WO1997016563A1 - Sequences nucleotidiques pour la detection des erwinia carotovora subsp. atroseptica - Google Patents

Sequences nucleotidiques pour la detection des erwinia carotovora subsp. atroseptica Download PDF

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WO1997016563A1
WO1997016563A1 PCT/FR1996/001692 FR9601692W WO9716563A1 WO 1997016563 A1 WO1997016563 A1 WO 1997016563A1 FR 9601692 W FR9601692 W FR 9601692W WO 9716563 A1 WO9716563 A1 WO 9716563A1
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seq
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dna
fragments
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Application number
PCT/FR1996/001692
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English (en)
Inventor
Yves Bertheau
Pascale Exbrayat
Dominique Frechon
Olivier Gallet
Emanuelle Guillot
Françoise LAURE
Valérie LE CLERC
Nicole Payet
Original Assignee
Institut National De La Recherche Agronomique
Institut National Agronomique Paris-Grignon
Sanofi Diagnostics Pasteur
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • NUCLEOTIDE SEQUENCES FOR THE DETECTION OF ERWINIA CAROTOVORA SUBSP. ATROSEPTICA.
  • the present invention relates to nucleotide sequences which can be used in particular as probes, and / or nucleotide primers for gene amplification, within the framework of the specific detection of Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca).
  • the invention also relates to a specific detection and identification method for these Eca, a specific diagnostic method for infectious states.
  • Pectinolytic bacteria of the genus Erwinia are responsible for a large number of pathologies, one of the symptoms of which is the maceration of tissues in a large number of plants and seeds. These bacteria are particularly capable of infecting potatoes, corn, tomatoes, sugar beets, cabbage, chicory, etc. , as well as greenhouse plants, such as ornamental plants.
  • Erwinia carotovora Erwinia carotovora, and more particularly Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc), Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), Erwinia carotovora subsp. odorifera (Eco), Erwinia carotovora subsp. betavasculorum (Ecb), and Erwinia carotovora subsp. wasabiae (Ecw), and, on the other hand, Erwinia chrysanthemi
  • Erwinia carotovora has been particularly studied because of its pathogenic power on several plants, and especially in potatoes (Pérombelon, 1989).
  • the Erwinia carotovora (Ec) species is currently divided into five subspecies: atroseptica (Eca), carotovora (Ecc), odorifera (Eco) and wasabiae
  • Ecb is responsible for beet rot, known as root necrosis (Thomson et al., 1981).
  • the action of Eca is generally limited to the potato in cool temperate climates, at temperatures between about 18 ° C and about 22 ° C (Pérombelon, 1980).
  • Some strains, not isolated from the potato, have been previously described as being Eca "atypical” due to the fact that they have some particular physiological characteristics, such as for example their capacity to develop at 37 ° C (Marti et al., 1989).
  • a new subspecies, called odorifera (Eco) has recently been described as representing "atypical” strains which are pathogenic at least on endive and produce volatile odorous metabolites (Gallois et al., 1992).
  • the main pathologies of potato caused by these bacteria, and more particularly by Eca, are as follows: failure to emerge, seedling loss, black leg, aerial rot of the stem, drying and rot of the tubers, and aerial wilt (Pérombelon and Kelman
  • Eca is considered the typical agent of the black leg in Europe because of its pathogenicity at low temperatures, and its ability to induce the disease early in vegetation, which increases losses at harvest. Most Ecc strains cannot produce typical black leg symptoms at low temperatures. Ecc is seen as an opportunistic agent rather than a primary causative agent of the disease. However, Ecc presents an increased pathogenic power at temperatures greater than or equal to about 25 ° C and is the primary causative agent of a black leg symptom of the potato in Arizona and in Colorado (Stanghellini and Meneley, 1975 ).
  • bacteria produce several extracellular enzymes capable of attacking the components of the cell wall; pectinases, cellulases, hemicellulases and proteases (for a detailed review, see article by A.
  • pectate-lyases also known as polygalacturonate-lyases, pectate-transeliminases, polygalacturonate-transeliminases, poly (1,4- ⁇ -D-galacturonide) lyases, and EC 4.2.2.2
  • pectate-lyases any enzyme capable, by means of a ⁇ -elimination reaction, of cutting a glycosidic ⁇ l-> 4 O bond present between two galacturonic residues.
  • pectate-lyases are mainly coded by pel genes called pelY (Manulis et al., 1988), pelB
  • Two pairs of gene amplification primers namely the AB pair (also designated Yl Y2), and the CD pair, used respectively for the detection of four of the five subspecies of Erwinia carotovora and of Erwinia chrysanthemi in general, have been more particularly described in the international application referenced above.
  • the primer Y1 is represented by the following sequence of nucleotides: TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT (SEQ ID NO 14) or a sequence complementary to the latter, or a sequence derived from the sequence Y1, in particular by deletion and / or substitution and / or addition of nucleotides, and capable of hybridizing with the genome of bacteria of the species
  • Erwinia carotovora or a sequence complementary to this derived sequence.
  • the primer Y2 is represented by one of the following nucleotide sequences: CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT (SEQ ID NO 15) C (SEQ ID NO 16) T (SEQ ID NO 17)
  • the pair of primers Yl Y2 is not specific to a specific subspecies of Erwinia carotovora, in particular Eca, even under the conditions of high stringency specified in said international application, and as such does not allow the only amplification of fragments of the Eca genome.
  • One of the aims of the present invention is precisely to provide new nucleotide sequences for the implementation of a detection and / or identification method which is specific for Eca.
  • Another object of the present invention is to provide a method of detection and specific identification of Eca, which is reliable, having in particular a good sensitivity threshold (from about lpg to about 10 fg, and from about 5 bacterial cells ), and simple to implement.
  • Another object of the present invention is to provide a specific diagnostic method for pathologies caused by Eca, in particular of the black leg in potatoes, and more particularly a method for early diagnosis of pathologies caused by Eca, namely a method for assessing the risk of occurrence of these pathologies in plants likely to be infected with Eca (latent infection mentioned above), or for assessing the risks of contamination of plants, in particular from the ground or from the water.
  • kits for implementing a detection and / or identification method, or a diagnostic method as described above.
  • the present invention follows from the discovery made by the inventors of a pair of primers constituted by the sequences Y 45 and Y46 described below, these sequences not only making it possible to specifically amplify the Eca gene fragments, but which can also be used as probes within the framework of the implementation of a specific detection and / or identification process for Eca.
  • the subject of the invention is the use of the nucleotide sequence Y45 and / or the nucleotide sequence Y46, represented respectively by the following sequences SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 2:
  • - SEQ ID NO 2 TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT or of any sequence derived by substitution and / or addition and / or deletion of one or more nucleotides of the sequences Y45 and Y46 mentioned above, insofar as these derived sequences, like the sequences Y45 and Y46 , are capable of specifically hybridizing with the genome (DNA or RNA) of bacteria of the subspecies Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), and more particularly with the genes coding for pectate lyases (PL) in the latter, in particular under the following hybridization conditions: temperature of 65 ° C.
  • Eca Erwinia carotovora subsp. atroseptica
  • PL pectate lyases
  • the term "derived sequence” is understood in the above and what follows, any sequence having at least about 60% identity with the nucleotide sequences of the invention (in particular in the 3 'region, in particular the 3 last nucleotides of this region), or any sequence capable of mimicking the nucleotide sequences of the invention, such as the peptide nucleic acids (PNA) described in particular in Egholm et al. (1992).
  • PNA peptide nucleic acids
  • sequence Y45, or a derived sequence as defined above, or their complementary sequence, and the sequence Y46, or a derived sequence as defined above, or their sequence complementary form a couple primers for gene amplification of copies of gene fragments encoding PL in Eca.
  • the subject of the invention is more particularly any method of detection and / or specific identification of bacteria of the subspecies Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), in a determined sample, and more particularly in soil or water, or in a host capable of carrying such bacteria, in particular in plants and seeds, characterized in that it comprises:
  • the amplification by any appropriate gene amplification method, of the number of copies of fragments of DNA or RNA sequences specific for said subspecies and likely to be present in the sample, or further DNA sequences resulting from reverse transcription from the above-mentioned RNA sequences, this amplification being carried out using a pair of primers consisting of the sequence Y45, or of a derived sequence such as defined above, or of a sequence complementary to the latter, and of the sequence Y46, or of a derived sequence as defined above, or of a sequence complementary to the latter,
  • the aforementioned method of the invention comprises, prior to the detection step and, where appropriate, that of amplification, a step of treatment of the sample taken from water, soil or from a host, in particular in plants and seeds, so as to make the Eca genome, possibly present in said sample, accessible to sequences Y45 and Y46, or to their derived sequences, or to sequences complementary to the above-mentioned sequences.
  • This sample treatment step can be carried out in particular by boiling, maceration (in a liquid such as water), grinding, sonication, in particular in the presence of detergent (for example laurylsulfate, Sodium Dodecyl Sulfate, Triton XlOO), d antioxidant (s), chelator (s), alkali, and / or compounds eliminating inhibitors such as polyphenols (polyvinyipyrrolidone for example), or polysaccharides (cetylt ⁇ metnyiammonium bromide for example).
  • detergent for example laurylsulfate, Sodium Dodecyl Sulfate, Triton XlOO), d antioxidant (s), chelator (s), alkali, and / or compounds eliminating inhibitors such as polyphenols (polyvinyipyrrolidone for example), or polysaccharides (cetylt ⁇ metnyiammonium bromide for example).
  • the treatment of the sample can also involve the capture of the bacteria present, in particular using specific antibodies fixed on a support such as immunocapture beads.
  • a bacterial culture after inoculation of a selective or semi-selective medium for the sample, can also constitute a step for processing the sample (step commonly called biological amplification).
  • the aforementioned amplification step is carried out using a pair of primers as described above, consisting of the sequence Y45, or of a derived sequence as defined above, or of a sequence complementary to the latter, and of the sequence Y46, or of a derived sequence as defined above, or of a sequence complementary to the latter, said amplification step being carried out by any appropriate gene amplification method, of the number of copies of fragments of at least one DNA or RNA sequence encoding a pectate lyase (PL) in Eca, likely to be present in said sample, this amplification being itself followed by the aforementioned detection step of the copies of DNA or RNA fragments thus amplified, said detection being carried out by revealing the primers used above when these ristics are marked, after elimination of the primers not used during the amplification, or using one (or more) nucleotide probe (s), of which at least one is marked, susceptible (s) to hybridize with said
  • PL pectate lyase
  • gene amplification step makes it possible to obtain a large quantity of copies of gene fragments encoding PL which is sufficient to allow the detection of any Eca present in the sample.
  • gene amplification comprises several stages, the first stage consisting of a phase of denaturation of the target DNA, namely the DNA or RNA encoding a PL in the Eca, susceptible to be present in the sample, or cDNA possibly obtained from RNA by reverse transcription.
  • the second step is that of hybridization of the Y45 and Y46 sequences or of their complementary or derived sequences, with the genome de ⁇ > Eca (namely with the aforementioned DNA or RNA).
  • the third step in a cycle of this amplification consists of the elongation of the hybridized primers.
  • the amplification consists of a succession of denaturation steps, hybridization of the aforementioned primers and elongation. These three-stage cycles are repeated the number of times necessary to obtain a large quantity of copies of fragments of genes encoding PLs.
  • the aforementioned gene amplification step can be carried out by any method using the conventional techniques of enzymatic amplification of DNA or RNA, such as the LCR (Ligase Chain Reaction) technique described in particular in the journal P.N.A.S. , USA, 88, pp. 189-193 (1991), or advantageously the PCR technique as described in particular in the European patent applications of Cetus (n ° 200 362, 201 184, 229 701 and 258 017), or also the 3SR technique described by Fahy et al . in PCR Meth. Appl. 1, 25-33 (1991), or the NASBA technique described in European patent application No. 329 822, or the techniques derived from the latter and any method aimed at amplifying the nucleotide sequences in vitro.
  • LCR Liigase Chain Reaction
  • the sensitivity and the specificity of the detection can be improved by continuing the method described above by an amplification of the anchored PCR type (or “nested PCR"), described in "PCR A Practical Approach “Edited by MJ McPherson, P. Quirke, GR Taylor, page 42, (1991) Oxford University Press, using primers internal to previously amplified fragments, which leads to amplification of the copy number of a fragment of DNA or RNA shorter than that whose copy number was initially amplified.
  • anchored PCR type or “nested PCR”
  • a particularly advantageous embodiment of the method for amplifying the copy number of DNA fragments encoding a PL in Eca includes the following steps:
  • the detection of copies of the amplified gene fragments mentioned above can be carried out by gel electrophoresis of all or part of the reaction medium in which the amplification was carried out, in particular on agarose or polyacrylamide gel, or by capillary electrophoresis or by chromatography .
  • the visualization of a large (more or less individualized) cluster of sequences at a specific point of the gel, and corresponding to the number of copies of all or part of the gene (s) thus amplified, is correlable to the presence of the above-mentioned genes (or corresponding RNAs), and therefore Eca, in the studied sample.
  • the copies of amplified gene fragments mentioned above are capable of being detected using nucleotide probes, in particular according to the methods described below.
  • the detection of the amplified fragments can be carried out by "immobilization" of the amplified fragments (after denaturing of the latter, in particular using a 40 mM EDTA solution - 200 mM NaOH) on a solid support as described below. afterwards, followed by hybridization of the fragments thus immobilized with one (or more) labeled detection probe (s), then rinsing of the solid support to remove the above-mentioned probes in excess and detection of the hybrid molecules formed during the hybridization step between the amplified fragments and said probes.
  • membranes nylon and nitrocellulose
  • polystyrene microplates, tubes, beads
  • glass latex
  • the aforementioned amplified fragments to be detected can be fixed on the solid support according to methods known to those skilled in the art, in particular by passive adsorption or by covalent coupling (Cook et al., Nucleic Acids Research (1988), 16 : 4077-4095; Nagata et ai, FEBS Lett. (1985), 183: 379-
  • the amplified fragments are detected according to the principle of the so-called "sandwich" method.
  • a capture probe is immobilized on a solid support, in particular by passive adsorption or by covalent bond according to the methods described above, and serves to capture by specific hybridization the nucleic acid of the target to be detected, namely the amplified fragments mentioned above.
  • the captured target sequence is detected using a second probe, called a detection probe marked with an easily detectable element, as described below.
  • the hybridization of the capture and detection probes can be done separately (in two stages) or simultaneously (in one stage), in particular according to one of the methods described by the following authors: Langhale and Malcolm,
  • these capture and detection probes are complementary to two different regions included in the target sequence to be detected.
