FR2740474A1 - Sequences nucleotidiques pour la detection des erwinia carotovora subsp. atroseptica - Google Patents

Abstract

La présente, invention concerne l'utilisation de la séquence nucléotidique Y45 et/ou de la séquence nucléotidique Y46, représentées respectivement par les séquences SEQ ID N0 1 et SEQ ID N0 2 suivantes: - SEQ ID NO 1: TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT - SEQ ID NO 2: TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection et d'identification spécifique des Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), dans un échantillon déterminé, et pus particulièrement dans le sol ou l'eau, ou chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries, notamment chez les plantes et les semences, et, le cas échéant, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic précoce des pathologies susceptibles d'être causées par lesdites Eca chez l'hôte susmentionné.

Description

SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES POUR LA DETECTION DES ERWINJA CAROTOVORA SUBSP. ATROSEPTICA.

La présente invention a pour objet des séquences nucléotidiques utilisables notamment en tant que sondes, et/ou amorces nucléotidiques pour l'amplification génique, dans le cadre de la détection spécifique des Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca).

L'invention concerne également un procédé de détection et d'identification spécifique de ces Eca, une méthode de diagnostic spécifique des états infectieux (infections latentes sans signes pathologiques apparents) et des pathologies causées par les Eca chez les plantes, ainsi que des trousses (ou kits) contenant les séquences susmentionnées et utilisables pour la mise en oeuvre dudit procédé et de ladite méthode.

Les bactéries pectinolytiques du genre Envinia (encore désignées ci-après envinias) sont responsables d'un grand nombre de pathologies, dont l'un des symptômes est la macération des tissus chez un grand nombre de plantes et de semences. Ces bactéries sont notamment capables d'infecter la pomme de terre, le maïs, la tomate, la betterave à sucre, le chou, l'endive, etc., ainsi que les plantes de serres, telles que les plantes ornementales.

Parmi ces erwinias, on peut citer principalement d'une part Erwinia carotovora, et piuk particulièrement Envinia carotovora subsp. carotovora (Ecc), Erwînia carotovora subsp. atroseptica (Eca), Erwinia carotovora subsp.

odonfrrn (Eco), Erwinia carotovora subsp. betavasculorum (Ecb), et Erwinia carotovora subsp. wasabiae (Ecw), et, d'autre part, Erwinia chrysanthemi (Ech), Erwinia cacticida
Erwinia carotovora a été particulièrement étudiée en raison de son pouvoir pathogène sur plusieurs plantes, et surtout chez la pomme de terre (Pérombelon, 1989). L'espèce Erwinia carotovora (Ec) est actuellement divisée en cinq sousespèces : atroseptica (Eca), carotovora (Ecc), odorifera (Eco) et wasabiae (Ecw) précédemment citées, ainsi que la sous-espèce betavasculorum (Ecb).

Cette classification a été réalisée sur la base de caractéristiques physiologiques et biochimiques, ainsi que sur leur pouvoir pathogène.

Ecb est responsable d'une pourriture de la betterave, dite nécrose racinaire (Thomson et al., 1981). L'action des Eca est généralement limitée à la pomme de terre dans des climats tempérés frais, à des températures comprises entre environ 18"C et environ 220C (Pérombelon, 1980). Quelques souches, non isolées à partir de la pomme de terre, ont été précédemment décrites comme étant des Eca "atypiques" en raison du fait qu'elles présentent quelques caractéristiques physiologiques particulières, comme par exemple leur capacité à se développer à 37"C (Marti et al., 1989). Une nouvelle sous-espèce, dénommée odorifera (Eco) a été récemment décrite comme représentant des souches "atypiques" qui sont pathogènes au moins sur l'endive et produisent des métabolites volatiles odorants (Gallois et al., 1992).D'autres souches d'Eca "atypiques" ont été identifiées comme étant des souches d'Ecc sur la base de caractéristiques phénotypiques et génotypiques (S. Priou, thèse ENSAR,
Rennes, 1992). A l'inverse, Ecc est largement répandue dans le monde et présente une large spécificité d'hôtes et de températures d'expression des symptômes (22 - 35"C) (Pérombelon et Kelman 1987, Smith et Bartz 1990).

Les principales pathologies de la pomme de terre causées par ces bactéries, et plus particulièrement par Eca, sont les suivantes : manque à la levée, fonte de semis, jambe noire, pourriture aérienne de la tige, dessèchement et pourriture des tubercules, et flétrissement aérien (Pérombelon et Kelman 1987). Les pathologies correspondant à la non-levée et à la jambe noire surviennent principalement à partir des tubercules mères et peuvent causer des pertes importantes dans les champs. Eca est considérée comme l'agent typique de la jambe noire en Europe en raison de son pouvoir pathogène à faible température, et de sa capacité à induire la maladie de façon précoce en végétation, ce qui augmente les pertes à la récolte. La plupart des souches d'Ecc ne peuvent pas produire de symptômes typiques de jambe noire à faible température.Ecc est considérée comme un agent opportuniste plutôt que comme un agent causal primaire de la maladie. Toutefois Ecc présente un pouvoir pathogène accru à des températures supérieures ou égales à environ 25"C et est l'agent causal primaire d'un symptôme de type jambe noire de la pomme de terre en Arizona et dans le Colorado (Stanghellini et Meneley, 1975).

Ces bactéries produisent plusieurs enzymes extracellulaires capables d'attaquer les composants de la paroi cellulaire; pectinases, cellulases, hémicellulases et protéases (pour une revue détaillée, voir l'article de A.

Kotoujansky paru dans Annu. Rev. Phytopathol. 1987, 25: 405-30).

Parmi ces enzymes, les pectate-lyases (encore désignées par polygalacturonate-lyases, pectate-transéliminases, polygalacturonatetranséliminases, poly( 1 ,4-a-D-galacturonide)lyases, et EC 4.2.2.2) participeraient au mécanisme de cette macération des plantes, sans pour autant être les seuls agents responsables de ce phénomène, et ne seraient pas toutes nécessaires à la virulence de ces bactéries.

Par pectate-lyases on entend toute enzyme capable, par le biais d'une réaction de p-élimination, de couper une liaison a 1- > 4 O glycosidique présente entre deux résidus galacturoniques.

Ces pectate-lyases (encore désignées ci-après par PL) sont principalement codées par des gènes pel nommés pelY (Manulis et al., 1988), pelB (Lei et al., 1987), pelA (Lei et al., 1988), pell (Ito et al., 1988), peul53 (Trollinger et al., 1989), pelA, pelC, pelE et pelD (Tamaki et al., 1988), pelA, pelD et pelE (Van Gijsegem, 1989), pelB (Schoedel et Collmer, 1986), pelA (Favey et al., 1992) et pelB (Hinton et al., 1989).

Ces gènes ont eux-mêmes été regroupés en trois familles en fonction de leurs homologies de séquences (Hinton et al., 1989). Il a en effet été déterminé que la famille pelA, D, E est présente chez Ech, que la famille pelB, C, I, X, est présente chez Eca, Ecc et Ech, et que la famille pelle3, Y (appelée pelY par la suite) est présente chez certaines souches d'Erwinia carotovora.

Il convient cependant de noter que ces gènes ne sont pas spécifiques des erwinias pectinolytiques. En effet, d'autres bactéries, telles que Yersinia pseudotubercuiosis (Yps), Klebsiella pneumoniae et Pseudomonas sp., sont capables de produire des PL. La famille peul Y a été mise en évidence chez Yps; une partie du gène pelle3 est effectivement commune à Eca et Yps (Trollinger et al., 1989).

La présence de séquences conservées tant au niveau des séquences nucléotidiques que protéiques correspondant à ces PL, serait à l'origine de l'apparition de réactions croisées lors de la mise en oeuvre de méthodes de détection des erwinias, que ces méthodes procèdent par hybridation entre acides nucléiques, ou par réaction immunologique à l'aide d'anticorps anti-PL.

Il a cependant été démontré dans la demande internationale n" WO 93/25708 que, contrairement à toute attente, la détection de fragments d'ADN codant une PL, pouvait être corrélée à la détection spécifique de bactéries pectinolytiques du genre Erwinia, et à l'identification d'une espèce, d'une sous-espèce, voire d'un pathovar déterminés.

Deux couples d'amorces d'amplification génique, à savoir le couple
A B (encore désigné Y1 Y2), et le couple C D, utilisés respectivement pour la détection de quatre des cinq sous-espèces d'Erwinia carotovora et des Erwinia chrysanthemi en général, ont été plus particulièrement décrits dans la demande internationale référencée ci-dessus.

L'amorce Y1 est représentée par l'enchaînement de nucléotides suivant:
TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT (SEQ ID NO 14) ou une séquence complémentaire de cette dernière, ou une séquence dérivée de
la séquence Y1, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition de nucléotides, et susceptible de s'hybrider avec le génome de bactéries de l'espèce
Erwinia carotovora, ou une séquence complémentaire de cette séquence dérivée.

L'amorce Y2 est représentée par l'un des enchaînements de nucléotides suivants:
CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT (SEQ ID NO 15)
.........C... (SEQ ID NO 16) ....... .T.. .. (SEQ ID NO 17)
(les points représentant des nucléotides identiques à ceux de la première ligne) ou leurs séquences complémentaires, ou une séquence dérivée des séquences Y2 susmentionnées, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition de nucléotides, et susceptible de s'hybrider avec le génome de bactéries de l'espèce
Erwinia carotovora, ou la séquence complémentaire de cette séquence dérivée.

Toutefois, dans le cadre du procédé de détection des Erwinia carotovora, tel que décrit dans la demande internationale susmentionnée, le couple d'amorces Y1 Y2 n'est pas spécifique d'une sous-espèce déterminée d'Erwinia carotovora, notamment des Eca, même dans les conditions de forte stringence précisée dans ladite demande internationale, et à ce titre ne permet pas la seule amplification de fragments du génome des Eca.

Un des buts de la présente invention est précisément de fournir de nouvelles séquences nucléotidiques pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection et/ou d'identification qui soit spécifique des Eca.

Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé de détection et d'identification spécifique des Eca, qui soit fiable, présentant notamment un bon seuil de sensibilité (d'environ lpg à environ 10 fg, et d'environ 5 cellules bactériennes), et simple à mettre en oeuvre.

Un autre but de la présente invention est de fournir une méthode de diagnostic spécifique des pathologies causées par les Eca, notamment de la jambe noire chez la pomme de terre, et plus particulièrement une méthode de diagnostic précoce des pathologies causées par les Eca, à savoir une méthode permettant de faire une évaluation du risque d'apparition de ces pathologies chez les plantes susceptibles d'être infectées par les Eca (infection latente susmentionnée), ou d'apprécier les risques de contamination des plantes, notamment à partir du sol ou de l'eau.

Un autre but de la présente invention est de fournir des trousses (ou kits) de mise en oeuvre d'un procédé de détection et/ou d'identification, ou d'une méthode de diagnostic tels que décrits ci-dessus.

