JP3092166B2 - 植物形質転換体を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法 - Google Patents
植物形質転換体を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子工学的手法によ
り植物体に遺伝子を導入して新しい形質を持った新品種
を開発する際、その形質転換体を効率よく検出あるいは
確認するためのプローブとしてのオリゴヌクレオチドお
よびその検出方法に関するものである。更に詳しくは、
組換え微生物などを用いて植物組織より形質転換組織の
誘導を行う場合、得られた組織が親植物の組織なのか、
形質転換した組織なのかを判断するのに極めて有効なプ
ローブとしてのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法
に関するものである。
り植物体に遺伝子を導入して新しい形質を持った新品種
を開発する際、その形質転換体を効率よく検出あるいは
確認するためのプローブとしてのオリゴヌクレオチドお
よびその検出方法に関するものである。更に詳しくは、
組換え微生物などを用いて植物組織より形質転換組織の
誘導を行う場合、得られた組織が親植物の組織なのか、
形質転換した組織なのかを判断するのに極めて有効なプ
ローブとしてのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法
に関するものである。
【０００２】
【従来技術】植物の品種改良技術において、近年では遺
伝子工学的手法により植物体へある種の外来遺伝子を導
入し、その遺伝子に特有な形質を発現させることによっ
て、既存種には無かった新しい形質を付加しようとする
試みが数多く為されている。新しく得られた植物組織が
真に形質転換体であるか否かの確認は、導入確認・発現
確認ともに遺伝子レベルでの解析が必要となってくる。
例えば、Agrobacterium tumefaciens を用いて遺伝子導
入を行い、得られた植物細胞の確認を行う場合、Tiプラ
スミド上のT-DNA が植物ゲノムDNA に組み込まれている
か否かの検定が重要である。この場合、従来はサザンハ
イブリダイゼーション法など、支持体上における試料核
酸と遺伝子プローブのハイブリダイゼーションにより遺
伝子の導入確認が為されてきた。発現確認に関しては、
脱分化細胞における一時的な発現や再分化植物における
器官特異的な発現など遺伝子レベル、あるいはタンパク
質レベルでの発現確認が行われてきた。
伝子工学的手法により植物体へある種の外来遺伝子を導
入し、その遺伝子に特有な形質を発現させることによっ
て、既存種には無かった新しい形質を付加しようとする
試みが数多く為されている。新しく得られた植物組織が
真に形質転換体であるか否かの確認は、導入確認・発現
確認ともに遺伝子レベルでの解析が必要となってくる。
例えば、Agrobacterium tumefaciens を用いて遺伝子導
入を行い、得られた植物細胞の確認を行う場合、Tiプラ
スミド上のT-DNA が植物ゲノムDNA に組み込まれている
か否かの検定が重要である。この場合、従来はサザンハ
イブリダイゼーション法など、支持体上における試料核
酸と遺伝子プローブのハイブリダイゼーションにより遺
伝子の導入確認が為されてきた。発現確認に関しては、
脱分化細胞における一時的な発現や再分化植物における
器官特異的な発現など遺伝子レベル、あるいはタンパク
質レベルでの発現確認が行われてきた。
【０００３】また、植物への外来遺伝子の導入にはプラ
スミドなどのベクターを用いた系が多用されるが、近年
本来は植物にはない薬剤耐性と酵素活性を、新しく植物
に付与することのできる系(GUS GENE FUSION SYSTEM;Cl
ontech Laboratorories,lnc.) が開発され、ベクターを
用いない系での遺伝子導入も盛んになりつつある。
スミドなどのベクターを用いた系が多用されるが、近年
本来は植物にはない薬剤耐性と酵素活性を、新しく植物
に付与することのできる系(GUS GENE FUSION SYSTEM;Cl