  • a particularly advantageous method of the present invention is characterized in that the step of detecting the amplified fragments of DNA encoding PLs obtained during the amplification step, is carried out in the following manner:
  • the composition issued from the previous step containing amplified single-stranded fragments, on the one hand a nucleotide sequence, also designated below as capture probe, capable of hybridizing with one of the strands of the amplified fragments, said capture probe being immobilized on a solid support, in particular in the wells of titration microplates (or “microtiter plates”), and, on the other hand with one (or more) labeled nucleotide probe (s), also designated ( s) detection probe (s), capable of hybridizing with the same strand of the amplified fragments as that with which the abovementioned capture probe is hybridized, but in a region distinct from that hybridized with the capture probe, for a sufficient period of time to allow hybridization of the ampl
  • the capture probe and the detection probe (s) used are single-stranded nucleotide sequences of approximately 10 to approximately 60 nucleotides, advantageously approximately 25 to approximately 35 nucleotides. corresponding to nucleotide sequences included in a gene encoding a PL in Dactenes of the genus trwinia, in particular cone Eca, and capable of hybridizing with the amplified fragments, said capture probe and detection probe (s) hybridizing respectively with different regions of said amplified fragments.
  • the capture probe and the detection probe (s) are chosen in particular from the following nucleotide sequences:
  • GATGTCGATACCATCGAGCCTTA or any sequence derived by substitution and / or addition and / or deletion of one or more nucleotides of the above-mentioned sequences, insofar as these derived sequences, like the aforementioned sequences, are capable of specifically hybridizing with the genome (or fragments derived therefrom) of bacteria of the subspecies Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), in particular under the hybridization conditions indicated above, or any sequence complementary to the above-mentioned sequences.
  • Eca Erwinia carotovora subsp. atroseptica
  • the capture probe and the detection probe (s) are chosen from one of the sequences represented by SEQ ID NO 3 to SEQ ID NO 10, the capture probe advantageously being that represented by SEQ ID NO 3, and the detection probe (s) advantageously being that (s) represented by SbQ ID NU / or (and) SbQ 1D NU y or (and) ShQ ID NU read, the detection probe preferably being that represented by SEQ ID NO 9.
  • the latter comprises: - denaturation of the double-stranded DNA likely to be present in said sample, in particular using a 40 mM EDTA solution - 200 mM NaOH,
  • the step of hybridization of the sequences according to the invention used as probes in the aforementioned method is carried out in a hybridization buffer containing Denhardt x 10, SSC x 6, SDS 0.1%.
  • the abovementioned hybridization step is preceded by the amplification of the number of copies of gene fragments coding for PL in bacteria of the species Erwinia carotovora in general, this amplification gene being produced in particular in the manner indicated above using a pair of primers capable of hybridizing specifically with the genome (or the DNA deriving from the corresponding RNAs) of bacteria of the species Erwinia carotovora and to amplify DNA fragments comprising the sequences corresponding to sequences Y45 and Y46 or their complementary or derived sequences as defined above.
  • the subject of the invention is also any kit (or kit) for detecting and identifying Eca, characterized in that it comprises the nucleotide sequence Y45 and / or the nucleotide sequence Y46, represented respectively by the sequences SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 2 following: - SEQ ID NO 1:
  • TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT or any sequence derived by substitution and / or addition and / or deletion of one or more nucleotides of the sequences Y45 and Y46 above, insofar as these derivative sequences, like the sequences Y45 and Y46, are capable of hybridizing specifically with the genome of bacteria of the Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), in particular under the following hybridization conditions: temperature of 65 ° C. in a buffer comprising Tris-HCl 10 mM pH 9, KC1 50 mM, MgCl2 1.5 mM, Triton X100
  • the invention relates more particularly to any kit as described above, in which the sequences Y45 and Y46 or their derived or complementary sequences, are in the form of pairs of primers for gene amplification.
  • Kits as described above, and particularly advantageous in the context of the present invention include: - a pair of primers as described above,
  • a solid support on which is immobilized a capture probe as defined above, in particular in the wells of a microplate, by passive adsorption, or by covalent bonding to polystyrene (or other material) of the wells of the microplate, or by covalent bond, for example to the polystyrene of a magnetic ball,
  • probes as defined above, said probes being labeled, in particular by an enzymatic molecule (such as peroxidase or alkaline phosphatase), or by a molecule fluorescent such as fluorochrome,
  • an enzymatic molecule such as peroxidase or alkaline phosphatase
  • a molecule fluorescent such as fluorochrome
  • a hybridization buffer comprising Denhardt x 10, SSC x 6, SDS 0, 1%
  • a solution of rinsing of the solid support advantageously a solution containing 10 mM Tris, 300 mM NaCl and Tween 20 at 0.1%, pH 7.4,
  • a positive control such as a genomic DNA corresponding to a gene or gene fragment encoding one or PLs in Eca, with which the nucleotide sequences of the invention are capable of hybridizing, said DNA being optionally inserted into the genome of a vector, said positive control also being able to serve as a quantification system and / or inhibition control,
  • reagents for the extraction of nucleic acids from the sample in particular SDS at 1% in Tris EDTA buffer, pH 8.0 added with 10 ⁇ g / ml of proteinase K,
  • nucleic acids for example target bacteria such as the Eca strain 1526,
  • the subject of the invention is also any method of diagnosing latent infections in plants and seeds infected with Eca, thus making it possible to make the early diagnosis of pathologies caused by Eca in plants and seeds, in particular of the black leg in Potato, said method being carried out by implementing a specific detection and identification process for Eca as described above according to the invention.
  • the result of the above-mentioned diagnostic method makes it possible to assess the risk presented by a host likely to be a carrier of Eca, to develop and if necessary, to transmit, or not, a pathology caused by these bacteria, and more particularly the black leg.
  • Eca detected within the framework of the above-mentioned diagnostic and detection methods, is meant both the natural strains of these bacteria, as well as the modified strains, in particular by genetic engineering.
  • the invention also relates to i the application of the above methods, detection of any organism (including microorganisms, plants etc.) genetically modified by insertion of a gene encoding one or PL in
  • the polymo ⁇ hism of the nucleotide sequences specific for pathogenic Eca, or fragments of these sequences can be representative of different groups within these erwinias, such as ecotypes, pathotypes (or pathovars) or biotypes of Eca, the polymo ⁇ hism being in particular evidence either by the action of restriction enzymes, by electrophoresis in temperature gradient or denaturing agent (s), or after hybridization with an RNA fragment by action of RNAase A, or by any other method aiming to demonstrate the polymorphism of nucleic acids in solid or liquid phase, in particular by hybridization with probes as described above, or by sequencing of the fragment (s) amplified according to the processes described above.
  • the invention also relates to the use of any kit as described above, for the implementation of a method for detecting and identifying the Eca mentioned above, or of a diagnostic method cited above.
  • the subject of the invention is also the nucleotide sequences represented by the following nucleotide sequences:
  • GATGTCGATACCATCGAGCCTTA or any sequence derived by substitution and / or addition and / or deletion of one or more nucleotides of the above-mentioned sequences, insofar as these derivative sequences, like the above-mentioned sequences, are capable of hybridizing specifically with the genome of bacteria of the Erwinia carotovora atroseptica (Eca) subspecies, in particular under the hybridization conditions indicated above, or any sequence complementary to the above-mentioned sequences.
  • Eca Erwinia carotovora atroseptica
  • the invention also relates to the use of the nucleotide sequences defined above for the implementation of a detection method, where appropriate for diagnostic purposes, in a host or in a medium as defined above, of any microorganism or any cell, into the genomes of which the nucleotide sequences according to the invention, have been introduced transiently or definitively. Such a process is advantageously carried out according to one of the methods described above.
  • the invention also relates to the use of the nucleotide sequences defined above, as markers of cells or micro ⁇ organisms genetically modified by the introduction or not into their genome of these nucleotide sequences, or of hosts cells infected (or transformed) by such microorganisms, in particular for monitoring the evolution of these cells, microorganisms and cellular hosts in a determined environment.
  • the invention relates in particular to plant cells (for example protoplasts) transformed with a vector chosen from those derived from the plasmids Ti and Ri of Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes respectively, these plasmids containing in one of their non-sites essential for their replication and transformation of plant cells, a sequence nucleotide according to the invention, in a position allowing its transfer to the host.
  • the invention also relates to plants regenerated from these transformed cells.
  • the invention also relates to animal cells transformed by a vector derived, for example, from retroviruses and containing one or more nucleotide sequence (s) of the invention.
  • the invention also relates to any process for obtaining the abovementioned nucleotide sequences.
  • the preparation of these nucleotide sequences can be carried out either by a chemical process or by other processes, such as amplification by LCR or PCR or any other method of 'gene amplification.
  • An appropriate mode of preparation of these nucleotide sequences (comprising at most about 200 nucleotides, or base pairs in the case of double-stranded nucleic acids) of the invention by chemical means (in the current state of the art in this art. domain) includes the following steps:
  • a method of preparing, by chemical means, nucleic acids of length greater than approximately 200 nucleotides - or base pairs comprises the following steps:
  • the assembly for example by abutment (or ligation, or ligation, by action of a ligase), of chemically synthesized oligonucleotides, provided at their ends with different restriction sites, according for example to the principle described in Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80 ,; 7461-7465, 1983, - cloning of the DNA thus obtained into an appropriate vector (plasmid, phage or cosmid), and recovery of the DNA by hybridization with an appropriate probe, or by electrophoresis, or by chromatography, generally after restriction.
  • abutment or ligation, or ligation, by action of a ligase
  • chemically synthesized oligonucleotides provided at their ends with different restriction sites, according for example to the principle described in Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80 ,; 7461-7465, 1983, - cloning of the DNA thus obtained into an appropriate vector (plasmid, phage or
  • the preparation of the nucleic acids of the invention can also be carried out by biological means, in particular after cloning of cellular hosts whose genome is likely to contain these nucleotide sequences, if necessary, after transformation of the genome of these hosts using suitable vectors containing these nucleotide sequences.
  • the present invention relates to any vector, in particular plasmid, containing in one of its sites not essential for its replication, a nucleotide sequence according to the invention.
  • the subject of the invention is also any cellular host transformed by a vector according to the invention, and in which said vector, or the nucleotide sequence according to the invention, integrated into the genome of the host, is capable of replicating.
  • the present invention thus relates to a process for obtaining the abovementioned nucleotide sequences, carried out by: - culturing a cellular host as described above, transformed
  • Another particularly advantageous method for obtaining the nucleotide sequences according to the invention comprises the following steps: - bringing together vectors containing the above-mentioned nucleotide sequences, with pairs of primers as described above, under conditions allowing amplification of the number of copies of these nucleotide sequences, in particular under the conditions described above,
  • the subject of the invention is also any pair of primers for gene amplification, characterized in that one of the primers, also designated Y45, is represented by SEQ ID NO 1, or by any derived sequence as described below. above, or by any sequence complementary to the above-mentioned sequences, while the other primer, also designated Y46, is represented by SEQ ID NO 2, or by any derived sequence as described above, or by any sequence complementary to the above-mentioned sequences .
  • the invention also relates to the nucleotide sequences described above, labeled, in particular radioactively, enzymatically, by a fluorescent compound, by binding to an antigenic molecule (capable of being recognized by antico ⁇ s) or to any other molecule capable of '' be directly or indirectly detected using reagents, this connection can be made via a spacer arm, in particular through a nucleotide sequence consisting of approximately 5 to 100 nucleotides located at the 3 'and / or 5' ends of these sequences, provided that when the sequences Y45 and Y46 are used as primers for gene amplification, only their 5 end 'can then be changed.
  • nucleotide sequences described above can be labeled with a radioactive element (for example ⁇ P, 33p 35s 3 H , 125i) or with a non-radioactive molecule, in particular biotin, acetylamino-fluorene, fluorochrome, digoxigenin, or an enzymatic molecule, or a hapten according to one of the methods described in the following publications: G. Gebeyehu et al: "Novel biotinylated nucleotide - analogs for labeling and c ⁇ io ⁇ mei ⁇ c deiecii ⁇ n ⁇ f DNA " Nucleic Acids Researcii (19S7), 15.
  • a radioactive element for example ⁇ P, 33p 35s 3 H , 125i
  • a non-radioactive molecule in particular biotin, acetylamino-fluorene, fluorochrome, digoxigenin, or an enzymatic molecule, or a
  • Fragments of the pel gene containing the Yl region, and others containing the Y2 region, were amplified in several strains of Erwinia carotovora using the aforementioned primers then sequenced and aligned in order to detect possible regions of these primers which would be characteristic of a subspecies of Erwinia carotovora.
  • the pairs Y45-Y44 and Y45-Y46 give the best levels of amplification from I pg of Eca target DNA (detection on agarose gel stained with ethidium bromide or on titration microplate).
  • NCPPB 633 Xanthomonas France campestris pv. malvacearum
  • T Type strain of the species.
  • Bernard Jouan National Institute of Agronomic Research, Rennes, France, personal collection.
  • CFBP French Collection of Phytopathogenic Bacteria, INRA, Angers, France.
  • 3 Régine Samson, National Institute for Agronomic Research, Angers, France.
  • 4 IPO, Research Institute for Plant Protection, Wageningen, Netherlands.
  • CIP International Potato Center, Lima, Peru.
  • Olivier Cazelles Federal Station of Agronomic Research, Changins, Switzerland, personal collection.
  • SCRI Scottish Crop Research Institute, UK.
  • the detection of the target nucleic acid sequences is carried out as follows.
  • the microplate containing the capture probe is sensitized by prehybridization using a solution containing Denhardt x 10, SSC x 6, SDS
  • - Prehybridization is carried out by adding 200 ⁇ l of this solution per well at 37 ° C for 30 min with stirring. The plate is then emptied of its contents.
  • - Hybridization is carried out in the titration microplate, previously sensitized, by adding 200 ⁇ l of Denhardt solution x 10, SSC x 6, SDS 0, 1%, 10 ng of the detection probe marked directly to the peroxidase and 10 to 20 ⁇ l of the solution containing the denatured amplified fragments, ie generally 1/10 of the initial amplification solution.
  • the hybridization reaction is carried out with moderate stirring at 37 ° C for 1 hour. During this period, the target nucleic sequence hybridizes simultaneously to the capture probe and to the detection probe (marked by a peroxidase).
  • the ternary product obtained (simultaneous hybridization of the capture and detection probes on the amplified fragment) is separated from the excess of detection probe contained in the hybridization buffer by 6 successive rapid washes, using a solution containing 10 mM Tris; 300 mM NaCl; Tween 20 at 0.1%, pH 7.4. The plate is then emptied of the last washing solution.