La présente invention découle de la découverte faite par les inventeurs d'un couple d'amorces constitué par les séquences Y 45 et Y46 décrites ciaprès, ces séquences permettant non seulement d'amplifier spécifiquement les fragments de gènes des Eca, mais pouvant également être utilisées en tant que sondes dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé de détection et/ou d'identification spécifique des Eca.

L'invention a pour objet l'utilisation de la séquence nucléotidique Y45 et/ou de la séquence nucléotidique Y46, représentées respectivement par les séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 2 suivantes:
- SEQ ID NO 1:
TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT
- SEQ ID NO 2:
TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT ou de toute séquence dérivée par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucléotides des séquences Y45 et Y46 susmentionnées, dans la mesure où ces séquences dérivées, tout comme les séquences Y45 et Y46, sont capables de s'hybrider spécifiquement avec le génome (ADN ou ARN) des bactéries de la sous-espèce Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), et plus particulièrement avec les gènes codant des pectate-lyases (PL) chez ces dernières, notamment dans les conditions d'hybridation suivantes: température de 65"C dans un tampon comprenant Tris-HCl 10 mM pH 9, KC1 50 mM,
MgCl2 1,5 mM, Triton X100 (marque déposée) 0,1 %, sérum albumine de boeuf (BSA) 0,2 mg/ml, ou encore de toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées, pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection et/ou d'identification spécifique des Eca, dans un échantillon déterminé, et plus particulièrement dans le sol ou l'eau, ou chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries, notamment chez les plantes et les semences, et, le cas échéant, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic précoce des pathologies susceptibles d'être causées par lesdites Eca chez l'hôte susmentionné.

De préférence, on entend par "séquence dérivée" dans ce qui précède et ce qui suit, toute séquence présentant au moins environ 60% d'identité avec les séquences nucléotidiques de l'invention (en particulier dans la région 3', notamment les 3 derniers nucléotides de cette région), ou encore toute séquence capable de mimer les séquences nucléotidiques de l'invention, tels que les acides nucléiques peptidiques (PNA) décrits notamment dans Egholm et al. (1992).

Avantageusement, dans le cadre de l'utilisation susmentionnée, la séquence Y45, ou une séquence dérivée telle que définie ci-dessus, ou leur séquence complémentaire, et la séquence Y46, ou une séquence dérivée telle que définie dessus, ou leur séquence complémentaire, forment un couple d'amorces pour l'amplification génique de copies de fragments de gènes codant des PL chez les Eca.

L'invention a plus particulièrement pour objet tout procédé de détection et/ou d'identification spécifique de bactéries de la sous-espèce Envinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), dans un échantillon déterminé, et plus particulièrement dans le sol ou l'eau, ou chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries, notamment chez les plantes et les semences, caractérisé en ce qu'il comprend::
- le cas échéant, l'amplification, par toute méthode d'amplification génique appropriée, du nombre de copies de fragments de séquences d'ADN ou d'ARN spécifiques de ladite sous-espèce et susceptibles d'être présentes dans l'échantillon, ou encore de séquences d'ADN résultant d'une transcription inverse à partir des séquences d'ARN susmentionnées, cette amplification étant effectuée à l'aide d'un couple d'amorces constitué de la séquence Y45, ou d'une séquence dérivée telle que définie ci-dessus, ou d'une séquence complémentaire de ces dernières, et de la séquence Y46, ou d'une séquence dérivée telle que définie ci-dessus, ou d'une séquence complémentaire de ces dernières,
- la détection
soit des fragments de séquences d'ADN ou d'ARN susmentionnés, dont le nombre de copies a été amplifié lors de l'étape d'amplification dessus, cette détection étant effectuée en mettant en jeu une hybridation moléculaire entre lesdits fragments amplifiés et toute sonde nucléotidique susceptible de s'hybrider avec lesdits fragments amplifiés, dont notamment les séquences représentées par SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 10 avantageusement marquées,
soit des séquences d'ADN ou d'ARN susmentionnées spécifiques de ladite sous-espèce, ou encore de séquences d'ADN résultant d'une transcription inverse à partir des séquences d'ARN susmentionnées, cette détection étant effectuée en mettant en jeu une hybridation moléculaire entre lesdites séquences d'ADN ou d'ARN et les séquences Y45 ou Y46, ou leurs séquences dérivées, ou les séquences complémentaires susmentionnées, ces séquences étant utilisées en tant que sondes avantageusement marquées, ce qui permet de déterminer la présence ou l'absence d'Eca dans l'échantillon en fonction de l'hybridation ou non des fragments et séquences d'ADN ou d'ARN susmentionnés avec les sondes citées ci-dessus.

Avantageusement, le procédé susmentionné de l'invention comprend, préalablement à l'étape de détection et, le cas échéant, celle d'amplification, une étape de traitement de l'échantillon prélevé dans l'eau, le sol ou chez un hôte, notamment chez les plantes et les semences, de manière à rendre le génome des
Eca, éventuellement présentes dans ledit échantillon, accessible aux séquences
Y45 et Y46, ou à leurs séquences dérivées, ou aux séquences complémentaires des séquences susmentionnées.

Cette étape de traitement de l'échantillon peut être réalisée notamment par ébullition, macération (dans un liquide tel que l'eau), broyage, sonication, notamment en présence de détergent (par exemple laurylsulfate, Sodium
Dodecyl Sulfate, Triton X100), d'antioxydant(s), de chélateur(s), d'alcali, et/ou de composés éliminant des inhibiteurs tels que les polyphénols (polyvinylpyrrolidone par exemple), ou les polysaccharides (bromure de cétyltriméthylammonium par exemple).

Le traitement de l'échantillon peut également faire intervenir la capture des bactéries présentes, notamment à l'aide d'anticorps spécifiques fixés sur un support tel que des billes d'immunocapture.

En alternative, une culture bactérienne, après inoculation d'un milieu sélectif ou semi-sélectif pour l'échantillon, peut également constituer une étape de traitement de l'échantillon (étape couramment nommée amplification biologique).

Selon un premier mode de réalisation préféré du procédé de l'invention, l'étape d'amplification susmentionnée est réalisée à l'aide d'un couple d'amorces tel que décrit ci-dessus, constitué de la séquence Y45, ou d'une séquence dérivée telle que définie ci-dessus, ou d'une séquence complémentaire de ces dernières, et de la séquence Y46, ou d'une séquence dérivée telle que définie cidessus, ou d'une séquence complémentaire de ces dernières, ladite étape d'amplification étant effectuée par toute méthode d'amplification génique appropriée, du nombre de copies de fragments d'au moins une séquence d'ADN ou ARN codant une pectate-lyase (PL) chez les Eca, susceptibles d'être présentes dans ledit échantillon, cette amplification étant elle-même suivie par l'étape de détection susmentionnée des copies de fragments d'ADN ou ARN ainsi amplifiés, ladite détection étant réalisée par révélation des amorces utilisées susmentionnées lorsque ces dernières sont marquées, après élimination des amorces non utilisées lors de l'amplification, ou à l'aide d'une (ou plusieurs) sonde(s) nucléotidique(s), dont l'une au moins est marquée, susceptible(s) de s'hybrider avec lesdits fragments d'ADN ou ARN ainsi amplifiés, ou encore par détection directe des fragments amplifiés dans le cas où l'étape d'élongation de la réaction d'amplification est réalisée à l'aide d'un ou plusieurs désoxynucléotides marqués.

Le procédé tel que décrit ci-dessus, est plus particulièrement caractérisé en ce que l'étape d'amplification génique permet d'obtenir une quantité importante de copies de fragments de gènes codant des PL qui soit suffisante pour permettre la détection des Eca éventuellement présentes dans l'échantillon.

En particulier, comme décrit ci-après, l'amplification génique comprend plusieurs étapes, la première étape étant constituée d'une phase de dénaturation de l'ADN cible, à savoir de l'ADN ou ARN codant une PL chez les Eca, susceptibles d'être présentes dans l'échantillon, ou de l'ADNc éventuellement obtenu à partir d'ARN par transcription inverse. La deuxième étape est celle de l'hybridation des séquences Y45 et Y46 ou de leurs séquences complémentaires ou dérivées, avec le génome des Eca (à savoir avec les ADN ou ARN susmentionnés). La troisième étape d'un cycle de cette amplification est constituée de l'élongation des amorces hybridées. L'amplification consiste en une succession d'étapes de dénaturation, hybridation des amorces susmentionnées et d'élongation.Ces cycles à trois étapes sont répétés le nombre de fois nécessaire pour obtenir une quantité importante de copies de fragments de gènes codant des PL.

L'étape d'amplification génique susmentionnée peut être réalisée par toute méthode utilisant les techniques classiques d'amplification enzymatique de l'ADN ou de l'ARN, telles que la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite notamment dans la revue P.N.A.S., USA, 88, pp. 189-193 (1991), ou avantageusement la technique PCR telle que décrite notamment dans les demandes de brevet européen de Cetus (n" 200 362, 201 184, 229 701 et 258 017), ou encore la technique 3SR décrite par Fahy et al. dans PCR Meth. Appl.

1, 25-33 (1991), ou encore la technique NASBA décrite dans la demande de brevet européen n" 329 822, ou les techniques dérivées de ces dernières et toute méthode visant à amplifier in vitro les séquences nucléotidiques.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la sensibilité et la spécificité de la détection peuvent être améliorées en poursuivant le procédé décrit ci-dessus par une amplification du type PCR ancrée (ou "nested PCR"), décrite dans "PCR A Practical Approach" Edited by M.J. McPherson, P.

Quirke, G.R. Taylor, page 42, (1991) Oxford University Press, en utilisant des amorces internes aux fragments précédemment amplifiés, ce qui conduit à l'amplification du nombre de copies d'un fragment d'ADN ou d'ARN plus court que celui dont le nombre de copies a été initialement amplifié.

