FR2970480A1

FR2970480A1 - Procede de depistage de xanthomonas axonopodis pv. phaseoli

Info

Publication number: FR2970480A1
Application number: FR1150388A
Authority: FR
Inventors: Tristan Boureau; Fabien Chhel; Gilles Hunault; Mohamed Kerkoud; Frederic Lardeux; Charles Manceau; Stephane Poussier; Frederic Saubion
Original assignee: DIAG GENE; Universite dAngers; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Diag-Gene Fr; Universite dAngers
Priority date: 2011-01-18
Filing date: 2011-01-18
Publication date: 2012-07-20
Anticipated expiration: 2031-01-18
Also published as: FR2970480B1

Abstract

La présente invention est relative à un procédé de dépistage de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli dans un échantillon biologique comprenant une étape de détection de la présence éventuelle d'une combinaison de deux gènes, ladite combinaison comprenant le gène AvrBsT et un gène choisi parmi le gène Xac3090, le gène XopP et le gène AvrXccB dans ledit échantillon. La présente invention a également pour objet des acides nucléiques utilisables en tant que sondes ou amorces pour la détection de ce pathovar dans un échantillon biologique et un kit de dépistage contenant au moins un desdits acides nucléiques.

Description

Domaine technique de l'invention Le domaine technique de l'invention se rapporte au domaine de la détection des phytopathogènes et, plus précisément, au domaine de la détection des souches bactériennes de Xanthomonas axonopodis pathovar (pv.) phaseoli, agent pathogène responsable de la graisse commune du haricot.

Etat de la technique La graisse commune ou brûlure bactérienne est une des principales bactérioses affectant le haricot commun (Phaseolus vulgaris).

L'agent causal de la graisse commune du haricot est Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (ci-après pathovar phaseoli) qui comprend quatre lignées phylogénétiques distinctes : GL1, GL2, GL3 et fuscans (Alavi et al. 2008, Applied and Environmental Microbiology, 3295-3301). La graisse commune du haricot est une bactériose très virulente responsable d'épidémies aux conséquences économiques graves qui ont justifié le classement en quarantaine du pathovar phaseoli. En particulier, le pathovar phaseoli figure à l'Annexe IIA de la directive communautaire 2000/29/CE, dans la liste des organismes nuisibles dont l'introduction et la dissémination doivent être interdites dans tous les états membres.

La principale source d'inoculum de la graisse commune du haricot est la semence. Le pathovar phaseoli peut rester viable de nombreuses années dans les enveloppes des semences sans provoquer de symptômes visibles. Lors de la germination, la bactérie peut passer dans les cotylédons et infecter ainsi la jeune plantule. La bactérie peut coloniser la plantule de manière endophyte ou épiphyte. Il a été montré que la bactérie est particulièrement bien adaptée à la survie épiphyte à la surface de la feuille grâce à sa capacité à s'agréger en biofilm. La colonisation des autres plantules du champ intervient principalement par voie aérienne. Il a été montré qu'une seule source d'inoculum dans un champ peut contaminer une zone d'un rayon de 8 m autour d'elle. Ainsi, un niveau de contamination des semences de 1 sur 10000 est suffisant pour provoquer, à l'échelle d'un champ, une épidémie. A l'heure actuelle, il n'existe pas de méthodes permettant d'endiguer les épidémies de graisse commune du haricot. Les seules méthodes de lutte existantes sont des méthodes prophylactiques consistant à utiliser des semences saines, à développer des semences résistantes au pathovar et/ou à contrôler les procédés de culture (rotation des cultures, contrôle de la date de plantation). Afin de disposer de semences saines, un des enjeux majeurs est la mise au point de tests de dépistage sensibles et fiables du pathovar phaseoli dans les échantillons biologiques. Les tests utilisés en routine pour le dépistage du pathovar phaseoli reposent essentiellement sur l'isolement des bactéries suspectes à partir du matériel végétal à tester, sur la mise en culture des bactéries isolées sur des milieux sélectifs ou semi-sélectifs et sur leur identification finale grâce à des tests de caractérisation phénotypique, sérologique, biochimique et/ou de pathogénicité vis-à-vis de plantules de Phaseolus vulgaris. On peut citer, à titre d'exemple, la méthode BHs/99/02 version b proposée par le Laboratoire National des Végétaux (LNPV) et largement utilisée par les laboratoires français ou encore la méthode de référence ISTA (International Seed Testing Association) intitulée « 7-021: Detection of Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli and Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli var. fuscans on Phaseolus vulgaris » (Sheppard et al., 2007). Ces tests de dépistage sont coûteux en temps et en manipulation et imposent l'utilisation de matériels lourds tels que des serres et des enceintes de confinement adaptées à la manipulation d'organismes de quarantaine. Par ailleurs, des tests de dépistage moléculaire basés sur la détection de marqueurs génétiques spécifiques du pathovar phaseoli ont été proposés dans l'état de la technique.

A titre d'exemple, Audy et al. (Phytopathology, 1996, 86, 4, p.361-p.366) propose un test de dépistage basé sur l'amplification par PCR d'un marqueur identifié par RAPD (Amplification aléatoire d'ADN polymorphe) via l'intermédiaire du couple d'amorces X4c et X4e. Toth et al. (Journal of applied Microbiology, 1998,85, 327-336) propose également un test de dépistage basé sur l'amplification d'un marqueur RAPD de 450 paires de bases (pb) par utilisation du couple d'amorces Xf1 et Xf2. Ce test permet de détecter spécifiquement le variant fuscans du pathovar Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli. Toth décrit également un test de dépistage par PCR multiplex combinant les amorces décrites par Audy et al. et les amorces Xf1 et Xf2.

En pratique, ces tests de dépistage souffrent d'un manque de spécificité et se révèlent inadaptés pour détecter l'ensemble des souches du pathovar phaseoli. En effet, le pathovar phaseoli regroupant quatre lignées phylogénétiques distinctes, il s'avère difficile de mettre au point un test de dépistage basé sur la détection de marqueurs génétiques qui permettent à la fois (i) de détecter l'ensemble des souches bactériennes du pathovar phaseoli et (ii) de discriminer le pathovar phaseoli des autres pathovars de Xanthomonas axonopodis. Il existe donc, à l'heure actuelle, un besoin de nouveaux tests de dépistage du pathovar phaseoli qui soient, à la fois, spécifiques, fiables et sensibles.

Résumé de l'invention La présente invention est relative à un procédé de dépistage du pathovar Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli dans un échantillon biologique, ledit procédé comprenant l'étape de détection d'une combinaison (Cl) de deux gènes, ladite combinaison (Cl) comprenant le gène AvrBst et un gène choisi parmi le groupe constitué par le gène Xac3090, le gène XopP et le gène AvrXccB, étant entendu que le résultat du procédé de dépistage est positif si la présence des deux gènes de ladite combinaison (Cl) est détectée dans ledit échantillon biologique. Un autre objet de la présente invention est une sonde ou une amorce nucléotidique utilisable dans un procédé de dépistage du pathovar Xanthomonas axonopodis pv. Phaseoli, ladite sonde ou ladite amorce ayant une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus d'un acide nucléique choisi parmi le groupe constitué par l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°5, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°6, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°7, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°8, l'acide nucléique de SEQ ID N°9, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N °10, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N °11, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N °12 et les acides nucléiques de séquence complémentaire. La présente invention a également pour objet un kit pour le dépistage du pathovar Xanthomonas axonopodis pv. Phaseoli dans un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend deux couples d'amorces permettant d'amplifier spécifiquement les deux gènes de la combinaison (Cl).

Fiqures La Figure 1 représente le gel d'électrophorèse (révélation par le bromure d'éthidium) des amplicons obtenus par amplification PCR multiplex, en présence des amorces Am1 F, Am1 R, Am2F et Am2R (gel A, amorces 1 et 2) ou des amorces Am3F, Am3R, Am4F et Am4R (gel B, amorces 3 et 4), des ADNs génomiques extraits de cultures bactériennes de souches appartenant au pathovar phaseoli, à savoir : NF1 (CFBP 2534), NF2 (CFBP 6166), NF3 (CFBP 6988) et fuscans (CFBP 6166). Les produits d'amplification escomptés sont observables pour les quatre souches du pathovar phaseoli aussi bien à l'issue de l'amplification par PCR multiplex en présence des couples d'amorces (Ami F, AmR1) et (Am2F, Am2R) qu'à l'issue de l'amplification par PCR multiplex en présence des couples d'amorces (Am3F, Am3R) et (Am4F, Am4R). Le couple d'amorces (Ami F, Am1 R) permet l'amplification d'un fragment de 257 pb du gène Xac3090. Le couple d'amorces (Am2F, Am2R) permet l'amplification d'un fragment de 393 pb du gène AvrBsT. Le couple d'amorces (Am3F, Am3R) permet l'amplification d'un fragment de 656 pb du gène XopP. Enfin, le couple d'amorces (Am4F, Am4R) permet l'amplification d'un fragment de 427 pb du gène AvrXccB. Le témoin positif correspond à la souche X. axonopodis pv. phaseoli référencée sous le numéro CFBP 6988. Le témoin négatif correspond à une amplification dans un tube dépourvu de matrice. La Figure 2A présente un gel d'électrophorèse obtenu à l'issue d'un test de dépistage du pathovar phaseoli par BIO-PCR effectué sur des semences saines de P. vulgaris (souches négatives) et des semences infectées de P. vulgaris (souches positives). Le test de dépistage comprend une étape d'enrichissement bactérien des macérâts de semence et une étape d'amplification de l'ADN bactérien par PCR multiplex en présence des couples d'amorces (Ami F, Am1 R) et (Am2F, Am2R). Les produits d'amplification attendus sont observables pour les semences contaminées alors qu'aucun produit d'amplification n'est observable pour les semences saines. La Figure 2B présente un gel d'électrophorèse obtenu à l'issue d'un test de dépistage du pathovar phaseoli par BIO-PCR effectué sur des semences saines de P. vulgaris (souches négatives) et des semences infectées de P. vulgaris (souches positives). Le test de dépistage comprend une étape d'enrichissement bactérien des macérâts de semence et une étape d'amplification de l'ADN bactérien par PCR multiplex en présence des couples d'amorces (Am3F, Am3R) et (Am4F, Am4R). Les produits d'amplification attendus sont observables pour les semences contaminées alors qu'aucun produit d'amplification n'est observable pour les semences saines.

Description détaillée de l'invention

1. Procédé de dépistage du pathovar phaseoli dans un échantillon biologique a. Présentation générale du procédé de dépistage

La présente invention a pour objet un procédé de dépistage du pathovar Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (ci-après pathovar phaseoli) dans un échantillon 25 biologique. Le Demandeur a montré qu'il est possible de détecter le pathovar phaseoli dans un échantillon biologique en détectant un ou plusieurs gènes choisis parmi les gènes Xac3090, AvrBsT, XopP et AvrXccB. En effet, le Demandeur a montré que ces gènes sont communs à toutes les lignées phylogénétiques du pathovar phaseoli alors qu'ils ne 30 sont pas simultanément présents dans le génome des lignées phylogénétiques appartenant à d'autres pathovars de Xanthomonas axonopodis. Par ailleurs, à la connaissance du demandeur, la présence simultanée de gènes homologues à Xac3090, AvrBsT, XopP ou AvrXccB n'a jamais été observée dans le génome des plantes hôtes du pathovar phaseoli, ni dans le génome de souches 35 bactériennes appartenant à d'autres taxons que Xanthomonas axonopodis pv phaseoli mais néanmoins susceptibles de coloniser lesdites plantes hôtes, comme par exemple Pseudomonas savastanoï pv. phaseolicola. La détection de deux gènes choisis parmi les gènes Xac3090, AvrBsT, XopP et AvrXccB est suffisante pour mettre en évidence la présence éventuelle du pathovar 40 phaseoli dans un échantillon biologique.20 Par ailleurs, le Demandeur a montré que le gène AvrBsT est présent chez un nombre très limité de souches de Xanthomonas axonopodis n'appartenant pas aux lignées phylogénétiques du pathovar phaseoli. A la connaissance du Demandeur, les souches de X. axonopodis (i) n'appartenant pas au pathovar phaseoli et (ii) comprenant dans leur génome le gène AvrBsT se limitent à quelques souches appartenant aux pathovars alfalfae et vesicatoria de X. axonopodis. A toutes fins utiles, il est à noter qu'à la connaissance du demandeur, il est peu probable que les pathovars alfalfae et vesicatoria puissent contaminer des plantules ou des semences de Phaseolus vulgaris. Afin de détecter la présence du pathovar phaseoli dans un échantillon biologique, il est donc avantageux de rechercher la présence (i) du gène AvrBsT et (ii) d'au moins un gène choisi parmi le groupe constitué par Xac3090, XopP et AvrXccB dans ledit échantillon biologique.

Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé de dépistage du pathovar Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli dans un échantillon biologique, ledit procédé comprenant une étape de détection d'une combinaison de deux gènes (Cl), ladite combinaison de gènes (C1) étant constituée par : - le gène AvrBsT et - un gène choisi parmi le groupe constitué par Xac3090, AvrXccB et XopP En d'autres termes, la combinaison (Cl) est choisie parmi le groupe constitué par la combinaison AvrBsT/Xac3090, la combinaison AvrBsT/AvrXccB et la combinaison AvrBsT/XopP. On entend par « combinaison AvrBsT/XopP » ou par « combinaison XopP/AvrBsT » le groupe de gènes constitué par le gène XopP et le gène AvrBsT Au sens de l'invention, une étape de détection d'une combinaison de deux gènes comprend les étapes de détection de la présence ou de l'absence de chacun des deux gènes de ladite combinaison dans l'échantillon biologique. Les étapes de détection des deux gènes de ladite combinaison peuvent être effectuées simultanément ou séparément.

Le procédé de dépistage du pathovar phaseoli est positif si, à la fois, les deux gènes de la combinaison (Cl) sont détectés dans ledit échantillon biologique. En d'autres termes, l'échantillon biologique est considéré comme contaminé par le pathovar phaseoli si on détecte la présence des deux gènes de la combinaison (Cl) dans ledit échantillon biologique.

A l'inverse, si aucun des deux gènes de la combinaison (Cl) ou si seulement un seul gène de la combinaison Cl est détecté comme présent dans ledit échantillon biologique, le test de dépistage est négatif et l'échantillon biologique n'est pas considéré comme contaminé par le pathovar phaseoli. Au sens de la présente invention, le pathovar « Xanthomonas axonopodis pv. 40 phaseoli », également appelé dans ce qui suit « pathovar phaseoli », regroupe les souches de X. axonopodis responsables de la graisse commune du haricot. Plus spécifiquement, ce pathovar regroupe les lignées phylogénétiques fuscans, GL1, GL2 et GL3 telles que définies dans Alavi et al., (Appt Environ Microbiol, 2008, 74, 3295-3301). Il est à noter que dans l'état de la technique antérieur aux travaux de reclassification de Vauterin et al. (1995, Int J Syst Bacteriol, 45, 472-489), les souches du pathovar phaseoli ont pu être dénommées sous les noms suivants : - Xanthomonas campestris pv. phaseoli (Smith) Dye - Xanthomonas phaseoli (Smith) Dowson - Xanthomonas phaseoli var. fuscans (Burkholder) Starr & Burkholder - Xanthomonas phaseoli (Smith) Dowson var. phaseoli - Xanthomonas fuscans (Burkholder) Burkholder On entend par « gène Xac3090 » l'acide nucléique de séquence SEQ ID N °1, l'acide nucléique de séquence complémentaire ainsi que les variants desdits acides nucléiques présents chez les différentes souches du pathovar phaseoli. Le gène Xac3090 est également dénommé dans la littérature XopL. On entend par « gène AvrBsT» l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°2, l'acide nucléique de séquence complémentaire ainsi que les variants desdits acides nucléiques présents chez les différentes souches du pathovar phaseoli. Le gène AvrBsT est également dénommé dans la littérature XopJ2.

