage et séquençage d'un fragment du gène codant pour l'ARNr 24 S de Dinophysis acuminata 1/ Préparation des échantillons Des cellules de Dinophysis acuminata ont été triées à l'aide d'un micromanipulateur à partir d'échantillons d'eau de mer durant la prolifération de Dinophysis acuminata observée en juillet 1991 dans l'estuaire de la Seine. Ces cellules ont été centrifugées et lavées dans 1 ml de tampon PBS. Après centrifugation à 10 000 g pendant 10 min, les cellules ont été resuspendues dans 100,ul de tampon TE (10 mM Tris- Hcl (pH 7,4), 1 mM EDTA (pH8)) et 10 pl d'une solution de 1 mg/ml de protéinase K (Merck). Le mélange est alors incubé pendant 15 min. à 37 C puis pendant 15 min. à 90 C. Les cellules sont ensuite soumises aux micro-ondes (650 W, 5 min.), comme décrit par Datta et al. (Appl. and

environ. Microbiol. 1988, 54, 2933-2937), puis centrifugées pendant 1 min. à 12 000 g.

2/ Amplification de la séquence partielle du gène codant pour l'ARNr 24 S de Dinophysis acuminata Ml de surnageant du produit obtenu à l'étape précédente sont dissous dans du tampon Taq DNA 1 X (50 mM KCI, 10 mM Tris HCI [pH 8,3], 0,001 % gélatine; Cetus) contenant 1,5 mM MgC12 (Cetus) puis l'amplification est effectuée dans un volume total de Ml avec 4,5 unités de l'enzyme Taq DNA polymérase (Cetus), 200 FM de chacun des désoxynucléotides triphosphates dATP, dGTP, dCTP, d'ITP (Boehringer Mannheim) et 300

ng de chacune des amorces (amorce 1 et amorce 2) décrites ci-dessus.

Les échantillons d'ADN ont été dénaturés initialement à 94' C pendant 5 min. puis la PCR a été réalisée en utilisant un bain sec à cycles de températures programmables (PHC2, commercialisé par la Société TECHNE); l'amplification se fait au cours de 30 cycles réactionnels, dont les étapes d'un cycle sont les suivantes: - 1 min. à 94' C: dénaturation - 1 min. à 60' C hybridation

- 2 min. à 70' C = polymérisation.

Le fragment d'ADN ainsi amplifié, qui présente une longeur de 515 bp sans les domaines variables D3, D4, D5 et D6, et de 805 bp dans sa totalité, a été ensuite isolé et purifié sur gel d'agarose à 1 % à partir de 80 1 de produit de la réaction, selon la méthode

décrite par Maniatis et al. (op. cité).

3/ Clonage et séquençage Le produit d'amplification a été "réparé" par l'action de l'enzyme ADN ligase du phage T4 (Pharmacia) cloneé en bouts francs dans un plasmide KSII Bluescript (Stratagène) linéarisé par l'action de Sma I: 1 ug de plasmide KSII Bluescript est placé dans un mélange constitué de 2 pd de tampon 10X de digestion, 13,5 ml d'H20 stérile et 10U d'enzyme de restriction Sma I. Le plasmide a été transfecté par électroporation à l'aide d'un appareil "Gene pulse system' (Biorad) comme décrit par Dower et ai. (Nucleic Acids Res. 1988, 16, 6127) et dans les conditions prescrites par le fabricant. L'extraction du plasmide et la purification ont été réalisées selon la méthode préconisée par Ausubel et al. ("Current

protocols in molecular biology" publié en 1987 par Wiley Interscience à New-York).

L'ADN purifié a été dilué dans 20 MI de tampon TE; 4 l de cette dilution ont été prélevés pour le séquencçage, réalisé à l'aide d'un séquenceur automatique "Applied Biosystems Model 373 A", en utilisant la technique du marquage des amorces T3 et T7 par des

fluorochromes comme indiqué par le fabricant.

La séquence du fragment obtenu est désigné par (SEQ ID N 3) dans la liste des

séquences annexée à la présente description.

A titre de comparaison, on a essayé d'amplifier la séquence codant pour l'ARNr 24 S de Dinophysis acuminata par (1) transcription inverse + PCR ou (2) PCR directe sur 50/l

de lysat cellulaire.

Comme on peut le voir sur la figure 2, la technique selon l'invention (PCR directe

sur 10 p1 de lysat cellulaire) donne une meilleure amplification de la séquence considérée.