ontech Laboratorories,lnc.) が開発され、ベクターを
用いない系での遺伝子導入も盛んになりつつある。
【０００４】この場合遺伝子導入操作を行った植物体、
あるいはその植物体より誘導した植物組織における遺伝
子の発現様式は上記の薬剤耐性能や酵素活性能の測定に
より発現の程度を調べるという手法が取られており、そ
の結果より遺伝子導入が成功したか否かの判断が下され
ていた。
あるいはその植物体より誘導した植物組織における遺伝
子の発現様式は上記の薬剤耐性能や酵素活性能の測定に
より発現の程度を調べるという手法が取られており、そ
の結果より遺伝子導入が成功したか否かの判断が下され
ていた。
【０００５】
【発明が解決しょうとする課題】遺伝子導入した植物
体、あるいはその植物体より誘導した植物組織における
遺伝子導入の確認を前記のサザンハイブリダイゼーショ
ン法などの従来法で行うと、材料としての植物体を多く
必要とし、操作も煩雑で熟練を要し、導入確認の結果を
得るまでに２−３日もの日時を要していた。また、検出
感度や選択性も低いものであったことなどから、簡便・
迅速かつ効率的な形質転換体の検出方法の開発が期待さ
れていた。
体、あるいはその植物体より誘導した植物組織における
遺伝子導入の確認を前記のサザンハイブリダイゼーショ
ン法などの従来法で行うと、材料としての植物体を多く
必要とし、操作も煩雑で熟練を要し、導入確認の結果を
得るまでに２−３日もの日時を要していた。また、検出
感度や選択性も低いものであったことなどから、簡便・
迅速かつ効率的な形質転換体の検出方法の開発が期待さ
れていた。
【０００６】そこで、本発明は、全く従来にない新規な
方法で形質転換体を検出することを目的とする。
方法で形質転換体を検出することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的を
達成するために鋭意研究を重ねてきたところ、オリゴヌ
クレオチドをプライマーとして用いた遺伝子増幅法によ
り、植物細胞付近に存在する特定遺伝子を効率よく検出
することを見いだし、さらに研究を重ねて本発明を完成
するに至った。ここに、遺伝子増幅法は、Saiki らが開
発したPolymerase Chain Reaction 法（以下、略してPC
R 法；Science. 230, 1350 (1985))に基づき行ってい
る。
達成するために鋭意研究を重ねてきたところ、オリゴヌ
クレオチドをプライマーとして用いた遺伝子増幅法によ
り、植物細胞付近に存在する特定遺伝子を効率よく検出
することを見いだし、さらに研究を重ねて本発明を完成
するに至った。ここに、遺伝子増幅法は、Saiki らが開
発したPolymerase Chain Reaction 法（以下、略してPC
R 法；Science. 230, 1350 (1985))に基づき行ってい
る。
【０００８】この方法では、ある特定のヌクレオチド配
列領域を検出する場合、その領域の一端は＋鎖を他端は
−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイズするオリゴヌク
レオチドを、一方のプライマーおよび他方のプライマー
として用意し、それらを熱変成により１本鎖状態にした
試料核酸に対して鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプ
ライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を１本鎖
に分離し、再度同様な反応を起こさせる。この一連の操
作を繰り返すことで、２つのプライマーに挟まれた領域
は確実に検出できるまでにコピー数が増大してくる。
列領域を検出する場合、その領域の一端は＋鎖を他端は
−鎖をそれぞれ認識してハイブリダイズするオリゴヌク
レオチドを、一方のプライマーおよび他方のプライマー
として用意し、それらを熱変成により１本鎖状態にした
試料核酸に対して鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプ
ライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を１本鎖
に分離し、再度同様な反応を起こさせる。この一連の操
作を繰り返すことで、２つのプライマーに挟まれた領域
は確実に検出できるまでにコピー数が増大してくる。
【０００９】材料としては植物体のあらゆる組織、器
官、例えば脱分化細胞、腫瘍組織など、また根、茎、
葉、花弁などでもよい。これらの材料をPCR 反応の試料
として用いるには、植物材料から核酸成分を遊離させる
前処理が必要である。しかし、プライマーがハイブリダ
イズできる核酸は数分子から数十分子以上存在すればPC
R反応は進行するので、材料を酸素、界面活性剤、アル
カリ、あるいは機械的破砕などで短時間処理する簡単な
操作だけでPCR 反応を進行させるに十分な核酸料を持っ
た試料液が調製できる。
官、例えば脱分化細胞、腫瘍組織など、また根、茎、
葉、花弁などでもよい。これらの材料をPCR 反応の試料
として用いるには、植物材料から核酸成分を遊離させる
前処理が必要である。しかし、プライマーがハイブリダ
イズできる核酸は数分子から数十分子以上存在すればPC
R反応は進行するので、材料を酸素、界面活性剤、アル
カリ、あるいは機械的破砕などで短時間処理する簡単な
操作だけでPCR 反応を進行させるに十分な核酸料を持っ
た試料液が調製できる。
【００１０】本発明でプライマーとして用いるオリゴヌ
クレオチドは、エルビニア カロトボーラ（Ervinia ca
rotovora）のDNA にコードされている遺伝子であって、
ペクチナーゼの合成に関する遺伝子pelA[ぺクテイトリ
アーゼ(pectate lyase gene)]を標的とする場合は、下
記の配列番号１〜８のいずれかの配列で表されるオリゴ
ヌクレオチドを用いる。 （５’）d-CTGTTAACACTTAGCTCGGC (３’）……（ａ：配列番号１） （５’）d-GAACGTGCGGTTTTCTTCAC (３’）……（ｂ：配列番号２） （５’）d-CAAGAAAGGGTCAACCAACG (３’）……（ｃ：配列番号３） （５’）d-GGCAGACGTGAGTTAACATC (３’）……（ｄ：配列番号４） （５’）d-TGCAACGTGGTGGTC （３’）……（ｅ：配列番号５） （５’）d-CCCAGGTACCGAAGTT (３’）……（ｆ：配列番号６） （５’）d-CAACATTACCAGCCCATCTG (３’）……（ｇ：配列番号７） （５’）d-GGAGAGTAGCTATACGGTAC (３’）……（ｈ：配列番号８）
クレオチドは、エルビニア カロトボーラ（Ervinia ca
rotovora）のDNA にコードされている遺伝子であって、
ペクチナーゼの合成に関する遺伝子pelA[ぺクテイトリ
アーゼ(pectate lyase gene)]を標的とする場合は、下
記の配列番号１〜８のいずれかの配列で表されるオリゴ
ヌクレオチドを用いる。 （５’）d-CTGTTAACACTTAGCTCGGC (３’）……（ａ：配列番号１） （５’）d-GAACGTGCGGTTTTCTTCAC (３’）……（ｂ：配列番号２） （５’）d-CAAGAAAGGGTCAACCAACG (３’）……（ｃ：配列番号３） （５’）d-GGCAGACGTGAGTTAACATC (３’）……（ｄ：配列番号４） （５’）d-TGCAACGTGGTGGTC （３’）……（ｅ：配列番号５） （５’）d-CCCAGGTACCGAAGTT (３’）……（ｆ：配列番号６） （５’）d-CAACATTACCAGCCCATCTG (３’）……（ｇ：配列番号７） （５’）d-GGAGAGTAGCTATACGGTAC (３’）……（ｈ：配列番号８）
【００１１】なお、本発明でプライマーとして用いるオ
リゴヌクレオチドは、特異性や検出感度および再現性か
ら考えて、少なくとも15塩基から30塩基程度までのヌク
レオチド断片でよく、化学合成したものあるいは天然の
ものどちらでもよい。
リゴヌクレオチドは、特異性や検出感度および再現性か
ら考えて、少なくとも15塩基から30塩基程度までのヌク
レオチド断片でよく、化学合成したものあるいは天然の
ものどちらでもよい。
【００１２】また、本発明における２つのプライマーと
