WO1999007722A1

WO1999007722A1 - Oligonucleotide specifique de l'espece escherichia coli et procede de detection et de visualisation des bacteries de cette espece

Info

Publication number: WO1999007722A1
Application number: PCT/FR1998/001737
Authority: WO
Inventors: Patrick Grimont; Béatrice REGNAULT; Monique Collin
Original assignee: Institut Pasteur
Priority date: 1997-08-04
Filing date: 1998-08-04
Publication date: 1999-02-18
Also published as: US20040219524A1; AU8987998A; US6551776B1; FR2766825B1; EP1003765A1; CA2299599A1; FR2766825A1; JP2001512665A

Abstract

L'invention concerne un oligonucléotide capable de s'hybrider spécifiquement à l'ARN ribosomal (ARNr) ou au gène correspondant (ADNr) de l'espèce génomique Escherichia coli (incluant toutes les Shigella à l'exception de S. boydii sérotype 13/Escherichia fergusonii. Elle concerne également un procédé de détection et de visualisation des bactéries de la susdite espèce.

Description

OLIGONUCLEOTIDE SPECIFIQUE DE L'ESPECE

ESCHERICHIA COLI ET PROCEDE DE DETECTION ET DE VISUALISATION DES BACTERIES DE CETTE ESPECE

L'invention concerne des oligonucléotides pour la détection et la visualisation de bactéries appartenant à l'espèce génomique Escherichia coli dans un échantillon Plus particulièrement, elle concerne un oligonucleotide capable de s'hybrider spécifiquement avec TARN ribosomal (ARNr) ou au gène correspondant (ADNr) de l'espèce génomique Escherichia coli (y compris les Shigella à l'exception de S boydu serotype 13) I Escherichia fergusonii

Elle concerne également un procédé de détection de l'espèce génomique en question mettant en oeuvre cet oligonucleotide ainsi que l'utilisation dudit oligonucleotide dans un procédé d'amplification génique Le terme "Escherichia coli" (E. coli) désigne dans ce document l'espèce génomique (genomospecies) contenant la souche-type Escherichia coli ATCC 11775 (= CEP 58-8) Une espèce génomique est un ensemble de souches dont l'acide désoxyπbonucléique (ADN) présente une homologie de plus de 70% avec l'ADN de la souche-type de l'espèce considérée avec une instabilité thermique de l'ADN hybride inférieure à 5°C (Grimont, 1988, Wayne et al , 1987) Suivant ces critères, l'espèce génomique E. col inclut, outre les souches habituellement identifiées comme E coli, les souches traditionnellement classées comme Shigella (S. dysenteriae, S. flexneri, S boydu, S. sonne i) à l'exception du serotype 13 de S. boydu (Brenner et al , 1973) En appliquant strictement ces critères, on peut arguer que Escherichia fergusonii appartient à l'espèce génomique E. coli (Farmer et al , 1985) E. coli est habituellement une bactérie commensale du colon de l'homme et des animaux à sang chaud. Pour cette raison, sa présence dans un échantillon d'eau, d'aliment, ou de l'environnement, est interprétée comme une indication de contamination fécale (bactérie indicatrice). Ainsi, un produit alimentaire ne doit pas contenir plus d'un certain nombre de cellules vivantes de E. coli (pouvant former une colonie sur un milieu de culture solide) dans une masse définie de produit (ces nombres varient selon les produits). Par exemple, l'eau potable ne doit pas contenir de cellule vivante de E. coli dans 100 ml (De Zuane, 1997). Le dénombrement des E. coli est essentiel pour apprécier la qualité hygiénique d'un aliment.

Des souches de l'espèce génomique E. coli peuvent être pathogènes. Parmi ces souches se trouvent tout ce qui est communément appelé Shigella, agent des dysenteries bacillaires humaines. Les souches communément appelées E. coli, peuvent causer différentes infections de l'homme ou des animaux selon l'équipement en gènes de pathogènicité (infections urinaires, diarrhées cholériformes ou hémorragiques, syndrome dysentérique, syndrome hémolytique et urémique, septicémie, méningite néonatale, infections purulentes diverses).

L'identification d'une souche de l'espèce génomique E. coli (identification taxonomique) est importante pour suspecter ou démontrer la contamination fécale de l'eau ou des aliments. Elle est également importante dans le cas où la bactérie est isolée d'un milieu biologique normalement stérile ou presque (urine, sang, liquide céphalo-rachidien, collection liquidienne dans un tissu ou dans un espace fermé du corps) Dans les espaces ouverts du corps (tube digestif) ou les fèces, la présence de E. coli est banale et l'identification des facteurs de pathogènicité de E. coli prime sur l'identification taxonomique. ^'L'identification taxonomique de E. coli repose classiquement sur l'isolement et la culture de la bactérie sur un milieu gélose solide et l'application de quelques tests biochimiques. L'apparition de colonies sur un milieu gélose demande au moins 18 heures. Dans le cas de prélèvements de l'environnement, une culture de quelques jours est souvent nécessaire pour que toutes les colonies qui doivent se développer apparaissent. L'application de tests biochimiques à partir d'une colonie isolée demande encore 18 à 48 heures. A titre d'exemple, le dénombrement de E. coli dans l'eau nécessite la filtration d'un volume d'eau à travers une membrane stérile, le dépôt de la membrane sur un milieu semi-sélectif et ou indicateur, l'incubation (48 heures) permettant de faire se développer des colonies d'une couleur caractéristique (mais non absolument spécifique) qui sont alors comptées. Chaque colonie isolée étant supposée dérivée d'une cellule bactérienne, le dénombrement des E. coli par unité de volume peut être réalisé. Il est prudent de vérifier que les colonies isolées correspondent bien à l'espèce E. coli et ceci demande au moins 18 heures de plus.