Un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé d'amplification du nombre de copies de fragments d'ADN codant une PL chez les Eca (ces fragments d'ADN étant issus d'ADN présent dans l'échantillon biologique ou obtenus par transcription inverse à partir d'ARN), comprend les étapes suivantes::
* dénaturation de l'ADN double brin en ADN mono-brin par chauffage pendant environ 30 secondes à une température d'environ 80"C à environ 100"C, avantageusement à 94"C, notamment dans un tampon constitué de Tris HC1 10 mM pH 9, KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM, Triton X100 0,1%, BSA 0,2 mg/ml, en présence de co-facteurs de l'ADN-polymérase, notamment d'ions
Mg2 + et K+, de désoxynucléotides choisis parmi dCTP, dATP, dGTP, dTTP, des amorces Y45 et Y46, d'une ADN polymérase thermorésistante par exemple, et le cas échéant les réactifs nécessaires à la "décontamination" du mélange réactionnel avant amplification, notamment 1'Uracile DNA glycosylase et le dUTP selon le procédé décrit dans le brevet US n" 5,035,996 de Life
Technologies Inc.,
* hybridation des couples d'amorces avec les gènes codant des PL, ou des fragments de ces gènes, susceptibles d'être présents dans l'échantillon étudié, par chauffage à une température d'environ 60"C à environ 76"C, avantageusement d'environ 65"C à environ 70"C, pendant environ 30 secondes,
* élongation des amorces, hybridées à l'étape précédente, par chauffage à une température d'environ 50"C à environ 76"C, avantageusement 72"C, pendant environ 45 secondes, produisant ainsi des séquences nucléotidiques complémentaires de fragments de gène(s) codant une ou des PL chez les Eca, ces séquences nucléotidiques complémentaires, encore désignées fragments amplifiés, étant délimitées par les amorces susmentionnées,
cette succession d'étapes (dénaturation, hybridation, élongation), constituant un cycle, étant répétée entre environ 20 et environ 50 fois, avantageusement entre 30 et 40 fois, cette répétition de cycles étant avantageusement précédée par une étape initiale de dénaturation de 1'ADN susceptible d'être présent dans ledit échantillon, ou obtenu par transcription inverse des ARN correspondants, par chauffage à 94"C pendant environ 5 minutes.

La détection des copies des fragments de gènes amplifiés susmentionnés peut être réalisée par électrophorèse sur gel de tout ou partie du milieu réactionnel dans lequel l'amplification a été effectuée, notamment sur gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou par électrophorèse capillaire ou par chromatographie. La visualisation d'un amas important (plus ou moins individualisé) de séquences en un point spécifique du gel, et correspondant au nombre de copies de tout ou partie du ou des gène(s) ainsi amplifiées, est corrélable à la présence des gènes susmentionnés (ou des ARN correspondants), et donc des Eca, dans l'échantillon étudié.

Avantageusement, les copies de fragments de gènes amplifiés susmentionnés, sont susceptibles d'être détectées à l'aide de sondes nucléotidiques, notamment selon les procédés décrits cidessous.

La détection des fragments amplifiés peut être réalisée par "immobilisation" des fragments amplifiés (après dénaturation de ces derniers, notamment à l'aide d'une solution d'EDTA 40 mM - NaOH 200 mM) sur un support solide tel que décrit ci-après, suivie de l'hybridation des fragments ainsi immobilisés avec une (ou plusieurs) sonde(s) de détection marquée(s), puis rinçage du support solide pour éliminer les sondes susmentionnées en excès et détection des molécules hybrides formées lors de l'étape d'hybridation entre les fragments amplifiés et lesdites sondes.

A titre d'illustration des membranes (nylon et nitrocellulose), le polystyrène (microplaques, tubes, billes), le verre, le latex peuvent être utilisés comme support solide.

La fixation sur le support solide des fragments amplifiés susmentionnés à détecter peut se faire selon des procédés connus de l'homme de l'art, notamment par adsorption passive ou par couplage covalent (Cook et al., Nucleic Acids
Research (1988), 16: 40774095; Nagata et al., FEBS Lett. (1985), 183: 379382; M. Longlaru et al., EP n" 0 420 260 A2; T. Gingeras et al., EP n" 0 276 302 B1; E. Hornes et L.M. Kornes, EP n" 0 446 260 B1).

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé susmentionné de l'invention, les fragments amplifiés sont détectés selon le principe de la méthode dite "sandwich".

Dans ce procédé une sonde de capture est immobilisée sur un support solide, notamment par adsorption passive ou par liaison covalente selon les méthodes décrites dessus, et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique de la cible à détecter, à savoir les fragments amplifiés susmentionnés.

La séquence cible capturée est détectée grâce à une deuxième sonde, dite sonde de détection marquée par un élément facilement détectable, tel que décrit ciaprès.

L'hybridation des sondes de capture et de détection peut se faire séparément (en deux temps) ou simultanément (en un temps), notamment selon une des méthodes décrites par les auteurs suivants: Langhale and Malcolm,
Gene (1985), 36: 201-210; Ranki et al., Gene (1983), 21: 77-85; Dunn and
Hassel, Cell (1977), 12: 23-36; Ranki and Soderlund, brevets US Nos 4,486,539 et 4,563,419.

Avantageusement, ces sondes de capture et de détection sont complémentaires de deux régions différentes comprises dans la séquence cible à détecter.

Ainsi, un procédé particulièrement avantageux de la présente invention, est caractérisé en ce que l'étape de détection des fragments amplifiés d'ADN codant des PL obtenus lors de l'étape d'amplification, est réalisée de la manière suivante:
- dénaturation des fragments amplifiés double brin pour obtenir des fragments amplifiés simple brin, notamment à l'aide d'une solution d'EDTA 40 mM - NaOH 200 mM,
- mise en contact, dans un tampon d'hybridation approprié, notamment dans un tampon constitué de Denhardt x 10, SSC x 6, SDS 0,1 %, avantageusement à 37"C pendant environ une heure, de la composition issue de l'étape précédente, contenant des fragments amplifiés simple brin, avec d'une part une séquence nucléotidique, encore désignée ci-après sonde de capture, susceptible de s'hybrider avec l'un des brins des fragments amplifiés, ladite sonde de capture étant immobilisée sur un support solide, notamment dans les puits de microplaques de titrage (ou encore "plaques de microtitrage"), et, d'autre part avec une (ou plusieurs) sonde(s) nucléotidique(s) marquée(s), encore désignée(s) sonde(s) de détection, susceptible(s) de s'hybrider avec le même brin des fragments amplifiés que celui avec lequel la sonde de capture susmentionnée est hybridée, mais en une région distincte de celle hybridée avec la sonde de capture, pendant une période de temps suffisante pour permettre l'hybridation des fragments amplifiés éventuellement présents avec d'une part ladite sonde de capture, et d'autre part la (ou les) sonde(s) de détection, pour former un complexe dans lequel les fragments amplifiés sont liés à la sonde de capture et à la (ou aux) sonde(s) de détection (on dit encore que les fragments amplifiés sont pris en "sandwich" entre la sonde de capture et la (ou les) sonde(s) de détection),
- élimination du tampon d'hybridation de manière à éliminer du support solide, d'une part, toute séquence nucléotidique susceptible d'être présente dans la composition issue de l'étape de dénaturation, ne s'étant pas hybridée avec la sonde de capture, et, d'autre part, toute sonde de détection restée libre dans le tampon d'hybridation après l'étape d'hybridation susmentionnée, et le cas échéant un ou plusieurs rinçages du support solide, notamment à l'aide d'une solution de rinçage contenant du Tris-HCl 10 mM, NaCl 300 mM et Tween 20 0,1%, pH 7,4,
- révélation de la présence ou de l'absence de la (ou des) sonde(s) de détection sur le support après élimination du tampon d'hybridation, témoignant respectivement de la présence ou de l'absence de fragments amplifiés dans la composition issue de l'étape d'amplification, et donc respectivement de la présence ou de l'absence d'Eca (ou des ADN ou ARN correspondants) dans l'échantillon étudié.

Avantageusement, la sonde de capture et la (ou les) sonde(s) de détection utilisée(s), sont des séquences nucléotidiques simple brin d'environ 10 à environ 60 nucléotides, avantageusement d'environ 25 à environ 35 nucléotides, correspondant à des séquences nucléotidiques comprises dans un gène codant une PL chez les bactéries du genre Erwinia, notamment chez les Eca, et susceptibles de s'hybrider avec les fragments amplifiés, lesdites sonde de capture et sonde(s) de détection s'hybridant respectivement avec des régions différentes desdits fragments amplifiés.

La sonde de capture et la (ou les) sonde(s) de détection sont choisies notamment parmi les séquences nucléotidiques suivantes:
- SEQ ID NO 1 (Y45):
TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT
- SEQ ID NO 2 (Y46):
TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT
- SEQ ID NO 3: TGTCGCTGGCGGAAAAAGTGGGCGATAACAT
- SEQ ID NO 4: ACCAACAGACAG
- SEQ ID NO 5: GACCAACAGACAGT
- SEQ ID NO 6:
AGACCAACAGACAGTA
- SEQ ID NO 7:
GAGACCAACAGACAGTAT
- SEQ ID NO 8 (revel 2):
GGCCGAGCCCAACAGACAATATGC
- SEQ ID NO 9 (revel 3): GGC CGAGAC CAACAGACAGTATGC
- SEQ ID NO 10 (genec 1)::
GATGTCGATACCATCGAGCCTTA ou toute séquence dérivée par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucléotides des séquences susmentionnées, dans la mesure où ces séquences dérivées, tout comme les séquences susmentionnées, sont capables de s'hybrider spécifiquement avec le génome (ou des fragments dérivés de celui-ci) des bactéries de la sousespèce Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), notamment dans les conditions d'hybridation indiquées ci-dessus, ou encore toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées.

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé de l'invention, ia sonde de capture et la (ou les) sonde(s) de détection sont choisies parmi l'une des séquences représentées par SEQ ID NO 3 à SEQ ID NO 10, la sonde de capture étant avantageusement celle représentée par SEQ ID NO 3, et la (ou les) sonde(s) de détection étant avantageusement celle(s) représentée(s) par SEQ ID NO 7 ou (et) SEQ ID NO 9 ou (et) SEQ ID NO 10, la sonde de détection étant de préférence celle représentée par SEQ ID NO 9.

Selon un deuxième mode de réalisation du procédé de l'invention, ce dernier comprend:
- une dénaturation de 1' ADN double brin susceptible d'être présent dans ledit échantillon, notamment à l'aide d'une solution d'EDTA 40 mM - NaOH 200 mM,
- une étape d'hybridation du génome des Eca, et plus particulièrement des séquences d'ADN codant une pectate-lyase (PL) chez ces bactéries, ou des séquences d'ARN correspondantes, ou des séquences d'ADN obtenues par transcription inverse des séquences d'ARN correspondantes, ou de fragments de ces séquences, avec la séquence Y45, ou une séquence dérivée telle que définie dessus, ou une séquence complémentaire de ces dernières, et/ou la séquence
Y46, ou une séquence dérivée telle que définie dessus, ou une séquence complémentaire de ces dernières, lesdites séquences étant utilisées en tant que sondes marquées, ou susceptibles d'être reconnues à leur tour par un réactif marqué, notamment de la manière indiquée ci-après,
- une étape de détection des séquences d'ADN ou d'ARN susmentionnées, ou de fragments de ces séquences, susceptibles d'être présents dans ledit échantillon, par révélation des sondes susmentionnées, ces sondes étant hybridées avec ce ou ces séquences ou fragments de ces séquences, et étant marquées.

Avantageusement, l'étape d'hybridation des séquences selon l'invention utilisées en tant que sondes dans le procédé susmentionné, est réalisée dans un tampon d'hybridation contenant du Denhardt x 10, SSC x 6, SDS 0,1 % .