  • the detection reaction is obtained by adding 200 ⁇ l of a buffer solution composed of 4 ml of 0.04M trisodium citrate to each well of the microplate; 0.01M citric acid; H2O2 30%, pH 5.6 + 1 tablet of Orthophenylenediamine (OPD) dosed at 30 mg per tablet. 200 ⁇ l of this solution are distributed in each well, then the microplate is placed in the dark for 30 min at 37 ° C.
  • a buffer solution composed of 4 ml of 0.04M trisodium citrate to each well of the microplate; 0.01M citric acid; H2O2 30%, pH 5.6 + 1 tablet of Orthophenylenediamine (OPD) dosed at 30 mg per tablet.
  • the colorimetric reaction obtained by the activity of the peroxidase on the OPD substrate is determined by measuring the optical density in absorbance at 492 nm with reference to 620 nm.
  • the hybridization and washing stages use suitable equipment.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation de la séquence nucléotidique Y45 et/ou de la séquence nucléotidique Y46, représentées respectivement par les séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 2 suivantes: SEQ ID NO 1: TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT; SEQ ID NO 2: TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection et d'identification spécifique des Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), dans un échantillon déterminé, et plus particulièrement dans le sol ou l'eau, ou chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries, notamment chez les plantes et les semences, et, le cas échéant, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic précoce des pathologies susceptibles d'être causées par lesdites Eca chez l'hôte susmentionné.

Description

SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES POUR LA DETECTION DES ERWINIA CAROTOVORA SUBSP. ATROSEPTICA.
La présente invention a pour objet des séquences nucléotidiques utilisables notamment en tant que sondes, et/ou amorces nucléotidiques pour l'amplification génique, dans le cadre de la détection spécifique des Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca).
L'invention concerne également un procédé de détection et d'identification spécifique de ces Eca, une méthode de diagnostic spécifique des états infectieux
(îniecuons latentes sans signes pathologiques apparents) et ues pauioiogies causées par les Eca chez les plantes, ainsi que des trousses (ou kits) contenant les séquences susmentionnées et utilisables pour la mise en oeuvre dudit procédé et de ladite méthode. Les bactéries pectinolytiques du genre Erwinia (encore désignées ci-après erwinias) sont responsables d'un grand nombre de pathologies, dont l'un des symptômes est la macération des tissus chez un grand nombre de plantes et de semences. Ces bactéries sont notamment capables d'infecter la pomme de terre, le maïs, la tomate, la betterave à sucre, le chou, l'endive, etc. , ainsi que les plantes de serres, telles que les plantes ornementales.
Parmi ces erwinias, on peut citer principalement d'une part Erwinia carotovora, et plus particulièrement Erwinia carotovora subsp. carotovora (Ecc), Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), Erwinia carotovora subsp. odorifera (Eco), Erwinia carotovora subsp. betavasculorum (Ecb), et Erwinia carotovora subsp. wasabiae (Ecw), et, d'autre part, Erwinia chrysanthemi
(Ech), Erwinia cacticida ...
Erwinia carotovora a été particulièrement étudiée en raison de son pouvoir pathogène sur plusieurs plantes, et surtout chez la pomme de terre (Pérombelon, 1989). L'espèce Erwinia carotovora (Ec) est actuellement divisée en cinq sous- espèces : atroseptica (Eca), carotovora (Ecc), odorifera (Eco) et wasabiae
(Ecw) précédemment citées, ainsi que la sous-espèce betavasculorum (Ecb). Cette classification a été réalisée sur la base de caractéristiques physiologiques et biochimiques, ainsi que sur leur pouvoir pathogène.
Ecb est responsable d'une pourriture de la betterave, dite nécrose racinaire (Thomson et al. , 1981). L'action des Eca est généralement limitée à la pomme de terre dans des climats tempérés frais, à des températures comprises entre environ 18°C et environ 22°C (Pérombelon, 1980). Quelques souches, non isolées à partir de la pomme de terre, ont été précédemment décrites comme étant des Eca "atypiques" en raison du fait qu'elles présentent quelques caractéristiques physiologiques particulières, comme par exemple leur capacité à se développer à 37°C (Marti et al., 1989). Une nouvelle sous-espèce, dénommée odorifera (Eco) a été récemment décrite comme représentant des souches "atypiques" qui sont pathogènes au moins sur l'endive et produisent des métabolites volatiles odorants (Gallois et al., 1992). D'autres souches û'Eca "atypiques" ont été identifiées comme étant des souches û'Ecc sur la base de caractéristiques phénotypiques et génotypiques (S. Priou, thèse ENSAR, Rennes, 1992). A l'inverse, Ecc est largement répandue dans le monde et présente une large spécificité d'hôtes et de températures d'expression des symptômes (22 - 35 °L) (Pérombelon et Kelman 198/, Smith et Bartz 1990).
Les principales pathologies de la pomme de terre causées par ces bactéries, et plus particulièrement par Eca, sont les suivantes : manque à la levée, fonte de semis, jambe noire, pourriture aérienne de la tige, dessèchement et pourriture des tubercules, et flétrissement aérien (Pérombelon et Kelman
1987). Les pathologies correspondant à la non-levée et à la jambe noire surviennent principalement à partir des tubercules mères et peuvent causer des pertes importantes dans les champs. Eca est considérée comme l'agent typique de la jambe noire en Europe en raison de son pouvoir pathogène à faible température, et de sa capacité à induire la maladie de façon précoce en végétation, ce qui augmente les pertes à la récolte. La plupart des souches d'Ecc ne peuvent pas produire de symptômes typiques de jambe noire à faible température. Ecc est considérée comme un agent opportuniste plutôt que comme un agent causal primaire de la maladie. Toutefois Ecc présente un pouvoir pathogène accru à des températures supérieures ou égales à environ 25 °C et est l'agent causal primaire d'un symptôme de type jambe noire de la pomme de terre en Arizona et dans le Colorado (Stanghellini et Meneley, 1975).
Ces bactéries produisent plusieurs enzymes extracellulaires capables d'attaquer les composants de la paroi cellulaire; pectinases, cellulases, hémicellulases et protéases (pour une revue détaillée, voir l'article de A.
Kotoujansky paru dans Annu. Rev. Phytopathol. 1987, 25: 405-30).
Parmi ces enzymes, les pectate-lyases (encore désignées par polygalacturonate-lyases, pectate-transéliminases, polygalacturonate- transéliminases, poly(l ,4-α-D-galacturonide)lyases, et EC 4.2.2.2) participeraient au mécanisme de cette macération des plantes, sans pour autant être les seuls agents responsables de ce phénomène, et ne seraient pas toutes nécessaires à la virulence de ces bactéries. Par pectate-lyases on entend toute enzyme capable, par le biais d'une réaction de β-élimination, de couper une liaison α l- > 4 O glycosidique présente entre deux résidus galacturoniques.
Ces pectate-lyases (encore désignées ci-après par PL) sont principalement codées par des gènes pel nommés pelY (Manulis et al. , 1988), pelB
(Lei et ai , 1987), pelA (Lei et ai , 1988), pell (Ito et al. , 1988), pell53 (TroUinger et al, 1989), pelA, pelC, pelE et pelD (Tamaki et al. , 1988), pelA, pelD et pelE (Van Gijsegem, 1989), pelB (Schoedel et Collmer, 1986), pelA (Favey et al. , 1992) et pelB (Hinton ét al., 1989). Ces gènes ont eux-mêmes été regroupés en trois familles en fonction de leurs nomologies de séquences (Hinton et aï., i9S9). Ii a en effet été détermine que la famille pelA, D, E est présente chez Ech, que la famille pelB, C, I, X, est présente chez Eca, Ecc et Ech, et que la famille pel!53, Y (appelée pelY par la suite) est présente chez certaines souches d'Erwinia carotovora. II convient cependant de noter que ces gènes ne sont pas spécifiques des erwinias pectinoly tiques. En effet, d'autres bactéries, telles que Yersinia pseudotuberculosis (Yps), Klebsiella pneumoniae et Pseudomonas sp. , sont capables de produire des PL. La famille pe/iF a été mise en évidence chez Yps; une partie du gène pell53 est effectivement commune à Eca et Yps (TroUinger et al. , 1989).
La présence de séquences conservées tant au niveau des séquences nucléotidiques que protéiques correspondant à ces PL, serait à l'origine de l'apparition de réactions croisées lors de la mise en oeuvre de méthodes de détection des erwinias, que ces méthodes procèdent par hybridation entre acides nucléiques, ou par réaction immunologique à l'aide d'anticorps anti-PL.
Il a cependant été démontré dans la demande internationale n° WO 93/25708 que, contrairement à toute attente, la détection de fragments d'ADN codant une PL, pouvait être corrélée à la détection spécifique de bactéries pectinoly tiques du genre Erwinia, et à l'identification d'une espèce, d'une sous-espèce, voire d'un pathovar déterminés.
Deux couples d'amorces d'amplification génique, à savoir le couple A B (encore désigné Yl Y2), et le couple C D, utilisés respectivement pour la détection de quatre des cinq sous-espèces d'Erwinia carotovora et des Erwinia chrysanthemi en général, ont été plus particulièrement décrits dans la demande internationale référencée ci-dessus.
L'amorce Yl est représentée par l'enchaînement de nucleotides suivant: TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT (SEQ ID NO 14) ou une séquence complémentaire de cette dernière, ou une séquence dérivée de la séquence Yl , notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition de nucleotides, et susceptible de s'hybrider avec le génome de bactéries de l'espèce
Erwinia carotovora, ou une séquence complémentaire de cette séquence dérivée.
L'amorce Y2 est représentée par l'un des enchaînements de nucleotides suivants: CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT (SEQ ID NO 15) C (SEQ ID NO 16) T (SEQ ID NO 17)
(les points représentant des nucleotides identiques à ceux de la première ligne) ou leurs séquences complémentaires, ou une séquence dérivée des séquences Y2 susmentionnées, notamment par suppression et/ou substitution et/ou addition de nucleotides. et susceptible de s'hybrider avec le génome de bactéries de l'espèce Erwinia carotovora, ou la séquence complémentaire de cette séquence dérivée.
Toutefois, dans le cadre du procédé de détection des Erwinia carotovora, tel que décrit dans la demande internationale susmentionnée, le couple d'amorces Yl Y2 n'est pas spécifique d'une sous-espèce déterminée d'Erwinia carotovora, notamment des Eca, même dans les conditions de forte stringence précisée dans ladite demande internationale, et à ce titre ne permet pas la seule amplification de fragments du génome des Eca.
Un des buts de la présente invention est précisément de fournir de nouvelles séquences nucléotidiques pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection et/ou d'identification qui soit spécifique des Eca.
Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé de détection et d'identification spécifique des Eca, qui soit fiable, présentant notamment un bon seuil de sensibilité (d'environ lpg à environ 10 fg, et d'environ 5 cellules bactériennes), et simple à mettre en oeuvre.
Un autre but de la présente invention est de fournir une méthode de diagnostic spécifique des pathologies causées par les Eca, notamment de la jambe noire chez la pomme de terre, et plus particulièrement une méthode de diagnostic précoce des pathologies causées par les Eca, à savoir une méthode permettant de faire une évaluation du risque d'apparition de ces pathologies chez les plantes susceptibles d'être infectées par les Eca (infection latente susmentionnée), ou d'apprécier les risques de contamination des plantes, notamment à partir du sol ou de l'eau.
Un autre but de la présente invention est de fournir des trousses (ou kits) de mise en oeuvre d'un procédé de détection et/ou d'identification, ou d'une méthode de diagnostic tels que décrits ci-dessus.
La présente invention découle de la découverte faite par les inventeurs d'un couple d'amorces constitué par les séquences Y 45 et Y46 décrites ci- après, ces séquences permettant non seulement d'amplifier spécifiquement les fragments de gènes des Eca, mais pouvant également être utilisées en tant que sondes dans le cadre de la mise en oeuvre d'un procédé de détection et/ou d'identification spécifique des Eca.
L' invention a pour objet l'utilisation de la séquence nucléotidique Y45 et/ou de la séquence nucléotidique Y46, représentées respectivement par les séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 2 suivantes:
- SEQ ID NO 1 :
TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT
- SEQ ID NO 2: TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT ou de toute séquence dérivée par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucleotides des séquences Y45 et Y46 susmentionnées, dans la mesure où ces séquences dérivées, tout comme les séquences Y45 et Y46, sont capables de s'hybrider spécifiquement avec le génome (ADN ou ARN) des bactéries de la sous-espèce Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), et plus particulièrement avec les gènes codant des pectate-lyases (PL) chez ces dernières, notamment dans les conditions d'hybridation suivantes: température de 65 °C dans un tampon comprenant Tris-HCl 10 mM pH 9, KC1 50 mM, MgCP) 1 ,5 mM, Triton XlOO (marque déposée) 0, 1 % , sérum albumine de boeuf (BSA) 0,2 mg/ml, ou encore de toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées, pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection et/ou d'identification spécifique des Eca, dans un échantillon déterminé, et plus particulièrement dans le sol ou l'eau, ou chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries, notamment chez les plantes et les semences, et, le cas échéant, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic précoce des pathologies susceptibles d'être causées par lesdites Eca chez l'hôte susmentionné.
De préférence, on entend par "séquence dérivée" dans ce qui précède et ce qui suit, toute séquence présentant au moins environ 60% d'identité avec les séquences nucléotidiques de l'invention (en particulier dans la région 3' , notamment les 3 derniers nucleotides de cette région), ou encore toute séquence capable de mimer les séquences nucléotidiques de l'invention, tels que les acides nucléiques peptidiques (PNA) décrits notamment dans Egholm et al. (1992).
Avantageusement, dans le cadre de l'utilisation susmentionnée, la séquence Y45, ou une séquence dérivée telle que définie ci-dessus, ou leur séquence complémentaire, et la séquence Y46, ou une séquence dérivée telle que définie ci-dessus, ou leur séquence complémentaire, forment un couple d'amorces pour l'amplification génique de copies de fragments de gènes codant des PL chez les Eca.