は、例えば一方のプライマーがａ配列を含有するオリゴ
ヌクレオチドであれば、他方のプライマーはｂ配列を含
有するオリゴヌクレオチドである。
は、例えば一方のプライマーがａ配列を含有するオリゴ
ヌクレオチドであれば、他方のプライマーはｂ配列を含
有するオリゴヌクレオチドである。
【００１３】また、プライマーは検出用として特に標識
しなくてもよい。プライマーによって規定されているDN
A における増幅領域は50塩基から2000塩基となればよ
く、好ましくは200 塩基から300 塩基程度である。
しなくてもよい。プライマーによって規定されているDN
A における増幅領域は50塩基から2000塩基となればよ
く、好ましくは200 塩基から300 塩基程度である。
【００１４】鋳型依存性ヌクレオチドの重合反応には、
耐熱性DNA ポリメラーゼを用いるが、この酵素は90〜95
℃の温度で活性が維持されるならば、何れの生物種由来
でもよい。この酵素は既知物質であり、例えばPerkin E
lmer Cetus社製の物を用いてもよい。熱変性温度は、通
常90〜95℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニー
リング操作の温度は通常37〜65℃、ヌクレオチド重合反
応は通常50〜75℃で、これを１サイクルとしたPCR 反応
を、試料としてのDNA 重にもよるが、通常20サイクル以
上で、好ましくは30〜45サイクル行って標的とするヌク
レオチド断片のコピー数を増幅させる。検出に際して
は、酵素反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にか
ければ増幅されたヌクレオチド断片の存在およびその長
さが確認できる。
耐熱性DNA ポリメラーゼを用いるが、この酵素は90〜95
℃の温度で活性が維持されるならば、何れの生物種由来
でもよい。この酵素は既知物質であり、例えばPerkin E
lmer Cetus社製の物を用いてもよい。熱変性温度は、通
常90〜95℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニー
リング操作の温度は通常37〜65℃、ヌクレオチド重合反
応は通常50〜75℃で、これを１サイクルとしたPCR 反応
を、試料としてのDNA 重にもよるが、通常20サイクル以
上で、好ましくは30〜45サイクル行って標的とするヌク
レオチド断片のコピー数を増幅させる。検出に際して
は、酵素反応液をそのままアガロースゲル電気泳動にか
ければ増幅されたヌクレオチド断片の存在およびその長
さが確認できる。
【００１５】その結果から、材料中に、プライマーが認
識すべき配列を持った核酸が存在していたか否か判定で
きる。この判定は、DNA の有無を直接判定するものとな
る。なお、増幅されたヌクレオチド断片の検出には、例
えばアクリルアミド電気泳動など各種の電気泳動やクロ
マトグラフィーも有効である。また、電気泳動では、マ
ーカーを入れて分子量を決定し、および／または臭化エ
チジウムなどを用いての核酸染色法を用いることによ
り、プライマーなどに標識をせずに検出を行うことがで
きる。
識すべき配列を持った核酸が存在していたか否か判定で
きる。この判定は、DNA の有無を直接判定するものとな
る。なお、増幅されたヌクレオチド断片の検出には、例
えばアクリルアミド電気泳動など各種の電気泳動やクロ
マトグラフィーも有効である。また、電気泳動では、マ
ーカーを入れて分子量を決定し、および／または臭化エ
チジウムなどを用いての核酸染色法を用いることによ
り、プライマーなどに標識をせずに検出を行うことがで
きる。
【００１６】
【実施例】（実験例１） 試料の調製 タバコ(Nicotiana tabacum cv. Samsun)展開葉の表面
に、一晩LB培地にて振とう培養したErvinia carotovora
strain EC1 培養懸濁液 2μl を塗布した。
に、一晩LB培地にて振とう培養したErvinia carotovora
strain EC1 培養懸濁液 2μl を塗布した。
【００１７】菌体懸濁液を塗布した中心点から半径2.5m