Le cas échéant, l'étape d'hybridation susmentionnée est précédée par l'amplification du nombre de copies de fragments de gènes codant des PL chez les bactéries de l'espèce Erwinia carotovora en général, cette amplification couple d'amorces susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec le génome (ou l'ADN dérivant des ARN correspondants) des bactéries de l'espèce Erwinia carotovora et d'amplifier des fragments d'ADN comprenant les séquences correspondantes aux séquences Y45 et Y46 ou leurs séquences complémentaires ou dérivées telles que définies ci-dessus.

S'agissant de l'étape de détection de ce deuxième mode de réalisation préféré du procédé de l'invention, celle-ci est avantageusement réalisée suivant les procédés identiques à ceux décrits ci-dessus, notamment par immobilisation sur un support solide des séquences ou fragments de séquences codant des PL susceptibles d'être présents dans ledit échantillon, ces séquences ou fragments de séquences étant le cas échéant hybridés avec une sonde de capture telle que décrite ci-dessus, elle-même immobilisée sur le support solide, les séquences
Y45 et/ou Y46 selon l'invention étant alors utilisées en tant que sondes de détection.

L'invention a également pour objet toute trousse (ou kit) de détection et identification des Eca, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence nucléotidique Y45 et/ou de la séquence nucléotidique Y46, représentées respectivement par les séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 2 suivantes:
- SEQ ID NO 1:
TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT
- SEQ ID NO 2:
TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT ou toute séquence dérivée par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucléotides des séquences Y45 et Y46 susmentionnées, dans la mesure où ces séquences dérivées, tout comme les séquences Y45 et Y46, sont capables de s'hybrider spécifiquement avec le génome des bactéries de la sousespèce Envinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), notamment dans les conditions d'hybridation suivantes: température de 65"C dans un tampon comprenant Tris-HCl 10 mM pH 9, Cl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, Triton X100 0,1 %, BSA 0,2 mg/ml, ou encore toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées.

L'invention vise plus particulièrement toute trousse telle que décrite cidessus, dans laquelle les séquences Y45 et Y46 ou leurs séquences dérivées ou complémentaires, se présentent sous forme de couples d'amorces pour l'amplification génique.

Des trousses telles que décrites ci-dessus, et particulièrement avantageuses dans le cadre de la présente invention, comprennent:
- un couple d'amorces tel que décrit ci-dessus,
- un support solide, sur lequel est immobilisée une sonde de capture telle que définie ci-dessus, notamment dans les puits d'une microplaque, par adsorption passive, ou par liaison covalente au polystyrène (ou autre matériau) des puits de la microplaque, ou encore par liaison covalente par exemple au polystyrène d'une bille magnétique,
- une (ou plusieurs) sonde(s) de détection telle(s) que définie(s) ci-dessus, lesdites sondes étant marquées, notamment par une molécule enzymatique (telle que la péroxydase ou la phosphatase alcaline), ou par une molécule fluorescente telle qu'un fluorochrome,
- et/ou les réactifs nécessaires à l'amplification génique, notamment par
PCR, tels que les différents désoxynucléotides triphosphate, la Taq-polymérase,
- et/ou les réactifs nécessaires à l'hybridation des fragments amplifiés avec la sonde de capture et la sonde de détection, avantageusement un tampon d'hybridation comprenant Denhardt x 10, SSC x 6, SDS 0,1 %, et une solution de rinçage du support solide, avantageusement une solution contenant du Tris 10 mM, NaCI 300 mM et Tween 20 à 0,1%, pH 7,4,
- et/ou les réactifs nécessaires à la "décontamination" du mélange réactionnel avant amplification (Uracile DNA glycosylase et dUTP),
- et/ou un témoin positif, tel qu'un ADN génomique correspondant à un gène ou fragment de gène codant une ou des PL chez les Eca, avec lequel les séquences nucléotidiques de l'invention sont susceptibles de s'hybrider, ledit
ADN étant le cas échéant inséré dans le génome d'un vecteur, ledit témoin positif pouvant également servir de système de quantification et/ou de témoin d'inhibition,
- et/ou un ensemble de réactifs pour l'extraction des acides nucléiques de l'échantillon, notamment du SDS à 1% en tampon Tris EDTA, pH 8.0 additionné de 10 yg/ml de protéinase K,
- et/ou un témoin d'extraction des acides nucléiques, par exemple des bactéries cibles telles que la souche 1526 d'Eca,
- et/ou un témoin de quantification, tel qu'une gamme étalon de cellules de la souche 1526 d'Eca,
- et/ou un milieu de culture plus ou moins sélectif desdites bactéries.

L'invention a également pour objet toute méthode de diagnostic des infections latentes chez les plantes et semences infectées par les Eca, permettant ainsi de faire le diagnostic précoce de pathologies causées par les Eca chez les plantes et les semences, notamment de la jambe noire chez la pomme de terre, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'un procédé de détection et d'identification spécifique des Eca tel que décrit ci-dessus selon l'invention.

Le résultat de la méthode de diagnostic susmentionnée permet d'évaluer le risque que présente un hôte susceptible d'être porteur d'Eca, de développer et le cas échéant, de transmettre, ou non, une pathologie causée par ces bactéries, et plus particulièrement la jambe noire.

Par Eca, détectées dans le cadre des méthodes de diagnostic et de détection susmentionnées, il faut entendre à la fois les souches naturelles de ces bactéries, ainsi que les souches modifiées, notamment par voie du génie génétique.

L'invention concerne également l'application des procédés susmentionnés, à la détection de tout organisme (notamment micro-organismes, plantes etc.) génétiquement modifié par insertion d'un gène codant une ou des PL chez les
Eca, dans le génome de tels organismes.

Le polymorphisme des séquences nucléotidiques spécifiques des Eca pathogènes, ou des fragments de ces séquences, peut être représentatif de différents groupes au sein de ces erwinias, tels que des écotypes, pathotypes (ou pathovars) ou biotypes des Eca, le polymorphisme étant notamment mis en évidence soit par l'action d'enzymes de restriction, par des électrophorèses en gradient de température ou d'agent(s) dénaturant(s), ou après hybridation avec un fragment d'ARN par action de l'ARNase A, ou par toute autre méthode visant à mettre en évidence le polymorphisme des acides nucléiques en phase solide ou liquide, en particulier par hybridation avec des sondes telles que décrites ci-dessus, ou par séquençage du (des) fragment(s) amplifié(s) selon les procédés décrits ci-dessus.

L'invention vise également l'utilisation de toute trousse telle que décrite ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection et d'identification des Eca susmentionné, ou d'une méthode de diagnostic citée ci-dessus.

L'invention a également pour objet les séquences nucléotidiques représentées par les enchaînements de nucléotides suivants:
- SEQ ID NO 1:
TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT
- SEQ ID NO 2:
TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT
- SEQ ID NO 3:
TGTCGCTGGCGGAAAAAGTGGGCGATAACAT
- SEQ ID NO 4: AC CAACAGACAG
- SEQ ID NO 5: GAC CAACAGACAGT
- SEQ ID NO 6: AGACCAACAGACAGTA
- SEQ ID NO 7: GAGAC CAACAGACAGTAT
- SEQ ID NO 8:
GGCCGAGCCCAACAGACAATATGC
- SEQ ID NO 9:
GGCCGAGACCAACAGACAGTATGC
- SEQ ID NO 10::
GATGTCGATACCATCGAGCCTTA ou toute séquence dérivée par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucléotides des séquences susmentionnées, dans la mesure où ces séquences dérivées, tout comme les séquences susmentionnées, sont capables de s'hybrider spécifiquement avec le génome des bactéries de la sous-espèce
Erwinia carotovora atroseptica (Eca), notamment dans les conditions d'hybridation indiquées ci-dessus, ou encore toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées.

L'invention concerne également l'utilisation des séquences nucléotidiques définies ci-dessus pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection, le cas échéant dans un but de diagnostic, chez un hôte ou dans un milieu tels que définis ci-dessus, de tout micro-organisme ou toute cellule, dans les génomes desquels les séquences nucléotidiques selon l'invention, ont été introduites de façon transitoire ou définitive. Un tel procédé est avantageusement réalisé suivant l'une des méthodes décrites ci-dessus.

A ce titre, I'invention a également pour objet l'utilisation des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, en tant que marqueurs de cellules ou microorganismes génétiquement modifiés par introduction ou non dans leur génome de ces séquences nucléotidiques, ou d'hôtes cellulaires infectés (ou transformés) par de tels micro-organismes, notamment pour le suivi de l'évolution de ces cellules, micro-organismes et hôtes cellulaires dans un environnement déterminé.

L'invention concerne notamment les cellules de plantes (par exemple les protoplastes) transformées par un vecteur choisi parmi ceux dérivés des plasmides Ti et Ri d'Agrobacterium tumefaciens et d'Agrobacterium rhizogenes respectivement, ces plasmides contenant en l'un de leurs sites non essentiels pour leur réplication et la transformation des cellules végétales, une séquence nucléotidique selon l'invention, dans une position permettant son transfert à l'hôte.

L'invention vise également les plantes régénérées à partir de ces cellules transformées.

L'invention concerne également les cellules animales transformées par un vecteur dérivé, par exemple, des rétrovirus et contenant une ou plusieurs séquence(s) nucléotidique(s) de l'invention.

L'invention concerne également tout procédé d'obtention des séquences nucléotidiques susmentionnées.

La préparation de ces séquences nucléotidiques peut être effectuée soit par un procédé chimique, soit par d'autres procédés, comme l'amplification par
LCR ou PCR ou toute autre méthode d'amplification génique.

Un mode de préparation approprié de ces séquences nucléotidiques (comportant au plus environ 200 nucléotides, ou paires de bases lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) de l'invention par voie chimique (dans l'état actuel des techniques dans ce domaine) comprend les étapes suivantes:
- la synthèse d'ADN en utilisant par exemple la méthode automatisée au ss- cyanéthyl phosphoramidite décrite dans Bioorganic Chemistry 4; 274-325, 1986,
- le clonage des ADN ainsi obtenus dans un vecteur approprié (plasmide, phage ou cosmide) et la récupération des ADN par hybridation avec une sonde appropriée immobilisée sur un support solide, ou par électrophorèse, ou par chromatographie, généralement après restriction.

Un mode de préparation, par voie chimique, d'acides nucléiques de longueur supérieure à environ 200 nucléotides - ou paires de bases (lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) comprend les étapes suivantes:
- l'assemblage, par exemple par aboutage (ou ligation, ou ligature, par action d'une ligase), d'oligonucléotides synthétisés chimiquement, pourvus à leurs extrémités de sites de restriction différents, selon par exemple le principe décrit dans Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80,; 7461-7465, 1983,
- le clonage des ADN ainsi obtenus dans un vecteur approprié (plasmide, phage ou cosmide), et la récupération des ADN par hybridation avec une sonde appropriée, ou par électrophorèse, ou par chromatographie, généralement après restriction.