L'invention a plus particulièrement pour objet tout procédé de détection et/ou d'identification spécifique de bactéries de la sous-espèce Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), dans un échantillon déterminé, et plus particulièrement dans le sol ou l'eau, ou chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries, notamment chez les plantes et les semences, caractérisé en ce qu'il comprend:
- le cas échéant, l'amplification, par toute méthode d'amplification génique appropriée, du nombre de copies de fragments de séquences d'ADN ou d'ARN specitiques de ladite sous-espece et susceptibles û être présentes dans l'échantillon, ou encore de séquences d'ADN résultant d'une transcription inverse à partir des séquences d'ARN susmentionnées, cette amplification étant effectuée à l'aide d'un couple d'amorces constitué de la séquence Y45, ou d'une séquence dérivée telle que définie ci-dessus, ou d'une séquence complémentaire de ces dernières, et de la séquence Y46, ou d'une séquence dérivée telle que définie ci-dessus, ou d'une séquence complémentaire de ces dernières,
- la détection : soit des fragments de séquences d'ADN ou d'ARN susmentionnés, dont le nombre de copies a été amplifié lors de l'étape d'amplification ci-dessus, cette détection étant effectuée en mettant en jeu une hybridation moléculaire entre lesdits fragments amplifiés et toute sonde nucléotidique susceptible de s'hybrider avec lesdits fragments amplifiés, dont notamment les séquences représentées par SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 10 avantageusement marquées, soit des séquences d'ADN ou d'ARN susmentionnées spécifiques de ladite sous-espèce, ou encore de séquences d'ADN résultant d'une transcription inverse à partir des séquences d'ARN susmentionnées, cette détection étant effectuée en mettant en jeu une hybridation moléculaire entre lesdites séquences d'ADN ou d'ARN et les séquences Y45 ou Y46, ou leurs séquences dérivées, ou les séquences complémentaires susmentionnées, ces séquences étant utilisées en tant que sondes avantageusement marquées, ce qui permet de déterminer la présence ou l'absence d'Eca dans l'échantillon en fonction de l'hybridation ou non des fragments et séquences d'ADN ou d'ARN susmentionnés avec les sondes citées ci-dessus.
Avantageusement, le procédé susmentionné de l'invention comprend, préalablement à l'étape de détection et, le cas échéant, celle d'amplification, une étape de traitement de l'échantillon prélevé dans l'eau, le sol ou chez un hôte, notamment chez les plantes et les semences, de manière à rendre le génome des Eca, éventuellement présentes dans ledit échantillon, accessible aux séquences Y45 et Y46, ou à leurs séquences dérivées, ou aux séquences complémentaires des séquences susmentionnées. Cette étape de traitement de l'échantillon peut être réalisée notamment par ébullition, macération (dans un liquide tel que l'eau), broyage, sonication, notamment en présence de détergent (par exemple laurylsulfate, Sodium Dodecyl Sulfate, Triton XlOO), d'antioxydant(s), de chélateur(s), d'alcali, et/ou de composés éliminant des inhibiteurs tels que les polyphénols (poly vinyipyrrolidone par exemple), ou les polysaccharides (bromure de cetyltπmetnyiammonium par exemple).
Le traitement de l'échantillon peut également faire intervenir la capture des bactéries présentes, notamment à l'aide d'anticorps spécifiques fixés sur un support tel que des billes d'immunocapture. En alternative, une culture bactérienne, après inoculation d'un milieu sélectif ou semi-sélectif pour l'échantillon, peut également constituer une étape de traitement de l'échantillon (étape couramment nommée amplification biologique).
Selon un premier mode de réalisation préféré du procédé de l'invention, l'étape d'amplification susmentionnée est réalisée à l'aide d'un couple d'amorces tel que décrit ci-dessus, constitué de la séquence Y45, ou d'une séquence dérivée telle que définie ci-dessus, ou d'une séquence complémentaire de ces dernières, et de la séquence Y46, ou d'une séquence dérivée telle que définie ci- dessus, ou d'une séquence complémentaire de ces dernières, ladite étape d'amplification étant effectuée par toute méthode d'amplification génique appropriée, du nombre de copies de fragments d'au moins une séquence d'ADN ou ARN codant une pectate-lyase (PL) chez les Eca, susceptibles d'être présentes dans ledit échantillon, cette amplification étant elle-même suivie par l'étape de détection susmentionnée des copies de fragments d'ADN ou ARN ainsi amplifiés, ladite détection étant réalisée par révélation des amorces utilisées susmentionnées lorsque ces dernières sont marquées, après élimination des amorces non utilisées lors de l'amplification, ou à l'aide d'une (ou plusieurs) sonde(s) nucléotidique(s), dont l'une au moins est marquée, susceptible(s) de s'hybrider avec lesdits fragments d'ADN ou ARN ainsi amplifiés, ou encore par détection directe des fragments amplifiés dans le cas où l'étape d'élongation de la réaction d'amplification est réalisée à l'aide d'un ou plusieurs désoxynucléotides marqués. Le procédé tel que décrit ci-dessus, est plus particulièrement caractérisé en ce que l'étape d'amplification génique permet d'obtenir une quantité importante de copies de fragments de gènes codant des PL qui soit suffisante pour permettre la détection des Eca éventuellement présentes dans l'échantillon. En particulier, comme décrit ci-après, l'amplification génique comprend plusieurs étapes, la première étape étant constituée d'une phase de dénaturation de l'ADN cible, à savoir de l'ADN ou ARN codant une PL chez les Eca, susceptibles d'être présentes dans l'échantillon, ou de l'ADNc éventuellement obtenu à partir d'ARN par transcription inverse. La deuxième étape est celle de l'hybridation des séquences Y45 et Y46 ou de leurs séquences complémentaires ou dérivées, avec ie génome deι> Eca (à savoir avec la, ADN uu ARN susmentionnés). La troisième étape d'un cycle de cette amplification est constituée de l'élongation des amorces hybridées. L'amplification consiste en une succession d'étapes de dénaturation, hybridation des amorces susmentionnées et d'élongation. Ces cycles à trois étapes sont répétés le nombre de fois nécessaire pour obtenir une quantité importante de copies de fragments de gènes codant des PL.
L'étape d'amplification génique susmentionnée peut être réalisée par toute méthode utilisant les techniques classiques d'amplification enzymatique de l'ADN ou de l'ARN, telles que la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite notamment dans la revue P.N.A.S. , USA, 88, pp. 189-193 (1991), ou avantageusement la technique PCR telle que décrite notamment dans les demandes de brevet européen de Cetus (n° 200 362, 201 184, 229 701 et 258 017), ou encore la technique 3SR décrite par Fahy et al. dans PCR Meth. Appl. 1, 25-33 (1991), ou encore la technique NASBA décrite dans la demande de brevet européen n° 329 822, ou les techniques dérivées de ces dernières et toute méthode visant à amplifier in vitro les séquences nucléotidiques.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la sensibilité et la spécificité de la détection peuvent être améliorées en poursuivant le procédé décrit ci-dessus par une amplification du type PCR ancrée (ou "nested PCR"), décrite dans "PCR A Practical Approach" Edited by M.J. McPherson, P. Quirke, G.R. Taylor, page 42, (1991) Oxford University Press, en utilisant des amorces internes aux fragments précédemment amplifiés, ce qui conduit à l'amplification du nombre de copies d'un fragment d'ADN ou d'ARN plus court que celui dont le nombre de copies a été initialement amplifié.
Un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé d'amplification du nombre de copies de fragments d'ADN codant une PL chez les Eca (ces fragments d'ADN étant issus d'ADN présent dans l'échantillon biologique ou obtenus par transcription inverse à partir d'ARN), comprend les étapes suivantes:
* dénaturation de l'ADN double brin en ADN mono-brin par chauffage pendant environ 30 secondes à une température d'environ 80°C à environ 100°C, avantageusement à 94°C, notamment dans un tampon constitué de Tris-
HC1 10 mM pH 9, KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM, Triton XlOO 0, 1 % , BSA 0.2 mg/ml, en présence de co-facteurs de l'ADN-polymérase, notamment d'ions Mg2 + et K + , de désoxynucléotides choisis parmi dCTP, dATP, dGTP, dTTP, des amorces Y45 et Y46, d'une ADN polymerase thermorésistante par exemple, et le cas échéant les réactifs nécessaires à la "décontamination" du mélange réactionnel avant amplification, notamment l'Uracile DNA glycosylase et le dUTP selon le procédé décrit dans le brevet US n° 5,035,996 de Life Technologies Inc.,
* hybridation des couples d'amorces avec les gènes codant des PL, ou des fragments de ces gènes, susceptibles d'être présents dans l'échantillon étudié, par chauffage à une température d'environ 60°C à environ 76°C, avantageusement d'environ 65°C à environ 70°C, pendant environ 30 secondes,
* élongation des amorces, hybridées à l'étape précédente, par chauffage à une température d'environ 50°C à environ 76°C, avantageusement 72°C, pendant environ 45 secondes, produisant ainsi des séquences nucléotidiques complémentaires de fragments de gène(s) codant une ou des PL chez les Eca, ces séquences nucléotidiques complémentaires, encore désignées fragments amplifiés, étant délimitées par les amorces susmentionnées, cette succession d'étapes (dénaturation, hybridation, élongation), constituant un cycle, étant répétée entre environ 20 et environ 50 fois, avantageusement entre 30 et 40 fois, cette répétition de cycles étant avantageusement précédée par une étape initiale de dénaturation de l'ADN susceptible d'être présent dans ledit échantillon, ou obtenu par transcription inverse des ARN correspondants, par chauffage à 94 °C pendant environ 5 minutes.
La détection des copies des fragments de gènes amplifiés susmentionnés peut être réalisée par électrophorèse sur gel de tout ou partie du milieu réactionnel dans lequel l'amplification a été effectuée, notamment sur gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou par électrophorèse capillaire ou par chromatographie. La visualisation d'un amas important (plus ou moins individualisé) de séquences en un point spécifique du gel, et correspondant au nombre de copies de tout ou partie du ou des gène(s) ainsi amplifiées, est corrélable à la présence des gènes susmentionnés (ou des ARN correspondants), et donc des Eca, dans l'échantillon étudié.
Avantageusement, les copies de fragments de gènes amplifiés susmentionnés, sont susceptibles d'être détectées à l'aide de sondes nucléotidiques, notamment selon les procédés décrits ci-dessous.
La détection des fragments amplifiés peut être réalisée par "immobilisation" des fragments amplifiés (après dénaturation de ces derniers, notamment à l'aide d'une solution d'EDTA 40 mM - NaOH 200 mM) sur un support solide tel que décrit ci-après, suivie de l'hybridation des fragments ainsi immobilisés avec une (ou plusieurs) sonde(s) de détection marquée(s), puis rinçage du support solide pour éliminer les sondes susmentionnées en excès et détection des molécules hybrides formées lors de l'étape d'hybridation entre les fragments amplifiés et lesdites sondes.
A titre d' illustration des membranes (nylon et nitrocellulose), le polystyrène (microplaques, tubes, billes), le verre, le latex peuvent être utilisés comme support solide.
La fixation sur le support solide des fragments amplifiés susmentionnés à détecter peut se faire selon des procédés connus de l'homme de l'art, notamment par adsorption passive ou par couplage covalent (Cook et al. , Nucleic Acids Research (1988), 16: 4077-4095; Nagata et ai , FEBS Lett. (1985), 183: 379-
382; M. Longlaru et al , EP n° 0 420 260 A2; T. Gingeras et al , EP n° 0 276 302 Bl; E. Homes et L.M. Kornes, EP n° 0 446 260 Bl).
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé susmentionné de l'invention, les fragments amplifiés sont détectés selon le principe de la méthode dite "sandwich" .
Dans ce procédé une sonde de capture est immobilisée sur un support solide, notamment par adsorption passive ou par liaison covalente selon les méthodes décrites ci-dessus, et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique de la cible à détecter, à savoir les fragments amplifiés susmentionnés. La séquence cible capturée est détectée grâce à une deuxième sonde, dite sonde de détection marquée par un élément facilement détectable, tel que décrit ci- après.
L'hybridation des sondes de capture et de détection peut se faire séparément (en deux temps) ou simultanément (en un temps), notamment selon une des méthodes décrites par les auteurs suivants: Langhale and Malcolm,
Gène (1985), 36: 201-210; Ranki et al , Gène (1983), 21 : 77-85; Dunn and Hassel, Cell (1977), 12: 23-36; Ranki and Soderlund, brevets US Nos 4,486,539 et 4,563,419. Avantageusement, ces sondes de capture et de détection sont complémentaires de deux régions différentes comprises dans la séquence cible à détecter.
Ainsi, un procédé particulièrement avantageux de la présente invention, est caractérisé en ce que l'étape de détection des fragments amplifiés d'ADN codant des PL obtenus lors de l'étape d'amplification, est réalisée de la manière suivante:
- dénaturation des fragments amplifiés double brin pour obtenir des fragments amplifiés simple brin, notamment à l'aide d'une solution d'EDTA 40 mM - NaOH 200 mM,
- mise en cυiuacL, dans un laπipυn d'hybridation approprie, notamment dans un tampon constitué de Denhardt x 10, SSC x 6, SDS 0, 1 % , avantageusement à 37 °C pendant environ une heure, de la composition issue de l'étape précédente, contenant des fragments amplifiés simple brin, avec d'une part une séquence nucléotidique, encore désignée ci-après sonde de capture, susceptible de s'hybrider avec l'un des brins des fragments amplifiés, ladite sonde de capture étant immobilisée sur un support solide, notamment dans les puits de microplaques de titrage (ou encore "plaques de microtitrage"), et, d'autre part avec une (ou plusieurs) sonde(s) nucléotidique(s) marquée(s), encore désignée(s) sonde(s) de détection, susceptible(s) de s'hybrider avec le même brin des fragments amplifiés que celui avec lequel la sonde de capture susmentionnée est hybridée, mais en une région distincte de celle hybridée avec la sonde de capture, pendant une période de temps suffisante pour permettre l'hybridation des fragments amplifiés éventuellement présents avec d'une part ladite sonde de capture, et d'autre part la (ou les) sonde(s) de détection, pour former un complexe dans lequel les fragments amplifiés sont liés à la sonde de capture et à la (ou aux) sonde(s) de détection (on dit encore que les fragments amplifiés sont pris en "sandwich" entre la sonde de capture et la (ou les) sonde(s) de détection), - élimination du tampon d'hybridation de manière à éliminer du support solide, d'une part, toute séquence nucléotidique susceptible d'être présente dans la composition issue de l'étape de dénaturation, ne s 'étant pas hybridée avec la sonde de capture, et, d'autre part, toute sonde de détection restée libre dans le tampon d'hybridation après l'étape d'hybridation susmentionnée, et le cas échéant un ou plusieurs rinçages du support solide, notamment à l'aide d'une solution de rinçage contenant du Tris-HCl 10 mM, NaCl 300 mM et Tween 20 0, 1 % , pH 7,4, - révélation de la présence ou de l'absence de la (ou des) sonde(s) de détection sur le support après élimination du tampon d'hybridation, témoignant respectivement de la présence ou de l'absence de fragments amplifiés dans la composition issue de l'étape d'amplification, et donc respectivement de la présence ou de l'absence d'Eca (ou des ADN ou ARN correspondants) dans l'échantillon étudié.