On entend par « gène XopP » l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°3, l'acide nucléique de séquence complémentaire ainsi que les variants desdits acides nucléiques présents chez les différentes souches du pathovar phaseoli. On entend par « gène AvrXccB» l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°4, l'acide nucléique de séquence complémentaire ainsi que les variants desdits acides nucléiques présents chez les différentes souches du pathovar phaseoli. Le gène AvrXccB est également dénommé dans la littérature XopJ5. De manière générale, un variant d'acide nucléique de référence présente une séquence nucléotidique très proche de la séquence dudit acide nucléique de référence. Dans le cadre de la présente invention, on entend plus spécifiquement « par un variant d'un acide nucléique de référence » un acide nucléique : - dont la séquence présente une ou plusieurs mutations ponctuelles choisies parmi (i) la délétion d'un nucléotide, (ii) l'insertion d'un nucléotide ou (iii) la substitution d'un nucléotide par un autre nucléotide en comparaison avec la séquence dudit acide nucléique de référence et qui possède au moins 950/0 d'identité de séquence en nucléotides avec ledit acide nucléique de référence. Un variant d'un acide nucléique de référence peut être un variant naturel c'est-à-dire un ADN polymorphe de l'acide nucléique de référence. Il peut également s'agir d'un variant non naturel obtenu, par exemple, par des techniques de mutagénèse. La ou les mutations ponctuelles contenues dans la séquence du variant par rapport à celle de l'acide nucléique de référence peuvent être des mutations silencieuses en raison de la dégénérescence du code génétique. Il peut s'agir également de mutations impliquant une modification de la séquence d'acides aminés de la protéine qui est éventuellement codée par l'acide nucléique de référence.

Dans le cadre de la présente description, une ou plusieurs mutations ponctuelles englobent 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 mutations ponctuelles. Il va de soi que le nombre maximal de mutations ponctuelles que peut comprendre la séquence de l'acide nucléique variant est limité par le pourcentage d'identité de séquence minimale que doit avoir la séquence dudit variant avec la séquence de l'acide nucléique de référence (soit dans le présent cas 95%).

Pour déterminer, le pourcentage d'identité de séquence d'un premier acide nucléique (A) avec un second acide nucléique (B), il est nécessaire d'effectuer, au préalable, l'alignement de leurs séquences respectives afin de déterminer le nombre de nucléotides qu'ont en commun leurs séquences, c'est-à-dire le nombre de nucléotides identiques qui sont correctement alignés. L'alignement de séquence peut être effectué par des méthodes bien connues de l'homme du métier, par exemple, à l'aide de l'algorithme d'alignement global de Needleman-Wunsch en prenant en compte les éventuels « gaps » (c'est-à-dire les éventuelles délétions et insertions contenues dans la séquence de l'acide nucléique (A) par rapport à la séquence de l'acide nucléique (B)) et la longueur entière des acides nucléiques (A) et (B) à aligner. On peut, par exemple, utiliser l'outil d'alignement « EMBOSS Pairwise Alignment Algorithms » disponible notamment sur le site internet de I'EMBL-EBI consultable à l'adresse suivante : www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/. Les paramètres à fixer pour réaliser l'alignement avec cet outil sont les suivants : (i) Method : EMBOSS :Needle (global) ; (ii) Gap extend : 0,5 ; (iii) Gap open : 10 ; (iv) Molecule : DNA ; (v) Matrix : DNAfull.

Une fois l'alignement global effectué, le pourcentage d'identité de séquence peut être obtenu en divisant (i) le nombre total de nucléotides identiques alignés par (ii) le nombre total de nucléotides contenus dans l'acide nucléique le plus long parmi l'acide nucléique (A) et l'acide nucléique (B) puis en multipliant par 100 le quotient obtenu. Au sens de l'invention, au moins 95% d'identité de séquence englobe au moins 950/0, 95,50/0, 960/0, 96,50/0, 97%, 97,50/0, 980/0, 98,50/0, 990/0, 99,50/0, 99,9% d'identité de séquence. On entend par « échantillon biologique » tout échantillon biologique susceptible d'être contaminé par X. axonopodis pv. phaseoli. A titre illustratif, un échantillon biologique au sens de l'invention peut être une culture bactérienne. Cette culture bactérienne peut être obtenue, par exemple, à partir d'une plante que l'on suspecte d'être infectée par le pathovar phaseoli ou à partir d'un d'échantillon de sol que l'on suspecte d'être souillé par des débris végétaux infectés par le pathovar phaseoli. L'échantillon biologique peut être également un matériel végétal issu d'une semence ou d'une partie d'une plante susceptible d'être infectée par le pathovar phaseoli. Au sens de l'invention, une partie d'une plante est une partie aérienne ou une partie non-aérienne de ladite plante. Une partie aérienne englobe la tige, les feuilles, les fruits et les gousses. Une partie non-aérienne d'une plante englobe les racines. Au sens de l'invention, les plantes susceptibles d'être infectées par le pathovar phaseoli englobent les plantes pouvant être naturellement infectées par une souche bactérienne appartenant au pathovar phaseoli telles que Phaseolus vulgaris, P. lunatus, Vigna aconit/fol/a et V. radiata. Lablab purpureus et Mucuna deeringiana, et les plantes pouvant être infectées par inoculation artificielle d'une souche du pathovar phaseoli telles que P. coccineus, P. acutifolius et Lupinus polyph Élus. Il est à noter que la liste des plantes réservoir du pathovar phaseoli présentée ci-dessus n'est pas exhaustive. Il est fort probable que le pathovar phaseoli puisse survivre au contact d'autres espèces végétales que celles mentionnées ci-dessus. Dans un mode de réalisation préféré, l'échantillon biologique est choisi parmi le groupe constitué par une culture bactérienne, un matériel végétal issu d'une semence de P. vulgaris et un matériel végétal issu d'une partie aérienne d'une plante de P. vulgaris telle qu'une feuille, une tige ou une gousse. Dans certains modes de réalisation du procédé selon l'invention, la combinaison (C1) est la combinaison AvrBsT/Xac3090. Le Demandeur a montré que la combinaison de gènes AvrBsT/Xac3090 est spécifique au pathovar phaseoli et qu'elle est présente chez toutes les lignées phylogénétiques du pathovar phaseoli. En d'autres termes, à la connaissance du Demandeur, il n'existe pas de souches bactériennes de X. axonopodis autres que celles du pathovar phaseoli qui possèdent dans leur génome cette combinaison de gènes.

En conséquence, il est possible de mettre en oeuvre un test de dépistage fiable et spécifique du pathovar phaseoli en détectant uniquement la combinaison (Cl) AvrBsT/Xac3090 et donc sans faire appel à une étape de vérification ultérieure basée, par exemple, sur la détection d'une autre combinaison de gènes. Le procédé de dépistage selon la présente invention peut comprendre des étapes supplémentaires à l'étape de détection de la combinaison (Cl). En particulier, le procédé de dépistage peut comprendre une étape ultérieure permettant de discriminer les lignées phylogénétiques du pathovar phaseoli entre elles. Cette étape de discrimination est de préférence réalisée lorsque l'étape de détection (Cl) est positive. Cette étape de discrimination peut comprendre l'isolement des souches bactériennes contaminant l'échantillon biologique et la caractérisation desdites souches bactériennes par des tests bien connus de l'homme du métier tels que les tests phénotypiques, les tests biochimiques, les tests sérologiques et les tests de pathogénicité sur plantules. Cette étape de discrimination peut également consister à rechercher la présence, dans l'échantillon biologique, d'un ou plusieurs marqueurs génétiques spécifiques d'une ou de plusieurs lignées phylogénétiques du pathovar phaseoli. A titre d'exemple, le marqueur RAPD de 450 paires de bases (pb) décrit par Toth et al. (Journal of applied Microbiology, 1998,85, 327-336) est spécifique de la lignée phylogénétique fuscans. Le Demandeur a montré que la combinaison de gènes (Cl) est suffisante pour détecter le pathovar phaseoli dans un échantillon biologique. En effet, les combinaisons (Cl) ont été détectées chez l'ensemble des souches du pathovar phaseoli testées par le Demandeur. Par ailleurs, le Demandeur a observé une forte identité de séquence pour les gènes AvrXccB, XopP, AvrBsT et Xac3090 entre les souches bactériennes appartenant aux différentes lignées phylogénétiques du pathovar phaseoli. Néanmoins, il ne peut pas être totalement exclu que parmi la multitude des souches du pathovar phaseoli, une ou plusieurs souches bactériennes, non encore identifiées, présentent un polymorphisme au niveau d'un gène de la combinaison (Cl) c'est-à-dire une ou plusieurs mutations au niveau dudit gène qui rendent la détection desdites souches impossible par les moyens de détection choisis pour la mise en oeuvre du procédé de dépistage selon la présente invention., Ceci est particulièrement vrai si l'étape de détection dudit gène comprend une étape d'hybridation avec une sonde ou une amorce nucléique au niveau de la région du gène où l'on observe le polymorphisme. Compte tenu des enjeux sanitaires liés à la détection du pathovar phaseoli, il peut se révéler avantageux d'être en mesure de détecter les éventuelles souches bactériennes du pathovar phaseoli présentant ce polymorphisme.

Ainsi, dans certains modes de réalisation, le test de dépistage selon la présente invention comprend une étape de vérification optionnelle consistant à détecter, dans ledit échantillon biologique, un ou plusieurs gènes ou un ou plusieurs marqueurs génétiques connus pour être présents dans le génome du pathovar phaseoli ou dans le génome d'une lignée phylogénétique spécifique du pathovar phaseoli.

On peut citer, à titre d'exemple de marqueurs génétiques apropriés, le marqueur RAPD de 730 pb décrit par Audy et al. (Phytopathology, 1996, 86, 4, p.361-p.366), le marqueur RAPD de 450 paires de bases (pb) décrit par Toth et al. (Journal of applied Microbiology, 1998,85, 327-336) ou la séquence d'insertion ISXax1 décrite par Alavi et aI.(Applied and Environmental Microbiology, 2007,73,1678-1682).

Le ou les gènes supplémentaires détectés peuvent être choisis parmi Xac3090, XopP et AvrXccB. Dans un mode de réalisation particulier, l'étape supplémentaire de vérification consiste à détecter, dans ledit échantillon biologique, une seconde combinaison (C2) de deux gènes choisis parmi le groupe constitué par la combinaison Xac3090/XopP, la combinaison Xac3090/AvrXccB et la combinaison XopP/AvrXccB, étant entendu que les combinaisons de gènes (Cl) et (C2) ne comprennent aucun gène en commun. Le tableau ci-dessous présente les couples de combinaisons (Cl) et (C2) possibles selon ce dernier mode de réalisation. Tableau 1 : couples de combinaisons (C11 et (C2 N ° de référence Combinaison de gènes (Cl) Combinaison de gènes (C2) 1 Xac3090/AvrBsT XopP/AvrXccB 2 XopP/AvrBsT Xac3090/AvrXccB 3 AvrBsT/AvrXccB XopP/Xac3090 On considère que le résultat de l'étape de vérification est positif si les deux gènes de la combinaison (C2) sont détectés comme présents dans ledit échantillon 10 biologique. Lorsque l'étape de vérification est réalisée dans le procédé de dépistage selon la présente invention, le résultat final issu du procédé de dépistage sera déterminé en fonction du résultat obtenu à l'étape de détection de la combinaison de gènes (Cl) et du résultat obtenu à l'étape de vérification. 15 On considère que le résultat du procédé de dépistage du pathovar phaseoli : ^ est positif si la combinaison (Cl) est détectée dans l'échantillon biologique et ^ est négatif si ni la combinaison (Cl), ni la combinaison (C2) n'est détectée dans l'échantillon biologique. Le Demandeur a montré que les combinaisons (C2) sont moins spécifiques que 20 les combinaisons (Cl) et qu'elles peuvent être présentes chez des souches bactériennes distinctes du pathovar phaseoli. Ainsi, lorsque la combinaison (C2) est détectée et que la combinaison (Cl) ne l'est pas, il est fort probable que l'échantillon biologique soit contaminé par une ou plusieurs souches bactériennes appartenant à un pathovar proche génétiquement du pathovar phaseoli plutôt que par le pathovar 25 phaseoli lui-même. Néanmoins, comme expliqué précédemment, il ne peut pas être totalement exclu que l'absence de détection de la combinaison (Cl) résulte d'une divergence au niveau de la séquence d'un des deux gènes de (Cl) rendant impossible sa détection par les moyens mis en oeuvre dans le test de dépistage. Le pathovar phaseoli étant un organisme de quarantaine, il peut être prudent de 30 considérer également que le test de dépistage est positif lorsque la combinaison (C2) est détectée même si la combinaison (Cl) ne l'est pas. Un tel principe de précaution est à privilégier si aucune méthode de diagnostic supplémentaire n'est utilisée en complément du procédé de dépistage selon la présente invention. Ainsi, dans certains modes de réalisation du procédé selon l'invention, on 35 considère que le résultat du procédé de dépistage du pathovar phaseoli est positif si au moins une des deux combinaisons (C1) et (C2) est détectée comme présente dans ledit5 échantillon biologique. En d'autres termes, le test de dépistage est considéré comme positif si le résultat de l'étape de détection de la combinaison (Cl) et/ou celui de l'étape de vérification est (sont) positif(s). Le tableau 2 ci-après présente les différents cas de figure possibles correspondant à ce mode de réalisation spécifique du procédé selon la présente invention.