La préparation des acides nucléiques de l'invention peut également être réalisée par voie biologique, notamment après clonage d'hôtes cellulaires dont le génome est susceptible de contenir ces séquences nucléotidiques, le cas échéant, après transformation du génome de ces hôtes à l'aide de vecteurs appropriés contenant ces séquences nucléotidiques.

A ce titre, la présente invention a pour objet tout vecteur, notamment plasmidique, contenant en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, une séquence nucléotidique selon l'invention.

L'invention a également pour objet tout hôte cellulaire transformé par un vecteur selon l'invention, et dans lequel ledit vecteur, ou la séquence nucléotidique selon l'invention, intégrée dans le génome de l'hôte, est susceptible de se répliquer.

Ainsi la présente invention vise un procédé d'obtention des séquences nucléotidiques susmentionnées, réalisé par:
- mise en culture d'un hôte cellulaire tel que décrit ci-dessus, transformé par un vecteur selon l'invention,
- récupération des vecteurs à partir de cet hôte cellulaire, notamment par un traitement de lyse cellulaire approprié,
- récupération des séquences nucléotidiques de l'invention par traitement des vecteurs susmentionnés à l'aide d'enzymes de restriction appropriés,
- purification des séquences nucléotidiques ainsi obtenues, notamment par électrophorèse sur gel, ou capillaire, ou par chromatographie.

Un autre procédé particulièrement avantageux d'obtention des séquences nucléotidiques selon l'invention, comprend les étapes suivantes:
- mise en présence de vecteurs contenant les séquences nucléotidiques susmentionnées, avec des couples d'amorces telles que décrites ci-dessus, dans des conditions permettant l'amplification du nombre de copies de ces séquences nucléotidiques, notamment dans les conditions décrites ci-dessus,
- purification des séquences nucléotidiques ainsi obtenues, notamment par électrophorèse sur gel, ou capillaire, ou par chromatographie.

L'invention a également pour objet tout couple d'amorces pour l'amplification génique, caractérisé en ce que l'une des amorces, encore désignée Y45, est représentée par SEQ ID NO 1, ou par toute séquence dérivée telle que décrite ci-dessus, ou par toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées, tandis que l'autre amorce, encore désignée Y46, est représentée par SEQ ID NO 2, ou par toute séquence dérivée telle que décrite dessus, ou par toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées.

L'invention vise également les séquences nucléotidiques décrites ci-dessus, marquées, notamment de manière radioactive, enzymatique, par un composé fluorescent, par liaison à une molécule antigénique (susceptible d'être reconnue par des anticorps) ou à toute autre molécule susceptible d'être directement ou indirectement détectée à l'aide de réactifs, cette liaison pouvant être effectuée par l'intermédiaire d'un bras espaceur, notamment par l'intermédiaire d'une séquence nucléotidique constituée d'environ 5 à 100 nucléotides située aux extrémités 3' et/ou 5' de ces séquences, sous réserve que lorsque les séquences
Y45 et Y46 sont utilisées en tant qu amorces pour l'amplification génique, seule leur extrémité 5' peut alors être modifiée.

A titre d'illustration, les séquences nucléotidiques décrites ci-dessus peuvent être marquées par un élément radioactif (par exemple 32p, 33p, 35S, 3H, 125I) ou par une molécule non radioactive notamment biotine, acétylaminofluorène, fluorochrome, digoxigénine, ou une molécule enzymatique, ou un haptène selon l'un des procédés décrits dans les publications suivantes: G.

Gebeyehu et al.: "Novel biotinylated nucleotide - analogs for labelling and colorimetric detection of DNA" Nucleic Acids Research (1987), 15: 45134534;
C. Levenson and Chu-an Chang: "Non isotopically labeled probes and primers".

In "PCR protocols: A guide to methods and applications". Academic Press, Inc.

(1990), 99-112; L.M. Smith et al.: "The synthesis of oligonucleotides containing an aliphatic amino group at the 5' terminus: synthesis of fluorescent
DNA primers for use in DNA sequence analysis". Nucleic Acids Research (1985), 13: 2399-2412; E. Jablonski et al.: Preparation of oligodeoxynucleotide - alkaline phosphatase conjugates and their use as hybridization probes". Nucleic
Acids Research (1986), 14: 6115-6128; D. Thierry et al.: "The detection of
Mycobacterium tuberculosis in uncultured clinical specimens using the polymerase chain reaction and a non-radioactive DNA probe". Molecular and cellular probes (1992), 6: 181-191; N. Costa Taveira et al.: "Detection of HIV1 proviral DNA by PCR and hybridization with digoxygenin labelled probes".

Molecular and cellular probes (1992), 6: 265-270.

La présente invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de l'amplification spécifique de fragments du génome des différentes souches d'Eca à l'aide des amorces Y45 et Y46 pour les Eca, et de la mise en oeuvre d'un procédé de détection spécifique des Eca selon l'invention.

I Amplification spécifique de fragments du génome des Eca à l'aide des amorces Y45 et Y46.

En utilisant le gène pel 153 d'Erwinia carotovora (numéro d'accession
J03673 dans GenBank) et le gène pel B d'Erwinia carotovora subsp. carotovora (numéro d'accession X16397 dans GenBank), les inventeurs ont sélectionné des couples d'amorces capables de s'hybrider avec des régions encadrant les régions avec lesquelles s'hybrident les amorces Y1 et Y2 dans les gènes pel susmentionnés.

Les fragments du gène pel contenant la région Y1, et d'autres contenant la région Y2, ont été amplifiés chez plusieurs souches d'Erwinia carotovora à l'aide des amorces susmentionnées puis séquencés et alignés afin de détecter d'éventuelles régions de ces amorces qui seraient caractéristiques d'une sousespèce d'Erwinia carotovora.

Plusieurs couples d'amorces susceptibles d'être spécifiques des Eca ont ainsi été identifiés.

Afin d'établir la spécificité de ces nouvelles amorces et la meilleure combinaison de séquences vis à vis des Eca, ces nouvelles amorces, ainsi que les amorces Y1 et Y2, ont été testées en combinaison. Les combinaisons effectuées sont les suivantes:
région Y1:
1. Y1: 5'-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT-3' (SEQ ID NO 14)
2. Y45: 5'-TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT-3' (SEQ ID NO 1)
région Y2:
1. Y2: 5'-CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT-3' (SEQ ID NO 15)
2. Y44: 5'-CCAACGTTCAGCAGAACAAGTTCA-3' (SEQ ID NO 11)
3. Y46: 5'-TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT-3' (SEQ ID NO 2)
4. Y50: 5'-AGAACAAGTTCATTATCGCGAGTC-3' (SEQ ID NO 12)
5. Y52: 5'-GTTTCGCCAACGTTCAGCAGAACA-3' (SEQ ID NO 13)
Les résultats d'amplification, sur un ensemble de souches représentatives (à savoir les souches d'Eca CIP 125, CH3 et 1526, la souche d'Ecb 2122, les souches d'Ecc 2046, 88.29a1, SCRI 193, SG39.1, 1336, 1H et 40H, les souches d'Eco CH11, 2154 et 1880, et les souches d'Ecw 3304 et 3308 indiquées dans le tableau III), sont résumés dans le tableau I suivant:
Tableau I

<tb> <SEP> Y2 <SEP> Y44 <SEP> Y46 <SEP> Y50 <SEP> Y52
<tb> Yî <SEP> Ec+ <SEP> Eca+ <SEP> Eca+ <SEP> Eca+ <SEP> Eca+ <SEP>
<tb> Y45 <SEP> Ec+ <SEP> Eca+ <SEP> Eca+ <SEP> Eca+ <SEP> Eca+
<tb>
(Ec+: révélation de 4 sous-espèces d'Erwinia carotovora, Eca+: amplification spécifique des souches d'Envinia carotovora subsp. atroseptica).

Sur les 10 couples d'amorces testés, les couples Y45-Y44 et Y45-Y46 donnent les meilleurs niveaux d'amplification à partir d' 1 pg d'ADN cible Eca (détection sur gel d'agarose coloré au bromure d'éthidium ou sur microplaque de titrage).

Les valeurs obtenues sur microplaque à partir de 2 Eca: CIP 125 (groupe
RFLP 1) et CH3 (groupe RFLP 2) sont regroupées dans le tableau I bis suivant:
Tableau I bis

<tb> <SEP> Couple
<tb> d'amorces <SEP> Y1- <SEP> Y1- <SEP> Y1- <SEP> Y1- <SEP> Y45- <SEP> Y45- <SEP> Y45- <SEP> Y45
<tb> Y44 <SEP> Y44 <SEP> Y46 <SEP> Y50 <SEP> Y52 <SEP> Y44 <SEP> Y46 <SEP> Y50 <SEP> Y52
<tb> Souche
<tb> CIP <SEP> 125 <SEP> 1,370 <SEP> 0,743 <SEP> 1,498 <SEP> 1,375 <SEP> 1,252 <SEP> 1,775 <SEP> 0,465 <SEP> 0,752
<tb> CH3 <SEP> CH3 <SEP> <SEP> 1,472 <SEP> 0,870 <SEP> 1,171 <SEP> 1,494 <SEP> 1,635 <SEP> 1,515 <SEP> 0,507 <SEP> 0,537
<tb>
La présence de 2 "mismatches" contigus (nucléotides présents chez Eca uniquement) à l'extrémité 3' de Y46, contribue vraisemblablement à une meilleure spécificité du couple Y45-Y46, qui représente donc le couple d'amorces préféré.

L'ensemble de la collection de souches d'Erwinia carotovora ainsi que d'autres ADN (cf. tableau III) a été testé sur plaques de microtitration, à partir d'l ng d'ADN cible, amplifié par le couple d'amorces Y45-Y46 par PCR à 65 C (pour la température d'hybridation des amorces). Les résultats obtenus en utilisant la technique décrite dans le paragraphe II ci-après, sont résumés dans le tableau II qui suit.

Tableau II

<tb> <SEP> Espèce <SEP> ou <SEP> sous-espèce <SEP> testée <SEP> nombre <SEP> de <SEP> moyenne <SEP> des <SEP> DO492nm
<tb> <SEP> souches <SEP> testées <SEP> sur <SEP> microplaques <SEP> de <SEP> titrage
<tb> Erwinia <SEP> carotovora <SEP> 36 <SEP> 3,298 <SEP> + <SEP> 0,158
<tb> subsp. <SEP> atroseptica
<tb> Erwinia <SEP> carotovora <SEP> 6 <SEP> 0,035 <SEP> + <SEP> 0,005
<tb> subsp. <SEP> betavascalonxm <SEP>
<tb> Erwinia <SEP> carotovora <SEP> 38 <SEP> 0,027 <SEP> + <SEP> 0,007
<tb> subsp. <SEP> carotovora
<tb> Erwinia <SEP> carotovora <SEP> 12 <SEP> 0,027 <SEP> + <SEP> 0,007
<tb> subsp. <SEP> odonfera
<tb> Erwinia <SEP> carotovora <SEP> 3 <SEP> 0.036 <SEP> + <SEP> 0,002
<tb> subsp.<SEP> wasabiae
<tb> divers <SEP> (plantes, <SEP> bactéries, <SEP> 27 <SEP> 0,028 <SEP> + <SEP> 0,007
<tb> champignons)
<tb>
En conclusion, seules les souches d'Eca sont détectées par le système susmentionné.