Avantageusement, la sonde de capture et la (ou les) sonde(s) de détection utilisée(s), sont des séquences nucléotidiques simple brin d'environ 10 à environ 60 nucleotides, avantageusement d'environ 25 à environ 35 nucleotides. correspondant à des séquences nucléotidiques comprises dans un gène codant une PL chez les Dactenes du genre trwinia, notamment cnez les Eca, et susceptibles de s'hybrider avec les fragments amplifiés, lesdites sonde de capture et sonde(s) de détection s'hybridant respectivement avec des régions différentes desdits fragments amplifiés. La sonde de capture et la (ou les) sonde(s) de détection sont choisies notamment parmi les séquences nucléotidiques suivantes:
- SEQ ID NO 1 (Y45): TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT
- SEQ ID NO 2 (Y46): TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT
- SEQ ID NO 3:
TGTCGCTGGCGGAAAAAGTGGGCGATAACAT
- SEQ ID NO 4:
ACCAACAGACAG - SEQ ID NO 5:
GACCAACAGACAGT
- SEQID NO6:
AGACCAACAGACAGTA
- SEQ ID NO 7: GAGACCAACAGACAGTAT
- SEQ ID NO 8 (revel 2):
GGCCGAGCCCAACAGACAATATGC
- SEQ ID NO 9 (revel 3):
GGCCGAGACCAACAGACAGTATGC - SEQ ID NO 10 (genec 1):
GATGTCGATACCATCGAGCCTTA ou toute séquence dérivée par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucleotides des séquences susmentionnées, dans la mesure où ces séquences dérivées, tout comme les séquences susmentionnées, sont capables de s'hybrider spécifiquement avec le génome (ou des fragments dérivés de celui-ci) des bactéries de la sous-espèce Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), notamment dans les conditions d'hybridation indiquées ci-dessus, ou encore toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux du procédé de l'invention, la sonde de capture et la (ou les) sonde(s) de détection sont choisies parmi l'une des séquences représentées par SEQ ID NO 3 à SEQ ID NO 10, la sonde de capture étant avantageusement celle représentée par SEQ ID NO 3, et la (ou les) sonde(s) de détection étant avantageusement celle(s) représentée(s) par SbQ ID NU / ou (et) SbQ 1D NU y ou (et) ShQ ID NU lu, la sonde de détection étant de préférence celle représentée par SEQ ID NO 9.
Selon un deuxième mode de réalisation du procédé de l'invention, ce dernier comprend: - une dénaturation de l'ADN double brin susceptible d'être présent dans ledit échantillon, notamment à l'aide d'une solution d'EDTA 40 mM - NaOH 200 mM,
- une étape d'hybridation du génome des Eca, et plus particulièrement des séquences d'ADN codant une pectate-lyase (PL) chez ces bactéries, ou des séquences d'ARN correspondantes, ou des séquences d'ADN obtenues par transcription inverse des séquences d'ARN correspondantes, ou de fragments de ces séquences, avec la séquence Y45, ou une séquence dérivée telle que définie ci-dessus, ou une séquence complémentaire de ces dernières, et/ou la séquence Y46, ou une séquence dérivée telle que définie ci-dessus, ou une séquence complémentaire de ces dernières, lesdites séquences étant utilisées en tant que sondes marquées, ou susceptibles d'être reconnues à leur tour par un réactif marqué, notamment de la manière indiquée ci-après,
- une étape de détection des séquences d'ADN ou d'ARN susmentionnées, ou de fragments de ces séquences, susceptibles d'être présents dans ledit échantillon, par révélation des sondes susmentionnées, ces sondes étant hy bridées avec ce ou ces séquences ou fragments de ces séquences, et étant marquées.
Avantageusement, l'étape d'hybridation des séquences selon l'invention utilisées en tant que sondes dans le procédé susmentionné, est réalisée dans un tampon d'hybridation contenant du Denhardt x 10, SSC x 6, SDS 0, 1 % .
Le cas échéant, l'étape d'hybridation susmentionnée est précédée par l'amplification du nombre de copies de fragments de gènes codant des PL chez les bactéries de l'espèce Erwinia carotovora en général, cette amplification génique étant réalisée notamment de la manière indiquée ci-dessus à l'aide d'un couple d'amorces susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec le génome (ou l'ADN dérivant des ARN correspondants) des bactéries de l'espèce Erwinia carotovora et d'amplifier des fragments d'ADN comprenant les séquences correspondantes aux séquences Y45 et Y46 ou leurs séquences complémentaires ou dérivées telles que définies ci-dessus.
S'agissant de l'étape de détection de ce deuxième mode de réalisation préféré du procédé de l'invention, celle-ci est avantageusement réalisée suivant les procédés identiques à ceux décrits ci-dessus, notamment par immobilisation sur un support solide des séquences ou fragments de séquences codant des PL susceptibles d être présents dans ledit ecnaïuiiiυn, ces séquences ou fragments de séquences étant le cas échéant hybrides avec une sonde de capture telle que décrite ci-dessus, elle-même immobilisée sur le support solide, les séquences Y45 et/ou Y46 selon l'invention étant alors utilisées en tant que sondes de détection.
L'invention a également pour objet toute trousse (ou kit) de détection et identification des Eca, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence nucléotidique Y45 et/ou de la séquence nucléotidique Y46, représentées respectivement par les séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 2 suivantes: - SEQ ID NO 1 :
TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT
- SEQ ID NO 2:
TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT ou toute séquence dérivée par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucleotides des séquences Y45 et Y46 susmentionnées, dans la mesure où ces séquences dérivées, tout comme les séquences Y45 et Y46, sont capables de s'hybrider spécifiquement avec le génome des bactéries de la sous- espèce Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), notamment dans les conditions d'hybridation suivantes: température de 65 °C dans un tampon comprenant Tris-HCl 10 mM pH 9, KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM, Triton XlOO
0,1 %, BSA 0,2 mg/ml, ou encore toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées.
L'invention vise plus particulièrement toute trousse telle que décrite ci- dessus, dans laquelle les séquences Y45 et Y46 ou leurs séquences dérivées ou complémentaires, se présentent sous forme de couples d'amorces pour l'amplification génique.
Des trousses telles que décrites ci-dessus, et particulièrement avantageuses dans le cadre de la présente invention, comprennent: - un couple d'amorces tel que décrit ci-dessus,
- un support solide, sur lequel est immobilisée une sonde de capture telle que définie ci-dessus, notamment dans les puits d'une microplaque, par adsoφtion passive, ou par liaison covalente au polystyrène (ou autre matériau) des puits de la microplaque, ou encore par liaison covalente par exemple au polystyrène d'une bille magnétique,
- une (ou plusieurs) sonde(s) de détection telle(s) que définie(s) ci-dessus, lesdites sondes étant marquées, notamment par une molécule enzymatique (telle que la péroxydase ou la phosphatase alcaline), ou par une molécule fluorescente telle qu'un fluorochrome,
- ei/ou les léacûfs nécessaires à i'anipiuieaiiυn génique, nυiaiiuneni par PCR, tels que les différents désoxynucléotides triphosphate, la Taq-polymérase,
- et/ou les réactifs nécessaires à l'hybridation des fragments amplifiés avec la sonde de capture et la sonde de détection, avantageusement un tampon d'hybridation comprenant Denhardt x 10, SSC x 6, SDS 0, 1 % , et une solution de rinçage du support solide, avantageusement une solution contenant du Tris 10 mM, NaCl 300 mM et Tween 20 à 0, 1 % , pH 7,4,
- et/ ou les réactifs nécessaires à la "décontamination" du mélange réactionnel avant amplification (Uracile DNA glycosylase et dUTP), - et/ou un témoin positif, tel qu'un ADN génomique correspondant à un gène ou fragment de gène codant une ou des PL chez les Eca, avec lequel les séquences nucléotidiques de l'invention sont susceptibles de s'hybrider, ledit ADN étant le cas échéant inséré dans le génome d'un vecteur, ledit témoin positif pouvant également servir de système de quantification et/ou de témoin d' inhibition,
- et/ ou un ensemble de réactifs pour l'extraction des acides nucléiques de l'échantillon, notamment du SDS à 1 % en tampon Tris EDTA, pH 8.0 additionné de 10 μg/ml de protéinase K,
- et/ou un témoin d'extraction des acides nucléiques, par exemple des bactéries cibles telles que la souche 1526 d'Eca,
- et/ou un témoin de quantification, tel qu'une gamme étalon de cellules de la souche 1526 d 'Eca,
- et/ou un milieu de culture plus ou moins sélectif desdites bactéries. L'invention a également pour objet toute méthode de diagnostic des infections latentes chez les plantes et semences infectées par les Eca, permettant ainsi de faire le diagnostic précoce de pathologies causées par les Eca chez les plantes et les semences, notamment de la jambe noire chez la pomme de terre, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'un procédé de détection et d'identification spécifique des Eca tel que décrit ci-dessus selon l'invention.
Le résultat de la méthode de diagnostic susmentionnée permet d'évaluer le risque que présente un hôte susceptible d'être porteur d'Eca, de développer et le cas échéant, de transmettre, ou non, une pathologie causée par ces bactéries, et plus particulièrement la jambe noire.
Par Eca, détectées dans le cadre des méthodes de diagnostic et de détection susmentionnées, il faut entendre à la fois les souches naturelles de ces bactéries, ainsi que les souches modifiées, notamment par voie du génie génétique.
L invention concerne également i 'application des procédés susmentionnés, à la détection de tout organisme (notamment micro-organismes, plantes etc.) génétiquement modifié par insertion d'un gène codant une ou des PL chez les
Eca, dans le génome de tels organismes. Le polymoφhisme des séquences nucléotidiques spécifiques des Eca pathogènes, ou des fragments de ces séquences, peut être représentatif de différents groupes au sein de ces erwinias, tels que des écotypes, pathotypes (ou pathovars) ou biotypes des Eca, le polymoφhisme étant notamment mis en évidence soit par l'action d'enzymes de restriction, par des électrophorèses en gradient de température ou d'agent(s) dénaturant(s), ou après hybridation avec un fragment d'ARN par action de l'ARNase A, ou par toute autre méthode visant à mettre en évidence le polymoφhisme des acides nucléiques en phase solide ou liquide, en particulier par hybridation avec des sondes telles que décrites ci-dessus, ou par séquençage du (des) fragment(s) amplifié(s) selon les procédés décrits ci-dessus.
L'invention vise également l'utilisation de toute trousse telle que décrite ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection et d'identification des Eca susmentionné, ou d'une méthode de diagnostic citée ci-dessus.
L'invention a également pour objet les séquences nucléotidiques représentées par les enchaînements de nucleotides suivants:
- SEQ ID NO 1 : TCACCGGACG C CGAACTGTGG CGT
- SEQ ID NO 2:
TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT - SEQ ID NO 3:
TGTCGCTGGCGGAAAAAGTGGGCGATAACAT
- SEQ ID NO 4:
ACCAACAGACAG - SEQ ID NO 5:
GAC C AAC AGACAGT
- SEQ ID NO 6:
AGACCAACAGACAGTA - SEQ ID NO 7:
GAGAC CAACAGACAGTAT
- SEQ ID NO 8:
GGCCGAGCCCAACAGACAATATGC
- SEQ ID NO 9: GGCCGAGACCAACAGACAGTATGC
- i£Λ^ LU 1NÛ 10.
GATGTCGATACCATCGAGCCTTA ou toute séquence dérivée par substitution et/ ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucleotides des séquences susmentionnées, dans la mesure où ces séquences dérivées, tout comme les séquences susmentionnées, sont capables de s'hybrider spécifiquement avec le génome des bactéries de la sous-espèce Erwinia carotovora atroseptica (Eca), notamment dans les conditions d'hybridation indiquées ci-dessus, ou encore toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées. L'invention concerne également l'utilisation des séquences nucléotidiques définies ci-dessus pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection, le cas échéant dans un but de diagnostic, chez un hôte ou dans un milieu tels que définis ci-dessus, de tout micro-organisme ou toute cellule, dans les génomes desquels les séquences nucléotidiques selon l'invention, ont été introduites de façon transitoire ou définitive. Un tel procédé est avantageusement réalisé suivant l'une des méthodes décrites ci-dessus.
A ce titre, l'invention a également pour objet l'utilisation des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, en tant que marqueurs de cellules ou micro¬ organismes génétiquement modifiés par introduction ou non dans leur génome de ces séquences nucléotidiques, ou d'hôtes cellulaires infectés (ou transformés) par de tels micro-organismes, notamment pour le suivi de l'évolution de ces cellules, micro-organismes et hôtes cellulaires dans un environnement déterminé.
L'invention concerne notamment les cellules de plantes (par exemple les protoplastes) transformées par un vecteur choisi parmi ceux dérivés des plasmides Ti et Ri d'Agrobacterium tumefaciens et d'Agrobacterium rhizogenes respectivement, ces plasmides contenant en l'un de leurs sites non essentiels pour leur réplication et la transformation des cellules végétales, une séquence nucléotidique selon l'invention, dans une position permettant son transfert à l'hôte.
L'invention vise également les plantes régénérées à partir de ces cellules transformées. L' invention concerne également les cellules animales transformées par un vecteur dérivé, par exemple, des rétrovirus et contenant une ou plusieurs séquence(s) nucléotidique(s) de l'invention.
L'invention concerne également tout procédé d'obtention des séquences nucléotidiques susmentionnées, La préparation de ces séquences nucléotidiques peut être effectuée soit par un procédé chimique, soit par d'autres procédés, comme l' amplification par LCR ou PCR ou toute autre méthode d'amplification génique.
Un mode de préparation approprié de ces séquences nucléotidiques (comportant au plus environ 200 nucleotides, ou paires de bases lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) de l' invention par voie chimique (dans l'état actuel des techniques dans ce domaine) comprend les étapes suivantes:
- la synthèse d'ADN en utilisant par exemple la méthode automatisée au β- cyanéthyl phosphoramidite décrite dans Bioorganic Chemistry 4; 274-325, 1986,
- le clonage des ADN ainsi obtenus dans un vecteur approprié (plasmide, phage ou cosmide) et la récupération des ADN par hybridation avec une sonde appropriée immobilisée sur un support solide, ou par électrophorèse, ou par chromatographie, généralement après restriction.
Un mode de préparation, par voie chimique, d'acides nucléiques de longueur supérieure à environ 200 nucleotides - ou paires de bases (lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) comprend les étapes suivantes:
- l'assemblage, par exemple par aboutage (ou ligation, ou ligature, par action d'une ligase), d'oligonucléotides synthétisés chimiquement, pourvus à leurs extrémités de sites de restriction différents, selon par exemple le principe décrit dans Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80,; 7461-7465, 1983, - le clonage des ADN ainsi obtenus dans un vecteur approprié (plasmide, phage ou cosmide), et la récupération des ADN par hybridation avec une sonde appropriée, ou par électrophorèse, ou par chromatographie, généralement après restriction.
