FR2812005A1 - Procede de detection de microorganismes - Google Patents

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Abstract

La pr esente invention concerne un proc ed e de d etection des el ements constitutifs d'une flore de microorganismes, dont au moins une partie des el ements possède un op eron en commun, caract eris e en ce que l'on identifie les el ements de ladite flore par l' etude de la s equence interg enique dudit op eron.

Description

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La présente invention concerne un procédé de détection des éléments constitutifs d'une flore de microorganismes, dont au moins une partie des éléments possède un opéron en commun, caractérisé en ce que l'on identifie les éléments de ladite flore par l'étude de la séquence intergénique dudit opéron.
Le système digestif humain héberge un nombre considérable de microorganismes qui constituent une flore microbienne d'une extrême complexité. Bien que ces bactéries soient réparties tout au long du tractus digestif, le côlon renferme l'essentiel de cette flore tant d'un point de vue quantitatif que qualitatif. On estime que la flore colique d'un individu est constituée de 1013 à 1015 bactéries, pour l'essentiel anaérobies, représentées par au moins 400 espèces appartenant à environ 30 genres différents. Ces bactéries colonisent les différents étages du côlon de façon relativement hétérogène. On décrit classiquement une flore dite de fermentation au niveau du caecum ainsi qu'une flore dite de putréfaction au niveau du côlon gauche.
Par ailleurs, on distingue une flore résidente d'une flore de passage. Cette flore résidente est elle-même scindée en flore dominante et flore sous-dominante. Les bactéries dominantes, essentiellement anaérobies, sont majoritairement représentées par le genre Bacteroïdes, bacilles gram négatif, mais aussi par les genres Bifidobaclerium, Lactobacillus ou Clostridium, bacilles gram positif. La flore sousdominante renferme des bactéries aéro-anaérobies et microaérophiles. On note surtout la présence d'entérobactéries et de streptocoques. Aussi bien le régime alimentaire, les infections, l'apport de pré et probiotiques que les traitements antibiotiques, sont susceptibles de provoquer des modifications drastiques de la composition de la flore colique. Ces variations ayant un impact direct sur la santé, il est important de les connaître et de les comprendre, tant pour les éviter que pour les déclencher dans un but thérapeutique. Jusqu'à présent, l'étude des bactéries coliques a permis de caractériser environ 200 espèces. Toutefois, ce type d'investigation se heurte à de nombreux problèmes liés essentiellement à la lourdeur des techniques.
Les résultats obtenus ainsi que les conclusions qui en découlent sont encore fragmentaires.
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L'identification des bactéries est réalisée selon différents procédés qui font appel soit à la mise en évidence de caractères phénotypiques ou biochimiques spécifiques, soit à l'utilisation et la reconnaissance de zones spécifiques hétérologues présentes sur le génome.
Un début d'identification pourra être effectué en décrivant la morphologie de l'organisme étudié et en recherchant par exemple la présence d'endospores, de gaines, de kystes, de bourgeons, de corps fructifiants...La forme des colonies, la pigmentation, l'origine du prélèvement sont également des informations utiles. Gn pourra également effectuer des études préliminaires en utilisant des colorants spécifiques de la capsule, des flagelles, des granules, de la paroi... Toutefois, une identification plus poussée et précise passe obligatoirement par des techniques d'isolement sur milieux sélectifs. De tels milieux sont développés ou améliorés afin d'augmenter la spécificité de cette sélection. Toutefois, il est difficile d'exclure complètement la présence d'éventuels contaminants qui peuvent alors interférer dans les tests de reconnaissance ultérieurement employés.