Récemment, des techniques fondées sur la détection de séquences nucléotidiques spécifiques de l'espèce génomique E. coli ont été décrites. Ainsi, la détection par amplification génique (type PCR) du gène codant la béta-glucuronidase permet d'identifier la présence de E. coli dans un échantillon. Cette méthode est surtout utilisée de manière qualitative et l'interprétation de l'amplification génique est fréquemment gênée par la possibilité d'une contamination due à la dispersion sur les appareils et outils expérimentaux de quelques fragments d'acide nucléique. L'hybridation in situ est une alternative intéressante à l'amplification génique. Une sonde oligonucléotidique marquée (généralement par une substance fluorescente) pénètre dans les cellules bactériennes préalablement traitées pour faciliter cette étape. Selon que les acides nucléiques ribosomiques ont ou non une séquence complémentaire (cible) à la sonde, la sonde se fixera sur sa cible et ne sera pas enlevée par lavage. Les bactéries ayant ainsi retenu la sonde deviennent marquées (par exemple, fluorescentes) et visibles par examen microscopique. Les acides ribonucléiques ribosomaux (ARNr) constituent la cible préférée en hybridation in situ du fait du nombre de copies par cellule (10 000 à 30 000), plus élevé que le nombre de copies d'ARN messager après induction (100 à 200) ou d'un gène donné (une à quelques unes). Ces ARN ribosomaux (ARNr) sont identifiés d'après leur constante de sédimentation (pour les bactéries: 5S, 16S et 23 S), présents dans la petite sous-unité (ARNr 16S) ou la grande sous-unité (ARN 23 S et 5 S) du ribosome.

Les plus grands ARNr sont le 16S (environ 1500 nucléotides) et le 23S (environ 3000 nucléotides). Une sonde nucléique complémentaire d'une partie d'un ARNr pourra s'hybrider avec cet ARNr mais aussi avec le brin complémentaire du gène (ADNr) qui a codé cet ARNr. Diverses applications de cette méthodologie ont été publiées (Amann et al., 1990; DeLong et al., 1989; Giovannoni et al., 1988; Trebesius et al., 1994).

Ces ARNr sont en fait apparus comme les molécules les plus appropriées pour servir de chronomètre moléculaire de l'évolution des bactéries (Brenner et al., 1969; Doi & Iragashi, 1965; Moore et McCarthy, 1967; Pace & Campbell, 1971 ; Takahashi et al., 1967). La structure primaire (séquence) des ARNr contient des régions très conservées et d'autres qui sont hypervariables (Sogin et al., 1972; Woese et al., 1975). La mise au point d'une méthode d'hybridation ADN-ARNr (Gillespie & Spiegelman, 1965) a été suivie d'un très grand nombre de publications appliquant cette approche à la îaxonomie et la phylogénie des bactéries et à l'identification de bactéries mal classées (Johnson et al., 1970; Palleroni et al., 1973; De Smedt & De Ley, 1977).

D'une façon générale, dans une expérience d'hybridation mettant en jeu des séquences données, le résultat dépend beaucoup de la température et de la molarité en ions sodium du milieu reactionnel. Pour un mileu reactionnel de composition donnée, on définit une température optimale d'hybridation. Si l'on élève la température, les brins réassociés finiront par se séparer. La température nécessaire à cette séparation dépend de la longueur de la partie de séquence parfaitement hybridée (appariement parfait) et de sa composition en nucléotides. Une température ne permettant que l'hybridation des séquences les plus longues est dite restrictive (par opposition à optimale). Des mésappariements lors de l'hybridation font chuter la stabilité thermique des molécules hybridées.

La spécificité de l'hybridation in situ va donc dépendre de la qualité de la sonde capable de reconnaître et de s'hybrider avec une séquence complémentaire présente dans un ARNr.

Kohne et al. (1968) ont décrit une méthode pour préparer des sondes réagissant avec l'ARNr sans cependant indiquer comment détecter E. coli spécifiquement. Gόbel et Stanbridge (1984) utilisent un gène ADNr clone pour détecter des mycoplasmes contaminant des cultures de tissus.

Galpin et al. (1981) ont utilisé l'hybridation des gènes codant l'ARNr pour détecter des infections à Mycoplasma pidmonis chez la souris. US 4,851,330 décrit une stratégie pour obtenir des fragments d'acide nucléique utilisables comme sonde réagissant avec les ARNr

WO-A-84/02721 décrit des méthodes pour détecter les microorganismes infectant un corps humain ou animal, en utilisant des sondes qui hybrident avec les ARNr. Il n'est pas indiqué comment détecter ou identifier E. coli.

Berent et al. (1985) montrent l'intérêt des sondes oligonucléotidiques par rapport aux sondes clonées.

Le brevet français 2 596 774 propose l'utilisation d'un oligonucleotide complémentaire de l'ARNr bactérien comme sonde et décrit deux sondes oligonucléotidiques universelles.

Gôbel et al. (1987) utilisent un oligonucleotide de synthèse réagissant avec l'ARNr ou son gène, dans le but d'identifier des mycoplasmes. US 5,084,565 décrit une sonde oligonucléotidique dite spécifique de E. coli. Cette sonde a pour cible la zone nucléotidique 465 à 477 (numérotation des nucléotides selon Brosius et al. [1978]). La sonde réagirait avec Escherichia fergusonii et Shigella boydii serotype 13 (en plus de E. coli et Shigella) et ne réagirait pas avec Citrobacter koseri. Rien n'est dit quant à la réaction de cette sonde avec les espèces du genre Cedecea qui sont phylogénétiquement proches de E. coli.