La préparation des acides nucléiques de l'invention peut également être réalisée par voie biologique, notamment après clonage d'hôtes cellulaires dont le génome est susceptible de contenir ces séquences nucléotidiques, le cas échéant, après transformation du génome de ces hôtes à l'aide de vecteurs appropriés contenant ces séquences nucléotidiques. A ce titre, la présente invention a pour objet tout vecteur, notamment plasmidique, contenant en l'un de ses sites non essentiels pour sa réplication, une séquence nucléotidique selon l'invention.
L' invention a également pour objet tout hôte cellulaire transformé par un vecteur selon l'invention, et dans lequel ledit vecteur, ou la séquence nucléotidique selon l'invention, intégrée dans le génome de l'hôte, est susceptible de se répliquer.
Ainsi la présente invention vise un procédé d'obtention des séquences nucléotidiques susmentionnées, réalisé par: - mise en culture d'un hôte cellulaire tel que décrit ci-dessus, transformé
- récupération des vecteurs à partir de cet hôte cellulaire, notamment par un traitement de lyse cellulaire approprié,
- récupération des séquences nucléotidiques de l'invention par traitement des vecteurs susmentionnés à l'aide d'enzymes de restriction appropriés,
- purification des séquences nucléotidiques ainsi obtenues, notamment par électrophorèse sur gel, ou capillaire, ou par chromatographie.
Un autre procédé particulièrement avantageux d'obtention des séquences nucléotidiques selon l'invention, comprend les étapes suivantes: - mise en présence de vecteurs contenant les séquences nucléotidiques susmentionnées, avec des couples d'amorces telles que décrites ci-dessus, dans des conditions permettant l'amplification du nombre de copies de ces séquences nucléotidiques, notamment dans les conditions décrites ci-dessus,
- purification des séquences nucléotidiques ainsi obtenues, notamment par électrophorèse sur gel, ou capillaire, ou par chromatographie.
L' invention a également pour objet tout couple d'amorces pour l'amplification génique, caractérisé en ce que l'une des amorces, encore désignée Y45, est représentée par SEQ ID NO 1 , ou par toute séquence dérivée telle que décrite ci-dessus, ou par toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées, tandis que l'autre amorce, encore désignée Y46, est représentée par SEQ ID NO 2, ou par toute séquence dérivée telle que décrite ci-dessus, ou par toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées.
L'invention vise également les séquences nucléotidiques décrites ci-dessus, marquées, notamment de manière radioactive, enzymatique, par un composé fluorescent, par liaison à une molécule antigenique (susceptible d'être reconnue par des anticoφs) ou à toute autre molécule susceptible d'être directement ou indirectement détectée à l'aide de réactifs, cette liaison pouvant être effectuée par l'intermédiaire d'un bras espaceur, notamment par l' intermédiaire d'une séquence nucléotidique constituée d'environ 5 à 100 nucleotides située aux extrémités 3' et/ou 5' de ces séquences, sous réserve que lorsque les séquences Y45 et Y46 sont utilisées en tant qu'amorces pour l'amplification génique, seule leur extrémité 5' peut alors être modifiée. A titre d'illustration, les séquences nucléotidiques décrites ci-dessus peuvent être marquées par un élément radioactif (par exemple ^P, 33p 35s 3H, 125i) ou par une molécule non radioactive notamment biotine, acétylamino- fluorène, fluorochrome, digoxigénine, ou une molécule enzymatique, ou un haptène selon l'un des procédés décrits dans les publications suivantes: G. Gebeyehu et al : "Novel biotinylated nucleotide - analogs for labelling and cυioπmeiπc deieciiυn υf DNA" Nucleic Acids Researcii (19S7), 15. 4J 13-4534; C. Levenson and Chu-an Chang: "Non isotopically labeled probes and primers '. In "PCR protocols: A guide to methods and applications". Académie Press, Inc. (1990), 99-112; L.M. Smith et al : "The synthesis of oligonucléotides containing an aliphatic amino group at the 5' terminus: synthesis of fluorescent
DNA primers for use in DNA séquence analysis". Nucleic Acids Research (1985), 13: 2399-2412; E. Jablonski ét al : Préparation of oligodeoxynucleotide - alkaline phosphatase conjugates and their use as hybridization probes" . Nucleic Acids Research (1986), 14: 6115-6128; D. Thierry et al : "The détection of Mycobacterium tuberculosis in uncultured clinical spécimens using the polymerase chain reaction and a non-radioactive DNA probe" . Molecular and cellular probes (1992), 6: 181-191 ; N. Costa Taveira et al : "Détection of HIV1 proviral DNA by PCR and hybridization with digoxygenin labelled probes" . Molecular and cellular probes (1992), 6: 265-270. La présente invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de l'amplification spécifique de fragments du génome des différentes souches d'Eca à l'aide des amorces Y45 et Y46 pour les Eca, et de la mise en oeuvre d'un procédé de détection spécifique des Eca selon l'invention.
I Amplification spécifique de fragments du génome des Eca à l'aide des amorces Y45 et Y46.
En utilisant le gène pel 153 d'Erwinia carotovora (numéro d'accession J03673 dans GenBank) et le gène pel B d'Erwinia carotovora subsp. carotovora
(numéro d'accession X16397 dans GenBank), les inventeurs ont sélectionné des couples d'amorces capables de s'hybrider avec des régions encadrant les régions avec lesquelles s'hybrident les amorces Yl et Y2 dans les gènes pel susmentionnés .
Les fragments du gène pel contenant la région Yl , et d'autres contenant la région Y2, ont été amplifiés chez plusieurs souches d'Erwinia carotovora à l'aide des amorces susmentionnées puis séquences et alignés afin de détecter d'éventuelles régions de ces amorces qui seraient caractéristiques d'une sous- espèce d'Erwinia carotovora.
Plusieurs couples d'amorces susceptibles d'être spécifiques des Eca ont ainsi été identifiés.
Afin d'établir la spécificité de ces nouvelles amorces et la meilleure i-υiiiuiiωuuii ut aCtjut-ùCtcî V ia u VIS «αCS
Figure imgf000023_0001
CCâ liGliVCuCG ûîTiûi'CCj, άϋ'oi uαC les amorces Yl et Y2, ont été testées en combinaison. Les combinaisons effectuées sont les suivantes:
. région Yl:
1. Yl: 5'-TTACCGGACGCCGAGCTGTGGCGT-3' (SEQ ID NO 14)
2. Y45: 5'-TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT-3' (SEQ ID NO 1)
. région Y2:
1. Y2: 5'-CAGGAAGATGTCGTTATCGCGAGT-3' (SEQ ID NO 15)
2. Y44: 5'-CCAACGTTCAGCAGAACAAGTTCA-3' (SEQ ID NO 11)
3. Y46: 5'-TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT-3' (SEQ ID NO 2)
4. Y50: 5'-AGAACAAGTTCATTATCGCGAGTC-3' (SEQ ID NO 12)
5. Y52: 5'-GTTTCGCCAACGTTCAGCAGAACA-3' (SEQ ID NO 13)
Les résultats d'amplification, sur un ensemble de souches représentatives (à savoir les souches d'Eca CIP 125, CH3 et 1526, la souche d'Ecb 2122, les souches d'Ecc 2046, 88.29al , SCRI 193, SG39.1, 1336, IH et 40H, les souches d'Eco CHU, 2154 et 1880, et les souches d'Ecw 3304 et 3308 indiquées dans le tableau III), sont résumés dans le tableau I suivant:
Tableau I
Figure imgf000023_0002
(Ec+ : révélation de 4 sous-espèces d'Erwinia carotovora, Eca+ : amplification spécifique des souches d'Erwinia carotovora subsp. atroseptica).
Sur les 10 couples d'amorces testés, les couples Y45-Y44 et Y45-Y46 donnent les meilleurs niveaux d'amplification à partir d' I pg d'ADN cible Eca (détection sur gel d'agarose coloré au bromure d'éthidium ou sur microplaque de titrage).
Les valeurs obtenues sur microplaque à partir de 2 Eca: CIP 125 (groupe RFLP 1) et CH3 (groupe KFLP l) sont regroupées dans le taDieau i DIS suivant:
Tableau I bis
Figure imgf000024_0001
La présence de 2 "mismatches" contigus (nucleotides présents chez Eca uniquement) à l'extrémité 3' de Y46, contribue vraisemblablement à une meilleure spécificité du couple Y45-Y46, qui représente donc le couple d'amorces préféré.
L'ensemble de la collection de souches d'Erwinia carotovora ainsi que d'autres ADN (cf. tableau III) a été testé sur plaques de microtitration, à partir d' I ng d'ADN cible, amplifié par le couple d'amorces Y45-Y46 par PCR à 65 °C (pour la température d'hybridation des amorces). Les résultats obtenus en utilisant la technique décrite dans le paragraphe II ci-après, sont résumés dans le tableau II qui suit. Tableau II
Figure imgf000025_0001
En conclusion, seules les souches d'Eca sont détectées par le système susmentionné, et ceci quelque soit le serogroupe d'Eca.
Tableau III
Souches hôtes pays groupes RFLP année
Eca
88.33 pomme France, 1 de terre 19881
88.45 France, 1 19881 88.1 France, 2 19881
Figure imgf000026_0001
88.30a " France, 19881
87.7 France,
19871
87.13 France,
19871
87.16a " France, 19871
87.16b France, 19871
86.14.11 France, 19861
86.20 France,
19861
511 France,
19642
SF1.1 Allemagne3
161 Hollande4
Cipl l4 Pérou, 19805
Cipl25 Pérou, 19805
Cipl31 Pérou, 19805
Cip026 Pérou, 2 19805
SH164.4 " La Réunion, 1 19883
CH3 Suisse, 2 19856 Tableau III (suite 1)
CH5 Suisse, 1 19856
CH6 Suisse, 1 19856
SF18.296 Suisse, 1 19583
1329 UK, 19672 1
1330 UK, 19672 1
SCRI1043 UK, 19857 1
1526T UK, 19572 1
1527 USA, 19732 1
1525 USA, 19692 1
1453 tomate France, 2 19732
1546 France, 2 19732
1064 pomme Hollande 1 de terre 19914
PD1399 2
19899
PD1442 1
19899
PD1444 2
19899
PD1716 2
19909
Ecb
2121 betterave USA, 19722 2122T USA, 19712
1520 tournesol Mexique2
NCPPB 2792 betterave USA, 19746 à sucre
NCPPB 2793 betterave USA, à sucre 19741°
SF 142.2 artichaut La Réunion, 19863
Ecc
89.19 pomme Argentine 8 de terre 19891
IH eau Espagne, 8 1989**
40H Espagne, 8 19898
SH230.134 banane Cuba3 19 Tableau III (suite 2)
CM1 choux Malawi, 17 19863
798 carotte USA2 9 (ATCC 495)
CH15 céleri Suisse, 9 19886
1489 chrys¬ France, 4 anthème 19712
1458 USA, 19712 8
SH230.115 maïs Cuba3 19
1350 con¬ Italie2 8 combre
1285 cyclamen Grèce2 6
SE99.1 endive France, 8
19851
1488 iris France, 9 19732
SB89.7 poireau France, 9 19823
2046τ pomme Danemark 12 de 19522 terre
88.22c France, 9 19881
88.29al France, 6 19881
88.44 France, 4 19881
87.25 France, 10 19871
86.14.51 France, 9 19861
S99 France, 18 19771
S101 France, 4
19771
PM2 Malawi, 15 19863
194 Maroc, 11 19632
Cip360 Pérou, 13 19845
Cip361 Pérou, 13 19845 Tableau III (suite 3)
CH26 Suisse, 4 19856 SCRI193 USA7 14
139 Hollande4 4 1336 UK, 19672 11
S.82.1 Vietnam, 8 19893
SG162.6 tournesol France, 8 19873
1403 Yougo¬ 16 slavie, 19692
797 tabac USA, 19512 13
SG39.1 7 La Réunion, 20 19873
La Réunion, 8
SG39.3 ? 19873
Eco
1893 céleri France, 3 19762
CHU Suisse, 7 19856
2155 endive France, 5 19832
2154 France, 4 19822
1892 France, 6 19812
1959 France, 4 19802
1878 France, 4 19792
1879 France, 5 19792
1880 France, 3 19792
1646.2 poireau France, 3 19803
1654 France, 3 19803
CH4 laitue Suisse, 4 19866 Tableau III (suite 4)
Ecw
3304 Japon2 21
3308 Japon2 21
3306 Japon2 21
Divers ADN testés
Botrytis cinerea, France
(BR 94)
Tomate var. France castone
Piment var. France yolowonder
Clavibacter Hollande9 michiganensis pv. sepedonicus
(PD 323)
Souche eau Hollande4 pectinolytique 1990
(S 64) Souche Hollande4 pectinolytique 1987
(S IO)
Pseudomonas blé Hollande4 aerofaciens rhizosphère 1991
(S 109) Pseudomonas blé Hollande4 putida rhizosphère 1991
(S 71)
Erwinia cacticida
(CFBP 3218)
Yersinia pathogène pseudotuberculosis humain
(ATCC 29833) Tableau III (suite 5)
Pseudomonas marginalis pv. marginalis (CFBP 2037)
Pseudomonas marginalis pv. alfalfae (CFBP 2039)
Xanthomonas France campestris pv. campestris (NCPPB 528)
Xanthomonas France campestris pv. malvacearum (NCPPB 633)
Xanthomonas France campestris pv. manihotis (LMG 777)
bactérie saprophyte pomme Hollande4,
(S 128) de terre 1987
Bacillus subtilis France (GM 168) bactérie saprophyte pomme Espagne*
(67F et IF) de terre
Erwinia salicis France (CFBP 802)
Phoma medicaginis var. pinodella
Septoria tritici
Fusarium solani Tableau III (suite 6)
Rhizoctonia solani
Azorhizobium Sesbania caulinodens rostrata
(OR 571)
Pseudomonas fluorescens
Solanum France tuberosum subsp. tuberosum (var. Bintje)
(T) Souche type de l 'espèce. (1) Bernard Jouan, Institut National de la Recherche Agronomique, Rennes, France, collection personnelle. (2) CFBP, Collection Française de Bactéries Phytopathogènes, INRA, Angers, France. (3) Régine Samson, Institut National de la Recherche Agronomique, Angers, France. (4) IPO, Research Institute for Plant Protection, Wageningen, Pays Bas. (5) CIP, International Potato Center, Lima, Pérou. (6) Olivier Cazelles, Station Fédérale de Recherches Agronomiques, Changins, Suisse, collection personnelle. (7) SCRI, Scottish Crop Research Institute, UK. (8) Maria Lopez, Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, Espagne, collection personnelle, (9) Jaap Janse, Plant Protection Service, Wageningen, Hollande, collection personnelle, (1°) Alan Collmer, Cornell University, USA, collection personnelle.