Ces tests font appel aux caractères biochimiques spécifiques d'une espèce. Il existe des systèmes multitests. Ce sont des galeries d'identification qui se présentent sous forme de kits, de microplaques, de bandelettes dont l'utilisation est parfois automatisée. Toutefois, il existe un certain degré d'hétérogénéité d'origine chromosomique ou plasmidique au sein de nombreuses espèces. Ainsi un ou plusieurs caractères seront absents lors de l'identification. Aussi ne donnera-t-on, la plupart du temps, que la probabilité d'appartenance à une espèce. Une similitude de 80% ou plus avec une bactérie de référence sera considérée comme acceptable. Des systèmes monotests sont également développés. Ils utilisent des substrats synthétiques fluorescents permettant de mettre en évidence la présence d'une enzyme spécifique d'un microorganisme. Ils permettent une analyse rapide mais sont limités dans leur utilisation. En effet, un test spécifique doit être développé pour chaque espèce.
Des tests immunologiques à partir d'anticorps poly- ou monoclonaux sont également développés. En dehors de la limitation évidente inhérente aux anticorps polyclonaux, ces tests sont majoritairement employés pour la caractérisation de sérotypes mais rarement pour l'identification d'espèces. Bien que couramment utilisés dans le diagnostic hospitalier, ils restent peu employés en bactériologie.
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Quant à la réalisation d'anticorps monoclonaux, elle reste un travail long, laborieux et onéreux. Ils sont par exemple dirigés contre des lipopolysaccharides, la membrane, les pili... mais sont cependant rarement spécifiques d'une espèce.
Le développement des techniques de biologie moléculaire a permis de développer de nouveaux tests d'identification. Ces techniques sont basées sur des réactions d'hybridation ou d'amplification en chaîne par polymérase (PCR).
L'hybridation génome/génome doit être supérieure ou égale à 70% pour identifier une espèce de bactérie inconnue comme étant la bactérie de référence connue dont on utilise l'ADN génomique pour réaliser le diagnostic. D'autres tests font intervenir des zones hétérologues sur l'ADN spécifique d'une espèce. On peut ainsi utiliser la technique d'hybridation qui consiste à déposer sur une membrane de nylon ou nitrocellulose le produit à analyser puis à incuber avec une sonde marquée (sonde froide ou sonde chaude) spécifique { 1 } .
On peut également employer des amorces spécifiques permettant d'amplifier un fragment de taille déterminée par la technique de PCR {2, 3}. Dans ce cas, les amplifiats obtenus par PCR peuvent être eux-mêmes analysés par d'autres techniques telles que la RFLP (polymorphisme de taille des fragments de restriction) {4} ou le TGGE (gel d'électrophorèse en gradient de température) {5}, affinant le diagnostic.
En dépit de leur grande capacité de discrimination, ces techniques restent limitées dans la mesure ou elles ne permettent d'analyser qu'une espèce à la fois, ou bien consiste à isoler un mélange d'espèces qu'on ne peut identifier alors sans connaître exactement le pattern d'analyse des amplifiats par une technique donnée sur un biotope donné.
Le développement des puces à ADN (biopuces) permet d'envisager un diagnostic rapide portant sur plusieurs centaines d'espèces. Cette technique consiste à placer sur une surface de quelques millimètres carrés plusieurs centaines de séquences d'ADN spécifiques d'un organisme donné. Ces sondes sont hybridées avec des fragments d'ADN, généralement obtenus par RT-PCR. L'hybridation éventuelle desdits fragments est alors observée, et indique la présence ou l'absence du gène exprimé, ou de l'organisme étudié.
Les cibles nucléiques étudiées ces dernières années sont essentiellement l'ARN ribosomal 16S (avec plus de 7000 séquences disponibles) {1, 2,4, 5}, la
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région séparant les loci génétiques 16S et 23S {3} et les facteurs d'élongation {6, 7}. Ainsi, en se basant sur les ARN 16S, plusieurs espèces nouvelles ont pu être détectées, appartenant aux groupes Bactéroïdes et Clostridium, mais pas Bifidobacterium {8}. Par ailleurs, et bien que les ARN 16S permettent de détecter et d'identifier de nombreuses bactéries au degré de l'espèce, ils sont incapables de discriminer les différentes espèces de Staphylocoques {2, 3}. Ainsi, une région variable du gène codant pour HSP 60 a été proposée pour l'étude des microorganismes de la flore intestinale {9}.