US 5,593,841 mentionne une sonde réagissant avec la région 995- 1030 de l'ARNr 16S de E. coli. Cette sonde réagit avec E. fergusonii mais ne réagit pas avec toutes les souches de E. coli testées et ne réagit pas avec Shigella dysenteriae . Rien n'est dit quant à la réaction de cette sonde avec Citrobacter koseri (= C. diversus) et les espèces du genre Cedecea qui sont phylogénétiquement proches de E. coli.

Kwok et al. (1990) ont montré qu'un mésappariement au niveau de l'extrémité 3' d'une amorce utilisée en amplification génique (PCR) affectait l'efficacité de l'amplification.

Cha et al (1992) ont décrit un test appelé "Mismatch Amplification Mutation Assay" dans lequel, une amorce présente un mésappariement avec la séquence cible d'une mutation à détecter, et deux 5 mésappariements avec la séquence correspondante de l'allèle sauvage. Ces mésappariements concernent la partie terminale 3' de l'amorce. Dans ces conditions, leur système PCR ne détecte que l'allèle mutant. Cette méthode a été appliquée à la détection spécifique de Salmonella enterica serotype Entérinais (Lampel et al., 1996) en créant un mésappariement à

10 la pénultième position de l'extrémité 3' d'une amorce.

L'invention propose un oligonucleotide pour la détection et la visualisation spécifiques et rapides de bactéries appartenant à l'espèce génomique Escherichia coli dans un échantillon. Elle concerne donc un oligonucleotide capable de réaliser une hybridation spécifique avec

15 l'espèce génomique de Escherichia coli (c'est-à-dire spécifique de toutes les souches de Escherichia coli, de Shigella (à l'exception de S. boydii serotype 13) et de Escherichia fergusonii.

Plus particulièrement, cet oligonucleotide est capable de s'hybrider avec la région 637-660 de l'ARN 16S de E. Coli ^système de

20 numérotation de Brosius et al., 1978). En effet, cette portion de l'ARN 16S est assez bien conservée chez les Enterobactéries mais pas suffisamment pour être spécifique de celles-ci. Cependant, de façon surprenante, elle s'est avérée très intéressante en ce qu'elle permet la détection de l'espèce génomique ci-dessus définie sans réaction croisée

25 avec d'autres espèces. L'oligonucleotide conforme à l'invention peut également ne s'hybrider spécifiquement qu'à au moins 10 nucléotides consécutifs de la région 637-660 de l'ARN 16S de E. coli. En effet, avec deux oligonucléotides reconnaissant des zones adjacentes et ensuite liés par une ligase, on obtient un oligonucleotide plus long et donc plus

3.0 résistant à des conditions d'hybridation plus stringentes.

On peut ainsi utiliser deux oligonucléotides représentant la moitié gauche et la moite droite de l'un des oligonucléotides de l'invention, les faire hybrider avec la cible, les lier par action d'une ligase, et augmenter la température de lavage de manière à éliminer tout petit oligonucleotide non lié. Cette méthode qui réduit le bruit de fond a été proposée par Alves et Carr (1988).

Avantageusement, l'oligonucleotide conforme à l'invention correspond à SEQ ID N° 1. En effet, un oligonucleotide de 24 nucléotides, complémentaire de la susdite région 637-660 de l'ARN 16S de E. coli a été synthétisé. Il a été appelé Ec637 et identifié SEQ ID N° 1.

Le marquage a été obtenu par greffage de deux chromophores (fluoresceine ou Texas Red) à chaque extrémité de l'oligonucleotide. L'oligonucléotide-sonde utilisé en hybridation in situ à 42°C en présence de 22% de formamide suivie d'un lavage à 60°C, rend fluorescentes les cellules de Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Shigella βexneri, Shigella boydii (sauf le serotype 13), Shigella sonne i et Escherichia fergusonii (groupe génomique E. coli). Elle ne réagit pas avec la plupart des autres espèces et genres testés. Toutefois, il a été observée que l'espèce Citrobacter koseri et les espèces de Cedecea, restent fluorescentes après lavage à 60°C.

En fait, il faut atteindre une température de l'ordre de 61°C pour que ces espèces ne réagissent plus. Cependant, à 61°C, le groupe génomique E. coli est rendu très faiblement fluorescent.

La présente invention concerne donc également un oligonucleotide permettant l'obtention de résultats encore meilleurs en terme de spécificité.

En effet, l'oligonucleotide Ec637 a été modifié au niveau d'un nucléotide situé à une position conservée (invariante) de la séquence d'ARNr 16S correspondante pour créer un mésappariement volontaire.

Ce mésappariement a été effectué dans la partie centrale de l'oligonucleotide. La séquence obtenue a été appelée Colinsitu et identifiée SEQ TD N° 2. L'introduction d'un mésappariement central a pour but de fragiliser l'hybride qui sera obtenu. Si une séquence diffère par un seul nucléotide de la séquence 637 à 660 de E. coli, cela causera deux mésappariements avec la sonde Colinsitu qui ne s'hybridera pas dans les conditions expérimentales choisies. Cette sonde reste réactive vis-à-vis de l'espèce génomique E. coli et devient inactive vis-à-vis de toutes les autres espèces et genres. Cette spécificité se maintient dans une large gamme de température de lavage allant de 51°C à 59°C.

La sonde Colinsitu peut être utilisée en hybridation in situ mais également, en hybridation sur filtre, en milieu liquide, en hybridation réverse, ou comme amorce spécifique dans un système d'amplification génique.