Tableau 2 : Interprétation des résultats du procédé de dépistage en fonction des résultats obtenus à l'étape de détection de la combinaison (Cl) et à l'étape de vérification. Cette interprétation illustre un mode de réalisation particulier de l'invention. N° Résultat de l'étape Résultat de l'étape Résultat du Interprétation de détection de la de vérification procédé de combinaison (Cl) (détection de (C2)) dépistage 1 Positif Positif Positif Echantillon contaminé par phaseoli 2 Positif Négatif Positif Très forte probabilité que l'échantillon soit contaminé par phaseoli. Mettre en oeuvre éventuellement une méthode de diagnostic complémentaire pour confirmation. 3 Négatif Positif Positif par Faible probabilité que l'échantillon soit principe de contaminé par phaseoli. Mise en oeuvre d'une précaution méthode de diagnostic complémentaire conseillée. 4 Négatif Négatif Négatif Echantillon non contaminé. Dans certains modes de réalisation, l'étape de vérification est réalisée systématiquement, c'est-à-dire indépendamment du résultat obtenu à l'étape de 15 détection de la combinaison (Cl). Dans d'autres modes de réalisation, l'étape supplémentaire de vérification est réalisée en fonction du résultat obtenu à l'étape de détection de la combinaison (C1). De préférence, l'étape de vérification est effectuée lorsque le résultat obtenu à l'étape de détection de la combinaison (C1) est négatif. 20 Dans ce dernier mode spécifique de réalisation, si le résultat de l'étape de détection de la combinaison (Cl) est positif, le procédé de dépistage est, de fait, positif et l'étape de vérification n'est pas réalisée. Si le résultat de l'étape de détection de la combinaison (Cl) est négatif, l'étape de vérification est réalisée à titre de confirmation. Ainsi, si la combinaison (C2) n'est pas 25 détectée, le résultat de l'étape de détection de (Cl) sera confirmé c'est-à-dire que le test de dépistage sera négatif et l'échantillon biologique considéré comme non contaminé par le pathovar phaseoli. En revanche si la combinaison (C2) est détectée comme présente dans ledit échantillon biologique, il existe une faible probabilité pour que l'échantillon biologique 30 soit contaminé par le pathovar phaseoli et selon un principe de précaution, il peut être considéré que le test de dépistage est positif, en particulier, si aucun test diagnostique supplémentaire n'est réalisé. Dans certains modes de réalisation, le procédé de dépistage du pathovar phaseoli dans un échantillon biologique comprend : (i) une étape de détection de la combinaison (Cl) Xac3090/ AvrBsT dans ledit échantillon biologique, et (ii) en option, une étape de vérification consistant à détecter la combinaison (C2) XopP/AvrXccB dans ledit échantillon biologique. Comme décrit précédemment, l'étape supplémentaire de vérification peut être réalisée soit systématiquement, c'est-à-dire indépendamment du résultat obtenu à l'étape de détection de la combinaison (C1), soit en fonction du résultat obtenu à l'étape de détection de la combinaison (C1). Ainsi, dans certains modes de réalisations, le procédé de dépistage du pathovar phaseoli dans un échantillon biologique comprend: (i) une étape de détection de la combinaison (Cl) Xac3090/ AvrBsT dans ledit échantillon biologique, et (ii) une étape de vérification consistant à détecter la combinaison (C2) XopP/AvrXccB dans ledit échantillon biologique, ladite étape de vérification étant effectuée uniquement si la combinaison (Cl) n'est pas détectée comme présente à l'étape (i), étant entendu que - le résultat du procédé de dépistage est négatif si aucune des combinaisons (Cl) et (C2) n'est détectée dans ledit échantillon biologique, et - le résultat du procédé de dépistage est positif si au moins une des combinaisons (Cl) et (C2) est détectée dans ledit échantillon biologique Le procédé de dépistage selon la présente invention peut être combiné à une méthode de diagnostic complémentaire ayant pour but d'infirmer ou de confirmer le résultat dudit procédé de dépistage. Cette méthode de diagnostic complémentaire est mise en oeuvre de préférence lorsque les cas de figure n °2 et n °3 présentés dans le tableau 2 ci-dessus sont réalisés. Ainsi, dans certains modes de réalisation, le procédé de dépistage selon la présente invention est utilisé en combinaison avec une méthode de diagnostic permettant la détection du pathovar phaseoli dans un échantillon biologique. Ladite méthode de diagnostic peut être choisie parmi les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier pour la détection du pathovar phaseoli dans un échantillon biologique. Ces méthodes peuvent comprendre : ^ une étape d'isolement et de culture pure de souches bactériennes issues de l'échantillon biologique à tester et susceptibles d'appartenir à x axonopodis pv. phaseoli et ^ une étape d'identification des souches bactériennes isolées par l'intermédiaire d'un ou de plusieurs tests de caractérisation choisis parmi les tests phénotypiques, les tests biochimiques, les tests sérologiques et les tests de pathogénicité.

Pour la réalisation de cette méthode diagnostique l'homme du métier peut se référer, entre autres, à la méthode BHs/99/02 version b, intitulée « Semences de haricot, détection de Pseudomonas savastonoi pv. phaseolicola et Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli par isolement sur milieux nutritifs » du Laboratoire National de la Protection des Végétaux (LNPV) (France), à la méthode ISTA 7-021, à l'article de ABD-Alla et al. (Folia Microbiol., 2010, 55, 1 :47-52) ou encore à l'article de Malin et al. (Plant Disease, 1983, 67,645-647) qui décrit une méthode indirecte d'immunomarquage de X. axonopodis pv. phaseoli. Selon l'enseignement de la présente demande de brevet, cette méthode diagnostique peut également comprendre une étape de détection d'un ou plusieurs gènes choisis parmi AvrBsT, Xac3090, AvrXccB et XopP dans les cultures bactériennes isolées à partir de l'échantillon biologique considéré. A titre d'exemple, la présence de la combinaison (Cl) de gènes peut être recherchée dans les cultures bactériennes pures isolées à partir de l'échantillon biologique.

Le procédé de dépistage selon la présente invention peut comprendre des étapes supplémentaires à celles décrites précédemment. La mise en oeuvre pratique du procédé de dépistage du pathovar phaseoli selon la présente invention est présentée, plus en détails, dans ce qui suit. b. Détection des gènes Xac3090, AvrBst, AvrXccB et XopP dans un échantillon biologique

L'homme du métier connaît de multiples méthodes permettant de détecter la présence d'un gène dans un échantillon biologique.

La présence d'un gène dans un échantillon biologique peut être détectée indirectement par l'intermédiaire de son produit d'expression. Les méthodes permettant de détecter le produit d'expression d'un gène sont des méthodes dites protéomiques qui regroupent par exemple certaines techniques de spectrométrie de masse ou d'immunologie.

La présence d'un gène peut être également détectée indirectement via ses produits de transcription. On peut citer par exemple comme méthode de détection des produits de transcription d'un gène les méthodes basées sur les puces à ADN ou les puces à ARN. Il est possible également de détecter la présence d'un gène dans un échantillon biologique directement c'est-à-dire par une méthode dite génomique consistant à détecter la séquence d'acide nucléique dudit gène, d'un de ses fragments ou d'un de ses variants. L'étape de détection de chaque gène de la combinaison (C1) peut donc consister à détecter une séquence d'acide nucléique correspondant audit gène.

Ainsi, dans certains modes de réalisation, le procédé de dépistage selon la présente invention est caractérisé en ce que la détection de la combinaison (Cl) comprend les étapes de détection de chacun des deux gènes qu'elle comprend, ces étapes étant effectuées simultanément ou séparément, étant entendu que : - l'étape de détection du gène Xac3090, si elle est réalisée, consiste à détecter dans ledit échantillon biologique la présence ou l'absence d'un premier acide nucléique cible (AN1) choisi parmi le groupe constitué par : ^ un acide nucléique ayant au moins 950/0 d'identité de séquence avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 ou avec l'acide nucléique de séquence complémentaire, et ^ un acide nucléique ayant au moins 30 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de SEQ ID N°1 ou de l'acide nucléique complémentaire ; - l'étape de détection du gène AvrBsT consiste à détecter dans ledit échantillon biologique la présence ou l'absence d'un second acide nucléique cible (AN2) choisi parmi le groupe constitué : ^ un acide nucléique ayant au moins 950/0 d'identité de séquence avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°2 ou avec l'acide nucléique de séquence complémentaire, et ^ un acide nucléique ayant au moins 30 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de SEQ ID N°2 ou de l'acide nucléique complémentaire ; - l'étape de détection du gène XopP, si elle est réalisée, consiste à détecter dans ledit échantillon biologique la présence ou l'absence d'un troisième acide nucléique cible (AN3) choisi parmi le groupe constitué : ^ un acide nucléique ayant au moins 950/0 d'identité de séquence avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°3 ou avec l'acide nucléique de séquence complémentaire, et ^ un acide nucléique ayant au moins 30 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de SEQ ID N°3 ou de l'acide nucléique complémentaire ; et - l'étape de détection du gène AvrXccB, si elle est réalisée, consiste à détecter dans ledit échantillon biologique la présence ou l'absence d'un quatrième acide nucléique cible (AN4) choisi parmi le groupe constitué : ^ un acide nucléique ayant au moins 950/0 d'identité de séquence avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°4 ou avec l'acide nucléique de séquence complémentaire, et ^ un acide nucléique ayant au moins 30 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de SEQ ID N°4 ou de l'acide nucléique complémentaire ; Aux fins de la présente description, les termes « acide nucléique », « polynucléotide », « oligonucléotide » se réfèrent aux séquences d'ADN, aux séquences d'ARN et aux séquences mixtes d'ARN/ADN qui, selon le contexte, peuvent être sous forme simple brin ou double brin (duplex).

Au sens de l'invention, « au moins 30 nucléotides consécutifs » englobent 30, 60, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650,1700, 1750, 1800, 1850, 1900 nucléotides consécutifs.

Au sens de l'invention, on entend par « un acide nucléique ayant au moins 30 nucléotides consécutifs issus d'un acide nucléique de référence ou de l'acide complémentaire », un acide nucléique qui est « un fragment d'au moins 30 nucléotides consécutifs dudit acide nucléique de référence ou de l'acide nucléique complémentaire dudit acide nucléique de référence ». En conséquence, il va de soi que la longueur totale de l'acide nucléique ayant au moins 30 nucléotides est limitée par la longueur de l'acide nucléique de référence. Au sens de l'invention, un premier acide nucléique est complémentaire à un second acide nucléique lorsque chaque base du premier acide nucléique situé en une position donnée (X) dans le sens 3' à 5' est complémentaire à la base du second acide nucléique situé en position (X) dans le sens 5' à 3'. Pour les acides nucléiques d'ADN, le premier couple de bases complémentaires est A et T et le second couple de bases complémentaires est G et C. Pour les acides nucléiques d'ARN, le premier couple de bases complémentaires est A et U et le second couple de bases complémentaires est G et C.

Au sens de l'invention, on entend par « nucléotides », les monomères constitutifs des acides nucléiques. Un nucléotide est composé (i) d'un groupement phosphate, (ii) d'un sucre choisi parmi le ribose, le désoxyribose et leurs analogues chuimiques et (iii) une base azotée choisie parmi l'adénine, la guanine, la thymine, la cytosine, l'uracile et leurs analogues chimiques.

Dans le cadre de la présente demande, « un acide nucléique cible » se réfère à n'importe quel acide nucléique cible choisi parmi l'acide nucléique (AN1), l'acide nucléique (AN2), l'acide nucléique (AN3) et l'acide nucléique (AN4) tels que définis précédemment. Dans les modes de réalisation pour lesquels le procédé de dépistage selon la présente invention comprend, en outre, une étape de vérification comprenant une étape de détection d'une combinaison (C2), ladite étape de détection de la combinaison (C2) dans ledit échantillon peut être effectuée en détectant les acides nucléiques cibles correspondant aux gènes contenus dans ladite combinaison (C2), comme définis ci-dessus.

Il est à noter que la détection de la présence d'un gène directement, c'est-à-dire par l'intermédiaire d'un acide nucléique cible lui correspondant, permet de déterminer si un échantillon est contaminé par le pathovar phaseoli même si ledit échantillon biologique est issu d'un végétal asymptomatique, c'est-à-dire ne présentant pas les symptômes de la graisse commune du haricot.

La détection du ou des acides nucléiques peut être réalisée par des méthodes classiques bien connues de l'homme du métier. Ces méthodes comprennent généralement la mise en contact de l'ADN de l'échantillon à tester avec au moins une sonde ou une amorce nucléotidique hybridant spécifiquement l'acide nucléique cible que l'on souhaite détecter. Au sens de l'invention, on entend par « ADN de l'échantillon biologique » l'ADN ou une partie de l'ADN contenu initialement dans l'échantillon biologique. Cet ADN peut être sous une forme purifiée ou partiellement purifiée. Ainsi, dans certains modes de réalisation, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape de détection de la présence ou de l'absence d'au moins un acide nucléique cible choisi parmi le groupe constitué par l'acide nucléique (AN1), l'acide nucléique (AN2), l'acide nucléique (AN3) et l'acide nucléique (AN4), ladite étape de détection dudit acide nucléique cible comprenant la mise en contact de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique avec au moins une sonde ou une amorce nucléotidique hybridant spécifiquement ledit acide nucléique cible. Les sondes et amorces nucléotidiques adaptées pour la mise en oeuvre du procédé selon la présente invention sont des acides nucléiques comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique cible tel que défini dans la présente description ou de l'acide nucléique complémentaire correspondant. Un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique cible ou de l'acide cible complémentaire englobe les acides nucléotides ayant 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, nucléotides consécutifs d'un acide nucléique cible ou de l'acide cible complémentaire tel que défini dans la présente invention. De manière préférée, la sonde ou amorce nucléotidique possède une longueur de 12 à 60 nucléotides, de préférence de 12 à 40 nucléotides. La sonde ou l'amorce nucléique est choisie de manière à ne pas contenir de régions pouvant induire une faible spécificité telles que des régions polyA et polyG qui se retrouvent dans un grand nombre d'acides nucléiques. A partir de la séquence de l'acide nucléique cible, l'homme du métier est capable de concevoir, par des méthodes de routine, un acide nucléique utilisable en tant qu'amorce ou sonde pour l'amplification ou la détection spécifique dudit acide nucléique cible par hybridation. Par exemple, l'homme du métier pourra : ^ concevoir in silico des amorces ou des sondes candidates pour la détection de l'acide nucléique cible en fonction des règles établies dans l'état de la technique, ^ effectuer des recherches de type BLAST sur des bases de données de manière à écarter les sondes ou amorces candidates qui pourraient hybrider des polynucléotides susceptibles d'être présents dans l'échantillon biologique à analyser et vérifier expérimentalement que les sondes et amorces retenues sont capables d'hybrider spécifiquement l'acide nucléique cible considéré. Lesdites sondes et amorces peuvent être préparées selon des méthodes classiques, en particulier par synthèse chimique en phase solide. Certaines de ces méthodes sont présentées dans l'ouvrage de synthèse « Comprehensive Natural Products Chemistry », 1999 édité chez Elsevier Science Ltd. par Meth-Cohn et al. (ISBN: 978-0-08-091283-7) et, plus précisément, au chapitre 7.05 intitulé « Oligonucléotide synthesis ». A titre d'exemple, pour la détection du gène Xac3090 via la détection de l'acide nucléique cible (AN1), l'homme du métier pourra rechercher à concevoir une sonde ou une amorce à partir d'une région de la séquence SEQ ID °1. A titre d'exemple, pour la détection du gène AvrBsT via la détection de l'acide nucléique cible (AN2), l'homme du métier pourra rechercher à concevoir une sonde ou une amorce à partir d'une région de la séquence SEQ ID 02. A titre d'exemple, pour la détection du gène XopP via la détection de l'acide nucléique cible (AN3), l'homme du métier pourra rechercher à concevoir une sonde ou une amorce à partir d'une région de la séquence SEQ ID 03. A titre d'exemple, pour la détection du gène Xac3090 via la détection de l'acide nucléique cible (AN4), l'homme du métier pourra rechercher à concevoir une sonde ou une amorce à partir d'une région de la séquence SEQ ID 04.

Par « hybridation », on entend le processus au cours duquel, dans des conditions appropriées, deux acides nucléiques simple brin s'apparient de manière à former un acide nucléique double brin ou « duplex », ledit acide nucléique duplex étant stabilisé par les liaisons hydrogènes s'établissant entre les bases nucléiques complémentaires. Dans le cas d'acides nucléiques d'ADN, l'adénine s'apparie avec la thymine et la guanine s'associe à la cytosine. L'hybridation est d'autant plus spécifique qu'elle s'effectue dans des conditions de forte stringence. Les conditions d'hybridation peuvent être ajustées en fonction de différents paramètres tels que la sensibilité à atteindre, la quantité de matériels de départ, la composition en nucléotides de la sonde ou de l'amorce...Il s'agit d'expérimentations de routine que l'homme du métier pourra mettre facilement en oeuvre, en particulier en s'inspirant de l'enseignement général de l'ouvrage : Primer, a manual for Iaboratory (édité par Dieffenbach et Dveksler, seconde édition, CSHL Press, 2003), de l'ouvrage de Hames et Higgins (Nucleic Acid Hybridization : a practicle approach, 1985, Ed. IRL Press, Oxford) et de l'ouvrage de Ausurel (Current protocols in molecular biology, 1997).