La présente invention a pour objet un procédé de détection et d'identification des éléments constitutifs d'une flore de microorganismes, en particulier la flore intestinale, selon lequel on détecte et on étudie une cible encore plus discriminatoire et universelle que celles déjà étudiées.
Le procédé selon la présente invention comprend la caractérisation des séquences de cette cible pour les organismes présents dans la flore microbienne étudiée, et permet ainsi de concevoir un test de diagnostic.
Ainsi, la cible étudiée dans le procédé de )'invention présente une forte hétérogénéité interespèce, ce qui permet la discrimination entre les microorganismes.
La présente invention concerne donc un procédé de détection des éléments constitutifs d'une flore de microorganismes dont au moins une partie des éléments possède un opéron en commun, caractérisé en ce que : a) on prépare l'ADN génomique de ladite flore ou les ARNm, b) on amplifie au moins une partie des séquences intergéniques non codantes situées dans l'opéron conservé chez au moins une partie des éléments de la flore et c) on identifie les différentes séquences intergéniques amplifiées afin de déterminer les éléments de ladite flore.
En effet, de façon surprenante, il a été remarqué que les régions intergéniques, dans les opérons conservés entre différentes espèces, présentent une certaine hétérogénéité, alors que les zones codantes qui flanquent lesdites régions en 5' et/ou en 3' sont généralement très conservées. Il est possible que ce fait soit du à une pression de sélection peu forte sur les régions non codantes au cours de l'évolution {10}.
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L'amplification est effectuée de préférence par amplification en chaîne par polymérase (PCR), mais d'autres méthodes (PCR-like) peuvent être employées, utilisant un couple d'amorces de séquences nucléotidiques permettant la mise en #uvre du procédé selon l'invention.
Par PCR-like on entend désigner toutes les méthodes mettant en #uvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues. En général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription reverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin, la technique TAS (Transcription-based Amplification System), la technique 3SR (Self-Sustained Sequence Replication), la technique NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification), la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction), la technique de RCR (Repair Chain Reaction), la technique CPR (Cycling Probe Reaction), la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase. Certaines de ces techniques ont depuis été perfectionnées.
L'analyse des séquences amplifiées est avantageusement effectuée sur une puce à ADN comportant des séquences complémentaires des séquences susceptibles d'être amplifiées à partir des éléments de ladite flore. La connaissance des microorganismes pouvant être présents dans l'échantillon biologique étudié est donc importante afin de choisir la puce à ADN à utiliser. Ainsi, il est nécessaire que la puce à ADN présente, à sa surface, des sondes spécifiques de chacun des organismes que l'on veut étudier. Une telle puce à ADN est également un objet de l'invention.
Ainsi, la mise en évidence des éventuelles hybridations des séquences amplifiées permet d'identifier les éléments présents dans la flore microbienne étudiée.
Un opéron particulièrement adapté à la mise en #uvre du procédé selon l'invention est l'opéron GroESL des bactéries. Cet opéron bactérien est bicistronique et contient des séquences codantes relativement homologues entre
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genres. Il est donc possible de déterminer des amorces dégénérées pour amplifier une zone hétérologue entre espèces qui correspond à la zone intergénique transcrite (ZIGO). L'opéron GroESL code chez les bactéries pour les protéines HSP10 et HSP60 (protéines de réponse aux chocs thermiques de 10 et 60 kDa respectivement) tout comme les gènes homologues conservés ou non sous forme d'opéron chez les mitochondries et autres organelles eucaryotiques (chloroplastes). L'étude de cet opéron permet non seulement de détecter les bactéries mais aussi d'autres microorganismes eucaryotes (levures, protozoaires, ou autres).
Le procédé selon l'invention est ainsi mis en #uvre, en utilisant des amorces dégénérées situées dans les séquences codantes des opérons. Les protéines HSP sont en effet extrêmement conservées selon les espèces, ce qui permet de trouver des séquences d'acides aminés s'alignant entre elles, et ainsi de choisir des oligonucléotides dégénérés pour effectuer l'amplification des séquences intergéniques, promotrices ou terminatrices.