L'invention a également pour objet des oligonucléotides complémentaires des oligonucléotides ci-dessous décrits.

D'autres types de marquage de la sonde (radioactivité, marquage chimique ou enzymatique) sont utilisables pour l'hybridation in situ.

Plus particulièrement, les oligonucléotides conformes à l'invention peuvent être marqués à leur extrémité 3' ou 5' ou aux extrémités 3' et 5'.

L'intérêt de cette sonde, appliquée en hybridation in situ avec examen microscopique des cellules bactériennes ou détection par cytométrie de flux, est de pouvoir détecter, identifier, et dénombrer les cellules de l'espèce génomique E. coli dans des échantillons divers tels que prélèvements cliniques et vétérinaires (en particulier urine), eau et autres boissons, aliments, environnement. L'invention a également pour objet un procédé de détection et de visualisation de bactéries de l'espèce génomique Escherichia coli (incluant toutes les Shigella à l'exception de S. boydii serotype 13) / Escherichia fergusonii dans un échantillon comprenant une étape d'hybridation de l'ARN ribosomal des bactéries de ladite espèce génomique avec un oligonucléotique selon l'invention, et plus particulièrement avec un oligonucléotique choisi parmi SEQ ID N° 1 et SEQ ED N° 2.

Plus particulièrement, l'hybridation en question peut être une hybridation in situ, une hybridation sur filtre, une hybridation en milieu liquide ou une hybridation reverse.

Par hybridation reverse aux fins de la présente invention, on entend une réaction d'hybridation dans laquelle la sonde oligonucléotidique d'intérêt est immobilisée sur un support, l'acide nucléique à détecter et/ou l'organisme contenant l'acide nucléique à détecter étant présent en solution.

Selon un mode particulier de réalisation d'une réaction d'hybridation reverse selon l'invention, les sondes oligonucléotidiques peuvent être mises en œuvre au sein d'un dispositif de détection comprenant une banque matricielle d'oligonucléotides. Un exemple de réalisation d'une telle banque matricielle peut consister en une matrice d'oligonucléotides-sondes fixés sur un support, la séquence de chaque sonde d'une longueur donnée étant située en décalage d'une ou plusieurs bases par rapport à la sonde précédente, chacune des sondes de l'arrangement matriciel étant ainsi complémentaire d^'une séquence distincte de l'ADN ou l'ARN cible à détecter et chaque sonde de séquence connue étant fixée en une position prédéterminée du support. La séquence cible à détecter peut être avantageusement marquée radioactivement ou non radioactivement. Lorsque la séquence cible marquée est mise en contact avec le dispositif matriciel, celle-ci forme des hybrides avec les sondes de séquences complémentaires. Un traitement à la nucléase, suivi d'un lavage, permet d'éliminer les hybrides sondes-séquences cible qui ne sont pas parfaitement complémentaires.

Du fait de la connaissance précise de la séquence d'une sonde à une position déterminée de la matrice, il est alors possible de déduire la séquence nucleotidique de la séquence d'ADN ou d'ARN cible et de détecter en conséquence d'éventuelles mutations localisées dans l'ADN ribosomal de E. coli, et plus particulièrement des mutations affectant la région 637-660 de l'ADN codant pour l'ARNr 16S de E. coli.

Une alternative à l'utilisation d'une séquence cible marquée peut consister en l'utilisation d'un support permettant une détection «bioélectronique» de l'hybridation de la séquence cibles sur les sondes du support matrice, lorsque ledit support est constitué ou comprend un matériau capable d'agir, par exemple, en tant que donneur d'électrons aux positions de la matrice auxquelles un hybride a été formé. Un tel matériau donneur d'électron est par exemple de l'or. La détection de la séquence nucleotidique de l'ADN ou ARN cible est alors déterminée par un dispositif électronique.

Un exemple de réalisation d'un biocapteur, tel que défini ci- dessus, est décrit dans la demande de brevet européen n° EP-0721 016 (Affymax technologies N.V.) ou encore dans le brevet américain n° US 5.202.231 (Crkvenjakov et Drmanac).

L'invention concerne également l'utilisation d'un oligonucleotide correspondant à SEQ ID N° 1 ou SEQ ID N° 2 ou différant de SEQ ID

N° 1 par un nucléotide ou un oligonucleotide complémentaire en tant qu'amorce pour la mise en oeuvre d'un procédé d'amplification génique, tel que la PCR.

Les oligonucléotides conformes à l'invention peuvent également être utilisés dans une méthode d'inhibition de l'hybridation En effet, on peut envisager de fixer sur un support (filtre, cupule ou microchip) un oligonucleotide identique ou homologue de la région 637-660 de l'ARN 16S de E. coli et de marquer d'une façon quelconque un oligonucleotide complémentaire à cette région conforme à la présente invention. En l'absence d'ADN ou d'ARN compétiteurs, les deux oligonucléotides doivent se réassocier complètement. L'introduction dans le système d'un acide nucléique capable de se réassocier avec l'un ou l'autre des nucléotides (par exemple un acide nucléique appartenant à l'une des espèces visées par la présente invention) ou les deux (cas de deux brins séparés) inhibe la fixation de l'oligonucleotide libre, marqué et conforme à l'invention sur le support. La présente invention a également pour objet un procédé de détection et de visualisation de microorganismes par hybridation permettant d'optimiser la spécificité de la sonde oligonucléotidique utilisée. En effet, un oligonucleotide est d'autant plus spécifique qu'il présente des différences nettes dans ses capacités d'hybridation avec d'une part les séquences cibles et d'autre part les autres séquences. Dans les conditions expérimentales d'hybridation, cette différence est d'autant plus décelable qu'il existe des différences de séquences (ou mésappariement) entre le susdit oligonucleotide et la séquence avec laquelle il est susceptible de s'hybrider. Par conséquent, il devient intéressant d'augmenter artificiellement le nombre de ces mésappariements en modifiant l'oligonucleotide utilisé pour l'hybridation au niveau d'un nucléotide généralement très conservé au niveau de la séquence que l'on cherche à détecter.