Les conditions d'hybridation peuvent être influencées par différents paramètres, tels que a) la pureté de la préparation de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ; b) la composition en bases de la sonde ou de l'amorce, les paires de base G-C possédant une plus grande stabilité thermique que les paires de bases A-T ou A-U ; c) la longueur de la séquence de bases homologues entre la sonde ou l'amorce et l'acide nucléique ; d) la force ionique : le taux d'hybridation augmente avec l'accroissement de la force ionique et la durée du temps d'incubation ; e) la température d'incubation ; f) la concentration de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider g) la présence d'agents dénaturants tels que des agents favorisant la rupture des liaisons hydrogène, comme le formamide ou l'urée, qui accroissent la stringence de l'hybridation ; h) le temps d'incubation, le taux d'hybridation augmentant avec la durée de l'incubation

i) la présence d'agents d'exclusion de volume, tels que le dextran ou le sulfate de dextran, qui augmentent le taux d'hybridation du fait qu'ils accroissent les concentrations effectives de la sonde ou l'amorce et de l'acide nucléique qui doit s'hybrider, au sein de la préparation. Un paramètre à considérer avec attention lors de la détermination des conditions de stringence à utiliser pour l'hybridation est la température de fusion moléculaire (Tm) qui correspond à la température à laquelle 500/0 des brins appariés se séparent. La température Tm reflète la stabilité du duplex formé. La température (Tm) est fonction de la composition du milieu ainsi que de la longueur totale et de la composition en nucléotides la sonde ou amorce considérée. En pratique, pour les amorces et sondes de faible longueur (inférieures à 30 bases), dans des conditions salines standard et en absence d'agent dénaturant, la température Tm peut être estimée par la règle de Wallace : Tm= 4°C (G+C) + 2°C (A+T) dans laquelle G, C, A et T correspondent au nombre de guanine, de cytosine, d'adénine et de thymidine présentes respectivement dans la séquence de la sonde ou de l'amorce considérée. Dans des conditions de stringence appropriées permettant à la fois de promouvoir l'hybridation de la sonde ou amorce avec l'acide nucléique cible tout en limitant les mésappariements et les appariements aspécifiques, la température d'hybridation est approximativement de 1 °C à 30°C, de préférence de 4°C à 10°C en-dessous de la température Tm de la sonde ou de l'amorce. Une température d'hybridation approximativement de 1 °C à 30°C en dessous de la température Tm englobe une température d'hybridation de 1 °C, 2°C, 3°C, 4°C, 5°C, 6 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C, 10 °C, 11 °C,12 °C, 13 °C, 14 °C, 15 °C, 16 °C, 17 °C, 18 °C, 19 °C, 20 °C, 21 °C, 22 °C, 23 °C, 24 °C, 25 °C, 26 °C, 27 °C, 28 °C, 29 °C et 30 °C en dessous de la température Tm. En règle générale, des sondes et des amorces de moins de 30 nucléotides adaptées pour la mise en oeuvre du procédé de dépistage selon la présente invention ont une Tm comprise entre 50°C et 80°C. Une Tm comprise entre 50°C et 80°C englobe les températures suivantes : 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 et 80 °C. Dans certains modes de réalisation, au cours du procédé de dépistage selon l'invention, l'ADN dudit échantillon biologique est mis en contact avec la/les sonde(s) ou amorce(s) nucléotidique(s) dans des conditions d'hybridation de forte stringence. Des conditions d'hybridation de forte stringence permettent de promouvoir l'hybridation des sondes ou des amorces nucléotidiques avec le ou les acides nucléiques cibles visés tout en limitant les appariements aspécifiques et les mésappariements.

Par « conditions d'hybridation de forte stringence » selon l'invention, on entend des conditions d'hybridation pour lesquelles la température d'hybridation est comprise entre 4°C et 6°C en-dessous de la Tm, de préférence environ 5°C en-dessous de la Tm de la sonde ou de l'amorce considérée. Si plusieurs sondes ou amorces sont utilisées simultanément, la température d'hybridation est comprise entre 4°C et 6°C, de préférence environ 5°C en-dessous de la Tm la plus basse parmi les Tm des sondes ou amorces utilisées simultanément. La sonde ou l'amorce peut être couplée à un marqueur chimique détectable par un moyen de tout type tel que des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou enzymatiques.

Par exemple, le marqueur peut consister en un isotope radioactif (32P 3H, 35S), un fluorophore (5-bromodéoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène), en une enzyme telle que la HRP (horseradish peroxidase) ou encore en un ligand tels que la biotine qui peut être détectée via une streptavidine marquée. Les sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent les puits de plaques de micro-titration, des billes de polystyrène, des billes magnétiques, des matériaux à base de nitrocellulose, des microparticules telles que des particules de latex ou encore des supports minéraux en quartz, verre ou silice.

Une sonde immobilisée sur un support solide peut être utilisée afin de détecter l'éventuelle présence d'un acide nucléique cible dans une solution de la manière suivante: un support sur lequel est immobilisé la sonde nucléotidique d'intérêt est pré-incubé dans un tampon d'hybridation contenant, entre autres, typiquement 100 pg/ml d'ADN de sperme de saumon à 65°C pendant une heure. Une solution d'acides nucléiques susceptible de contenir l'acide nucléique cible est mise en contact avec les sondes immobilisées dans des conditions analogues à l'étape de pré-hybridation pendant plusieurs heures. Le support est ensuite lavé plusieurs fois par des solutions tampons SSC contenant du SDS à 65°C de manière à éliminer les acides nucléiques non correctement hybridés. Le profil d'hybridation est analysé ensuite selon des techniques classiques permettant de mettre en évidence la formation éventuelle du duplex sonde-acide nucléique cible. Les conditions de l'hybridation peuvent naturellement être ajustées par l'homme du métier, par exemple en modifiant la température d'hybridation et/ou la concentration saline du tampon. Afin d'obtenir un test de dépistage présentant une meilleure sensibilité, il est préférable d'amplifier l'acide nucléique cible à détecter. Ainsi, dans certains modes de réalisation du procédé selon l'invention, l'étape de détection d'au moins un acide nucléique cible comprend les étapes consistant à: - réaliser une étape d'amplification de l'ADN contenu dans ledit échantillon à l'aide d'au moins une amorce nucléotidique hybridant spécifiquement ledit acide nucléique cible et - détecter la présence éventuelle du produit d'amplification dudit acide nucléique cible L'acide nucléique cible peut correspondre indifféremment à un gène de la combinaison (Cl) ou à un gène de la combinaison (C2) dans les modes de réalisation où l'étape de vérification est réalisée.

Le produit d'amplification (ou amplicon) obtenu est un acide nucléique double brin correspondant soit à l'acide nucléique cible en entier, soit à un fragment dudit acide nucléique cible. De manière générale, l'acide nucléique cible n'est pas amplifié en entier de telle sorte que le produit d'amplification correspond à un fragment dudit acide nucléique. Le produit d'amplification comprend généralement au moins 100 paires de base consécutives, ce qui englobe un acide nucléique ayant au moins 200, au moins 250, au moins 300, au moins 400, au moins 500, au moins 600, au moins 700, au moins 800, au moins 900, au moins 1000, au moins 1200, au moins 1300, au moins 1400, au moins 1500, au moins 1800 paires de base. La longueur du produit d'amplification est limitée par la longueur de l'acide nucléique cible amplifié auquel il correspond. L'amplification de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique peut être effectuée par des méthodes d'amplification bien connues de l'homme du métier telles que la réaction en chaîne de la polymérase (PCR), l'amplification par PCR multiplex, l'amplification par PCR nichée (nested PCR), l'amplification par réaction en chaîne par la ligase (ligase chain reaction). Au sens de l'invention, au moins une amorce nucléotidique englobe 1, 2, 3, 4, 5 et 6 amorces nucléotidiques. De manière préférée, l'amplification des acides nucléiques cibles correspondant aux gènes d'une combinaison selon l'invention est effectuée par PCR ou par PCR multiplex.

Brièvement, les procédés d'amplification de l'ADN, en particulier par PCR et PCR multiplex, sont basés sur la répétition successive d'un cycle comprenant trois phases : - une phase de dénaturation permettant, entre autres, de dissocier les duplex d'ADN contenus dans le milieu réactionnel, cette étape est effectuée généralement à une température d'environ 92°C et, - une phase d'hybridation ou d'appariement des amorces aux acides nucléiques matrices simples brins (en anglais : annealing phase). Cette phase est généralement effectuée à une température d'hybridation d'environ 5°C en dessous de la Tm des amorces utilisées. - une phase d'élongation qui permet la synthèse des brins complémentaires des acides nucléiques matrices hybridés à au moins une amorce. L'élongation est assurée par une ADN polymérase, par exemple, une Taq polymérase à une température d'environ 72°C. L'amplification par PCR multiplex est utilisée lorsque l'on souhaite que les étapes de détection des gènes appartenant à une combinaison selon la présente invention soient effectuées de manière simultanée. L'amplification par PCR est de préférence utilisée lorsque les gènes appartenant à une combinaison sont détectés séparément. Ainsi, dans certains modes de réalisation du procédé selon la présente invention, les étapes de détection des gènes d'une combinaison (Cl) ou d'une combinaison (C2) peuvent être effectuées séparément en réalisant pour chaque gène de la combinaison considérée la séquence d'étapes suivante : - réaliser une étape d'amplification par PCR de l'ADN contenu dans ledit échantillon à l'aide d'un couple d'amorces hybridant spécifiquement un acide nucléique cible correspondant au gène considéré et - détecter la présence éventuelle du produit d'amplification dudit acide nucléique cible Dans d'autres modes de réalisation, les étapes de détection des gènes d'une combinaison (Cl) ou d'une combinaison (C2) peuvent être effectuées simultanément en réalisant la séquence d'étapes suivante : - réaliser une étape d'amplification par PCR multiplex de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique à l'aide de deux couples d'amorces distincts, chaque couple d'amorces étant capable d'hybrider spécifiquement un acide nucléique cible correspondant à un gène de ladite combinaison, et - détecter les produits d'amplification éventuellement formés. Lorsque le procédé de dépistage comprend une étape de vérification qui est effectuée systématiquement, les étapes de détection des combinaisons (Cl) et (C2) peuvent être effectuées par PCR multiplex. Dans ce cas de figure, l'ADN de l'échantillon biologique est amplifié en présence de quatre couples d'amorces définies de la manière suivante : - un couple d'amorces hybridant spécifiquement l'acide nucléique cible (AN1) tel que défini précédemment, - un couple d'amorces hybridant spécifiquement l'acide nucléique cible (AN2) tel que défini précédemment, - un couple d'amorces hybridant spécifiquement l'acide nucléique cible (AN3) tel que défini précédemment, et - un couple d'amorces hybridant spécifiquement l'acide nucléique cible (AN4) tel que défini précédemment. L'homme du métier peut se référer aux règles générales établies dans l'état de la technique pour la conception de couples d'amorces adaptées pour la mise en oeuvre des différents modes de réalisation du procédé selon la présente invention.

L'homme du métier pourra se référer, par exemple, à l'ouvrage : Primer, a manual for laboratory (édité par Dieffenbach et Dveksler, seconde édition, CSHL Press, 2003), en particulier au chapitre 1 dudit ouvrage intitulé « Introduction to PCR ». Ainsi, il est préférable que les amorces destinées à être utilisées en même temps dans un procédé d'amplification présentent des Tm dans un intervalle ayant une amplitude d'au plus 3°C. Il est également préférable que les amorces ne comportent pas de structure secondaire telles qu'une épingle à cheveu, qu'elles ne puissent pas s'associer entre elles pour former des homo-dimères ou des hétéro-dimères et qu'elles ne comprennent pas des séquences répétées de plus de 4 nucléotides.

Pour la conception des couples d'amorces selon la présente invention, l'homme du métier peut utiliser des outils de conception in silico. On peut citer, à titre d'exemple, l'outil de conception Primer-Blast développé par le NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) qui permet de concevoir des couples d'amorces en fixant certains paramètres (Tm, écart de Tm, taille du produit d'amplification...) puis de vérifier leur spécificité par des recherches de type BLAST sur des bases de données de séquences. Chaque couple d'amorces sélectionné à l'issue des recherches sur les bases de données peut être testé expérimentalement pour vérifier leur efficacité à promouvoir l'amplification de l'acide nucléique cible d'intérêt. Les amorces peuvent être préparées par synthèse chimique. L'homme du métier pourra se référer, par exemple, à l'ouvrage de « Comprehensive Natural Products Chemistry », 1999 édité chez Elsevier Science Ltd. par Meth-Cohn et al. (ISBN: 978-0-08-091283-7) et plus spécifiquement au chapitre 7.05 intitulé « Oligonucléotide synthesis ». Enfin, les conditions de mise en oeuvre des étapes d'amplification par PCR ou par PCR multiplex peuvent être ajustées en modulant différents paramètres tels que les températures de dénaturation, d'élongation et d'hybridation, les concentrations des différents réactifs utilisés, la durée des différentes phases, le nombre de cycles à réaliser, le type d'ADN polymérase utilisée et en tenant compte des spécificités des amorces utilisées. Il s'agit de mises au point de routine que l'homme du métier pourra réaliser au vu de ses connaissances générales et au vu de l'enseignement d'ouvrages techniques tels que le manuel « PCR application Manual », édité par Roche Diagnostics GmbH, 2006, Sème édition. A titre d'exemple, on peut citer comme couples d'amorces utilisables pour amplifier par PCR l'ADN de l'échantillon biologique : - en vue de la détection du gène Xac3090 : le couple d'amorces constitué par l'amorce sens de séquence SEQ ID N°13 et l'amorce anti-sens de séquence SEQ ID N°14. - en vue de détection du gène AvrBsT: le couple d'amorces constitué par l'amorce sens de séquence SEQ ID N °15 et l'amorce anti-sens de séquence SEQ ID N °16. - en vue de détection du gène XopP : le couple d'amorces constitué par l'amorce sens de séquence SEQ ID N °17 et l'amorce anti-sens de séquence SEQ ID N °18. - en vue de détection du gène AvrXccB : le couple d'amorces constitué par l'amorce sens de séquence SEQ ID N °19 et l'amorce anti-sens de séquence SEQ ID N °20. A titre d'exemple, on peut citer comme couples d'amorces utilisables pour l'amplification par PCR ou PCR multiplex de l'ADN de l'échantillon biologique en vue de la détection des gènes AvrBsT et Xac3090 : - pour la détection du gène Xac3090 : le couple d'amorces constitué par l'amorce sens de séquence SEQ ID N °5 et l'amorce anti-sens de séquence SEQ ID N °6. Ce couple d'amorces permet l'obtention d'un fragment de 257 pb (paires de base) par amplification de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 - pour la détection du gène AvrBsT : le couple d'amorces constitué par l'amorce sens de séquence SEQ ID N °7 et l'amorce anti-sens de séquence SEQ ID N °8. Ce couple d'amorces permet l'obtention d'un fragment de 393 pb par amplification de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°2.

A titre d'exemple, on peut citer comme couples d'amorces utilisables pour l'amplification par PCR ou PCR multiplex de l'ADN de l'échantillon biologique en vue de la détection des gènes XopP et AvrXccB: - pour la détection du gène XopP : le couple d'amorces constitué par l'amorce sens de séquence SEQ ID N °9 et l'amorce anti-sens de séquence SEQ ID N °10. Ce couple d'amorces permet l'obtention d'un fragment de 656 pb par amplification de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°3. - pour la détection du gène AvrXccB: le couple d'amorces constitué par l'amorce sens de séquence SEQ ID N °11 et l'amorce anti-sens de séquence SEQ ID N °12. Ce couple d'amorces permet l'obtention d'un fragment de 427 pb par amplification de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°4. Dans certains modes de réalisation du procédé selon la présente invention, - la combinaison de gènes (Cl) comprend le gène Xac3090 et le gène AvrsBsT, et - les étapes de détection du gène Xac3090 et du gène AvrBsT comprennent la séquence d'étapes suivante : (a) réaliser une étape d'amplification par PCR multiplex de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique à l'aide de : - un premier couple d'amorces hybridant spécifiquement le premier acide nucléique cible (AN1) tel que défini précédemment et - un second couple d'amorces hybridant spécifiquement le second acide nucléique cible (AN2) tel que défini précédemment; et (b) détecter la présence éventuelle du produit d'amplification du premier acide nucléique cible (AN1) et celle du second acide nucléique cible (AN2).