Le procédé utilisé pour la détermination des groupes RFLP (1 à 21) décrits ci-dessus, notamment les amorces ainsi que les enzymes de restriction utilisés, sont décrits dans l'article de Darrasse et al, Applied and Environmental Microbiology, vol. 60, No 5, 1437-1443 (1994).
II Exemple de mise en oeuyre d'un procédé de détection spécifique des Eca-
La détection des séquences nucléiques cibles est réalisée de la façon suivante.
Une partie aliquote αe la solution α ampliπcauon est preievee, dénaturée par l'addition d'un volume égal d'une solution de EDTA 40 mM - NaOH 200 mM, puis hybridée dans un puits de la microplaque selon le protocole suivant:
- La microplaque contenant la sonde capture est sensibilisée par une préhybridation à l'aide d'une solution contenant Denhardt x 10, SSC x 6, SDS
0, 1 % . du
- La préhybridation s'effectue en ajoutant 200 μl de cette solution par puits à 37 °C pendant 30 min sous agitation. La plaque est ensuite vidée de son contenu. - L'hybridation est réalisée dans la microplaque de titrage, préalablement sensibilisée, en ajoutant dans chaque puits 200 μl de la solution Denhardt x 10, SSC x 6, SDS 0, 1 % , 10 ng de la sonde de détection marquée directement à la péroxydase et 10 à 20 μl de la solution contenant les fragments amplifiés dénaturés, soit généralement le 1/10 de la solution d'amplification initiale. La réaction d'hybridation est effectuée sous agitation modérée à 37 °C pendant 1 heure. Au cours de cette période, la séquence nucléique cible s 'hybride simultanément à la sonde de capture et à la sonde de détection (marquée par une péroxydase).
- Le produit ternaire obtenu (hybridation simultanée des sondes de capture et de détection sur le fragment amplifié) est séparé de l'excès de sonde de détection contenu dans le tampon d'hybridation par 6 lavages successifs rapides, à l'aide d'une solution contenant Tris 10 mM; NaCl 300 mM; Tween 20 à 0, 1 % , pH 7,4. La plaque est ensuite vidée de la dernière solution de lavage.
- La réaction de détection est obtenue par l'addition dans chaque puits de la microplaque de 200 μl d'une solution de tampon composée de 4 ml de citrate trisodique 0,04M; acide citrique 0,01M; H2O2 30% , pH 5,6 + 1 comprimé de Orthophénylènediamine (OPD) dosé à 30 mg par comprimé. 200 μl de cette solution sont distribués dans chaque puits, puis la microplaque est placée à l'obscurité pendant 30 min à 37°C.
- La réaction enzymatique est ensuite arrêtée en ajoutant 50 μl d'une solution de H2SO4 4 N.
La réaction colorimétrique obtenue par l'activité de la péroxydase sur le substrat OPD est déterminée par mesure de la densité optique en absorbance à 492 nm avec référence à 620 nm.
Les étapes d'hybridation et de lavage utilisent un appareillage adapté.
BIBLIOGRAPHIE
- Darrasse et al , 1994. Applied Environmental Microbiology, 60(5) : 1437-1443
- Egholm ét al , 1992, J. Am. Chem. Soc, 114 : 1895
- Favey et al , 1992, Journal of General Microbiology, 138: 499-508
- Gallois, A. , and Samson, R. 1992. International Journal of Systematic
Bacteriology. 42 : 582-588.
- Hinton et al , 1989, Molecular Microbiology, 3: 1785-1795
- Ito et al , 1988, Agricultural Biological Chemistry. , 52: 479-487
- Lei et al , 1987, Journal of Bacteriology, 169: 4379-4383
- Lei et al, 1988, Gène, 62: 159-164
- Manulis, 1988, Journal of Bacteriology, 170: 1825-1830
- Marti et al, 1989. Proc. 7th Int. Conf. Plant Path. Budapest. In Plant Pathogenic Bacteria, Z. Klement (éd.), 755-760
- Pérombelon, M. CM. 1989. In. Proc. 7th Int. Conf. Plant Path. Bact. , Budapest, Hungary, Eds: Z. Klement (éd.), 745-751
- Pérombelon, M. CM. , and Kelman, A. 1987. Plant diseases. 71 : 283-285. - Pérombelon, M. CM. 1980. Annual Review of Phytopathology. 18 : 361-387
- Schoedel and Collmer, 1986, Journal of Bacteriology, 167: 117-123
- Smith, C, and Bartz, J.A. 1990. Plant disease. 74 : 505-509.
- Stanghellini, M.E. 1982, and Meneley, J.C. 1975. Phytopathology. 65 : 86- 87.
- lamaki, b.J . , «JOIÛ, b. , Kooeson, M., ivianuns, ύ. , anu Keen, IN .Ï. ι.9δ8. Journal of Bacteriology., 170 : 3468-3478.
- Thomson, S.V., Hildebrand, D.C, and Schroth, M.N. 1981. Phytopathology. 71 : 1037-1042.
- TroUinger et al, 1989, Molecular Plant Microbe Interactions, 2: 17-25
- Van Gijsegem, 1989, Molecular Microbiology, 3: 1415-1424.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATION GENERALE:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE
(INRA)
(B) RUE: 147 RUE DE L'UNIVERSITE
(C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75338 CEDEX 07
(A) NOM: INSTITUT NATIONAL AGRONOMIQUE PARIS-GRIGNON
(INA-PG) mi PTTF- i f, RTTR I-T.ATTDR RF.RNAPΓ> (C) VILLE: PARIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 75231 CEDEX 05
(A) NOM: SANOFI DIAGNOSTICS PASTEUR
(B) RUE: 3 BOULEVARD RAYMOND POINCARE
(C) VILLE: MARNES-LA-COQUETTE
(E) PAYS : FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92430
(ii) TITRE DE L1 INVENTION: SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES POUR LA DETECTION DES ERWINIA CAROTOVORA SUBSP. ATROSEPTICA
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 17
(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: TCACCGGACG CCGAACTGTG GCGT 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2: TCGCCAACGT TCAGCAGAAC AAGT 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: TGTCGCTGGC GGAAAAAGTG GGCGATAACA T 31
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 12 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: ACCAACAGAC AG 12
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 14 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: GACCAACAGA CAGT 14 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6 :
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6: AGACCAACAG ACAGTA 16
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 18 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7: GAGACCAACA GACAGTAT 18
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: GGCCGAGCCC AACAGACAAT ATGC 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: GGCCGAGACC AACAGACAGT ATGC 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 23 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION, linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10- GATGTCGATA CCATCGAGCC TTA 23
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE. ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11: CCAACGTTCA GCAGAACAAG TTCA 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(il) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12: AGAACAAGTT CATTATCGCG AGTC 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:
(l) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13: GTTTCGCCAA CGTTCAGCAG AACA 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique)
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:
TTACCGGACG CCGAGCTGTG GCGT 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: CAGGAAGATG TCGTTATCGC GAGT 24
(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 16:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire '
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16: CAGGAAGATC TCGTTATCGC GAGT 24 (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 17:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 24 paires de bases
(B) TYPE: acide nucléique
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17: CAGGAAGATT TCGTTATCGC GAGT 24

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation de la séquence nucléotidique Y45 et/ou de la séquence nucléotidique Y46, représentées respectivement par les séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 2 suivantes:
- SEQ ID NO 1 :
TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT
- SEQ ID NO 2:
TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT ou de toute séquence dérivée par substitution et/ou addition et/ou suppression d un ou plusieurs nucleotides des séquences V4D et ï4t> susmentionnées, dans la mesure où ces séquences dérivées, tout comme les séquences Y45 et Y46, sont capables de s'hybrider spécifiquement avec le génome des bactéries de la sous- espèce Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), notamment dans les conditions d'hybridation suivantes: température de 65 °C dans un tampon comprenant Tris-HCl 10 mM pH 9, KC1 50 mM, MgCl2 1 ,5 mM, Triton XlOO 0, 1 % , BSA 0,2 mg/ml, ou encore de toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées, pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection et/ou d'identification spécifique des Eca, dans un échantillon déterminé, et plus particulièrement dans le sol ou l'eau, ou chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries, notamment chez les plantes et les semences, et, le cas échéant, pour la mise en oeuvre d'une méthode de diagnostic précoce des pathologies susceptibles d'être causées par lesdites Eca chez l'hôte susmentionné.
2. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la séquence Y45, ou une séquence dérivée telle que définie dans la revendication 1 , ou leur séquence complémentaire, et la séquence Y46, ou une séquence dérivée telle que définie dans la revendication 1 , ou leur séquence complémentaire, forment un couple d'amorces pour l'amplification génique de copies de fragments de gènes codant des pectate-lyases (PL) chez les Eca.
3. Procédé de détection et/ou d'identification spécifique de bactéries de la sous-espèce Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), dans un échantillon déterminé, et plus particulièrement dans le sol ou l'eau, ou chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries, notamment chez les plantes et les semences, caractérisé en ce qu'il comprend: - le cas échéant, l'amplification, par toute méthode d'amplification génique appropriée, du nombre de copies de fragments de séquences d'ADN ou d'ARN spécifiques de ladite sous-espèce et susceptibles d'être présentes dans l'échantillon, ou encore de séquences d'ADN résultant d'une transcription inverse à partir des séquences d'ARN susmentionnées, cette amplification étant effectuée à l'aide d'un couple d'amorces constitué de la séquence Y45, ou d'une séquence dérivée telle que définie dans la revendication 1 , ou d'une séquence complémentaire de ces dernières, et de la séquence Y46, ou d'une séquence dérivée telle que définie dans la revendication 1 , ou d'une séquence complémentaire de ces dernières,
- ia détection : soit des fragments de séquences d'ADN ou d'ARN susmentionnés, dont le nombre de copies a été amplifié lors de l'étape d'amplification ci-dessus, cette détection étant effectuée en mettant en jeu une hybridation moléculaire entre lesdits fragments amplifiés et toute sonde nucléotidique susceptible de s'hybrider avec lesdits fragments amplifiés, dont notamment les séquences représentées par SEQ ID NO 1 à SEQ ID NO 10 avantageusement marquées, soit des séquences d'ADN ou d'ARN susmentionnées spécifiques de ladite sous-espèce, ou encore de séquences d'ADN résultant d'une transcription inverse à partir des séquences d'ARN susmentionnées, cette détection étant effectuée en mettant en jeu une hybridation moléculaire entre lesdites séquences d'ADN ou d'ARN et les séquences Y45 ou Y46, ou leurs séquences dérivées, ou les séquences complémentaires susmentionnées, ces séquences étant utilisées en tant que sondes avantageusement marquées, ce qui permet de déterminer la présence ou l'absence d'Eca dans l'échantillon en fonction de l'hybridation ou non des fragments et séquences d'ADN ou d'ARN susmentionnés avec les sondes citées ci-dessus.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il comprend, préalablement à l'étape de détection et, le cas échéant, celle d'amplification, une étape de traitement de l'échantillon prélevé dans l'eau, le sol ou chez un hôte, notamment chez les plantes et les semences, de manière à rendre le génome des Eca, éventuellement présentes dans ledit échantillon, accessible aux séquences Y45 et Y46, ou à leurs séquences dérivées, ou aux séquences complémentaires des séquences susmentionnées.
5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que l'étape d'amplification est réalisée à l'aide d'un couple d'amorces tel que défini dans la revendication 2, par toute méthode d'amplification génique appropriée, du nombre de copies de fragments d'au moins une séquence d'ADN ou ARN codant une pectate-lyase (PL) chez les Eca, susceptibles d'être présentes dans ledit échantillon, ou d'au moins une séquence d'ADN obtenue par transcription inverse de la séquence d'ARN susmentionnée, cette amplification étant elle- même suivie par l'étape de détection des copies de fragments de séquences d'ADN ou ARN ainsi amplifiés, ladite détection étant réalisée par révélation des amorces utilisées susmentionnées lorsque ces dernières sont marquées, après élimination des amorces non utilisées lors de l'amplification, ou a l aide d'une (ou plusieurs) sonde(s) nucléotidique(s), dont l'une au moins est marquée, susceptible(s) de s'hybrider avec lesdits fragments d'ADN ou ARN ainsi amplifiés, ou encore par détection directe des fragments amplifiés dans le cas où l'étape d'élongation de la réaction d'amplification est réalisée à l'aide d'un ou plusieurs désoxynucléotides marqués.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'amplification du nombre de copies de fragments d'une séquence d'ADN codant une PL chez les Eca, comprend les étapes suivantes:
* dénaturation de l'ADN double brin en ADN mono-brin par chauffage pendant environ 30 secondes à une température d'environ 80 °C à environ 100°C, avantageusement à 94°C, notamment dans un tampon constitué de Tris- HC1 10 mM pH 9, KC1 50 mM, MgCl2 1,5 mM, Triton XlOO 0,1 %, BSA 0,2 mg/ml, en présence de co-facteurs de l'ADN-polymérase, notamment d'ions
Mg2 + et K+ , de désoxynucléotides choisis parmi dCTP, dATP, dGTP, dTTP, des amorces Y45 et Y46, d'une ADN polymerase thermorésistante par exemple, et le cas échéant les réactifs nécessaires à la "décontamination" du mélange réactionnel avant amplification, notamment l'Uracile DNA glycosylase et le dUTP selon le procédé décrit dans le brevet US n° 5,035,996 de Life
Technologies Inc.,
* hybridation des couples d'amorces avec les gènes codant des PL, ou des fragments de ces gènes, susceptibles d'être présents dans l'échantillon étudié, par chauffage à une température d'environ 60°C à environ 76°C, avantageusement d'environ 65 °C à environ 70°C, pendant environ 30 secondes,
* élongation des amorces, hy bridées à l'étape précédente, par chauffage à une température d'environ 50°C à environ 76°C, avantageusement 72°C, pendant environ 45 secondes, produisant ainsi des séquences nucléotidiques complémentaires de fragments de gène(s) codant une ou des PL chez les Eca, ces séquences nucléotidiques complémentaires, encore désignées fragments amplifiés, étant délimitées par les amorces susmentionnées, cette succession d'étapes (dénaturation, hybridation, élongation),
5 constituant un cycle, étant répétée entre environ 20 et environ 50 fois, avantageusement entre 30 et 40 fois, cette répétition de cycles étant avantageusement précédée par une étape initiale de dénaturation de l'ADN susceptible d'être présent dans ledit échantillon, ou obtenu par transcription inverse des ARN correspondants, par chauffage à 94 °C pendant environ 5 i o minutes .