De préférence, on utilise les amorces décrites par les séquences SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2, pour amplifier la région intergénique ZIGO d'E coli et des Enterobacteriaceae.
ENT-BDEG : CTGGAYGTKAARRTNGGYGAYATYGT (SEQ ID N 1) ENT-ADEG : ANNACNGTNGCRGTRGTGGTRCCGTC (SEQ ID N 2)
D'autres amorces dégénérées peuvent également être utilisées pour la mise en #uvre du protocole selon l'invention, en particulier toute amorce choisie parmi les séquences SEQ ID N 3 à SEQ ID N 21.
UNI-ADEG 1 : GGNGAYGGNACNACNACNGCNACNNT (SEQ ID N 3) UNI-ADEG 2 : GGNGAYGGNACNACNACNTGNTCNNT (SEQ ID N 4) ENT-BNEW : AANMTTCGTCCNYTRCANGAYCGNGT (SEQ ID N 5) CLO-BNEW2 : ATNARRCCAYTWGGWGAYMGNGTWGT (SEQ ID N 6) BIF-BNEW : AARCCRCTCGAGGACMRNRTNSTSGT (SEQ ID N 7)
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UNI-A3 : GGNGAYGGNACNAANACNGCNACNNT (SEQ ID N 8) BIF-BNEW2 : ATCAAGCCNCTMGRRGACMRSRTNST (SEQ ID N 9) HEL-BNEW : NTNCANCCNTTNGGNGANAGNGTNTT (SEQ ID N 10) CAM-BNEW : NTNCANCCNTTNGGNAANCGNGTNCT (SEQ ID N Il) BACT-BNEW : NTNAANCCNTTNGCNGANCGNGTNCT (SEQ ID N 12) CHLA-BNEW : NTNAANCCNTTNGGNGANAGNATNTT (SEQ ID N 13) MYCP-BNEW : NTNAAACCNNTNGGNAANCGNGTNAT (SEQ ID N 14) STA-BNEW : NTNAAACCNNTNGGNAANCGNGTNAT (SEQ ID N 15) LACC-BNEW : TTGAAACCNTTAGNGRAYCGYGTRST (SEQ ID N 16) LACB-BNEW : TTAMARCCAWTMGGNGATCGNGTNRT (SEQ ID N 17) CLO-BNEW3 : ATNANACCANTNGGNGACAGNGTNGT (SEQ ID N 18) ENT-BNEW2 : NTNCGNCCNTTNCANGANCGNGTNAT (SEQ ID N 19) LEG-BNEW : NTNCGNCCNTTNCANGANCGNGTNGT (SEQ ID N 20) AER-BNEW : NTNCGNCCNCTNCANGANCGNGTNAT (SEQ ID N 21)
Ces amorces sont également objets de la présente invention. De façon préférée, on effectue la détection d'un microorganisme en utilisant un couple d'amorces SEQ ID N 1 / SEQ ID N 2, ou (SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, ou SEQ ID N 8)/ (une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 5 à SEQ ID N 7 ou SEQ ID N 9 à SEQ ID N 21).
Les séquences SEQ ID N 5 à SEQ ID N 7 et/ou SEQ ID N 9 à SEQ ID N 21, utilisées notamment dans des réactions d'amplification avec les séquences
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SEQ ID N 3, SEQ ID N 4 et/ou SEQ ID N 8 permettent respectivement la détection des microorganismes et espèces listés ci-dessous. Un ou plusieurs couple(s) de séquences peu(ven)t être utilisé(s) dans une réaction d'amplification.