Dans certains modes de réalisation du procédé selon l'invention, le premier couple d'amorces hybridant spécifiquement le premier acide nucléique cible (AN1) tel que défini précédemment dans la présente description consiste en : - un premier acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°5 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire et - un second acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°6 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire. Le second couple d'amorces hybridant spécifiquement le second acide nucléique cible (AN2) tel que défini précédemment dans la présente description consiste en : - un premier acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°7 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire et - un second acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°8 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire. Dans d'autres modes de réalisation du procédé de dépistage selon l'invention - le procédé de dépistage comprend, de plus, une étape de vérification comprenant la détection dans ledit échantillon biologique de la combinaison de gènes (C2) XopP/AvrXccB, et - les étapes de détection du gène XopP et du gène AvrXccB comprennent la séquence d'étapes suivantes: (a) réaliser une étape d'amplification par PCR multiplex de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique à l'aide de : - un premier couple d'amorces hybridant spécifiquement le premier acide nucléique cible (AN3) tel que défini précédemment et - un second couple d'amorces hybridant spécifiquement le second acide nucléique cible (AN4) tel que défini précédemment; et (b) détecter la présence éventuelle du produit d'amplification du premier acide nucléique cible (AN3) et celle du second acide nucléique cible (AN4).

Dans certains modes de réalisation du procédé selon l'invention, le premier couple d'amorces hybridant spécifiquement le premier acide nucléique cible (AN3) consiste en : - un premier acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°9 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire et - un second acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°10 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire ; et le second couple d'amorces hybridant spécifiquement l'acide nucléique cible (AN4) consiste en : - un premier acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°11 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire et - un second acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 10 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°12 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire. Dans l'ensemble des modes de réalisation précédemment décrits qui comprennent une étape d'amplification de l'ADN de l'échantillon biologique en présence d'au moins une amorce s'hybridant spécifiquement avec un acide nucléique cible selon l'invention, la détection du ou des produits d'amplifications peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme du métier. La détection du produit d'amplification peut être effectué à l'issue de l'étape d'amplification ou au cours de l'étape d'amplification.

A cette fin, l'homme du métier peut utiliser une des différentes stratégies de détection décrites dans l'état de la technique. Par exemple, le milieu réactionnel obtenu à l'issue de l'étape d'amplification est soumis à une électrophorèse sur gel de type agarose de manière à séparer les produits d'amplification en fonction de leur taille. Le gel d'électrophorèse est ensuite révélé par une méthode adaptée telle que la révélation au bromure d'éthidium. Dans cette méthode, le produit d'amplification est identifié par son poids moléculaire. Il est également possible d'effectuer un southern blot afin de détecter la bande d'ADN correspondant au produit d'amplification. Le produit d'amplification peut être également identifié par un test sandwich basé sur l'utilisation d'une première sonde immobilisée sur un support solide et utilisée pour capturer le produit d'amplification et d'une seconde sonde marquée permettant de détecter cette capture. Les produits d'amplification peuvent être également détectés (et quantifiés) au cours de la réaction d'amplification de l'ADN de l'échantillon biologique. On utilise alors la technique dite de PCR en temps réel (également appelé PCR quantitative). Dans le cadre de la présente invention, on utilisera, de préférence, les techniques de PCR en temps réel basées sur l'introduction dans le milieu réactionnel d'une sonde nucléotidique rapporteuse spécifique de l'amplicon à détecter. Cette sonde peut être marquée par une molécule fluorescente. La sonde rapporteuse peut également comporter, un agent d'extinction de la fluorescence qui va moduler la fluorescence émise au cours de la réaction d'amplification de l'ADN. Un tel type de sonde est utilisée dans la méthode communément appelée « TagMan assay » développée par Applied Biosystems (Holland et al., PNAS, 1991,88 :7276-7280) qui exploite l'activité 5' exonucléase de la Taq polymérase. Le fluorophore située en 5'- de la sonde est clivé au cours de la phase d'amplification par la Taq polymérase lorsque ladite sonde est hybridée à un brin d'ADN servant de matrice à l'élongation. On peut également utiliser les sondes dites « molecular beacon » caractérisées par une structure en épingle à cheveu (Tyagi and Kramer, 1996, Nat. Biotechnol.,1996, 16 :49-53). La structure « boucle » de la sonde comprend une séquence complémentaire de l'amplicon que l'on cherche à détecter et une tige formée par l'hybridation de deux séquences « bras ». Chaque séquence « bras » est liée à une extrémité à la séquence complémentaire et comprend à son autre extrémité soit le fluorophore, soit l'agent d'extinction de la fluorescence. Lorsque la sonde s'hybride avec l'amplicon, ladite sonde devient linéaire de telle sorte que l'agent de quenching et le fluorophore se retrouvent éloignés, ce qui restaure l'émission de fluorescence. On peut citer comme couple fluorophore-agent de quenching le couple FAM-Dabsyl. Quelque soit le type de sonde fluorescente utilisée, les propriétés de fluorescence de cette sonde nucléotidique rapporteuse sont modifiées suite à son hybridation à une séquence complémentaire de telle sorte que le suivi de la fluorescence à une longueur d'onde caractéristique permet de suivre la formation dans le temps du produit d'amplification. Selon un principe analogue, il est également possible de suivre la formation de plusieurs amplicons lors d'une PCR multiplex en introduisant dans le milieu réactionnel, pour chaque produit d'amplification à détecter, une sonde nucléotidique rapporteuse caractérisée par une longueur d'onde d'émission spécifique. Pour la mise en oeuvre des techniques par PCR en temps réel, l'homme du métier pourra se référer, entre autres, à l'ouvrage « PCR primer : A manual for laboratory » (édité par Dieffenbach et Dveksler, seconde édition, CSHL Press, 2003), en particulier au chapitre 1 dudit ouvrage intitulé « Introduction to PCR ». Dans certains modes de réalisation, l'étape d'amplification de l'ADN de l'échantillon biologique peut être précédée par une étape d'extraction de l'ADN dudit échantillon biologique.

On entend par « étape d'extraction de l'ADN » une étape consistant à séparer l'ADN d'un ou de plusieurs constituants cellulaires présents dans ledit échantillon biologique. Ladite étape permet, par définition, d'extraire au moins une partie de l'ADN génomique bactérien éventuellement présent dans l'échantillon biologique considéré. Il est à noter qu'en fonction de la nature de l'échantillon biologique et de la méthode d'extraction utilisée, l'ADN extrait peut comprendre de l'ADN bactérien génomique et de l'ADN provenant d'une autre source, par exemple, de l'ADN végétal. Le procédé d'extraction de l'ADN peut varier en fonction de la nature de l'échantillon biologique. L'homme du métier peut, par des expériences de routine, déterminer la séquence d'étapes à réaliser et les conditions expérimentales à utiliser pour réaliser l'extraction de l'ADN contenu dans un échantillon biologique donné. Ainsi, l'étape d'extraction de l'ADN contenu dans un échantillon biologique peut comprendre (i) une étape de lyse cellulaire, (ii) une étape d'élimination au moins partielle des constituants cellulaires autres que l'ADN par tout moyen connu de l'homme du métier tel que la précipitation, l'extraction ou la centrifugation et (iii) la récupération d'une solution enrichie en ADN. L'homme du métier pourra en particulier utiliser les kits de purification ou les réactifs de purification disponibles dans le commerce. A titre d'exemple, l'extraction de l'ADN de l'échantillon biologique peut être effectuée par la méthode standard au Phenol-Chloroforme en utilisant le réactif « TRI Reagent DNA/Protein isolation » commercialisée par Ambion. L'homme du métier pourra utiliser également le kit de purification développé par Promega « Wizard® Genomic DNA Promega Purification Kit », comme présenté ci-après dans les exemples de la présente demande ou encore s'inspirer de la méthode d'extraction de l'ADN à partir d'une culture bactérienne décrite par Audy et al. (Phytopathology, 1996, 361-366 voir plus précisément p.363). A titre d'exemple, pour réaliser l'extraction de l'ADN à partir de semences de Phaseolus vulgaris, l'homme du métier peut se référer, entre autres, aux méthodes décrites par Audy et al. (Phytopathology, 1996, 361-366 voir plus précisément p.363) Il est à noter que Audy et al. utilisent des méthodes d'extraction différentes en fonction du type recherché de contamination - externe ou interne - des semences par le pathovar phaseoli. . Il est à noter que les procédés décrits par Audy et al. pour l'extraction de l'ADN génomique à partir de semences peuvent être adaptés à d'autres échantillons biologiques obtenus, par exemple, à partir de gousses, de feuilles et/ou de tiges d'une plantule de Phaseolus vulgaris. Dans certains modes de réalisation, le procédé de dépistage du pathovar phaseoli dans un échantillon biologique comprend une étape d'enrichissement bactérien permettant d'augmenter le nombre de bactéries du pathovar phaseoli susceptibles d'être présentes dans ledit échantillon biologique.

Cette étape d'enrichissement bactérien peut consister en une étape de culture sur un milieu de culture sélectif ou semi sélectif du pathovar phaseoli. Cette étape d'enrichissement permet d'augmenter la sensibilité du test. Par ailleurs, combiner cette étape d'enrichissement bactérien avec une étape ultérieure d'amplification de l'ADN de l'échantillon peut permettre d'augmenter l'efficacité de l'étape d'amplification PCR en éliminant, au moins en partie, les inhibiteurs de PCR et en réduisant la présence de faux positif. Le principe basé sur la combinaison d'une étape d'enrichissement bactérien et d'une étape subséquente d'amplification de l'ADN de l'échantillon biologique a été décrit dans l'état de la technique sous le nom de Bio-PCR. L'homme du métier pourra se référer, en particulier, à l'article de Schaad et al., 1995, Phytopathology, 1995, 85, 243-248). Un exemple de mise en oeuvre de ce procédé peut comprendre les étapes consistant à: ^ faire macérer des graines de P. vulgaris dans de l'eau stérile pendant 24h. ^ procéder à un enrichissement bactérien en cultivant les bactéries présentes dans le macérât sur un milieu de culture adapté ^ procéder à l'amplification de l'ADN de la culture bactérienne, par exemple par PCR ou PCR multiplex, en présence d'une ou plusieurs amorces appropriées telles que décrites précédemment. A titre d'exemple de milieu adapté, on peut citer les milieux de culture de type MXP. La composition du milieu MXP est présentée dans le tableau 8 ci-après. Dans certains modes de réalisation, le procédé de dépistage selon la présente invention peut comprendre, à la fois, une étape d'enrichissement bactérien et une étape d'extraction de l'ADN de l'échantillon biologique.

c. Illustration d'un mode de réalisation particulier du procédé de dépistage du pathovar phaseoli Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de dépistage du pathovar phaseoli dans un échantillon biologique comprend : (i) une étape de détection de la combinaison (Cl) Xac3090/ AvrBsT dans ledit échantillon biologique, ladite étape (i) comprenant les étapes consistant à : - à amplifier par PCR multiplex l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique à l'aide du couple d'amorces de séquences SEQ ID N°5 et SEQ ID N°6 et du couple d'amorces de séquences SEQ ID N°7 et SEQ ID N °8 et - détecter la présence éventuelle du produit d'amplification du gène Xac3090 et celle du produit d'amplification du gène AvrBsT (ii) une éventuelle étape de vérification consistant à détecter la combinaison (C2) XopP/AvrXccB dans ledit échantillon biologique, ladite étape de vérification étant effectuée uniquement si la combinaison (Cl) n'est pas détectée comme présente à l'étape (i), ladite étape (ii) comprenant - à amplifier par PCR multiplex l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique à l'aide du couple d'amorces de séquences SEQ ID N°9 et SEQ ID N°10 et du couple d'amorces de séquences SEQ ID N°11 et SEQ ID N °12 et - détecter la présence éventuelle du produit d'amplification du gène XopP et celle du produit d'amplification du gène AvrXccB, étant entendu que : - le résultat du procédé de dépistage est négatif si aucune des combinaisons (Cl) et (C2) n'est détectée dans ledit échantillon biologique et - le résultat du procédé de dépistage est positif si au moins une des combinaisons (Cl) et (C2) est détectée dans ledit échantillon biologique. 2. Sondes et amorces selon la présente invention La présente invention a également pour objet des acides nucléiques utilisables, entre autres, pour la détection du pathovar phaseoli dans un échantillon biologique. Un acide nucléique selon la présente invention a une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprend au moins 12 nucléotides consécutifs issus d'un acide nucléique choisi parmi le groupe constitué par l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°5, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°6, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°7, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°8, l'acide nucléique de SEQ ID N°9, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°10, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N °11, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N °12 et les acides nucléiques de séquence complémentaire. Un acide nucléique ayant une longueur allant de 12 à 30 nucléotides englobe un acide nucléique ayant une longueur de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 et 30 nucléotides. Un acide nucléotide comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus d'un acide nucléique de référence englobe un acide nucléotide comprenant au moins 12, au moins 13, au moins 14, au moins 15, au moins 16, au moins 17, au moins 18, au moins 19, au moins 20 et au moins 21 nucléotides consécutifs issus d'un acide nucléique de référence, étant entendu que le nombre de nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de référence est limité par la taille dudit acide nucléique de référence.

Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce a une longueur allant de 18 à 23 nucléotides. Les acides nucléiques utilisables en tant que sondes ou amorces pour la détection du pathovar phaseoli peuvent être préparées par des méthodes classiques de synthèse chimique en phase solide, certaines de ces méthodes sont présentées dans l'ouvrage de synthèse « Comprehensive Natural Products Chemistry », édité en 1999 chez Elsevier Science Ltd. par Meth-Cohn et al. (ISBN: 978-0-08-091283-7) et plus spécifiquement au chapitre 7.05 intitulé « Oligonucléotide synthesis ». Dans un mode de réalisation particulier, l'acide nucléique selon la présente invention a une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprend au moins 12 nucléotides consécutifs issus d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°5. L'acide nucléique est en outre caractérisé en ce qu'il est capable d'hybrider spécifiquement dans des conditions de forte stringence un acide nucléique nucléique cible (AN1) choisi parmi le groupe constitué par : ^ un acide nucléique ayant au moins 950/0 d'identité de séquence avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 ou avec l'acide nucléique de séquence complémentaire, et ^ un acide nucléique ayant au moins 30 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de SEQ ID N°1 ou de l'acide nucléique complémentaire. Comme présenté précédemment, on entend par des conditions d'hybridation de forte stringence des conditions pour lesquelles la température d'hybridation est comprise entre 4°C et 6°C au-dessous du Tm, de préférence environ 5°C au-dessous de la Tm dudit acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce. Dans un autre mode de réalisation, l'acide nucléique selon la présente invention a une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprend au moins 12 nucléotides 20 consécutifs issus d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°6. L'acide nucléique est en outre caractérisé en ce qu'il est capable d'hybrider spécifiquement dans des conditions de forte stringence un acide nucléique nucléique cible (AN1) choisi parmi le groupe constitué par : ^ un acide nucléique ayant au moins 950/0 d'identité de séquence avec l'acide 25 nucléique de séquence SEQ ID N°1 ou avec l'acide nucléique de séquence complémentaire, et ^ un acide nucléique ayant au moins 30 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de SEQ ID N°1 ou de l'acide nucléique complémentaire.