Par conséquent, la présente invention concerne un procédé de détection et de visualisation de microorganismes (ou d'un groupe de microorganismes) par hybridation mettant en oeuvre un oligonucleotide complémentaire à la séquence cible du microorganisme à l'exception d'un nucléotide localisé dans la partie centrale dudit oligonucleotide. Le 5 nucléotide en question est localisé à une position invariante de la séquence cible des microorganismes et est de préférence en position centrale.

Par exemple, pour un oligonucleotide complémentaire d'une longueur de 20 paires de bases, le nucléotide non complémentaire est

10 localisé entre les positions 7 et 13 incluses selon une numérotation de l'oligonucleotide commençant à son extrémité N-terminale, de préférence, le nucléotide en question est localisé à la position 10.

L'invention concerne donc un procédé de détection et de visualisation telle que ci-dessus décrit appliqué à des bactéries de 15 l'espèce génomique Escherichia coli (incluant toutes les Shigella à l'exception de S. boydii serotype 13) / Escherichia fergusonii.

Ainsi, dans le cadre de la présente invention, l'oligonucleotide complémentaire mis en oeuvre dans le susdit procédé est un oligonucleotide conforme à la présente invention ne différant de SEQ ID

20 N° 1 que par un nucléotide et de préférence correspondant à SEQ ID N°

2.

Parmi les applications potentielles de l'invention, on citera plus particulièrement les suivantes :

- Recherche de la confirmation que des souches atypiques de E. 25 coli appartiennent bien à cette espèce. Les Centres de Référence reçoivent souvent des souches qui pourraient être des E. coli atypiques. Elles donnent des réactions biochimiques inhabituelles pour cette espèce comme une réaction négative pour la production d'indole ou de gaz, l'hydrolyse du o-nitrophényl-β-galactopyranoside, l'hydrolyse des béta- - 30 glucuronides, des réactions de fermentation inhabituelles, ou une croissance très faible dans les milieux usuels. La sonde Colinsitu peut confirmer si ces souches appartiennent à l'espèce génomique E. coli-E. fergusonii. Si la réaction avec la sonde est positive, il est facile de distinguer E. fergusonii par la fermentation de l'adonitol et du cellobiose ;

- Détection, identification et dénombrement de E. coli dans l'urine de malades ou d'animaux infectés. La plupart des infections urinaires étant dues à E. coli et une infection ou colonisation urinaire se caractérisant par la présence de plus de 1000 ou 10 000 bactéries par ml, une hybridation in situ avec Colinsitu d'une dilution appropriée d'urine devrait permettre de constater la présence et de dénombrer E. coli dans les urines en 2 à 3 heures ;

- Détection et dénombrement de E. coli dans l'eau et les aliments. Escherichia coli est le principal indicateur biologique de contamination fécale de l'eau et des aliments. Il suffit de filtrer une quantité connue et suffisante d'eau et de réaliser l'hybridation in situ sur les filtres ainsi obtenus. Si, à l'aide d'un micromètre et d'un réticule, on connait le volume filtré rapporté à une surface observée au microscope, il est possible de quantifier le nombre de cellule de E. coli dans l'eau. Dans le cas d'aliments qui ne sont pas filtrables et qui ne doivent pas avoir un E. coli par 25 g, un enrichissement peut être nécessaire à partir de 25 g d'aliment, l'hybridation in situ effectué ensuite sur le milieu de culture indiquera si E. coli est présent. L'invention ne se limite pas à la description ci-dessus mais en englobe toutes les variantes. Les exemples ci-après permettent de mieux la comprendre tout en n'étant mentionnés qu'à titre purement illustratif.

EXEMPLES Souches bactériennes utilisées Au total, 208 souches ont été utilisées pour évaluer la spécificité des sondes.

L'authenticité des souches a été vérifiée en les réidentifiant sur galeries Biotype-100 (BioMérieux, La Balme-les-Grottes, France). Les galeries ont été inoculées selon les instructions du fabricant. L'identification automatique a été obtenue grâce au programme Recognizer^" (Taxolab Institut Pasteur, Paris) et un ordinateur Macintosh Powerbook 5300ce (Apple Computers). EXEMPLE 1 : Hybridation in situ Au cours des essais, une séquence de 23 nucléotides appelée

Ec465, 5' -GGT AAC GTC AAT GAG CAA AGG TA- 3', reconnaissant la région 465 à 487 de l'ARNr 16S, a aussi été synthétisée. Cette séquence Ec465, correspondant à SEQ ID N° 3, a été utilisée dans un but de comparaison. Une méthode publiée (Trebesius et al., 1994) a été suivie avec quelques modifications. Les cultures ont été diluées en eau distillée stérile pour obtenir une absorbance à 600 nm de 0,010, et 100 μl furent filtrés à travers des filtres PC (Millipore, St Quentin-en-Yvelines, France) de 0,22 μm. La fixation a été effectuée par une solution aqueuse à 3% de paraformaldehyde. La formamide dans la mixture d'hybridation représentait 22% du volume. La sonde a été ajoutée à la concentration de 25 pmole. L'hybridation a été réalisée à 42°C pendant 2 heures. Après lavage (étape déterminant la spécificité: 20 min à 51°C pour Colinsitu, 60°C pour Ec637, 48°C pour Ec465), les filtres ont été déposés sur des lames de verre, recouverts de 5μl de Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA) et d'une lamelle.