7. Procédé selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que l'étape de détection des fragments amplifiés de gènes codant des PL obtenus lors de l 'étape d'amplification, est réalisée de la manière suivante:
15 - dénaturation des fragments amplifiés double brin pour obtenir des fragments amplifiés simple brin, notamment à l'aide d'une solution d'EDTA 40 mM - NaOH 200 mM,
- mise en contact, dans un tampon d'hybridation approprié, notamment dans un tampon constitué de Denhardt x 10, SSC x 6, SDS 0, 1 % 0 avantageusement à 37 °C pendant environ une heure, de la composition issue de l'étape précédente, contenant des fragments amplifiés simple brin, avec d'une part une séquence nucléotidique, encore désignée ci-après sonde de capture, susceptible de s'hybrider avec l'un des brins des fragments amplifiés, ladite sonde de capture étant immobilisée sur un support solide, notamment dans les 5 puits de microplaques de titrage (ou encore "plaques de microtitrage"), et, d'autre part avec une (ou plusieurs) sonde(s) nucléotidique(s) marquée(s), encore désignée(s) sonde(s) de détection, susceptible(s) de s'hybrider avec le même brin des fragments amplifiés que celui avec lequel la sonde de capture susmentionnée est hybridée, mais en une région distincte de celle hybridée avec 0 la sonde de capture, pendant une période de temps suffisante pour permettre l'hybridation des fragments amplifiés éventuellement présents avec d'une part ladite sonde de capture, et d'autre part la (ou les) sonde(s) de détection, pour former un complexe dans lequel les fragments amplifiés sont liés à la sonde de capture et à la (ou aux) sonde(s) de détection, 5 - élimination du tampon d'hybridation de manière à éliminer du support solide, d'une part, toute séquence nucléotidique susceptible d'être présente dans la composition issue de l'étape de dénaturation, ne s'étant pas hybridée avec la sonde de capture, et, d'autre part, toute sonde de détection restée libre dans le tampon d'hybridation après l'étape d'hybridation susmentionnée, et le cas échéant un ou plusieurs rinçages du support solide, notamment à l'aide d'une solution de rinçage contenant du Tris-HCl 10 mM, NaCl 300 mM et Tween 20 0, 1 % , pH 7,4,
- révélation de la présence ou de l'absence de la (ou des) sonde(s) de détection sur le support après élimination du tampon d'hybridation, témoignant respectivement de la présence ou de l'absence de fragments amplifiés dans la composition issue de l'étape d'amplification, et donc respectivement de la présence ou de l'absence d'Eca dans l'échantillon étudié.
8. Procède selon la revendication /, caractérise en ce que la sonde de capture et la (ou les) sonde(s) de détection utilisée(s), sont des séquences nucléotidiques simple brin d'environ 10 à environ 60 nucleotides, avantageusement d'environ 25 à environ 35 nucleotides, correspondant à des séquences nucléotidiques comprises dans un gène codant une PL chez les bactéries du genre Erwinia, notamment chez les Eca, et susceptibles de s'hybrider avec les fragments amplifiés, lesdites sonde de capture et sonde(s) de détection s'hybridant respectivement avec des régions différentes desdits fragments amplifiés, et étant notamment choisies parmi les séquences nucléotidiques suivantes:
- SEQ ID NO 1 :
TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT
- SEQ ID NO 2: TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT
- SEQ ID NO 3:
TGTCGCTGGCGGAAAAAGTGGGCGATAACAT
- SEQ ID NO 4:
ACCAACAGACAG - SEQ ID NO 5:
GACCAACAGACAGT
- SEQ ID NO 6:
AGACCAACAGACAGTA
- SEQ ID NO 7: GAGACCAACAGACAGTAT
- SEQ ID NO 8:
GGCCGAGCCCAACAGACAATATGC - SEQ ID NO 9:
GGCCGAGACCAACAGACAGTATGC
- SEQ ID NO 10:
GATGTCGATACCATCGAGCCTTA ou toute séquence dérivée par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucleotides des séquences susmentionnées, dans la mesure où ces séquences dérivées, tout comme les séquences susmentionnées, sont capables de s'hybrider spécifiquement avec le génome des bactéries de la sous-espèce Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), notamment dans les conditions d'hybridation indiquées dans la revendication 1 , ou encore toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées.
9. Procédé selon l'une des revendications 3 à 8, caractérisé en ce que la sonde de capture et la (ou les) sonde(s) de détection sont choisies parmi l'une des séquences représentées par SEQ ID NO 3 à SEQ ID NO 10, la sonde de capture étant avantageusement celle représentée par SEQ ID NO 3, et la (ou les) sonde(s) de détection étant avantageusement celle(s) représentée(s) par SEQ ID NO 7 ou (et) SEQ ID NO 9 ou (et) SEQ ID NO 10, la sonde de détection étant de préférence celle représentée par SEQ ID NO 9.
10. Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce qu'il comprend:
- une étape d'hybridation du génome des Eca susceptible d'être présentes dans l'échantillon, et plus particulièrement des séquences d'ADN codant une pectate-lyase (PL) chez ces bactéries, ou des séquences d'ARN correspondantes, ou des séquences d'ADN obtenues par transcription inverse des séquences d'ARN correspondantes, ou de fragments de ces séquences, avec la séquence Y45 , ou une séquence dérivée telle que définie dans la revendication 1 , ou une séquence complémentaire de ces dernières, et/ou la séquence Y46, ou une séquence dérivée telle que définie dans la revendication 1 , ou une séquence complémentaire de ces dernières, lesdites séquences étant utilisées en tant que sondes marquées, ou susceptibles d'être reconnues à leur tour par un réactif marqué, ladite hybridation étant notamment effectuée dans un tampon d'hybridation contenant du Denhardt x 10, SSC x 6, SDS 0, 1 % , cette étape d'hybridation étant le cas échéant précédée par l'amplification du nombre de copies de fragments de gènes codant des PL chez les bactéries de l'espèce Erwinia carotovora en général, cette amplification génique étant réalisée notamment de la manière indiquée dans la revendication 6 à l'aide d'un couple d'amorces susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec le génome des bactéries de l'espèce Erwinia carotovora et d'amplifier des fragments d'ADN comprenant les séquences correspondantes aux séquences Y45 et Y46 ou leurs séquences complémentaires ou dérivées telles que définies ci-dessus, - une étape de détection des séquences d'ADN ou ARN susmentionnées, ou de fragments de ces séquences, susceptibles d'être présents dans ledit échantillon, par révélation des sondes susmentionnées, ces sondes étant hybridées avec ces séquences ou fragments de séquences, et étant marquées, ladite détection étant notamment réalisée de la manière indiquée dans la revendication 7, notamment par immobilisation sur un support solide de ces séquences ou tragments de séquences susceptibles d être présents dans ledit échantillon, ces séquences ou fragments de séquence étant le cas échéant hybrides avec une sonde de capture, elle-même immobilisée sur le support solide, les séquences Y45 et/ou Y46 étant alors utilisées en tant que sondes de détection.
11. Trousse (ou kit) de détection et identification des Eca, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence nucléotidique Y45 et/ou de la séquence nucléotidique Y46, représentées respectivement par les séquences SEQ ID NO 1 et SEQ ID NO 2 suivantes:
- SEQ ID NO 1 : TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT
- SEQ ID NO 2:
TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT ou toute séquence dérivée par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucleotides des séquences Y45 et Y46 susmentionnées, dans la mesure où ces séquences dérivées, tout comme les séquences Y45 et Y46, sont capables de s'hybrider spécifiquement avec le génome des Eca, notamment dans les conditions d'hybridation suivantes: température de 65°C dans un tampon comprenant Tris-HCl 10 mM pH 9, KC1 50 mM, MgCl2 1 ,5 mM, Triton XlOO
0,1 % , BSA 0,2 mg/ml, ou encore toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées.
12. Trousse selon la revendication 11 , caractérisée en ce qu'elle comprend:
- un couple d'amorces tel que défini dans la revendication 2,
- un support solide, sur lequel est immobilisée une sonde de capture telle que définie dans la revendication 7, notamment dans les puits d'une microplaque de titrage, par adsorption passive, ou par liaison covalente par exemple au polystyrène des puits de la microplaque, ou encore par liaison covalente par exemple au polystyrène d'une bille magnétique,
- une (ou plusieurs) sonde(s) de détection telle(s) que définie(s) ci-dessus, lesdites sondes étant marquées, notamment par une molécule enzymatique (telle que la péroxydase ou la phosphatase alcaline), ou par une molécule fluorescente telle qu'un fluorochrome,
- et/ou les réactifs nécessaires à l'amplification génique, notamment par PCR, tels que les différents désoxynucléotides triphosphate, la Taq-polymérase, - et/ou les réactifs nécessaires à l'hybridation des fragments amplifiés avec la sonde de capture et la sonde de détection, avantageusement un tampon d'hybridation comprenant du Denhardt x 10, SSC x 6, SDS 0,1 % , et une solution de rinçage du support solide, avantageusement une solution contenant du Tris 10 mM, NaCl 300 mM et Tween 20 à 0, 1 % , pH 7,4, - et/ou les réactifs nécessaires à la "décontamination" du mélange réactionnel avant amplification (Uracile DNA glycosylase et dUTP) selon le procédé décrit dans le brevet US n° 5,035,996 de Life Technologies Inc. ,
- et/ou un témoin positif, tel qu'un ADN génomique correspondant à un gène ou fragment de gène codant des PL chez les Eca, avec lequel les séquences nucléotidiques de l'invention sont susceptibles de s'hybrider, ledit ADN étant le cas échéant inséré dans le génome d'un vecteur, ledit témoin positif pouvant également servir de système de quantification et/ou de témoin d'inhibition.
13. Méthode de diagnostic précoce de pathologies causées par les Eca chez les plantes et les semences, notamment de la jambe noire chez la pomme de terre, ladite méthode étant réalisée par mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 3 à 10.
14. Utilisation d'une trousse selon l'une des revendications 10 à 12, pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'une des revendications 3 à 9, ou d'une méthode de diagnostic selon la revendication 13.
15. Séquences nucléotidiques représentées par les enchaînements de nucleotides suivants: - SEQ ID NO 1:
TCACCGGACGCCGAACTGTGGCGT
- SEQ ID NO 2:
TCGCCAACGTTCAGCAGAACAAGT - SEQ ID NO 3:
TGTCGCTGGCGGAAAAAGTGGGCGATAACAT
- SEQID NO4: ACCAACAGACAG - SEQ ID NO 5:
GACCAACAGACAGT
- SEQ ID NO 6:
AGACCAACAGACAGTA
- SEQ ID NO 7: GAGACCAACAGACAGTAT
- SEQ ID HO 8:
GGCCGAGCCCAACAGACAATATGC
- SEQ ID NO 9:
GGCCGAGACCAACAGACAGTATGC - SEQ ID NO 10:
GATGTCGATACCATCGAGCCTTA ou toute séquence dérivée par substitution et/ou addition et/ou suppression d'un ou plusieurs nucleotides des séquences susmentionnées, dans la mesure où ces séquences dérivées, tout comme les séquences susmentionnées, sont capables de s'hybrider spécifiquement avec le génome des bactéries de la sous-espèce
Erwinia carotovora subsp. atroseptica (Eca), notamment dans les conditions d'hybridation indiquées dans la revendication 1 , ou encore toute séquence complémentaire des séquences susmentionnées.
16. Couple d'amorces pour l'amplification génique, caractérisé en ce que l'une des amorces, encore désignée Y45, est représentée par SEQ ID NO 1, ou par une séquence dérivée telle que définie dans la revendication 1, ou par une séquence complémentaire de ces dernières, tandis que l'autre amorce, encore désignée Y46, est représentée par SEQ ID NO 2, ou par une séquence dérivée telle que définie dans la revendication 1, ou par une séquence complémentaire de ces dernières.
17. Séquences nucléotidiques selon la revendication 15, caractérisées en ce qu'elles sont marquées, notamment de manière radioactive, enzymatique, par un composé fluorescent, par liaison à une molécule antigenique (susceptible d'être reconnue par des anticorps) ou à toute autre molécule susceptible d'être directement ou indirectement détectée à l'aide de réactifs.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0401037A2 (fr) * 1989-06-01 1990-12-05 Life Technologies Inc. Procédé pour contrôler la contamination dans l'amplification des acides nucléiques
JPH04229176A (ja) * 1990-12-27 1992-08-18 Shimadzu Corp 植物形質転換体を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法
WO1993025708A1 (fr) * 1992-06-05 1993-12-23 Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES ISSUES DE GENES CODANT DES PECTATE-LYASES, ET LEURS UTILISATIONS NOTAMMENT POUR LA DETECTION DE BACTERIES DU GENRE $i(ERWINIA)
WO1994026929A1 (fr) * 1993-05-19 1994-11-24 Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) Sequences nucleotidiques caracteristiques des erwinia carotovora

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0401037A2 (fr) * 1989-06-01 1990-12-05 Life Technologies Inc. Procédé pour contrôler la contamination dans l'amplification des acides nucléiques
JPH04229176A (ja) * 1990-12-27 1992-08-18 Shimadzu Corp 植物形質転換体を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法
WO1993025708A1 (fr) * 1992-06-05 1993-12-23 Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES ISSUES DE GENES CODANT DES PECTATE-LYASES, ET LEURS UTILISATIONS NOTAMMENT POUR LA DETECTION DE BACTERIES DU GENRE $i(ERWINIA)
WO1994026929A1 (fr) * 1993-05-19 1994-11-24 Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) Sequences nucleotidiques caracteristiques des erwinia carotovora

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DARRASSE A ET AL: "Isolation by genomic subtraction of DNA probes specific for erwinia carotovora subsp. atroseptica", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 60, no. 1, January 1994 (1994-01-01), pages 298 - 306, XP000472734 *
DE BOER S ET AL: "Attenuation of PCR inhibition in the presence of plant compounds by addition of BLOTTO", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 23, no. 13, July 1995 (1995-07-01), pages 2567 - 68, XP002007961 *
DE BOER S ET AL: "PCR detection of Erwinia carotovora subsp. atroseptica associated with potato tissue", PHYTOPATHOLOGY, vol. 85, no. 8, 1995, pages 854 - 58, XP000575625 *
PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 016, no. 581 (C - 1012) 21 December 1992 (1992-12-21) *
SMID E ET AL: "Detection of Erwinia carotovora subsp. atroseptica and Erwinia chrysanthemi in potato tubers using polymerase chain reaction", PLANT PATHOLOGY, vol. 44, December 1995 (1995-12-01), pages 1058 - 69, XP000575626 *

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