30 Dans un autre mode de réalisation, l'acide nucléique selon la présente invention a une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprend au moins 12 nucléotides consécutifs issus d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°7. L'acide nucléique est, en outre, caractérisé en ce qu'il est capable d'hybrider spécifiquement, dans des conditions de forte stringence, un acide nucléique nucléique 35 cible (AN2) choisi parmi le groupe constitué par : ^ un acide nucléique ayant au moins 950/0 d'identité de séquence avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°2 ou avec l'acide nucléique de séquence complémentaire, et un acide nucléique ayant au moins 30 nucléotides consécutifs issus de l'acide 40 nucléique de SEQ ID N°2 ou de l'acide nucléique complémentaire.

Dans un autre mode de réalisation, l'acide nucléique selon la présente invention a une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprend au moins 12 nucléotides consécutifs issus d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°8. L'acide nucléique est, en outre, caractérisé en ce qu'il est capable d'hybrider spécifiquement dans des conditions de forte stringence un acide nucléique nucléique cible (AN2) choisi parmi le groupe constitué par : ^ un acide nucléique ayant au moins 950/0 d'identité de séquence avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°2 ou avec l'acide nucléique de séquence complémentaire, et ^ un acide nucléique ayant au moins 30 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de SEQ ID N°2 ou de l'acide nucléique complémentaire. Dans un autre mode de réalisation, l'acide nucléique selon la présente invention a une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprend au moins 12 nucléotides consécutifs issus d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°9.

L'acide nucléique est en outre caractérisé en ce qu'il est capable d'hybrider spécifiquement dans des conditions de forte stringence un acide nucléique nucléique cible (AN3) choisi parmi le groupe constitué par : ^ un acide nucléique ayant au moins 950/0 d'identité de séquence avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°3 ou avec l'acide nucléique de séquence complémentaire, et ^ un acide nucléique ayant au moins 30 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de SEQ ID N°3 ou de l'acide nucléique complémentaire.

Dans un autre mode de réalisation, l'acide nucléique selon la présente invention a une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprend au moins 12 nucléotides consécutifs issus d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°10. L'acide nucléique est en outre caractérisé en ce qu'il est capable d'hybrider spécifiquement dans des conditions de forte stringence un acide nucléique nucléique cible (AN3) choisi parmi le groupe constitué par : ^ un acide nucléique ayant au moins 950/0 d'identité de séquence avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°3 ou avec l'acide nucléique de séquence complémentaire, et un acide nucléique ayant au moins 30 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de SEQ ID N°3 ou de l'acide nucléique complémentaire.

Dans un autre mode de réalisation, l'acide nucléique selon la présente invention a une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprend au moins 12 nucléotides consécutifs issus d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°11.

L'acide nucléique est en outre caractérisé en ce qu'il est capable d'hybrider spécifiquement dans des conditions de forte stringence un acide nucléique nucléique cible (AN4) choisi parmi le groupe constitué par : ^ un acide nucléique ayant au moins 950/0 d'identité de séquence avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°4 ou avec l'acide nucléique de séquence complémentaire, et ^ un acide nucléique ayant au moins 30 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de SEQ ID N°4 ou de l'acide nucléique complémentaire.

Dans un autre mode de réalisation, l'acide nucléique selon la présente invention a une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprend au moins 12 nucléotides consécutifs issus d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N°12. L'acide nucléique est en outre caractérisé en ce qu'il est capable d'hybrider spécifiquement dans des conditions de forte stringence un acide nucléique cible (AN4) choisi parmi le groupe constitué par : ^ un acide nucléique ayant au moins 950/0 d'identité de séquence avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°4 ou avec l'acide nucléique de séquence complémentaire, et ^ un acide nucléique ayant au moins 30 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de SEQ ID N°4 ou de l'acide nucléique complémentaire.

Dans certains modes de réalisation, l'acide nucléique selon la présente invention est choisi dans le groupe constitué par l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°5, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N °6, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N °7, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°8, l'acide nucléique de SEQ ID N°9, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N °10, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N °11, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°12 et les acides nucléiques de séquence complémentaire.

Les acides nucléiques selon la présente invention sont utilisables en tant qu'amorce ou sonde pour la détection du pathovar phaseoli dans un échantillon biologique. Les acides nucléiques selon la présente invention peuvent être utilisés, en particulier, en tant qu'amorce ou sonde pour la détection d'un gène choisi parmi le groupe constitué par le gène Xac3090, le gène AvrBsT, le gène XopP et le gène AvrXccB dans un échantillon biologique. Dans le contexte de la présente invention, « un acide nucléique est utilisable en tant qu'amorce » signifie que ledit acide nucléique peut être utilisé dans une étape d'amplification d'un acide nucléique cible choisi parmi (AN1), (AN2), (AN3) et (AN4).

Dans le contexte de la présente invention, « un acide nucléique est utilisable en tant que sonde » signifie que ledit acide nucléique permet la détection directe d'un acide nucléique cible ou d'un produit d'amplification dudit acide nucléique cible. A cette fin, ledit acide nucléique peut être couplé à un marqueur chimique détectable ou immobilisé sur un support solide. A titre d'exemple, le marqueur chimique peut consister en un isotope radioactif (32P 3H, 35S), un fluorophore (5-bromodéoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène), en une enzyme telle que la HRP ou encore en un ligand tels que la biotine qui peut être détectée via une streptavidine marquée.

Les supports solides adaptés sont également bien connus de l'homme du métier et comprennent, entre autres, les puits de plaques de micro-titration, des billes de polystyrène, des billes magnétiques, des matériaux à base de nitrocellulose, des microparticules telles que des particules de latex. 3. Kit pour le dépistage du pathovar Xanthomonas axonopodis pv. Phaseoli dans un échantillon biologique

Un objet supplémentaire de la présence invention est un kit pour le dépistage du pathovar Xanthomonas axonopodis pv. Phaseoli dans un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend deux couples d'amorces, chaque couple d'amorces permettant d'amplifier les deux gènes d'une combinaison (C1) telle que définie précédemment, à savoir, une combinaison choisie parmi le groupe constitué par la combinaison AvrBsT/Xac3090, la combinaison AvrBsT/XopP et la combinaison AvrBsT/AvrXccB.

Dans certains modes de réalisation, le kit de dépistage comprend deux couples d'amorces supplémentaires permettant d'amplifier les deux gènes d'une combinaison (C2) choisie parmi le groupe constitué par la combinaison Xac3090/XopP, la combinaison Xac3090/AvrXccB et la combinaison XopP/AvrXccB, étant entendu que la combinaison (C1) et la combinaison (C2) ne comporte pas de gène en commun.

En d'autres termes, le kit de dépistage comprend quatre couples d'amorces permettant d'amplifier les gènes AvrBst, Xac3090, AvrXccB et XopP. Un autre objet de la présente invention est un kit de dépistage du pathovar Xanthomonas axonopodis pv. Phaseoli dans un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend au moins un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce choisi parmi le groupe constitué les acides nucléiques présentés dans la partie 2 de la présente description intitulée « Sondes et amorces selon la présente invention » Dans certains modes de réalisation, le kit de dépistage du pathovar phaseoli selon la présente invention comprend au moins un couple d'amorces choisi parmi : - un couple d'amorces consistant en : o un premier acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°5 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire et o un second acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°6 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire ; - un couple d'amorces consistant en : o un premier acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°7 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire et o un second acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°8 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire ; - un couple d'amorces consistant en : o un premier acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°9 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire et o un second acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°10 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire ; et un couple d'amorces consistant en : o un premier acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°11 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire et o un second acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°12 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire

Dans d'autres modes de réalisation, le kit de dépistage du pathovar phaseoli selon la présente invention comprend au moins un couple d'amorces choisi parmi : - le couple d'amorces de séquences SEQ ID N °5 et SEQ ID N °6, 40 - le couple d'amorces de séquences SEQ ID N °7 et SEQ ID N °8, 25 30 35 le couple d'amorces de séquences SEQ ID N °9 et SEQ ID N °10 et - le couple d'amorces de séquences SEQ ID N °11 et SEQ ID N °12

L'expression « au moins un couple d'amorces » englobe 1 couple d'amorces, 2 couples d'amorces, 3 couples d'amorces et 4 couples d'amorces précédemment cités. Dans certains modes de réalisation le kit de dépistage selon la présente invention comprend au moins un couple d'amorces choisi parmi : - le couple d'amorces de séquences SEQ ID N °5 et SEQ ID N °6, et - le couple d'amorces de séquences SEQ ID N °7 et SEQ ID N °8.

Le kit de dépistage selon la présente invention peut comprendre, en outre des sondes et amorces précédemment indiqués, un ou plusieurs moyens de mise en oeuvre d'une étape d'amplification de l'ADN d'un échantillon biologique tels que : ^ un tampon d'hybridation, une Taq polymérase, et ^ un mélange de nucléotides dATP, dGTP, dCTP et dTTP Le kit de dépistage peut, en outre, comprendre un témoin positif constitué d'ADN génomique provenant d'une ou plusieurs souches bactériennes appartenant aux lignées phylogénétiques du pathovar phaseoli.

Le kit de dépistage selon la présente invention peut comprendre également un ou plusieurs moyens permettant la détection des produits d'amplification.

La présente invention est également illustrée, sans y être en aucune manière limitée, par les exemples suivants. EXEMPLES

1. Matériels et méthodes

30 a. Matériel bactérien et condition de culture Les souches bactériennes on été gracieusement fournies par la CFBP Collection française de bactéries phytopathogènes) du centre de l'Institut National de Recherche Agronomique (INRA) d'Angers. Les souches bactériennes testées comprennent des souches bactériennes appartenant aux quatre lignées phylogénétiques du pathovar 35 phaseoli. Afin de tester la spécificité du test de dépistage selon la présente invention, la présence des gènes AvrBsT, Xac3090, XopP et AvrXccB a été recherchée, via la mise en oeuvre d'amplifications PCR multiplex, chez différentes souches bactériennes appartenant en majorité au genre Xanthomonas. Après décongélation, les cellules sont repiquées sur un milieu solide (TSA 100/0) 40 puis laissées à incuber à 28°C durant 48h. Elles sont ensuite cultivées en milieu liquide25 LP (levure, Biogélytone et eau distillée), un dérivé du milieu LPGA sans glucose ni Agar Agar. L'incubation est réalisée à 28°C pendant une nuit sur table d'agitation pour garantir une bonne oxygénation de la culture. b. Extraction de l'ADN génomique bactérien L'extraction de l'ADN génomique à partir de suspension bactérienne a été réalisée à l'aide du kit « Wizard Genomic DNA Purification Kit » (Promega). Environ 2 ml de suspension bactérienne sont introduits dans un microtube stérile de 2 ml puis centrifugés à 18°C pendant 5 min à 13000 rpm. Le surnageant est éliminé et le culot repris par 600 pl de solution de lyse nucléique. Par la suite, les tubes sont incubés dans un bain-marie à 80°C pendant 5 min pour continuer l'étape de lyse cellulaire. Après l'incubation, 3 pl de RNase à 4 ng/ml sont ajoutés. Les tubes sont incubés au bain-marie à 37°C pendant environ 30 min. 200 pl de solution de précipitation des protéines sont ajoutés et les tubes sont incubés 5 min dans de la glace puis centrifugés à 4°C à 13 000 tours/min pendant 5 min. Le surnageant est récupéré et introduit dans un microtube comprenant 600 pl d'isopropanol. Le mélangé obtenu est centrifugé à 4°C pendant 5 min à 13000 rpm. L'ADN est ensuite lavé par de l'éthanol à 700/0 (600 pl environ) qui permet d'éliminer l'isopropanol résiduel puis une centrifugation pendant 5 min à 13000 rpm à 4°C est effectuée. Le surnageant est éliminé. Le culot d'ADN est séché à l'étuve à 68 °C pendant environ 15 min puis repris à l'aide de 100 pl d'eau ultra pure stérile. Les tubes sont enfin incubés au bain-marie à 65 °C pendant 1 h puis stockés à 4°C. La pureté et la concentration de la solution d'ADN génomique sont déterminées par spectrophotométrie (mesure de l'absorbance à 260 nm et 280 nm) à l'aide d'un spectrophotomètre (NanoDrop). La solution d'ADN génomique est diluée de manière à obtenir une concentration en ADN génomique de 1 ng/µl ou 5 ng/µl en vue de la mise en oeuvre de la PCR.

c. Préparation d'extrait d'ADN à partir de suspension bactérienne bouillie 1,5 mL de suspension bactérienne sont mis à bouillir durant 10-15 minutes au bain-marie afin de provoquer l'éclatement des cellules. La suspension est ensuite refroidie 10 minutes dans un bain de glace. Après refroidissement, la suspension bouillie est centrifugée pendant 2 min à 6000 rpm (rotations par minute) afin de séparer l'ADN des débris cellulaires. Le surnageant contenant l'ADN est récupéré, aliquoté et conservé à -80°C. Le surnageant est un extrait d'ADN pouvant être utilisé directement comme matrice d'amplification.

d. Préparation des amorces Des couples d'amorces utilisables pour l'amplification par PCR multiplex des gènes Xac3090 et AvrBsT d'une part, et des gènes XopP et AvrXccB d'autre part, sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous. Les amorces ont été préparées par synthèse chimique et purifiées par HPLC.

Tableau 2 : Couples d'amorces selon la présente invention utilisables pour la détection du aathovar phaseoli déGènes tectés Amorces IpE4° Sens : 5'-3' Taille du produit d'amplification attendu (pb) Am1 F 5 5'-CCATGCTGAGCACGGTCATT-3' Xac3090 (Sens) 257 Am l R 6 5'-CGCCTTCCAGTTGCTGACAT3' Pour PCR Antisens multiplex 1 Am2F 7 5'-ACGAGCCCTTCCCAAACTAGC-3' AvrBsT Sens 393 Am2R 8 5'-TACCAACATCGTACGCTTCCC-3' Antisens Am3F 9 5'-CGTCAGTGAGTGCTCGGTTG-3' XopP Sens 656 Am3R 10 5'-TCAGAGCCCTGGAAGCAAGA-3' Pour PCR Antisens multiplex 2 Am4F 11 5'-CGTTGAAGGGCGTGAAGAAC-3' AvrXccB Sens 427 Am4R 12 5'-TACTCGGAGTCGGCGAAAAG-3' Antisens Afin de comparer le test de détection par PCR selon la présente invention avec les 10 tests décrits dans l'état de la technique pour la détection du pathovar phaseoli, les amorces présentées ci-dessous ont également été préparées par synthèse chimique.

Tableau 3 : Maraueurs et couples d'amorces décrits dans l'état de la techniaue Marqueurs Amorces SEQ Sens : 5'-3' Taille du produit ID N° d'amplification attendu (pb) Pour PCR Séquence Xpha1 ACCCGCTGGGCCGGCTTC comparative d'insertion (sens) 21 167 pb 1 (Alavi et al., Xpha2 2007) (antisens) 22 CCTGCCACGCCTTGACCTC Pour PCR Marqueur X4c (sens) 23 GGCAACACCCGATCCCTAAACAGG comparative RAPD (Audy 730 pb X4e 2 et al., 1996) CGCCGGAAGCACGATCCTCGAAG (antisens) 24 Pour PCR Marqueur Xf1 (sens) 25 ACGCAAGACCCATCGTCATTC comparative RAPD (Toth 450 b 3 et al., 1998 p Xf2 ATGGCTCAAGGAAAAACTTTCAGG (antisens) 26 15 e. Conditions de mise en oeuvre des étapes d'amplification par PCR ou PCR multiplex Les amplifications des ADN génomiques issus des différentes souches bactériennes ont été effectuées par PCR ou PCR multiplex en utilisant les couples d'amorces présentées dans les tableaux 3 et 4 ci-dessus. La taille du produit 20 d'amplification escompté pour chaque couple d'amorces est également présentée dans ces tableaux.