m の円盤状に葉を打ち抜き、1.5ml容のエッペンドルフ
チューブにとり、緩衝液40μl (0.1M Potassium Phosph
atepH7.0)を加え0.5ml 容のエッペンドルフチューブで
粉砕した。
m の円盤状に葉を打ち抜き、1.5ml容のエッペンドルフ
チューブにとり、緩衝液40μl (0.1M Potassium Phosph
atepH7.0)を加え0.5ml 容のエッペンドルフチューブで
粉砕した。
【００１８】そこにLysozyme (10mg／ml) を 2μl 加え
25℃で15分間インキューベートした。続いてAlk-SDS 溶
液（0.2N NaOH ，１％ SDS）を50μl 加え、25℃で10分
間静置した。次に3M Potassium acetateを37.5μl 加え
25℃で10分間静置した。
25℃で15分間インキューベートした。続いてAlk-SDS 溶
液（0.2N NaOH ，１％ SDS）を50μl 加え、25℃で10分
間静置した。次に3M Potassium acetateを37.5μl 加え
25℃で10分間静置した。
【００１９】4℃15,000rpm で20分間遠心分離を行って
上清を回収し、0.5 容の2-propanolを加え、20℃15,000
rpm で２分間遠心分離を行った。得られた沈澱を75％ e
thanolで洗浄し乾燥後１mlの蒸留水を加えて試料液とし
た。
上清を回収し、0.5 容の2-propanolを加え、20℃15,000
rpm で２分間遠心分離を行った。得られた沈澱を75％ e
thanolで洗浄し乾燥後１mlの蒸留水を加えて試料液とし
た。
【００２０】プライマーの合成 Ervinia carotovoraが保存するDNA のペクチナーゼの合
成に関する遺伝子pelAの塩基配列から、 （５’）d-CTGTTAACACTTAGCTCGGC (３’）……（ａ配
列；配列番号１） および、 （５’）d-GAACGTGCGGTTTTCTTCAC (３’）……（ｂ配
列；配列番号２） を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化
学合成し、それぞれプライマー（ａ）およびプライマー
（ｂ）とした。化学合成にはMILLIPORE 社のCyclon plu
s DNA synthesizer を用い、ホスフォネイト法により行
った。合成したオリゴヌクレオチドの精製にはC18 逆相
カラムを用いた。
成に関する遺伝子pelAの塩基配列から、 （５’）d-CTGTTAACACTTAGCTCGGC (３’）……（ａ配
列；配列番号１） および、 （５’）d-GAACGTGCGGTTTTCTTCAC (３’）……（ｂ配
列；配列番号２） を選び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化
学合成し、それぞれプライマー（ａ）およびプライマー
（ｂ）とした。化学合成にはMILLIPORE 社のCyclon plu
s DNA synthesizer を用い、ホスフォネイト法により行
った。合成したオリゴヌクレオチドの精製にはC18 逆相
カラムを用いた。
【００２１】PCR 前記の試料液 3μl を用い、それに滅菌蒸留水 14.55μ
l 、10×反応用緩衝液3 μl 、dNTP溶液 4.8μl 、NP40
溶液 3μl 、プライマー（ａ）0.75μl 、プライマー
（ｂ）0.75μl 、そして耐熱性DNA ポリメラーゼ0.15μ
l を加え、30μlの反応液を調製した。この反応液の入
った容器にミネラルオイル（SIGMA 社）を50μl 重層し
た。
l 、10×反応用緩衝液3 μl 、dNTP溶液 4.8μl 、NP40
溶液 3μl 、プライマー（ａ）0.75μl 、プライマー
（ｂ）0.75μl 、そして耐熱性DNA ポリメラーゼ0.15μ
l を加え、30μlの反応液を調製した。この反応液の入
った容器にミネラルオイル（SIGMA 社）を50μl 重層し
た。
【００２２】添加液の詳細は下記の通りである。 10×反応用緩衝液；500mM KCI, 100mM Tris-HCI(pH8.