Les filtres montés sur lame ont été examinés par épifluorescence en utilisant un microscope BX60 Olympus équipé d'un filtre WTBA (pour la fluorescéine) ou NG (pour le Texas Red) et d'une caméra couleur DEI- 470 (Optronics).

Le Tableau montre les résultats obtenus en hybridation in situ avec les sondes fluorescentes Colinsitu, Ec637, et Ec465. Toutes les souches testées de Escherichia coli, Shigella (sauf S. boydii serotype 13), et Escherichia fergusonii, sont rendues fluorescentes par la réaction d'hybridation utilisant la sonde Colinsitu. Aucune autre espèce génomique ne réagit. Lorsque la sonde est Ec637, une réaction est obtenue avec Citrobacter koseri et les espèces du genre Cedecea.

La sonde Ec465, utilisée en comparaison a réagit faiblement avec E. coli et avec des souches de Buttiauxella et l'expérience n'a pas été poussée plus avant.

Le résultat de l'hybridation in situ, c'est-à-dire les cellules bactériennes rendues fluorescentes, peut aussi être visualisé par cytométrie de flux plutôt que par microscopie. TABLEAU

Réactions obtenues avec les sondes fluorescentes en hybridation in situ.

Réaction avec Espèces Souche Colinsitu Ec637 Ec465 Espèce génomique Escherichia coli :

Escherichia coli CIP 54.8 + + +f

2430 + + +f

CIP 54-120 + + +f

CIP 54-122 + + +f

CIP 54-124 + + +f

CIP 70-59 + + +f

CIP 70-68 + + +f

044 +

052 +

066 +

O90 +

O103 +

O l Oδ +

01 10 + ou i +

01 13 + 01 19 +

0121 +

0127 +

0132 +

0135 +

0136 +

O140 +

0151 +

O157:H7 +

96-4597 +

6085 +

67 Tunis +

K-12 HB101 +

H19 +

PMK1 +

H30 +

E3251 1 +

B2 F1 H21 +

0X3 H21 +

412 + ffl 8 +

96-302 +

96-303 +

96-301a +

Shigella dysenteriae 1 NCDC 1007-71 + +

Y6R +

60R +

Shigella βexneri la CIP 54-58 + + Shigella boydii 15 NCDC 965-58 + + Shigella sonnei CIP 52-55 + + Escherichia fergusonii 1016-74 + +

85-1 1615 + +

568-73 + + 29586 + +

32-96 + +

1-85 + +

Autres espèces genomiques d u genre Escherichia :

Escherichia hermanii 1158-78 - -

1200-74 - -

3514-77 - -

980-72 - -

E. vulneris CDC 2524-69 - -

394-83 - -

875-72 - -

E. blattae 9005-74 - -

Autres genres

Budvicia aquatica 2377 - -

20186HG - -

Buttiauxella agrestis CUETM 77-167 - -

B. brennerae Sl/6-571 - -

B. cochleae S3/1-49 - -

B.ferragutiae CUETM 78-31 - -

B. gaviniae Sl/14-669 - - +f

CUETM 77-159 - -

B. georgiana CDC 2891-76 - -

B. izardii S3/2-161 - -

B. nockiae NSW 1 1 - -

B. warmboldiae NSW 326 - -

Cedecea davisae 005 - +

C lapagei 004 - +

C. neteri 002 - +

Cedecea sp. 001 - +

Citrobacter amalonaticus 9020-77 -

C. braakii 80-58 -

C. farmeri 2991-81 -

C. freundii 621-64 _ C. koseri (= C. diversus) 3613-63 +

8132-86 +

8127-86 +

C. rodentium 1843-73

C. sedlakii 4696-86

C. werkmanii 876-58

C. youngae 460-61

Citrobacter species 10 4693-86

Citrobacter species 11 2970-59

Edwardsiella hoshinae 2-78

E. ictaluri 92-7041

E. tarda 10396

Enterobacter aerogenes Al

E. agglomerans group II 3123-70 groupe III {Pantoea dispersa) 1429-71 groupe IV 1471-71 groupe V 3482-71 groupe Vf {Pantoea ananas) 6070-69 groupe VU 6003-71 groupe VÏÏI 5422-69 groupe IX 4388-71 groupe X 1600-71 groupe XI 5378-71 groupe XII 219-71 groupe Xπi {Pantoea agglomerans) E20

E. amnigenus 77-118

E. asburiae 1497-78

E. cancerogenes 2176

E. cloacae CIP 60-85

77-21

E. gergoviae 16-74

E. hormaechei 491-62

E. intermedium 77-130 E. nimipressuralis E63

E. persicinus HK204

E. pyrinus 4205-93

E. sakazakii 4562-70

E. taylorae 2126-81

E vinia carotovora 495

E. carotovora subsp. betavasculorum E235

2122

E. chrysanthemi SR32

1451

E. cypripedii EC 155

E. mallotivora 2851

E. nigriβuens EN 104

E. rhapontici 1075

E. rubrifaciens ER 105

E. stewartii CNBP 3157

E. uredovora 158

Ewingella americana 23

Hafnia alvei group I 5632-72

H. alvei group II 4510-75

Klebsiella ornithinolytica 626

K. oxytoca 131-82

K. planticola CIP 100751

K. pneumoniae subsp. pneumoniae 464

K2

12-52

532

K. pneumoniae subsp. ozaenae 10-79

K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis 475

K. terrigena 1

Koserella trabulsii 3518-73

Kluyvera ascorbata 648-74

K. cryocrescens 2065-78 Leclercia adecarboxylata CUETM 77-3

8-82

Leminorella grimontii 1944-81 Leminorella sp. 3346-72 Moellerella wisconsensis 2897-78 Morganella morganii 25830 Obesumbacterium proteus NCIMB 8771