Le tableau 4 ci-dessous présente la composition du milieu réactionnel. Dans le cas où deux couples d'amorce sont utilisées simultanément (PCR multiplex), la concentration finale de chaque amorce dans le milieu est 0,17 µM. Pour chaque couple d'amorces, les conditions de mise en oeuvre de la PCR ont 5 été optimisées et sont présentées dans les tableaux 5 et 6 ci-après. A l'issue de l'amplification par PCR ou PCR multiplex, les produits d'amplification sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1,2% ou à 1,50/0, durant 20 à 30 minutes, à 135 V. Après migration, les gels sont plongés pendant 15 min dans une solution de bromure d'éthidium et révélés sous lumière UV. 10 Tableau 4 : Composition du milieu réactionnel pour l'amplification des ADN génomiques bactériens par PCR ou PCR multiplex Réactifs Concentration Concentration Volume pour une initiale finale réaction (pl) Tampon 5X 5X 1 X 3,6 dNTP (2,5 mM) 2,5 mM 0,22 mM 1,6 Amorce sens 20 µM 0,17 µM 0,15 Amorce anti-sens 20 µM 0,17 µM 0,15 Go Taq (Promega) 5 U/µL 0,02 U/µL 0,08 H2O qsp 18 pl 10,42 ADN 1 ou 5 ng/µL 0,11 ou 0,55 ng/µL 2 TOTAL 18 15 dNTP : mélange équimolaire de désoxyadénosine triphosphate, désoxyguanosine triphosphate, désoxythymidine triphosphate et désoxycytidine triphosphate (dATP, dGTP, dCTP et dTTP). Go Taq : polymérase commerciale sous forme de solution aqueuse (tampon 5X comprenant une concentration en MgCl2 de 2 mM) La composition du milieu réactionnel présenté dans le Tableau 5 est fournie à 20 titre indicatif et peut être modifiée en faisant varier les concentrations des différents constituants.

Tableau 5: Conditions de mise en oeuvre des PCR multiplex selon la présente invention. L'étape « Pré-cycle » correspondant à l'étape initiale de dénaturation, l'étape 25 post-cycle correspond à l'étape finale d'élongation. Le cycle PCR comprend une phase de dénaturation, une phase d'hybridation et une phase d'élongation.

PCR multiplex Etapes réalisées Température Temps Pour amplification Pré-cycle 95°C 5 min Xac3090 et AvrBsT 95 °C 30 sec Cycles (nombre : 35) 63°C 30 sec 72 °C 45 sec Post-cycle 72°C 5 min Pour amplification XopP Pré-cycle 95°C 5 min et AvrXccB 95 °C 30 sec Cycles (nombre : 35) 63°C 30 sec 72 °C 45 sec Post-cycle 72°C 5 min Tableau 6 : Conditions de mise en oeuvre d'amplifications PCR utilisant les couples d'amorces décrits dans l'état de la technique. L'étape « Pré-cycle » correspondant à l'étape initiale de dénaturation, l'étape post-cycle correspond à l'état final d'élongation. Le cycle PCR comprend une phase de dénaturation, une phase d'hybridation et une phase d'élongation. Couple d'amorces Etapes réalisées Température Temps Pré-cycle 94°C 3 min 95 °C 30 sec Xpha1-Xpha2 Cycles (nombre : 35) 60°C, 63°C ou 65°C 45 sec 72 °C 45 sec Post-cycle 72°C 3 min Pré-cycle 95°C 2 min 95°C 1 min X4c-X4e Cycles (nombre : 35) 72°C 1 min 72°C 1 min Post-cycle 72°C 10 min Pré-cycle 94°C 3 min 94 °C 30 sec Xf1-Xf2 Cycles (nombre : 35) 65°C 30 sec 72°C 1 min Post-cycle 72°C 10 min 2. Procédés de dépistage du pathovar phaseoli selon la présente invention

a. Spécificité de détection Les ADN génomiques de 110 souches bactériennes ont été amplifiés séparément par le procédé de PCR multiplex 1 en présence des amorces Am1 F, Am1 R, Am2F et Am2R et par le procédé de PCR multiplex 2 en présence des amorces Am3F, Am3R, Am4F et Am4R. Le test de dépistage utilisant la PCR multiplex 1 permet la détection de l'ensemble des souches bactériennes appartenant au pathovar phaseoli puisqu'on observe la présence des 2 bandes caractéristiques des produits d'amplification attendus, à savoir à 393 pb et à 257 pb, pour l'ensemble des 27 souches testées appartanant au pathovar phaseoli, qu'elles appartiennent à la lignée GL1, GL2, GL3 ou fuscans. La figure 1 présente le gel d'électrophorèse obtenu pour des souches spécifiques du pathovar phaseoli, à savoir, NF1, NF2, NF3 et fuscans (voir Figure 1, gel A).

Ces produits d'amplification ne sont pas observés simultanément chez les souches bactériennes n'appartenant pas au pathovar phaseoli. En d'autres termes, aucun faux positif n'est observé grâce à ce test, puisque le test est considéré positif uniquement lorsqu'on observe une amplification simultanée des deux fragments d'ADN correspondant aux gènes AvrBst et Xac3090. Le test de dépistage basé sur la PCR multiplex 2 est également spécifique du pathovar phaseoli puisque les bandes caractéristiques des amplicons attendus, à savoir les bandes à 656 pb et à 427 pb pour les gènes XopP et AvrXccB respectivement, ne sont pas simultanément observables pour les souches bactériennes n'appartenant pas au pathovar phaseoli. Il est à noter que deux fragments d'amplification sont observables chez la souche CFBP 2532 de X. oryzae pv. oryzae mais avec des tailles supérieures à la taille attendue : un tel résultat ne constitue donc pas un faux positif. A titre d'illustration, on peut se reporter à la figure 1 qui présente le gel d'électrophorèse obtenu pour des souches spécifiques du pathovar phaseoli, à savoir, 15 NF1, NF2, NF3 et fuscans (voir Figure 1, gel B). Il est à noter que pour les souches bactériennes appartenant à la lignée phylogénétique GL1, on n'observe pas de bande à 657 pb correspondant au produit d'amplification du gène XopP par les sondes Am3F et Am3R. L'absence de signal met en lumière une divergence dans la séquence du gène XopP chez ces souches par 20 rapport aux autres souches du pathovar phaseoli. Pour surmonter ce défaut de détection, il est possible de concevoir un nouveau couple d'amorces pour la détection du gène XopP qui soit fonctionnel pour l'ensemble des souches bactériennes du pathovar phaseoli A titre d'exemple, il est possible d'utiliser le couple d'amorces de séquence SEQ ID N°17 et SEQ ID N°18 qui permet d'amplifier un fragment de 1936 pb 25 comprenant le gène XopP chez toutes les lignées phylogénétiques du pathovar phaseoli. Il est à noter que le couple d'amorces Am3F et Am3R peut être avantageusement utilisé pour discriminer les souches de la lignée GL1 des souches bactériennes appartenant aux lignées phylogénétiques GL2, GL3 et fuscans du 30 pathovar phaseoli. En particulier, ce couple d'amorces pourrait être utilisé dans une étape de discrimination des lignées phylogénétiques du pathovar phaseoli telle que présentée dans la présente description. L'ensemble des résultats de cette étude est présenté dans le tableau 7 ci-après. Tableau 7: résultats des expériences PCR pour différentes souches 35 bactériennes Souches CFBP Amplification Amplification amorces 1 et 2 amorces 3 et 4 X. campestris pv. campestris race 8 1124 0 0 X hyacinthi 1156 0 0 X arboricola pv.corylina 1159 0 0 Xylophilus ampelinus 1192 0 0 Acidovorax avenae subsp. avenae 1201 0 0 Souches CFBP Amplification Amplification amorces 1 et 2 amorces 3 et 4 Herbaspirilium rubrisubalbicans 1202 0 0 Xanthomonas axonopodis pv. vasculorum 1215 0 0 Herbaspirilium rubrisubalbicans 1295 0 0 X .campestris pv. incanae 1371 0 0 Pseudomonas savastano'i pv.phaseolicola 1390 0 0 Pseudomonas syringae pv.syringae 1392 0 0 Erwinia amylovora 1430 0 0 Pectobacterium atrosepticum 1526 0 0 Dickeya sp. 1537 0 0 Xanthomonas axonopodis pv.glycines 1559 0 0 X .campestris pv. Campestris race 5 1712 0 0 X. campestris pv. campestris race 1 1869 0 0 Ralstonia solanacearum 1960 0 0 Pectobacterium carotovorum 2046 0 0 subsp.carotovorum Dickeya diffenbaciae 2051 0 0 X. translucens pv.poae 2057 0 0 Pseudomonas cichorii 2101 0 0 X oryzae pv.oryzicola 2286 0 0 Agrobacterium tumefaciens 2413 0 0 Burkholderia andropogonis 2421 0 0 Acidovorax avenae subsp.cattleyae 2423 0 0 Acidovorax avenae subsp. avenae 2425 0 0 Pseudomonas corrugata 2431 0 0 Acidovorax facilis 2441 0 0 Acidovorax delafieldii 2442 0 0 X. campestris pv. incanae 2527 0 0 X. horturum pv.pelargonii 2533 0 0 X. translucens pv.secalis 2539 0 0 X. cucurbitae 2542 0 0 Acidovorax anthurii 3232 0 0 Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria 3271 0 0 Curtobacterium flacuumfaciens pv.betae 3509 0 0 X translucens pv.graminis 3524 0 0 Acidovorax temperans 3610 0 0 X arboricola pv.pruni 3894 0 0 X. cynarae 4188 0 0 Acidovorax avenae subsp.citrulli 4459 0 0 Acidovorax konjaci 4460 0 0 X. sacchari 4641 0 0 X. pisi 4643 0 0 X. melonis 4644 0 0 X codiaei 4690 0 0 X theicola 4691 0 0 Acidovorax valerianellae 4730 0 0 X. campestris pv. campestris race 6 4954 0 0 X. campestris pv. campestris race 9 4955 0 0 Clavibacter michiganensis 4999 0 0 subsp. michiganensis Xanthomonas axonopodis pv. axonopodis 5141 0 0 X campestris pv.campestris 5241 0 0 Pseudomonas brassicacearum 5593 0 0 Souches CFBP Amplification Amplification amorces 1 et 2 amorces 3 et 4 Xanthomonas axonopodis pv.vesicatoria 5618 0 0 X. campestris pv.campestris race 3 5683 0 0 Xanthomonas axonopodis pv. vasculorum 5696 0 0 X. campestris pv.armoriacae 5824 0 0 X campestris pv.barbarae 5825 0 0 X campestris pv.barbarae 5826 0 0 X. campestris pv. raphani 5827 0 0 X horturum pv.hederae 5858 0 0 X fragariae 6766 0 0 X alblineans 7063 0 0 Pseudomonas savastanoi pv. 7087 0 0 phaseolicola race 6 Xanthomonas axonopodis pv.citrumelo 3369 0 1 bande Xanthomonas axonopodis pv.citri 3371 0 1 bande Xanthomonas axonopodis pv. vasculorum 5695 0 1 bande X. campestris pv.campestris race 4 5817 0 1 bande X. campestris pv.campestris race 4 277g 0 1 bande X. campestris pv.campestris race 2 305g 0 1 bande X. campestris pv.campestris race 6 HR16181 f 0 1 bande X bromi 1976 1 bande 0 Xanthomonas axonopodis pv.manihotis 2624 1 bande 0 X. cassavae 4642 1 bande 0 Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria 6817 1 bande 0 Xanthomonas axonopodis 2530 0 2 bandes pv. malvacearum X. oryzae pv.oryzae 2532 0 2 bandes - amplicons de taille différente à celle des amplicons attendus. X vasicola pv.holcicola 2543 1 bande 1 bande Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6996 2 bandes 2 bandes (NP3) Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 412 2 bandes 1 bande' (NF]) Xanthomonas axonopodis pv.phaseoli 2534 2 bandes 1 bande' (NF]) Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6164 2 bandes 1 bande' (NF]) Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6982 2 bandes 1 bande' (NF]) Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6983 2 bandes 1 bande' (NF]) Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6984 2 bandes 1 bande' (NF]) Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6985 2 bandes 1 bande' (NF]) Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 1815 2 bandes 2 bandes (var. fuscans) Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6165 2 bandes 2 bandes var.. fuscans Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6166 2 bandes 2 bandes var. fuscans Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6960 2 bandes 2 bandes Souches CFBP Amplification Amplification amorces 1 et 2 amorces 3 et 4 (var. fuscans) Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6965 2 bandes 2 bandes (var. fuscans) Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6969 2 bandes 2 bandes (var. fuscans) Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6970 2 bandes 2 bandes (var. fuscans) Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6971 2 bandes 2 bandes (var. fuscans) Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6975 2 bandes 2 bandes (var. fuscans) Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6979 2 bandes 2 bandes (var. fuscans) Xanthomonas axonopodis pv.phaseoli 6988 2 bandes 2 bandes (NF2) Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6989 2 bandes 2 bandes (NF2) Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6990 2 bandes 2 bandes (NF2) Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6991 2 bandes 2 bandes (NF2) Xanthomonas axonopodis pv.phaseoli 6992 2 bandes 2 bandes (NF3) Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6993 2 bandes 2 bandes (NF3) Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 6994 2 bandes 2 bandes (NF3) * Pour les souches de la lignée GL 1 du pathovar phaseoli, on n'observe pas d'amplification du gène XopP avec le couple d'amorces Am3F et Am3R. Néanmoins, la présence du gène XopP a été mise en évidence en utilisant le couple d'amorces SEQ ID N 017 et SEQ ID N 018 qui permet une amplification effective de ce gène chez toutes les lignées du pathovar phaseoli.

b. Sensibilité de détection Pour tester la sensibilité du test, nous avons effectué une première suspension bactérienne dans 1 ml d'eau stérile en introduisant des colonies d'une souche de X.axonopodis pv. phaseoli. Une gamme de dilution allant jusqu'à 106 a été préparée à partir de cette suspension bactérienne mère. L'étalement est réalisé en déposant 50 pl de chaque dilution sur 3 boîtes de milieu LB qui sont placées à 28 °C jusqu'à l'apparition de nouvelles colonies. Le comptage du nombre de colonies sur chaque boîte nous a permis de déterminer le nombre d'UFC présent dans la suspension mère.

En moyenne, nous avons dénombré 77 UFC pour 50 pl à la dilution 10-6 soit 1,54x109 UFC.mI-' dans la suspension mère. L'ADN génomique contenu dans chaque suspension de dilution a été extrait selon le protocole décrit au point Lb ci-dessus et soumis à une amplification par PCR multiplex en présence soit de la combinaison d'amorces (Am-1 F, Am1 R, Am2F, Am2R), soit de la combinaison d'amorces (Am3F, Am3R, Am4F, Am4R). Les produits d'amplifications ont été ensuite analysés par électrophorèse avec révélation au BET. Les produits d'amplification des gènes Xac3090 et AvrBsT (fragments de 257 pb et de 393 pb, respectivement) sont nettement détectables sur les gels d'électrophorèse obtenus pour les différentes dilutions bactériennes utilisées. Ainsi, un test de dépistage utilisant la combinaison d'amorces (Ami F, Am1 R, Am2F, Am2R) par PCR multiplex présente un seuil de détection de l'ordre de 103 UFC/ml. Le test de dépistage basé sur la détection des gènes XopP et AvrXccB présente une sensibilité plus faible : les produits d'amplification ne sont pas détectés pour les dilutions par 105 et par 106 de la suspension mère. Le seuil de détection de ce test se situe donc entre 104 et 105 UFC/ml. En pratique, dans le cas de dépistage effectué à partir d'échantillons biologiques de type semence, le seuil de détection pourrait être amélioré en faisant précéder l'étape d'amplification PCR par une étape d'enrichissement bactérien (méthode de type B10- PCR).