3), 15mM MgC12, 0.1 ％（ｗ／ｖ）ゼラチン NP40溶液；NONIDET P-40, Tween 20を混合したもの（終
濃度何れも0.05％） dNTP溶液；dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合したもの（終
濃度何れも1.25mM) プライマー（ａ）及び（ｂ) ；前述した化学合成精製品
の各水溶液（5 ODU/ml） 耐熱性DNA ポリメラーゼ；Taq DNA ポリメラーゼ（5 un
it／ml; Perkin Elmer Cetus) 。
3), 15mM MgC12, 0.1 ％（ｗ／ｖ）ゼラチン NP40溶液；NONIDET P-40, Tween 20を混合したもの（終
濃度何れも0.05％） dNTP溶液；dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合したもの（終
濃度何れも1.25mM) プライマー（ａ）及び（ｂ) ；前述した化学合成精製品
の各水溶液（5 ODU/ml） 耐熱性DNA ポリメラーゼ；Taq DNA ポリメラーゼ（5 un
it／ml; Perkin Elmer Cetus) 。
【００２３】反応条件は、次の通りである。 熱変性；94℃ １分 アニーリング；55℃ １分 重合反応；72℃ １分。
【００２４】熱変性からアニーリングを経て重合反応に
至る過程を１サイクル（所用時間5.7 分）とし、これを
42サイクル（総所用時間約４時間）反復した。これらの
操作は、Perkin Elmer Cetus社製DNA Thermal Cyclerに
上記反応条件をプログラムして行った。
至る過程を１サイクル（所用時間5.7 分）とし、これを
42サイクル（総所用時間約４時間）反復した。これらの
操作は、Perkin Elmer Cetus社製DNA Thermal Cyclerに
上記反応条件をプログラムして行った。
【００２５】検出 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下の条件で行った。
め、アガロースゲル電気泳動を以下の条件で行った。
【００２６】アガロースゲルはゲル濃度 2％（ｗ／ｖ）
とし、臭化エチジウム(0.5μg ／ml) を含むものを用い
た。泳動は定電圧150Vで35分行った。なお、操作方法な
らびに他の条件は、maniatisなどによるMolecula Cloni
ng(1982)に記載されていた技法で行った。反応液の他に
分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較
により、ゲル中、紫外線光などで検出されたヌクレオチ
ド断片の長さを算出した。
とし、臭化エチジウム(0.5μg ／ml) を含むものを用い
た。泳動は定電圧150Vで35分行った。なお、操作方法な
らびに他の条件は、maniatisなどによるMolecula Cloni
ng(1982)に記載されていた技法で行った。反応液の他に
分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対移動度の比較
により、ゲル中、紫外線光などで検出されたヌクレオチ
ド断片の長さを算出した。
【００２７】結果 前述したように、Ervinia carotovoraのDNA におけるpe
lA遺伝子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわち、PCR によってプライ
マーが増幅させるヌクレオチドの大きさは推定できる。
それによると、プライマー（ａ）とプライマー（ｂ）を
用いた場合、推定261 塩基対のヌクレオチドが増幅され
たはずである。この推定はアガロースゲル電気泳動の結
果とよく一致した。
lA遺伝子は、すでに塩基配列が決定されており、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわち、PCR によってプライ
マーが増幅させるヌクレオチドの大きさは推定できる。
それによると、プライマー（ａ）とプライマー（ｂ）を
用いた場合、推定261 塩基対のヌクレオチドが増幅され
たはずである。この推定はアガロースゲル電気泳動の結
果とよく一致した。
【００２８】図１は、増幅されたヌクレオチド断片のア
ガロースゲル電気泳動の結果を示す。図中、（イ）はマ
ーカー（φ× 174／HinC II)を、（ロ）はErvinia caro
tovora strain EC1 を、（ハ）はタバコ葉（対照）を、
（ニ）はタバコ感染葉を示す。
ガロースゲル電気泳動の結果を示す。図中、（イ）はマ
ーカー（φ× 174／HinC II)を、（ロ）はErvinia caro
tovora strain EC1 を、（ハ）はタバコ葉（対照）を、
（ニ）はタバコ感染葉を示す。
【００２９】
【発明の効果】本発明では、PCR の採用によりプライマ
ーが植物体の標的ヌクレオチドのコピー数を増幅する。
しかも増幅されるヌクレオチド配列は２本以上のプライ
マーの反応によって規定できるので、本発明に従えば形
質転換体から特定の外来遺伝子を高感度で容易に検出で
きるし、検出に際しては高い選択性が得られる。
ーが植物体の標的ヌクレオチドのコピー数を増幅する。
しかも増幅されるヌクレオチド配列は２本以上のプライ
マーの反応によって規定できるので、本発明に従えば形
質転換体から特定の外来遺伝子を高感度で容易に検出で
きるし、検出に際しては高い選択性が得られる。
【００３０】本発明では、高い検出感度が得られるにも
かかわらず検出には多量の材料を必要とせず、材料の前
処理も簡便である。しかも、反応時間が短く、検出も簡
単な機材で済み、操作もまた容易なため、結果を得るま
での時間を大幅に短縮できる。また、本発明では検出に
アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムによる核酸染
色法を用いることで、プライマーなどに標識をせずに検
出が行え、しかもヌクレオチド断片の長さが確認できる
ので、結果の信頼性が高くなる。