CIP 104862

Pragia fontium 2434 Proteus mirabilis PMI

PR14

P. myxofaciens

P. penneri 8.88

P. vulgaris PR1

Providencia alcalifaciens 3370-67

P. heimbachae 8025-83

P. rettgeri 1163

P. rustigiani 132-68

P. stuartii 282

Rahnella aquatilis 3307

Salmonella enterica subsp. arizonae 44

S. enterica subsp. diarizonae 41

S. enterica subsp. enterica serotype . 6323-88 serotype ... 122 serotype ... 119 serotype Typhimurium LT2 serotype Gallinarum 4-86

S. enterica subsp. houtenae 6700-88

S. enterica subsp. salamae 1492-74

Serratia entomophila Al

S. caria 4024

S. fond cola 5680

S. grimesii 503 S. liquefaciens ATCC 27592

275

S. marcescens 504 S. odorifera 1073 S. plymuthica 510 S. proteomaculans 3630 S. rubidaea 864 Trabulsiella guamensis 370-85

371-85

Yersinia enterocolitica ATCC 27729 Y. frederiksenii CIP 8029

Y. intermedia 29908

Y. kristensenii 9993

Y. pestis EV40

Y. pseudotuberculosis 29833 Y. ruckeri ATCC 29473

Yokenella regensburgei 2403

2405

Espèces d'autres familles :

Acinetobacter .... Al 745 Aeromonas caviae 67.24

Pseudomonas aeruginosa 63-52

Pseudomonas fluorescens DSM 50090

P. putida 2066

Vibrio alginolyticus LMG 4408 V. anguillarum CIP 63-36

V. cholerae CIP 62-13

V. harveyi ATCC 1426

V. hollisae CEP 101886

Xanthomonas maltophilia 2377 Légendes

+ : bonne fluorescence des cellules bactériennes

+f : fluorescence faible

- : absence de fluorescence (rien) : expérience non effectuée.

EXEMPLE 2 : Amplification génique

L'oligonucleotide Colinsitu (non marqué) et le nucléotide suivant (complémentaire de la région conservée 8-32 de l'ARNr 16S): 5'-ATT TGA AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3' (SEQ ID N° 4) ont été utilisés comme amorce pour l'amplification spécifique du gène codant l'ARNr 16S de E. coli. La trousse d'amplification "GeneAmp" DNA Amplification Reagent Kit" (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) a été utilisée selon les instructions du fabricant, avec la DNA polymérase "AmpliTaq³"' et un thermocycleur "DNA Thermal Cycler 480» (Perkin Elmer Cetus). Le volume reactionnel était de 100 μl comprenant 10 μl de tampon, 2,5 unités d' AmpliTaq, 200 μM de chaque nucléotide dATP, dGTP, dCTP, dTTP, 100 pMole de chaque amorce et 30 à 50 ng d'ADN total. Les conditions d'amplification ont été les suivantes: dénaturation initiale à 94°C pendant 3 minutes, 25 cycles de 60 s à 94°C pour la dénaturation, 60 s à 65,5°C pour la réassociation, 120 s à 72°C pour l'élongation. Le produit d'amplification a été soumis à une électrophorése en 1,3% d'agarose (Appligéne, Illkirch, France). La taille attendue du fragment amplifié était d'environ 600 paires de bases. L'utilisation de ce système permet effectivement d'amplifier ce fragment spécifiquement pour l'espèce génomique Escherichia coli-Shigella-E. fergusonii. EXEMPLE 3 : Hybridation sur filtre

L'hybridation sur filtre de nitrocellulose, de nylon, ou de cellulose, est une méthode pratique permettant d'appliquer une même sonde à un grand nombre (une centaine) d'échantillons d'ADN. L'hybridation peut se faire sur colonies. Dans ce cas, la membrane est appliquée sur des colonies, imprégnée de soude (lyse les bactéries, détruit l'ARN, et dénature l'ADN), et mise en présence de la sonde marquée dans un tampon adéquat. Après un temps d'exposition suffisant (plusieurs heures), la membrane est lavée, séchée au four (pour fixer irréversiblement l'ADN), et le marquage est révélé. Cette méthode nécessite d'avoir des colonies sur une boite, mais permet de sélectionner une colonie réagissant parmi des milliers. Un protocole semblable permet de filtrer 96 échantillons sur une membrane traitée de la même façon que les colonies.

EXEMPLE 4 : Hybridation en milieu liquide

Si un échantillon est traité de manière à lyser les bactéries et à extraire l'ADN, celui-ci peut être dénaturé et mis à hybrider avec une sonde radioactive (1251, par exemple). La radioactivité associée à l'ADN hybride peut être comptée (comptage γ) après séparation, par chromatographie sur hydroxyapatite, de la radioactivité associée à la sonde non hybridée.

EXEMPLE 5 : Hybridation reverse

Des sondes oligonucléotidiques peuvent être fixées sur un support (filtre, microplaque, microchip). Plusieurs sondes peuvent ainsi être disponibles sur un même support. Le gène-cible est amplifié et marqué, et l'amplicon est mis dans les conditions d'hybridation avec le panel de sondes. Après lavage et révélation du marquage, la fixation du marquage sur une des sondes permet l'identification. Cette approche permet aussi la détection simultanée de plusieurs organimes lorsque l'amplification est effectuée sur de l'ADN extrait d'un prélèvement plurimicrobien (Rijpens et al., 1995). Bien que le travail publié utilise comme cible l'espace intergénique entre les gènes codant les ARNr 16 et 23S, cette approche est applicable au gène codant l'ARNr 16S.