Tableau III
Souches hôtes pays groupes RFLP
année
Eca 88.33 pomme France, 1
de terre 19881 88.45 " France, i
19881 88.1 " France, 2
19881 88.22a " France, i
19881 88.30a " France, 1
19881 87.7 " France, 2
19871 87.13 " France, i
19871 87.16a " France, 1
19871 87.16b " France, 1
19871 86.14.11 " France, 1
19861 86.20 " France, 1
19861 511 " France, 1
19642 SF1.1 " Allemagne3 1 161 " Hollande4 1 Cipll4 " Pérou, 1
19805
Cip125 " Pérou, 1
19805
Cip131 " Pérou, 1
19805
Cip026 " Pérou, 2
19805
SH164.4 " La Réunion, 1
19883
CH3 " Suisse, 2
19856
Tableau III (suite 1)
CH5 " Suisse, 1
19856
CH6 " Suisse, 1
19856
SF18.296 " Suisse, 1
19583 1329 " UK, 19672 1 1330 " UK, 19672 1 SCRI1043 " UK, @, 19857 1526T " UK, 19572 i 1527 " USA, 19732 i 1525 " USA, 19692 1 1453 tomate France, 2
19732 1546 " France, 2
19732 1064 pomme Hollande I
de terre 19914
PD1399 " " 2
19899
PD1442 " " 1
19899
PD1444 " " 2
19899
PD1716 " " 2
19909
Ecb 2121 betterave USA, 19722 2122T " USA, 19712 1520 tournesol Mexique2
NCPPB 2792 betterave USA, 19746
à sucre
NCPPB 2793 betterave USA,
à sucre 197410
SF 142.2 artichaut La Réunion,
19863
Ecc 89.19 pomme Argentine 8
de terre 19891 1H eau Espagne, 8
19898 40H " Espagne, 8
19898
SH230.134 banane Cuba3 19
Tableau III (suite 2)
CM1 choux Malawi, 17
19863 798 carotte USA2 9
(ATCC 495)
CH15 céleri Suisse, 9
19886 1489 chrys- France, 4
anthème 19712 1458 " USA, 19712 8
SH230.115 maïs Cuba3 19 1350 con- Italie2 8
combre 1285 cyclamen Grèce2 6
SE99.1 endive France, 8
19851 1488 iris France, 9
19732
SB89.7 poireau France, 9
19823 2046T pomme Danemark 12
de 19522
terre 88.22c " France, 9
19881 88.29a1 " France, 6
19881 88.44 " France, 4
19881 87.25 " France, 10
19871 86.14.51 " France, 9
19861
S99 " France, 18
19771
S101 " France, 4
19771
PM2 " Malawi, 15
19863 194 " Maroc,
19632
Cip360 " Pérou, 13
19845
Cip361 " Pérou, 13
19845
Tableau III (suite 3)
CH26 " Suisse, 4
19856 SCRI193 " USA7 14 139 " Hollande4 4 1336 " UK, 19672 11
Si82.1 " Vietnam, 8
19893
SG162.6 tournesol France, 8
19873 1403 " Yougo- 16
slavie,
19692 797 tabac USA, 19512 13
SG39.1 ? La Réunion, 20
19873
La Réunion, 8
SG39.3 ? 19873
Eco 1893 céleri France, 3
19762 CHîl " Suisse, 7
19856 2155 endive France, 5
19832 2154 " France, 4
19822 1892 " France, 6
19812 1959 " France, 4
19802 1878 " France, 4
19792 1879 " France, 5
19792 1880 " France, 3
19792 1646.2 poireau France, 3
19803 1654 " France, 3
19803
CH4 laitue Suisse, 4
19866
Tableau II (suite 4)
Ecw 3304 Japon2 21 3308 Japon2 21 3306 Japon2 21
Divers ADN testés
Botrytis cinerea, France (BR 94)
Tomate var. France castone
Piment var. France yolowonder Clavibacter Hollande9 michiganensis pv. sepedonicus (PD 323)
Souche eau Hollande4 pectinolytique 1990 (S 64)
Souche Hollande4 pectinolytique 1987 (S 10)
Pseudomonas blé Hollande4 aerofaciens rhizosphère 1991 (S 109)
Pseudomonas blé Hollande4 putida rhizosphère 1991 (S 71)
Erwinia cacticida (CFBP 3218)
Yersinia pathogène pseudotuberculosis humain (ATCC 29833)
Tableau III (suite 5)
Pseudomonas marginalis pv. marginalis (CFBP 2037)
Pseudomonas marginalis pv.

alfaijàe (CFBP 2039)
Xanthomonas France campestris pv.

campestris (NCPPB 528)
Xanthomonas France campestris pv.

malvacearum (NCPPB 633)
Xanthomonas France campestris pv.

manihotis (LMG 777) bactérie saprophyte pomme Hollande4, (S 128) de terre 1987
Bacillus subtilis France (GM 168) bactérie saprophyte pomme Espagne8 (67F et 1F) de terre
Erwinia salicis France (CFBP 802)
Phoma medicaginis var. pinodella
Septoria tritici
Fusarium solani
Tableau III (suite 6)
Rhizoctonia solani
Azorhizobium Sesbania
caulinodens rostrata
(OR 571)
Pseudomonas fluorescens
Solanum France tuberosum subsp.

tuberosum (var. Bintje)
(T) Souche type de l'espèce. (1) Bernard Jouan, Institut National de la
Recherche Agronomique, Rennes, France, collection personnelle. (2) CFBP,
Collection Française de Bactéries Phytopathogènes, INRA, Angers, France. (3)
Régine Samson, Institut National de la Recherche Agronomique, Angers,
France. (4) IPO, Research Institute for Plant Protection, Wageningen, Pays Bas.

(5) CIP, International Potato Center, Lima, Pérou. (6) Olivier Cazelles, Station
Fédérale de Recherches Agronomiques, Changins, Suisse, collection
personnelle. (7) SCRI, Scottish Crop Research Institute, UK. (8) Maria Lopez,
Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, Espagne, collection
personnelle, (9) Jaap Janse, Plant Protection Service, Wageningen, Hollande,
collection personnelle, (10) Alan Collmer, Cornell University, USA, collection
personnelle.

Le procédé utilisé pour la détermination des groupes RFLP (1 à 21) décrits ci-dessus, notamment les amorces ainsi que les enzymes de restriction utilisés, sont décrits dans l'article de Darrasse et al.. Applied and
Environmental Microbiology, vol. 60, No 5, 1437-1443 (1994).

II Exemple de mise en oeuvre d'un procédé de détection spécifique des
Eca.

La détection des séquences nucléiques cibles est réalisée de la façon suivante.

Une partie aliquote de la solution d'amplification est prélevée, dénaturée par l'addition d'un volume égal d'une solution de EDTA 40 mM - NaOH 200 mM, puis hybridée dans un puits de la microplaque selon le protocole suivant:
- La microplaque contenant la sonde capture est sensibilisée par une préhybridation à l'aide d'une solution contenant Denhardt x 10, SSC x 6, SDS 0,1%.du
- La préhybridation s'effectue en ajoutant 200 yI de cette solution par puits à 37"C pendant 30 min sous agitation. La plaque est ensuite vidée de son contenu.

- L'hybridation est réalisée dans la microplaque de titrage, préalablement sensibilisée, en ajoutant dans chaque puits 200 yI de la solution Denhardt x 10,
SSC x 6, SDS 0,1%, 10 ng de la sonde de détection marquée directement à la péroxydase et 10 à 20 yl de la solution contenant les fragments amplifiés dénaturés, soit généralement le 1/10 de la solution d'amplification initiale.

La réaction d'hybridation est effectuée sous agitation modérée à 37"C pendant 1 heure. Au cours de cette période, la séquence nucléique cible s'hybride simultanément à la sonde de capture et à la sonde de détection (marquée par une péroxydase).

- Le produit ternaire obtenu (hybridation simultanée des sondes de capture et de détection sur le fragment amplifié) est séparé de l'excès de sonde de détection contenu dans le tampon d'hybridation par 6 lavages successifs rapides, à l'aide d'une solution contenant Tris 10 mM; NaCI 300 mM; Tween 20 à 0,1%, pH 7,4. La plaque est ensuite vidée de la dernière solution de lavage.

- La réaction de détection est obtenue par I addition dans chaque puits de la microplaque de 200 il d'une solution de tampon composée de 4 ml de citrate trisodique 0,04M; acide citrique 0,01M; H2O2 30%, pH 5,6 + 1 comprimé de
Orthophénylènediamine (OPD) dosé à 30 mg par comprimé.

200 ,ul de cette solution sont distribués dans chaque puits, puis la microplaque est placée à l'obscurité pendant 30 min à 37"C.

- La réaction enzymatique est ensuite arrêtée en ajoutant 50 yl d'une solution de H2SO4 4 N.

La réaction colorimétrique obtenue par l'activité de la péroxydase sur le substrat OPD est déterminée par mesure de la densité optique en absorbance à 492 nm avec référence à 620 nm.

Les étapes d'hybridation et de lavage utilisent un appareillage adapté.

BIBLIOGRAPHIE - Darrasse et al., 1994. Applied Environmental Microbiology, 60(5): 1437-1443 - Egholm et al., 1992, J. Am. Chem. Soc., 114:1895 - Favey et al., 1992, Journal of General Microbiology, 138: 499-508 - Gallois, A., and Samson, R. 1992. International Journal of Systematic
Bacteriology. 42 : 582-588.

- Hinton et al., 1989, Molecular Microbiology, 3: 1785-1795 - Ito et al., 1988, Agricultural Biological Chemistry., 52: 479487 - Lei et al., 1987, Journal of Bacteriology, 169: 43794383 - Lei et al., 1988, Gene, 62: 159-164 - Manulis, 1988, Journal of Bacteriology, 170: 1825-1830 - Marti et al., 1989. Proc. 7th Int. Conf. Plant Path. Budapest. In Plant Pathogenic
Bacteria, Z. Klement (ed.), 755-760 - Pérombelon, M.C.M. 1989. In. Proc. 7th Int. Conf. Plant Path. Bact.,
Budapest, Hungary, Eds: Z. Klement (ed.), 745-751 - Pérombelon, M.C.M., and Kelman, A. 1987. Plant diseases. 71: 283-285.