かかわらず検出には多量の材料を必要とせず、材料の前
処理も簡便である。しかも、反応時間が短く、検出も簡
単な機材で済み、操作もまた容易なため、結果を得るま
での時間を大幅に短縮できる。また、本発明では検出に
アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムによる核酸染
色法を用いることで、プライマーなどに標識をせずに検
出が行え、しかもヌクレオチド断片の長さが確認できる
ので、結果の信頼性が高くなる。
【００３１】さらに、標的ヌクレオチドを持つ微生物の
検出に関しては、標的ヌクレオチドに高い選択性を持つ
ので、例えば組換え微生物による植物の形質転換実験な
どにおいて、微生物に標的ヌクレオチドを組み込んでい
れば植物体における微生物の存在指標として利用するこ
とが可能である。
検出に関しては、標的ヌクレオチドに高い選択性を持つ
ので、例えば組換え微生物による植物の形質転換実験な
どにおいて、微生物に標的ヌクレオチドを組み込んでい
れば植物体における微生物の存在指標として利用するこ
とが可能である。
【００３２】
配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ) ：１ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Ervinia carotovora 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 CTGTTAACACTTAGCTCGGC 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ) ：２ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Ervinia carotovora 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 GAACGTGCGGTTTTCTTCAC 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ) ：３ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Ervinia carotovora 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 CAAGAAAGGGTCAACCAACG 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ) ：４ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Ervinia carotovora 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 GGCAGACGTGAGTTAACATC 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；５ 配列の長さ １５塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Ervinia carotovora 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 TGCAACGTGGTGGTC 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；６ 配列の長さ １６塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Ervinia carotovora 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 CCCAGGTACCGAAGTT 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；７ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Ervinia carotovora 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 CAACATTACCAGCCCATCTG 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；８ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Ervinia carotovora 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 GGAGAGTAGCTATACGGTAC
【図１】増幅された実験例１のヌクレオチド断片のアガ
ロースゲル電気泳動図である。
ロースゲル電気泳動図である。
フロントページの続き (56)参考文献 Ｐｒｏｇ．Ｐｌａｎｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍ ｏｌ．Ｂｉｏｌ．（1990．Ａｕｇ．) ｐ．183−188 Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅ ｐ．，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２（1989）, ｐ．116−128 Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．62，Ｎｏ．１ （1988）ｐ．159−164 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ．，Ｖｏｌ．11，Ｎｏ．２（1983) ｐ．369−385 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．83，Ｎｏ．22 （1986）ｐ．8447−8451 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/11 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 エルビニア カロトボーラ（Ervinia ca