Exemple 2: Choix d'oligonucléotides spécifiques de Dinophysis acuminata Ces oligonucléotides, appelés amorces 3 et 4 comme indiqué précédemment, font partie du domaine variable D3 pour le premier et de la région suivant le domaine variable D6 pour le second. Cette région, elle aussi variable, englobe les deux hélices 32-33 de la structure secondaire de l'ARNr 24 S des dinoflagellés. La spécificité de ces oligonucléotides a été testée en essayant de dupliquer, par la technique de la PCR, des brins d'ADN de représentants de chaque ordre constituant la classe des dinoflagellés: Prorocentrum micans, Prorocentrum lima (prorocentrales), Alexandrium tamarense, Alexandrium minutum (peridiniales), Scrippsiella trochoideae (péridiniales), ainsi que sur un autre représentant du genre Dinophysis: Dinophysis sacculus. Cette espèce est considérée comme une des espèces les plus proches phylogéniquement de D. acuminata, sa séquence d'ARNr 24 S étant fortement homologue de celle de D. acuminata. L'ADN de D. sacculus nécessaire pour effectuer ce test de spécificité a été isolé par triage des cellules de D. sacculus présentes dans un échantillon d'eau de mer, puis suspension dans de l'eau de mer stérile et lyse de ces cellules. La température d'hybridation des cycles de la PCR était soit de 50 C, soit de 60 C, les échantillons d'ADN de D. acuminata et D. sacculus étant non purifiés. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 1 ci-dessous: TABLEAU 1: spécificité des oligonucléotides "amorce 3" et "amorce 4"

ESPECES REACTIVITE AVEC LES SONDES

"AMORCE 3" ET "AMORCE 4"

C 60 C

Dinophysis acuminata + + Dinophysis sacculus +

Prorocentrum micans - -

Prorocentrum Lima - -

Alexandrium tamarense - -

Alexandrium minutum - -

Scrippsiella trochoidea - -

Comme on peut le constater, les oligonucléotides "amorce 3" et "amorce 4"

permettent la duplication, donc la détection, de séquences d'acides nucléiques du micro-

organisme du genre Dinophysis. Par ailleurs, il est clair qu'une température d'hybridation de C permet la détection simultanée de D. acuminata et D. sacculus, c'est-à-dire du genre Dinophysis, alors qu'une température d'hybridation de 60 C permet la détection de l'espèce

D. acuminata seule.

Exemple 3: Détection de la présence de Dinophysis acuminata dans un échantillon d'eau de mer. 1/ Filtration d'un échantillon d'eau de mer L'eau de mer est préfiltrée sur un filtre Scrynel 100,unm (ZBF Rickschlikon Suisse), puis successivement filtrée sur un filtre Scrynel 48,umn et Scrynel 22 um. Ce filtre de 22 am de diamètre de pore est placé dans un tube de centrifugation de 50 ml dans lequel est rajouté ml de tampon PBS. On agite manuellement le tube pendant 2 min. puis on agite au vortex pendant 30 s. Les cellules décrochées du filtre sont centrifugées pendant 10 min. à 2000 g et lavées dans 2 ml de tampon PBS. Après avoir resuspendu les cellules, le tout est

transféré dans un micro-tube de 1,5 ml de volume.

2/ Amplification génique et visualisation d'un fragment spécifique de 721 pb de Dinophysis acuminata Ce traitement est effectué de manière analogue à la procédure décrite à l'exemple 1, étapes 2) et 3), avec les modifications suivantes: on utilise 0,2 mM de chaque desoxynucléotide triphosphate; SU de Taq polymerase; les étapes de dénaturation, hybridation et polymérisation durent respectivement 30 s., 30 s. et 40 s.; l'étape de polymérisation est effectuée à 72' C et on utilise le couple d'oligonucléotides (amorce 3 et amorce 4) à la place du couple (amorce 1 et amorce 2). Comme on peut le voir sur la figure 4 (colonnes 1 et 2), la séquence de 721 pb spécifique de Dinophysis acuminata est mise en s évidence, ce qui permet d'affirmer que l'échantillon d'eau de mer testé contient

effectivement des cellules de Dinophysis acuminata.

La température d'hybridation utilisée au cours de la PCR (70' C) n'est valable que dans le cas d'une détection à partir d'ADN purifié. Cette température a du être abaissée à

' C dans le cas d'une détection à partir d'ADN non purifié.

Lorsqu'on a utilisé de l'ADN purifié, la température d'hybridation de 70 C a permis de détecter la présence de l'espèce D. acuminata seule. Lorsque la température d'hybridation a été abaissée à 60 C, on a déterminé la présence simultanée de D. sacculus et de D.

acuminata, donc du genre Dinophysis.

Exemple 4: sensibilité de la méthode de détection

A partir d'échantillons bruts d'eau de mer prélevés en Manche (cf Tableau 2 ci-

après), des dilutions ont été faites après filtrations successives suivant la procédure de

l'exemple 3, étape 1).