III. Comparaison avec les méthodes de l'état de la technique Le procédé de dépistage basé sur l'utilisation de la PCR multiplex 1 consistant à détecter les gènes Xac3090 (grâce aux amorces Am1 F et Am1 R) et le gène AvrBsT (grâce aux amorces Am2F et Am2R) a été comparé à des tests de dépistage basé sur la détection par PCR : - de la séquence d'insertion ISXax1 amplifiée par les amorces Xpha1 et Xpha2 (fragment amplifié de 167 pb) ^ du marqueur RAPD amplifié par les amorces X4c et X4e ou ^ Du marqueur RAPD amplifié par les amorces Xf1 et Xf2 Cette étude comparative a été réalisée sur 137 souches bactériennes représentatives de la diversité des bactéries phytopathogènes de X. axonopodis à partir d'extraits d'ADN provenant de suspensions bouillies. En dépit d'essais visant à améliorer sa spécificité notamment par l'augmentation de la stringence, le test de dépistage basé sur l'utilisation des amorces Xpha1 et Xpha2 n'est pas spécifique du pathovar phaseoli puisque que des produits d'amplification sont observables pour les souches appartenant au pathovar vesicatoria. Par ailleurs, on observe de très nombreuses bandes sur les gels d'électrophorèse, ce qui illustre la faible spécificité des sondes Xpha1 et Xpha2 pour la séquence d'insertion ISXax1 et, en occurrence, la forte occurrence d'amplifications résultant d'hybridations non spécifiques des sondes. Le test de dépistage basé sur l'utilisation des amorces X4c-X4e et la détection d'un fragment de 730 pb n'est pas non plus spécifique du pathovar phaseoli. En effet, l'utilisation de ce couple d'amorces induit l'amplification du fragment d'intérêt chez des souches appartenant au pathovar dieffenbachiae et au pathovar mangiferaeindicae de l'espèce X. axonopodis. Par ailleurs, ce test de dépistage ne permet pas de détecter l'ensemble des souches du pathovar phaseoli puisque aucune bande d'amplification n'a été détectée pour plusieurs souches telles que la souche CFB P6165. Le test de dépistage basé sur les amorces Xf1-Xf2 et l'amplification d'un 5 fragment de 450 pb ne permet que la détection des souches bactériennes appartenant à la lignée phylogénétique fuscans du pathovar phaseoli. Contrairement aux tests de dépistage décrits ci-dessus, le procédé de dépistage selon la présente invention basé sur la PCR multiplex 1 fournit un résultat positif (détection des deux produits d'amplification correspondant aux gènes Xac3090 et 10 AvrBsT) pour l'ensemble des souches bactériennes appartenant au pathovar phaseoli. Aucun faux positif n'a été détecté.

IV. Procédé de dépistage par BIO-PCR Des semences de P.vulgaris préalablement contaminées par une souche de X. 15 axonopodis pv. phaseoli sont mises à macérer 24h dans de l'eau distillée stérile. Le macérât obtenu est mis à cultiver sur le milieu sélectif MXP pendant 24h ou 48h. La composition du milieu MXP (Claflin et al., 1987, Phytopathology 77, 730-734. ) est présentée ci-après dans le tableau 8. Les PCR multiplex décrites dans le tableau 6 sont mises en oeuvre. A titre de 20 témoin négatif, on utilise des cultures obtenues à partir de macérât de semences saines. Les résultats du test de dépistage (gel d'électrophorèse avec révélation au BET) sont présentées à la figure 2.A (PCR multiplex 1 pour les gènes Xac3090 et AvrBsT) et à la figure 2.B (PCR multiplex 2 pour les gènes XopP et AvrXccB). Les 2 bandes 25 correspondant aux produits d'amplification attendus par la mise en oeuvre des PCR sont observables pour les puits correspondant aux macérâts de souches contaminées par le pathovar phaseoli (souches positives) alors qu'aucune bande n'est observable pour les puits correspondant aux macérâts témoins. La mise en oeuvre du test de dépistage par BIO-PCR permet d'améliorer la 30 sensibilité. Un enrichissement sur milieu MXP de 24h permet d'obtenir une sensibilité comparable à la méthode par PCR directe, à savoir de l'ordre de 103 UFC/ml. Un enrichissement sur milieu MXP de 48h permet d'obtenir une sensibilité de l'ordre de 10UFC/m1 dans les meilleures conditions.

35 Tableau 8 : Composition du mileu MXP utilisé. Composants Concentration K2HPO4 0,8 g/L KH2PO4 0,6 g/L Extrait de levure 0,7 g/L Amidon de Pomme de terre insoluble 8,0 g/L Potassium Bromide 10,0 g/L Glucose 1,0 g/L Agar 15,0 g/L Ajout après autoclavage : Chlorothalonile 15 mg/L Cephalexine 20 mg/L Kasugamycine 20 mg/L Gentamycine 2 mg/L Methyl violet 2B 1 °/O 30 pL/L Methyl green 1 °/O 60 pL/L Tableau 9 : présentation du listage de séquences. Référence de la séquence Descriptif SEQ ID N °1 Gène Xac3090 SEQ ID N °2 Gène AvrBsT SEQ ID N°3 Gène XopP SEQ ID N °4 Gène AvrXccB SEQ ID N°5 Amorce sens pour l'amplification du fragment de 257 pb du gène Xac3090 (Ami F) SEQ ID N°6 Amorce antisens pour l'amplification du fragment de 257 pb du gène Xac3090 (Ami R) SEQ ID N°7 Amorce sens pour l'amplification d'un fragment de 393 pb du gène AvrBsT (Am2F) SEQ ID N°8 Amorce antisens pour l'amplification d'un fragment de 393 pb du gène AvrBsT(Am2R) SEQ ID N°9 Amorce sens pour l'amplification d'un fragment de 656 pb du gène XopP (Am3F) SEQ ID N°10 Amorce antisens pour l'amplification d'un fragment de 656 bp du gène XopP (Am3R) SEQ ID N°11 Amorce sens pour l'amplification d'un fragment de 427 pb du gène AvrXccB (Am4F) SEQ ID N°12 Amorce antisens pour l'amplification d'un fragment de 427 pb du gène AvrXccB (Am4R) SEQ ID N°13 Amorce sens pour l'amplification d'un fragment de 1494 pb du gène Xac3090 SEQ ID N°14 Amorce antisens pour l'amplification d'un fragment de 1494 pb du gène Xac3090 SEQ ID N°15 Amorce sens pour l'amplification d'un fragment de 1020 pb du gène AvrBsT SEQ ID N°16 Amorce antisens pour l'amplification d'un fragment de 1020 pb du gène AvrBsT SEQ ID N°17 Amorce sens pour l'amplification d'un fragment de 1936 pb du gène XopP SEQ ID N°18 Amorce antisens pour l'amplification d'un fragment de 1936 bp du gène XopP SEQ ID N°19 Amorce sens pour l'amplification d'un fragment de 708 pb du gène AvrXccB SEQ ID N°20 Amorce antisens pour l'amplification d'un fragment Référence de la séquence Descriptif de 708 pb du gène AvrXccB SEQ ID N °21 Amorce Xpha1 (sens) SEQ ID N °22 Amorce Xpha2 (antisens) SEQ ID N °23 Amorce X4c (sens) SEQ ID N °24 Amorce X4e (antisens) SEQ ID N°25 Amorce Xf1 (sens) SEQ ID N °26 Amorce Xf2 (antisens)

Claims

REVENDICATIONS1. Procédé de dépistage du pathovar Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli dans un échantillon biologique, ledit procédé comprenant une étape de détection (i) d'une combinaison (Cl) de deux gènes choisie parmi le groupe de combinaisons constitué par ^ la combinaison AvrBsT/Xac3090, ^ la combinaison AvrBsT/XopP, et ^ la combinaison AvrBsT/AvrXccB, étant entendu que le résultat du procédé de dépistage est positif si la présence des deux gènes de ladite combinaison (C1) est détectée dans ledit échantillon biologique.
2. Procédé de dépistage selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit procédé de dépistage comprend une étape de vérification (ii) consistant à détecter une seconde combinaison (C2) de deux gènes choisie parmi le groupe constitué par : ^ la combinaison XopP/AvrXccB, ^ la combinaison Xac3090/AvrXccB, et ^ la combinaison Xac3090/XopP, étant entendu que la première combinaison de gènes (Cl) et la seconde combinaison de gènes (C2) ne comportent aucun gène en commun.
3. Procédé de dépistage selon la revendication 2 caractérisée en ce que l'étape de vérification (ii) est effectuée uniquement lorsque le résultat de l'étape de détection (i) est négatif.
4. Procédé de dépistage selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce que la détection de la combinaison (Cl) comprend les étapes de détection de chacun des deux gènes, ces étapes étant simultanées ou effectuées séparément, étant entendu que : - l'étape de détection du gène Xac3090, si elle est réalisée, consiste à détecter dans ledit échantillon biologique la présence ou l'absence d'un premier acide nucléique cible (AN1) choisi parmi le groupe constitué par : ^ un acide nucléique ayant au moins 950/0 d'identité de séquence avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°1 ou avec l'acide nucléique de séquence complémentaire, et ^ un acide nucléique ayant au moins 30 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de SEQ ID N°1 ou de l'acide nucléique complémentaire ;- l'étape de détection du gène AvrBst consiste à détecter dans ledit échantillon biologique la présence ou l'absence d'un second acide nucléique cible (AN2) choisi parmi le groupe constitué : ^ un acide nucléique ayant au moins 950/0 d'identité de séquence avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°2 ou avec l'acide nucléique de séquence complémentaire, et ^ un acide nucléique ayant au moins 30 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de SEQ ID N°2 ou de l'acide nucléique complémentaire ; - l'étape de détection du gène XopP, si elle est réalisée, consiste à détecter dans ledit échantillon biologique la présence ou l'absence d'un troisième acide nucléique cible (AN3) choisi parmi le groupe constitué : ^ un acide nucléique ayant au moins 950/0 d'identité de séquence avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°3 ou avec l'acide nucléique de séquence complémentaire, et un acide nucléique ayant au moins 30 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de SEQ ID N°3 ou de l'acide nucléique complémentaire ; et - l'étape de détection du gène AvrXccB, si elle est réalisée, consiste à détecter dans ledit échantillon biologique la présence ou l'absence d'un quatrième acide nucléique cible (AN4) choisi parmi le groupe constitué : ^ un acide nucléique ayant au moins 950/0 d'identité de séquence avec l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°4 ou avec l'acide nucléique de séquence complémentaire, et ^ un acide nucléique ayant au moins 30 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de SEQ ID N°4 ou de l'acide nucléique complémentaire ; 25
5. Procédé de dépistage selon la revendication 2 ou 3 caractérisé en ce que la détection de la combinaison (C2) comprend les étapes de détection de chacun des deux gènes qu'elle comprend comme défini dans la revendication 4. 30
6. Procédé de dépistage selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape de détection de la présence ou de l'absence d'au moins un acide nucléique cible choisi parmi le groupe constitué par l'acide nucléique (AN1), l'acide nucléique (AN2), l'acide nucléique (AN3) et l'acide nucléique (AN4) tels qu'ils sont définis dans la revendication 4, ladite étape de détection dudit 35 acide nucléique cible comprenant la mise en contact de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique avec au moins une sonde ou une amorce nucléotidique hybridant spécifiquement ledit acide nucléique cible.
7. Procédé de dépistage selon la revendication 6 caractérisé en ce que ladite étape de 40 détection d'un acide nucléique cible comprend les étapes suivantes consistant à:réaliser une étape d'amplification de l'ADN contenu dans ledit échantillon à l'aide d'au moins une amorce nucléotidique hybridant spécifiquement ledit acide nucléique cible et - détecter la présence éventuelle du produit d'amplification dudit acide nucléique cible 5
8. Procédé de dépistage selon la revendication 7 caractérisé en ce que l'amplification de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique est choisi parmi le groupe constitué par l'amplification par réaction en chaîne de la polymérase (PCR), l'amplification par PCR multiplex, l'amplification par PCR nichée (nested PCR), l'amplification par réaction 10 en chaîne par la ligase (ligase chain reaction)
9. Procédé de dépistage selon la revendication 4 caractérisé en ce que : - la combinaison de gènes (Cl) comprend le gène Xac3090 et le gène AvrsBsT, et - les étapes de détection du gène Xac3090 et du gène AvrBsT comprennent la 15 séquence d'étapes suivantes : (a) réaliser une étape d'amplification par PCR multiplex de l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique à l'aide de : - un premier couple d'amorces hybridant spécifiquement le premier acide nucléique cible (AN1) tel que défini dans la revendication 4 et 20 - un second couple d'amorces hybridant spécifiquement le second acide nucléique cible (AN2) tel que défini dans la revendication 4 ; et (b) détecter la présence éventuelle du produit d'amplification du premier acide nucléique cible (AN1) et celle du second acide nucléique cible (AN2). 25
10. Procédé de dépistage selon la revendication 5 caractérisé en ce que - la combinaison de gènes (C2) comprend le gène XopP et le gène AvrXccB et - les étapes de détection du gène XopP et du gène AvrXccB comprennent la séquence d'étapes suivantes : (a) réaliser une étape d'amplification par PCR multiplex de l'ADN contenu dans ledit 30 échantillon biologique à l'aide de : - un premier couple d'amorces hybridant spécifiquement le premier acide nucléique cible (AN3) tel que défini dans la revendication 4 et - un second couple d'amorces hybridant spécifiquement le second acide nucléique cible (AN4) tel que défini dans la revendication 4 ; et 35 (b) détecter la présence éventuelle du produit d'amplification du premier acide nucléique cible (AN3) et celle du second acide nucléique cible (AN4).
11. Procédé de dépistage selon la revendication 9 caractérisé en ce que : - le premier couple d'amorces consiste en :- un premier acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°5 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire et - un second acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°6 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire ; et ^ le second couple d'amorces consiste en : - un premier acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°7 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire et - un second acide nucléique d'une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°8 ou de l'acide nucléique de séquence complémentaire.
12. Procédé de dépistage selon la revendication 2 caractérisé en ce que : - la combinaison (Cl) comprend le gène Xac3090 et le gène AvrBsT, les étapes de détection desdits gènes étant telles que définies dans la revendication 9 ou la revendication 11 - la combinaison (C2) comprend le gène XopP et le gène AvrXccB, les étapes de détection desdits gènes étant telles que définies dans la revendication 10
13. Procédé de dépistage selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 caractérisé en ce que l'échantillon biologique est obtenu à partir d'une culture bactérienne, d'une semence de Phaseolus vulgaris ou d'une partie aérienne d'une plante de Phaseolus vulgaris.
14. Sonde ou amorce nucléotidique utilisable dans un procédé de dépistage du pathovar Xanthomonas axonopodis pv. Phaseoli, ladite sonde ou ladite amorce ayant une longueur allant de 12 à 30 nucléotides et comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs issus d'un acide nucléique choisi parmi le groupe constitué par l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°5, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°6, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°7, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°8, l'acide nucléique de SEQ ID N°9, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N°10, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N °11, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N °12 et les acides nucléiques de séquence complémentaire.
15. Kit pour le dépistage du pathovar Xanthomonas axonopodis pv. Phaseoli dans un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend deux couples d'amorces permettant d'amplifier les deux gènes de la combinaison (Cl) telle que définie dans la revendication 1.
16. Kit de dépistage du pathovar Xanthomonas axonopodis pv. Phaseoli dans un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde ou une amorce nucléotidique telle que définie dans la revendication 14.