- Pérombelon, M.C.M. 1980. Annual Review of Phytopathology. 18 : 361-387 - Schoedel and Collmer, 1986, Journal of Bacteriology, 167:117-123 - Smith, C., and Bartz, J.A. 1990. Plant disease. 74 : 505-509.

- Stanghellini, M.E. 1982, and Meneley, J.C. 1975. Phytopathology. 65 : 8687.

- Tamaki, S.J., Gold, S., Robeson, M., Manulis, S., and Keen, N.T. 1988.

Journal of Bacteriology., 170 : 3468-3478.

- Thomson, S.V., Hildebrand, D.C., and Schroth, M.N. 1981. Phytopathology.

71:1037-1042.

- Trollinger et al., 1989, Molecular Plant Microbe Interactions, 2: 17-25 - Van Gijsegem, 1989, Molecular Microbiology, 3: 1415-1424.

LISTE DE SEQUENCES (1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE
(INRA)
(B) RUE: 147 RUE DE L'UNIVERSITE
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75338 CEDEX 07
(A) NOM: INSTITUT NATIONAL AGRONOMIQUE PARIS-GRIGNON
(INA-PG)
(B) RUE: 16 RUE CLAUDE BERNARD
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75231 CEDEX 05
(A) NOM: SANOFI DIAGNOSTICS PASTEUR
(B) RUE: 3 BOULEVARD RAYMOND POINCARE
(C) VILLE: MARNES-LA-COQUETTE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92430
(ii) TITRE DE L' INVENTION: SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES POUR LA DETECTION
DES ERWINIA CAROTOVORA SUBSP.ATROSEPTICA
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 18
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release &num;1.0, Version &num;1.25 (OEB) (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
TCACCGGACG CCGAACTGTG GCGT 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 2:
TCGCCAACGT TCAGCAGAAC AAGT 24 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 31 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
TGTCGCTGGC GGAAAAAGTG GGCGATAACA T 31
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 12 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 4:
ACCAACAGAC AG 12 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:
GACCAACAGA CAGT 14
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:
AGACCAACAG ACAGTA 16 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE:ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:
GAGACCAACA GACAGTAT 18 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:
GGCCGAGCCC AACAGACAAT ATGC 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 9:
GGCCGAGACC AACAGACAGT ATGC 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
GATGTCGATA CCATCGAGCC TTA 23 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 11:
CCAACGTTCA GCAGAACAAG TTCA 24 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:
AGAACAAGTT CATTATCGCG AGTC 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:SEQ ID NO: 13:
GTTTCGCCAA CGTTCAGCAG AACA 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
TTACCGGACG CCGAGCTGTG GCGT 24 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:
CAGGAAGATG TCGTTATCGC GAGT 24 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:
CAGGAAGATC TCGTTATCGC GAGT 24 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:
CAGGAAGATT TCGTTATCGC GAGT 24

Claims (17)

REVENDICATIONS

1. Utilisation de la séquence nucléotidique Y45 et/ou de la séquence nucléotidique Y46, représentées respectivement par les séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 2 suivantes:

- SEQ ID NO 1:

TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT

- SEQ ID NO 2:

TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT ou de toute séquence dérivée par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucléotides des séquences Y45 et Y46 susmentionnées, dans la mesure où ces séquences dérivées, tout comme les séquences Y45 et Y46, sont capables de s'hybrider spécifiquement avec le génome des bactéries de la sousespèce Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), notamment dans les conditions d'hybridation suivantes: température de 65"C dans un tampon comprenant Tris-HCl 10 mM pH 9, KC1 50 mM, MgC12 1,5 mM, Triton X100 0,1%, BSA 0,2 mg/ml, ou encore de toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées, pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection et/ou d'identification spécifique des Eca, dans un échantillon déterminé, et plus particulièrement dans le sol ou l'eau, ou chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries, notamment chez les plantes et les semences, et, le cas échéant, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic précoce des pathologies susceptibles d'être causées par lesdites Eca chez l'hôte susmentionné.

2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence

Y45, ou une séquence dérivée telle que définie dans la revendication 1, ou leur séquence complémentaire, et la séquence Y46, ou une séquence dérivée telle que définie dans la revendication 1, ou leur séquence complémentaire, forment un couple d'amorces pour l'amplification génique de copies de fragments de gènes codant des pectate-lyases (PL) chez les Eca.

3. Procédé de détection et/ou d'identification spécifique de bactéries de la sous-espèce Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), dans un échantillon déterminé, et plus particulièrement dans le sol ou l'eau, ou chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries, notamment chez les plantes et les semences, caractérisé en ce qu'il comprend::

- le cas échéant, l'amplification, par toute méthode d'amplification génique appropriée, du nombre de copies de fragments de séquences d'ADN ou d'ARN spécifiques de ladite sous-espèce et susceptibles d'être présentes dans l'échantillon, ou encore de séquences d'ADN résultant d'une transcription inverse à partir des séquences d'ARN susmentionnées, cette amplification étant effectuée à l'aide d'un couple d'amorces constitué de la séquence Y45, ou d'une séquence dérivée telle que définie dans la revendication 1, ou d'une séquence complémentaire de ces dernières, et de la séquence Y46, ou d'une séquence dérivée telle que définie dans la revendication 1, ou d'une séquence complémentaire de ces dernières,

- la détection

soit des fragments de séquences d'ADN ou d'ARN susmentionnés, dont le nombre de copies a été amplifié lors de l'étape d'amplification ci-dessus, cette détection étant effectuée en mettant en jeu une hybridation moléculaire entre lesdits fragments amplifiés et toute sonde nucléotidique susceptible de s 'hybrider avec lesdits fragments amplifiés, dont notamment les séquences représentées par SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 10 avantageusement marquées,

soit des séquences d'ADN ou d'ARN susmentionnées spécifiques de ladite sous-espèce, ou encore de séquences d'ADN résultant d'une transcription inverse à partir des séquences d'ARN susmentionnées, cette détection étant effectuée en mettant en jeu une hybridation moléculaire entre lesdites séquences d'ADN ou d'ARN et les séquences Y45 ou Y46, ou leurs séquences dérivées, ou les séquences complémentaires susmentionnées, ces séquences étant utilisées en tant que sondes avantageusement marquées, ce qui permet de déterminer la présence ou l'absence d'Eca dans l'échantillon en fonction de l'hybridation ou non des fragments et séquences d'ADN ou d'ARN susmentionnés avec les sondes citées ci-dessus.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend, préalablement à l'étape de détection et, le cas échéant, celle d'amplification, une étape de traitement de l'échantillon prélevé dans l'eau, le sol ou chez un hôte, notamment chez les plantes et les semences, de manière à rendre le génome des

Eca, éventuellement présentes dans ledit échantillon, accessible aux séquences

Y45 et Y46, ou à leurs séquences dérivées, ou aux séquences complémentaires des séquences susmentionnées.

5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que l'étape d'amplification est réalisée à l'aide d'un couple d'amorces tel que défini dans la revendication 2, par toute méthode d'amplification génique appropriée, du nombre de copies de fragments d'au moins une séquence d'ADN ou ARN codant une pectate-lyase (PL) chez les Eca, susceptibles d'être présentes dans ledit échantillon, ou d'au moins une séquence d'ADN obtenue par transcription inverse de la séquence d'ARN susmentionnée, cette amplification étant ellemême suivie par l'étape de détection des copies de fragments de séquences d'ADN ou ARN ainsi amplifiés, ladite détection étant réalisée par révélation des amorces utilisées susmentionnées lorsque ces dernières sont marquées, après élimination des amorces non utilisées lors de l'amplification, ou à l'aide d'une (ou plusieurs) sonde(s) nucléotidique(s), dont l'une au moins est marquée, susceptible(s) de s'hybrider avec lesdits fragments d'ADN ou ARN ainsi amplifiés, ou encore par détection directe des fragments amplifiés dans le cas où l'étape d'élongation de la réaction d'amplification est réalisée à l'aide d'un ou plusieurs désoxynucléotides marqués.

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'amplification du nombre de copies de fragments d'une séquence d'ADN codant une PL chez les Eca, comprend les étapes suivantes:

* dénaturation de l'ADN double brin en ADN mono-brin par chauffage pendant environ 30 secondes à une température d'environ 80"C à environ 100"C, avantageusement à 94"C, notamment dans un tampon constitué de Tris

HCI 10 mM pH 9, KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM, Triton X100 0,1%, BSA 0,2 mg/ml, en présence de co-facteurs de l'ADN-polymérase, notamment d'ions Mu2 + et K+, de désoxynucléotides choisis parmi dCTP, dATP, dGTP, dTTP, des amorces Y45 et Y46, d'une ADN polymérase thermorésistante par exemple, et le cas échéant les réactifs nécessaires à la "décontamination" du mélange réactionnel avant amplification, notamment 1'Uracile DNA glycosylase et le dUTP selon le procédé décrit dans le brevet US n" 5,035,996 de Life

Technologies Inc.,

* hybridation des couples d'amorces avec les gènes codant des PL, ou des fragments de ces gènes, susceptibles d'être présents dans l'échantillon étudié, par chauffage à une température d'environ 60"C à environ 76"C, avantageusement d'environ 65"C à environ 70"C, pendant environ 30 secondes,

* élongation des amorces, hybridées à l'étape précédente, par chauffage à une température d'environ 50"C à environ 76"C, avantageusement 72"C, pendant environ 45 secondes, produisant ainsi des séquences nucléotidiques complémentaires de fragments de gène(s) codant une ou des PL chez les Eca, ces séquences nucléotidiques complémentaires, encore désignées fragments amplifiés, étant délimitées par les amorces susmentionnées,

cette succession d'étapes (dénaturation, hybridation, élongation), constituant un cycle, étant répétée entre environ 20 et environ 50 fois, avantageusement entre 30 et 40 fois, cette répétition de cycles étant avantageusement précédée par une étape initiale de dénaturation de l'ADN susceptible d'être présent dans ledit échantillon, ou obtenu par transcription inverse des ARN correspondants, par chauffage à 94"C pendant environ 5 minutes.