rotovora）のDNAにコードされている遺伝子であって、
ペクチナーゼの合成に関する遺伝子pelA[ペクテイトリ
アーゼ遺伝子（pectate lyase gene)]を標的とし、該遺
伝子のヌクレオチド配列に相補的な下記の（ａ）〜
（ｈ）のいずれかの配列で表されるオリゴヌクレオチ
ド。 （５’）d-CTGTTAACACTTAGCTCGGC (３’）……（ａ） （５’）d-GAACGTGCGGTTTTCTTCAC (３’）……（ｂ） （５’）d-CAAGAAAGGGTCAACCAACG (３’）……（ｃ） （５’）d-GGCAGACGTGAGTTAACATC (３’）……（ｄ） （５’）d-TGCAACGTGGTGGTC （３’）……（ｅ） （５’）d-CCCAGGTACCGAAGTT (３’）……（ｆ） （５’）d-CAACATTACCAGCCCATCTG (３’）……（ｇ） （５’）d-GGAGAGTAGCTATACGGTAC (３’）……（ｈ） - 【請求項２】 植物細胞に存在する請求項１に記載の遺
伝子を検出する方法であって、 試料中の一本鎖状態の標的ヌクレオチド配列に、請求
項１に記載のいずれかのオリゴヌクレオチド（プライマ
ー）をハイブリダイズさせて、四種のヌクレオチドの重
合反応により鎖長反応を行い、 得られた二本鎖ヌクレオチド配列を一本鎖に分離し、
その相補鎖を他方のプライマーによる鎖長反応の鋳型と
して機能させ、 これら二つのプライマーによる同時の鎖長反応および
鎖長反応生成物の鋳型からの分離操作を繰り返すことに
より、特定のヌクレオチド断片のコピー数を増幅し、 増幅された該ヌクレオチド断片を電気泳動またはクロ
マトグラフィーにより検出し、および、 該断片の分子量の決定および／または核酸染色によ
り、前記の試料中に認識されるべきヌクレオチド配列が
存在しているか否かを判定することの工程を包含するこ
とを特徴とする形質転換体の検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02407123A JP3092166B2 (ja) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | 植物形質転換体を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02407123A JP3092166B2 (ja) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | 植物形質転換体を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000048684A Division JP2000210092A (ja) | 2000-01-01 | 2000-02-25 | 植物形質転換体を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法 |
| JP2000048685A Division JP2000197486A (ja) | 2000-01-01 | 2000-02-25 | 植物形質転換体を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04229176A JPH04229176A (ja) | 1992-08-18 |
| JP3092166B2 true JP3092166B2 (ja) | 2000-09-25 |
Family
ID=18516743
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02407123A Expired - Fee Related JP3092166B2 (ja) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | 植物形質転換体を検出するためのオリゴヌクレオチドおよびその検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3092166B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2740474B1 (fr) * | 1995-10-30 | 1998-01-02 | Agronomique Inst Nat Rech | Sequences nucleotidiques pour la detection des erwinia carotovora subsp. atroseptica |
-
1990
- 1990-12-27 JP JP02407123A patent/JP3092166B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．６２，Ｎｏ．１（１９８８）ｐ．１５９−１６４ |
| Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．２（１９８３）ｐ．３６９−３８５ |
| Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２（１９８９），ｐ．１１６−１２８ |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８３，Ｎｏ．２２（１９８６）ｐ．８４４７−８４５１ |
| Ｐｒｏｇ．Ｐｌａｎｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０．Ａｕｇ．）ｐ．１８３−１８８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04229176A (ja) | 1992-08-18 |
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