TABLEAU 2

Echantillon Volume (1) contenu Nb de Réactivité Dinophysis avec les amorces 3 et 4 1 0,25 Phytoplancton 176 000 + et Dinophysis acuminata 2 0,25 et 88000 + 3 0,25 et 44000 +

4 0,25 " 22000 +

Comme on peut le voir sur la Figure 5, la concentration minimale détectée est de 30

cellules de Dinophysis acuminata après récupération sur filtre.

il 2721944

LISTE DE SEQUENCES

(1) INFORMATION GENERALE:

(i) DEPOSANT:

(A) NOM: IFREMER

(B) RUE: 155 RUE JEAN JACQUES ROUSSEAU

(C) VILLE: ISSY LES MOULINEAUX

(E) PAYS: FRANCE

(F) CODE POSTAL: 92138 CEDEX

(A) NOM: DIAGNOSTICS NOUVEAUX ALIMENTAIRES

(B) RUE: 2196 BOULEVARD DE LA LIRONDE

(C) VILLE: MONTFERRIER/LEZ

(E) PAYS: FRANCE

(F) CODE POSTAL: 34397 CEDEX 5

(ii) TITRE DE L' INVENTION: METHODE DE DETECTION D'UN MICRO-ORGANISME DU

GENRE DINOPHYSIS

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 5 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible

(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS

(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB)

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 19 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: OUI (iii) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

12 2721944

CCGTCTCGAA ACACGGACC 19

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 23 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: OUI (iii) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

TTGCTACTAC CACCATGATC TGC 23

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 805 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

CCGTCTTGAA ACACGGACCA AGGAGTCTAG CATATGTGCA TGCGCATGGG CTTTACACCT 60

GTGTGTGCAA CGAAAGTGAC TGCTGGGATA AGTGCGCCAC AACCCGACCA ATTGATTGAG 120

AAAGGTTTrGA GTATCAGCAT ATGTGTTAGG ACCCGAAATA TGGTGAACTA TGCTTGAGAA 180

GGGCAAACTC AGGGGAAACT CTGATGGAGG CTCGTAGCGG TACTGACGCG CAAATCGTTC 240

GTCATACTTG GGTATAGGGG CGAAAGACTA ATCGAACCAT CTAGTAGCTG GTTCCCTCTG 300

AAGTTTCCCT CAGGCTAGCT GGAGTTGAAC AGTTTTATCA GGTAAAGCGA ATGATTAGAG 360 GAATCGGGGG CGCGCCGTTC TCGACCTATT CTCAAACTTT TAACTGGGTA AGATCCAGTG 420

GTTAACTTGG GTGAACTTAT TGGGGCACAT TITTACATCC AAGTGGGCCA TTTTTTGGTA 480

AGCAGAACTG GCGATGAGGG ATGAACCTAA CGTAGGCCTA AGGTGCCTTA ACTGCTCGCT 540

CATTAGATAC CATAAAGGG GTTGGTCCAT ITTTGACAGCA GGACGGTGGT CATGGAAGTT 600

13 2721944

GAAATCCGCT AAGGAGTG'rG TAACAACTCA CCTGCCGAAT GGACTAGCCC CGAAAATGGA 660

TGGCGCTCAA GCGGGTGACC GATGCCCAGC CATTGCTGCA AGTATGCTAC AACAATGAGT 720

AGGAGGGTGT GGTGATTrGTG ATGAATCTCT AAATGTGAAT 'TTGGGTGAAG CAATTTrCCAG 780

TCCAAGATCT TGGTGGTAGT AGCAA 805

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 18 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: OUI (iii) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:

GCGCATGGGC T'TACACC 18

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (iii) HYPOTHETIQUE: OUI (iii) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:

rTTGCTrCACC CAAATTCACA TTTA 24

Claims (4)

REVENDICATIONS

1. Séquence d'ADN spécifique du genre Dinophysis, caractérisée en ce qu'elle est la

séquence ID N' 3.

2. Oligonucléotides spécifiques de Dinophysis acuminata, de séquences respectives: ' GCGCATGGGC T1TACACC 3' (SEQ ID N' 4) et

' TITGCITCACC CAAATTCACA TITA 3' (SEQ ID N- 5)

3. Méthode de détection ou de contrôle de la présence ou l'absence d'un micro-organisme du genre Dinophysis dans un échantillon d'eau de mer par détection d'une séquence d'acide nucléique spécifique dudit microorganisme qui consiste à: (a) isoler l'ADN des cellules de l'échantillon; (b) soumettre ledit ADN, purifié ou non, à une réaction de polymérisation en chaîne à l'aide des amorces nucléotidiques décrites dans la revendication 2, à une température d'hybridation comprise entre 50 et 70 C de façon à amplifier, si elle est présente, la séquence d'acide nucléique spécifique du micro-organisme; et (c) déterminer si la séquence d'acide nucléique spécifique du micro-organisme est présente

dans l'échantillon.

4. Nécessaire pour la détection d'une séquence d'acide nucléique spécifique d'un micro-

organisme du genre Dinophysis, qui comprend les composants suivants: - les deux amorces nucléotidiques telles que définies dans la revendication 2; un agent de polymérisation; et

- chacun des différents nucléosides triphosphates.