EXEMPLE 6 : Spécificité de la sonde Colinsitu

Il est maintenant bien établi que les espèce du genre Shigella (sauf S. boydii serotype 13) appartiennent à l'espèce génomique Escherichia coli (Brenner et al., 1973). Il n'est donc pas surprenant que la sonde Colinsitu réagisse avec les Shigella. Dans le genre Escherichia, E. fergusonii présente 59 à 63 % d'homologie avec E. coli (par hybridation des ADN) avec une instabilité thermique des molécules hybridées de 4,5°C (Farmer et al., 1985). Donc les souches de E. fergusonii remplissent partiellement les critères qui les feraient inclure dans l'espèce génomique Escherichia coli. Rappelons que ces critères sont une homologie supérieure ou égale à 70 % avec une instabilité thermique des molécules hybridées inférieure ou égale à 5°C (Wayne et al., 1987). Ces critères devant être interprétés avec souplesse (Wayne et al., 1987). La sonde Colinsitu est donc strictement spécifique de l'espèce génomique E. coli si l'on admet E. fergusonii dans cette espèce génomique.

La comparaison de la spécificité de la sonde Colinsitu avec celle d'autres sondes qui ont été ou pourraient être proposées, apparaîtra clairement avec des souches de référence suivantes données à titre d'exemple:

Souches devant être visualisées par Colinsitu dans les conditions décrites: Escherichia coli CIP 54.8 (= ATCC 1 1775) Shigella dysenteriae serotype 1 NCDC 1007-71 Shigella flexneri serotype la CIP 54-58

Shigella boydii serotype 15 NCDC 965-58

Shigella sonnei CIP 52-55

Escherichia fergusonii CIP 103357 (= ATCC 35469)

Souches ne devant pas être visualisées par Colinsitu dans les conditions décrites:

Shigella boydii serotype 13 CDC 1610-55

Escherichia vulneris CDC 875-72 (= ATCC 33821)

Escherichia hermanii CDC 980-72 (= ATCC 33650)

Citrobacter koseri {= C. diversus) CDC 3613-63 (= ATCC 27156) Citrobacter braakii 80-58 (= ATCC51113)

Cedecea davisae CIP 80.34 (= ATCC 33431)

Cedecea lapagei CIP 80.35 (= ATCC 33432)

Cedecea neteri CIP 103241 (= ATCC 33855)

Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae K2 • Obesumbacterium proteus CIP 104862

Salmonella enterica serotype Typhimurium (= S. typhimurium) LT2 (=

CIP 60.62, ATCC 43971).

REFERENCES

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Claims

REVENDICATIONS

1. Oligonucleotide capable de s'hybrider spécifiquement à l'ARN ribosomal (ARNr) ou au gène correspondant (ADNr) de l'espèce génomique Escherichia coli (incluant toutes les Shigella à l'exception de S. boydii serotype 13) / Escherichia fergusonii.

2. Oligonucleotide selon la revendication 1 capable de s'hybrider spécifiquement à la région 637-660 de l'ARNr 16S de E. Coli.

3. Oligonucleotide selon la revendication 2 capable de s'hybrider spécifiquement avec au moins 10 nucléotides de la région 637-660 de l'ARNr 16S de E. coli

4. Oligonucleotide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il correspond à SEQ ID N° 1.

5. Oligonucleotide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il diffère d'un nucléotide de SEQ ID N° 1.

6. Oligonucleotide selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il correspond à SEQ ID N° 2.

7. Oligonucleotide complémentaire de l'oligonucleotide selon l'une des revendications 1 à 6.

8. Oligonucleotide selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il est marqué à son extrémité 3' ou 5' ou aux extrémités 3' et 5'.

9. Procédé de détection et de visualisation de bactéries de l'espèce génomique Escherichia coli (incluant toutes les Shigella à l'exception de S. boydii serotype 13) / Escherichia fergusonii dans un échantillon comprenant une étape d'hybridation de l'ARN ribosomal des bactéries de ladite espèce génomique avec un oligonucleotide selon l'une des revendications 1 à 8.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'oligonucleotide est choisi parmi SEQ ID N° 1 et SEQ ID N° 2.

11. Procédé selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que l'hybridation est une hybridation in situ, une hybridation sur filtre, une hybridation en milieu liquide ou une hybridation reverse.

12. Utilisation d'un oligonucleotide selon l'une des revendications 4 à 7 en tant qu'amorce pour la mise en oeuvre d'un procédé d'amplification génique.

13. Procédé de détection et de visualisation de microorganismes par hybridation caractérisé en ce qu'il met en œuvre un oligonucleotide complémentaire à la séquence cible desdits microorganismes, à l'exception d'un nucléotide localisé dans la partie centrale dudit oligonucleotide.

14. Procédé de détection et de visualisation selon la revendication 13, caractérisé en ce que le nucléotide non complémentaire est localisé à une position invariante chez lesdits microorganismes.

15. Procédé de détection et de visualisation selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que les microorganismes sont des bactéries de l'espèce génomique Escherichia coli (incluant les Shigella à l'exception de S. boydii serotype 13) / Escherichia fergusonii.

16. Procédé de détection et de visualisation selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'oligonucleotide complémentaire mis en œuvre est tel que défini dans la revendication 5 ou 6.