Ainsi, les séquences selon la présente invention permettent notamment de détecter les microorganismes des genres et familles suivants : Lactococcus (SEQ ID N 8), Bifidibacterium (SEQ ID N 7 et/ou 9), Mycobacterium (SEQ ID N 9), Helicobacter (SEQ ID N 10), Campylobacter (SEQ ID N 11), Bacteroïdes (SEQ ID N 12), Chlamydia (SEQ ID N @ Mycoplasma (SEQ ID N 14), Staphylococcus (SEQ ID N 15), Lactococcus et/ou Streptococcus (SEQ ID N 16), Lactobacillus et/ou Bacillus (SEQ ID N 17), Clostridium (SEQ ID N 6 et/ou 18), Enterobacteriaceae (SEQ ID N 5 et/ou 19), Pasteurella et/ou Haemophilus (SEQ ID N 19), Neisseria et/ou Legionella (SEQ ID N 20), Aeromonas et/ou Bordetella (SEQIDN 21).
L'invention a également pour objet les séquences génomiques de microorganismes pouvant être amplifiées par les amorces selon l'invention, en particulier les couples d'amorces SEQ ID N 1/ SEQ ID N 2, et (SEQ ID N 3.
SEQ ID N 4 ou SEQ ID N 8)/ (une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 5 à SEQ ID N 7 ou SEQ ID N 9 à SEQ ID N 21).
La présente invention a également pour objets des trousses de diagnostic pour la mise en #uvre du procédé selon l'invention. Ces trousses de diagnostic contiennent des amorces dégénérées permettant l'amplification d'une ou plusieurs régions intergéniques d'un opéron conservé parmi les espèces. Elles peuvent également contenir les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification. Par ailleurs, de l'ADN représentant des contrôles positifs ou négatifs peut être inclus dans les trousses de diagnostic selon l'invention.
Une trousse de diagnostic selon l'invention contient aussi avantageusement les éléments nécessaires pour l'analyse des produits amplifiés. En particulier, une trousse à diagnostic selon l'invention contient une puce à ADN selon l'invention, qui présente, à sa surface, les séquences correspondant aux différents microorganismes.
Selon l'espèce que l'on désire détecter, la trousse de diagnostic selon l'invention contient le couple d'amorces et les éléments d'analyse appropriés. Par
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ailleurs, une trousse selon l'invention peut également comprendre des instructions pour la mise en #uvre du procédé selon l'invention.
Le couplage d'amorces et de sondes spécifiques permet ainsi une identification rapide et précise de la flore d'un sujet donné. On peut donc établir le ou les profils de populations caractéristiques de sujets sains. On peut aussi établir les profils types de différentes pathologies.
Le procédé selon l'invention offre également la possibilité d'un suivi facile de l'volation de la flore en fonction de l'alimentation. Plus spécifiquement, on peut suivre les effets, au niveau colique, d'un aliment particulier tel qu'un pré ou probiotique ou d'un traitement médicamenteux tel qu'une antibiothérapie.
On peut donc envisager la mise au point d'aliments ou médicaments à visée effet sur la flore permettant un rétablissement et un retour à un profil normal après un déséquilibre faisant suite à une pathologie ou une agression quelconque.
On peut également utiliser des amorces et des sondes correspondant à des souches pathogènes afin d'établir éventuellement des seuils critiques de populations précédant une pathologie. On peut alors déterminer quelles sont les autres populations susceptibles d'exercer un effet barrière sur ces pathogènes.
Les outils de diagnostic de la flore intestinale développés et basés sur le procédé selon l'invention (qui sont également objets de l'invention) intéressent dans un premier temps les industriels de l'agro-alimentaire et de la pharmacie afin de mettre au point leurs produits et de voir l'impact de ceux-ci sur la flore intestinale.
En effet, des régimes particuliers sont susceptibles à long terme de modifier de façon importante la composition de la flore et d'avoir par conséquent des effets néfastes ou bénéfiques selon les types de populations qui apparaissent ou disparaissent. De la même façon, des traitement médicamenteux et en particulier les traitements antibiotiques entraînent des déséquilibres au sein de la microflore. La caractérisation des populations touchées selon le type de médicament permettrait de mettre en place un traitement parallèle ou ultérieure capable d'empêcher ces modifications ou de rétablir une flore correcte le plus rapidement possible.