7. Procédé selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que l'étape de détection des fragments amplifiés de gènes codant des PL obtenus lors de l'étape d'amplification, est réalisée de la manière suivante:

- dénaturation des fragments amplifiés double brin pour obtenir des fragments amplifiés simple brin, notamment à l'aide d'une solution d'EDTA 40 mM - NaOH 200 mM,

- mise en contact, dans un tampon d'hybridation approprié, notamment dans un tampon constitué de Denhardt x 10, SSC x 6, SDS 0,1% avantageusement à 37"C pendant environ une heure, de la composition issue de l'étape précédente, contenant des fragments amplifiés simple brin, avec d'une part une séquence nucléotidique, encore désignée ci-après sonde de capture, susceptible de s'hybrider avec l'un des brins des fragments amplifiés, ladite sonde de capture étant immobilisée sur un support solide, notamment dans les puits de microplaques de titrage (ou encore "plaques de microtitrage"), et, d'autre part avec une (ou plusieurs) sonde(s) nucléotidique(s) marquée(s), encore désignée(s) sonde(s) de détection, susceptible(s) de s'hybrider avec le même brin des fragments amplifiés que celui avec lequel la sonde de capture susmentionnée est hybridée, mais en une région distincte de celle hybridée avec la sonde de capture, pendant une période de temps suffisante pour permettre l'hybridation des fragments amplifiés éventuellement présents avec d'une part ladite sonde de capture, et d'autre part la (ou les) sonde(s) de détection, pour former un complexe dans lequel les fragments amplifiés sont liés à la sonde de capture et à la (ou aux) sonde(s) de détection,

- élimination du tampon d'hybridation de manière à éliminer du support solide, d'une part, toute séquence nucléotidique susceptible d'être présente dans la composition issue de l'étape de dénaturation, ne s'étant pas hybridée avec la sonde de capture, et, d'autre part, toute sonde de détection restée libre dans le tampon d'hybridation après l'étape d'hybridation susmentionnée, et le cas échéant un ou plusieurs rinçages du support solide, notamment à l'aide d'une solution de rinçage contenant du Tris-HC1 10 mM, NaCI 300 mM et Tween 20 0,1%, pH 7,4,

- révélation de la présence ou de l'absence de la (ou des) sonde(s) de détection sur le support après élimination du tampon d'hybridation, témoignant respectivement de la présence ou de l'absence de fragments amplifiés dans la composition issue de l'étape d'amplification, et donc respectivement de la présence ou de l'absence d'Eca dans l'échantillon étudié.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la sonde de capture et la (ou les) sonde(s) de détection utilisée(s), sont des séquences nucléotidiques simple brin d'environ 10 à environ 60 nucléotides, avantageusement d'environ 25 à environ 35 nucléotides, correspondant à des séquences nucléotidiques comprises dans un gène codant une PL chez les bactéries du genre Erwinia, notamment chez les Eca, et susceptibles de s'hybrider avec les fragments amplifiés, lesdites sonde de capture et sonde(s) de détection s'hybridant respectivement avec des régions différentes desdits fragments amplifiés, et étant notamment choisies parmi les séquences nucléotidiques suivantes:

- SEQ ID NO 1:

TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT

- SEQ ID NO 2:

TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT

- SEQ ID NO 3: TGTCGCTGGCGGAAAAAGTGGGCGATAACAT

- SEQ ID NO 4:: ACCAACAGACAG

- SEQ ID NO 5: GACCAACAGACAGT

- SEQ ID NO 6: AGAC CAACAGACAGTA

- SEQ ID NO 7:

GAGACCAACAGACAGTAT

- SEQ ID NO 8:

GGCCGAGCCCAACAGACAATATGC

- SEQ ID NO 9:

GGCCGAGACCAACAGACAGTATGC

- SEQ ID NO 10:

GATGTCGATACCATCGAGCCTTA ou toute séquence dérivée par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucléotides des séquences susmentionnées, dans la mesure où ces séquences dérivées, tout comme les séquences susmentionnées, sont capables de s'hybrider spécifiquement avec le génome des bactéries de la sous-espèce

Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), notamment dans les conditions d'hybridation indiquées dans la revendication 1, ou encore toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées.

9. Procédé selon l'une des revendications 3 à 8, caractérisé en ce que la sonde de capture et la (ou les) sonde(s) de détection sont choisies parmi l'une des séquences représentées par SEQ ID NO 3 à SEQ ID NO 10, la sonde de capture étant avantageusement celle représentée par SEQ ID NO 3, et la (ou les) sonde(s) de détection étant avantageusement celle(s) représentée(s) par SEQ ID

NO 7 ou (et) SEQ ID NO 9 ou (et) SEQ ID NO 10, la sonde de détection étant de préférence celle représentée par SEQ ID NO 9.

10. Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce qu'il comprend:

- une étape d'hybridation du génome des Eca susceptible d'être présentes dans l'échantillon, et plus particulièrement des séquences d' DN codent une pectate-lyase (PL) chez ces bactéries, ou oes séquences d'ADN obtenues par transcription inverse des séquences d'ARN correspondantes, ou de fragments de ces séquences, avec la séquence Y45, ou une séquence dérivée telle que définie dans la revendication 1, ou une séquence complémentaire de ces dernières, et/ou la séquence Y46, ou une séquence dérivée telle que définie dans la revendication 1, ou une séquence complémentaire de ces dernières, lesdites séquences étant utilisées en tant que sondes marquées, ou susceptibles d'être reconnues à leur tour par un réactif marqué, ladite hybridation étant notamment effectuée dans un tampon d'hybridation contenant du Denhardt x 10, SSC x 6, SDS 0,1%, cette étape d'hybridation étant le cas échéant précédée par l'amplification du nombre de copies de fragments de gènes codant des PL chez les bactéries de l'espèce

Erwinia carotovora en général, cette amplification génique étant réalisée notamment de la manière indiquée dans la revendication 6 à l'aide d'un couple d'amorces susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec le génome des d'amorces susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec le génome des bactéries de l'espèce Erwinia carotovora et d'amplifier des fragments d'ADN comprenant les séquences correspondantes aux séquences Y45 et Y46 ou leurs séquences complémentaires ou dérivées telles que définies ci-dessus,

- une étape de détection des séquences d'ADN ou ARN susmentionnées, ou de fragments de ces séquences, susceptibles d'être présents dans ledit échantillon, par révélation des sondes susmentionnées, ces sondes étant hybridées avec ces séquences ou fragments de séquences, et étant marquées, ladite détection étant notamment réalisée de la manière indiquée dans la revendication 7, notamment par immobilisation sur un support solide de ces séquences ou fragments de séquences susceptibles d'être présents dans ledit échantillon, ces séquences ou fragments de séquence étant le cas échéant hybridés avec une sonde de capture, elle-même immobilisée sur le support solide, les séquences Y45 et/ou Y46 étant alors utilisées en tant que sondes de détection.

11. Trousse (ou kit) de détection et identification des Eca, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence nucléotidique Y45 et/ou de la séquence nucléotidique Y46, représentées respectivement par les séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 2 suivantes:

- SEQ ID NO 1:

TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT

- SEQ ID NO 2:

TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT ou toute séquence dérivée par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucléotides des séquences Y45 et Y46 susmentionnées, dans la mesure où ces séquences dérivées, tout comme les séquences Y45 et Y46, sont capables de s'hybrider spécifiquement avec le génome des Eca, notamment dans les conditions d'hybridation suivantes: température de 65"C dans un tampon comprenant Tris-HCl 10 mM pH 9, KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM, Triton X100 0,1%, BSA 0,2 mg/ml, ou encore toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées.

12. Trousse selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle comprend:

- un couple d'amorces tel que défini dans la revendication 2,

- un support solide, sur lequel est immobilisée une sonde de capture telle que définie dans la revendication 7, notamment dans les puits d'une microplaque de titrage, par adsorption passive, ou par liaison covalente par exemple au polystyrène des puits de la microplaque, ou encore par liaison covalente par exemple au polystyrène d'une bille magnétique,

- une (ou plusieurs) sonde(s) de détection telle(s) que définie(s) dessus, lesdites sondes étant marquées, notamment par une molécule enzymatique (telle que la péroxydase ou la phosphatase alcaline), ou par une molécule fluorescente telle qu'un fluorochrome,

- et/ou les réactifs nécessaires à l'amplification génique, notamment par

PCR, tels que les différents désoxynucléotides triphosphate, la Taq-polymérase,

- et/ou les réactifs nécessaires à l'hybridation des fragments amplifiés avec la sonde de capture et la sonde de détection, avantageusement un tampon d'hybridation comprenant du Denhardt x 10, SSC x 6, SDS 0,1%, et une solution de rinçage du support solide, avantageusement une solution contenant du Tris 10 mM, NaCl 300 mM et Tween 20 à 0,1 , pH 7,4,

- et/ou les réactifs nécessaires à la "décontamination" du mélange réactionnel avant amplification (Uracile DNA glycosylase et dUTP) selon le procédé décrit dans le brevet US n" 5,035,996 de Life Technologies Inc.,

- et/ou un témoin positif, tel qu'un ADN génomique correspondant à un gène ou fragment de gène codant des PL chez les Eca, avec lequel les séquences nucléotidiques de l'invention sont susceptibles de s'hybrider, ledit ADN étant le cas échéant inséré dans le génome d'un vecteur, ledit témoin positif pouvant également servir de système de quantification et/ou de témoin d'inhibition.

13. Méthode de diagnostic précoce de pathologies causées par les Eca chez les plantes et les semences, notamment de la jambe noire chez la pomme de terre, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 3 à 10.

14. Utilisation d'une trousse selon l'une des revendications 10 à 12, pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 3 à 9, ou d'une méthode de diagnostic selon la revendication 13.

15. Séquences nucléotidiques représentées par les enchaînements de nucléotides suivants:

- SEQ ID NO 1:

TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT

- SEQ ID NO 2:

TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT

- SEQ ID NO 3: TGTCGCTGGCGGAAAAAGTGGGCGATAACAT

- SEQ ID NO 4: AC CAACAGACAG

- SEQ ID NO 5: GAC CAACAGACAGT

- SEQ ID NO 6:

AGACCAACAGACAGTA

- SEQ ID NO 7: GAGACCAACAGACAGTAT

- SEQ ID NO 8:

GGCCGAGCCCAACAGACAATATGC

- SEQ ID NO 9:

GGCCGAGACCAACAGACAGTATGC

- SEQ ID NO 10::

GATGTCGATACCATCGAGCCTTA ou toute séquence dérivée par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucléotides des séquences susmentionnées, dans la mesure où ces séquences dérivées, tout comme les séquences susmentionnées, sont capables de s'hybrider spécifiquement avec le génome des bactéries de la sousespèce

Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), notamment dans les conditions d'hybridation indiquées dans la revendication 1, ou encore toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées.

16. Couple d'amorces pour l'amplification génique, caractérisé en ce que l'une des amorces, encore désignée Y45, est représentée par SEQ ID NO 1, ou par une séquence dérivée telle que définie dans la revendication 1, ou par une séquence complémentaire de ces dernières, tandis que l'autre amorce, encore désignée Y46, est représentée par SEQ ID NO 2, ou par une séquence dérivée telle que définie dans la revendication 1, ou par une séquence complémentaire de ces dernières.

17. Séquences nucléotidiques selon la revendication 15, caractérisées en ce qu'elles sont marquées, notamment de manière radioactive, enzymatique, par un composé fluorescent, par liaison à une molécule antigénique (susceptible d'être reconnue par des anticorps) ou à toute autre molécule susceptible d'être directement ou indirectement détectée à l'aide de réactifs.