Ces outils intéressent aussi les professionnels de la santé pour la caractérisation de la flore intestinale de patients, ce qui peut permettre, par exemple, d'orienter un traitement. En effet, les gastro-entérologues estiment à 70% la part de la population des pays industrialisés se plaignant de troubles digestifs divers que
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l'on appelle colopathies fonctionnelles celles-ci allant de simples désordres digestifs comme les ballonnements, les flatulences à des désordres plus importants comme la constipation, ou la diarrhée.... La majeure partie de leurs consultations concerne ces colopathies fonctionnelles.
Peu de solutions sont apportées pour soigner ces troubles car pour certaines colopathies leur cause est encore assez méconnue et pour d'autres on ne dispose pas de traitement efficace. A cela s'ajoute le problème du diagnostic médical car les patients présentant ces symptômes de colopathies fonctionnelles ne présentent généralement aucune lésion physique au niveau du côlon. Seul un questionnaire permet au gastro-entérologue de se diriger vers un type de traitement qui se révèle peu efficace dans une majorité des cas. Le marché des produits pouvant soulager ces troubles est donc important, tout comme celui du diagnostic. En effet, un diagnostic de l'état de la flore des patients pourrait renseigner le médecin sur les causes de leurs troubles et le traitement à conduire.
Les exemples suivants sont destinés à illustrer l'invention, et ne doivent pas être considérés comme limitant l'invention.
DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Schéma de l'opéron groESL de E coli. Les amorces universelles sont utilisées pour l'amplification de la séquence intergénique.
Figure 2 : Principe d'une puce à ADN. Des séquences spécifiques sont fixées sur un support solide. L'hybridation éventuelle des séquences complémentaires permet de déterminer leur présence dans un échantillon.
EXEMPLES Exemple 1 : Isolement de souches
Afin de posséder un échantillon large et représentatif de la flore colique humaine, il est nécessaire d'isoler de nouvelles souches bactériennes, encore dites non cultivables (et donc inconnues), qui constituent un fort pourcentage des bactéries de la flore colique humaine.
Pour réaliser ces isolements, une grande quantité de selles humaines est collectée et stérilisée au moyen de rayonnements de type gamma ou par la chaleur,
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en vue d'y ensemencer des échantillons de ces mêmes selles humaines et de les cultiver en aérobiose et anaérobiose, en milieux liquide et solide.
En fonction des conditions de culture utilisées, on peut ainsi isoler de nouveaux genres, espèces ou souches de bactéries coliques ou autres microorganismes eucaryotes.
Exemple 2 : des séquences des souches isolées
Il s'agit d'effectuer la caractérisation moléculaire de séquences, idéalement d'ARNm pour effectuer une quantification et sinon d'ADN génomique, des isolats de micro-organismes bactériens ou eucaryotes.
On effectue l'étude des séquences correspondant à des portions de l'opéron bactérien bicistronique GroESL. Les gènes de cet opéron sont en effet relativement homologues entre genres.
Une analyse informatique (alignement des séquences) permet ainsi de définir des amorces dégénérées pour l'amplification de la zone hétérologue entre espèces qui correspond à la zone intergénique transcrite.
Ainsi, les amorces SEQ ID N 3 et SEQ ID N 4 ont été définies après alignement des séquences correspondant à plus de 100 espèces d'organismes vivants (procaryotes et eucaryotes, non montré).
Les séquences SEQ ID N 5 à SEQ ID N 21 correspondent à des séquences complémentaires qui peuvent être utilisées pour l'amplification de microorganismes de divers genres et/ ou familles.
Les amorces SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2 ont, quant à elles, été définies à partir des séquences conservées des gènes GroES et GroEL de E. coli, en utilisant la dégénérescence du code génétique.
Exemple 3 : d'amplification
Les réactions de PCR sont effectuées selon le protocole suivant :
2 ml de bouillon de culture agité à 37 C pendant 18 h sont concentrés par centrifugation et resuspension du culot bactérien dans 30 (il d'eau distillée, puis une dilution au 1/10eme de ce concentré traité à 100 C pendant 10 minutes est utilisée comme matrice pour les réactions de PCR. Les conditions de réaction sont 94 C / 5
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min, puis 25 cycles de (94 C / 30 sec, 60 C / 45 sec, 72 C / 30 sec), suivis d'une étape d'élongation à 72 C pendant 7 min.
L'analyse des amplifiats permet de monter qu'on peut amplifier, en utilisant les amorces SEQ ID N 1 et SEQ ID N 2, la zone intergénique de différentes Entérobactéries, telles qu'Escherichia coli, Enterobacter clocae, Morganella morganii, Serratia licquefasciens, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, Klebsiella oxytoca. La région amplifiée varie en longueur, selon les espèce, de 400 à 500 paires de bases (pb).
L'utilisation du couple SEQ ID N 3 et SEQ ID N 5 donne des amplifiats de taille comprise entre 550 et 650 pb.
L'utilisation des couples (SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, ou SEQ ID N 8) (une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 5 à SEQ ID N 7 ou SEQ ID N 9 à SEQ ID N 21) permet l'amplification de séquences spécifiques de certaines familles et espèces, et l'identification des organismes de ces familles ou espèces.
Pour les réactions d'amplification, on utilise de préférence une amorce notée A avec une amorce notée B .
Les régions amplifiées par PCR ou RT-PCR. avec les amorces précitées peuvent évidemment être clonées dans différents vecteurs, afin d'être utilisées pour affiner l'analyse (en particulier pour les séquencer).
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Références {1}- Welling, et al., Applied Environmental Microbiology, 64 :3336-45, 1998 : Variations of bacterial populations in human feces measured by fluorescent in situ hybridization with group-specific 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes.
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Claims (11)

REVENDICATIONS
1) Procédé de détection des éléments constitutifs d'une flore de microorganismes dont au moins une partie des éléments possède un opéron en commun, caractérisé en ce que : a) on prépare l'ADN génomique de ladite flore ou les ARNm, b) on amplifie au moins une partie des séquences intergéniques non codantes situées dans l'opéron conservé chez au moins une partie des éléments de la flore et c) on identifie les différentes séquences intergéniques amplifiées afin de déterminer les éléments de ladite flore.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'identification des séquences amplifiées est réalisée sur une puce à ADN comportant des séquences complémentaires des séquences susceptibles d'être amplifiées à partir des éléments connus de ladite flore et la mise en évidence d'éventuelles hybridations permettant d'identifier les éléments présents dans la flore.
3) Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la flore est une flore bactérienne et en ce que l'opéron est un opéron GroESL.
4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les séquences intergéniques au moins partiellement amplifiées sont la zone ZIGO entre les gènes GroES et GroEL (ou homologues).
5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les amorces destinées à amplifier la séquence intergénique sont situées dans les séquences codantes pour les gènes flanquants.
6) Procédé selon l'une des revendications 4 et 5, caractérisé en ce qu'au moins une amorce est choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 21.
7) Puce à ADN caractérisée en ce qu'elle présente, à sa surface, des séquences complémentaires aux séquences intergéniques non codantes situées dans un opéron conservé entre différentes espèces.
8) Puce à ADN selon la revendication 7, caractérisée en ce que les séquences de plusieurs organismes, complémentaires aux séquences intergéniques non codantes situées dans ledit opéron conservé sont présentes à la surface de ladite puce.
<Desc/Clms Page number 15>
9) Trousse de diagnostic pour la mise en #uvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle contient des amorces dégénérées permettant l'amplification d'une ou plusieurs régions intergéniques d'un opéron conservé parmi les espèces, et de façon optionnelle, une puce à ADN selon l'une des revendications 7 ou 8.
10) Amorce pour la mise en #uvre d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences SEQ IDN 1 àSEQIDN 21.
11) Séquence génomique d'un microorganisme caractérisée en ce qu'elle peut être obtenue par amplification avec un couple d'amorces choisi parmi SEQ ID N 1/ SEQ ID N 2, (SEQ ID N 3, SEQ ID N 4 ou SEQ ID N 8)/ (une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 5 à SEQ ID N 7 ou SEQ ID N 9 à SEQ ID N 21).
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