ES2352849T3 - Procedimiento para almacenar adn usando quitosano, y productos que utilizan los procedimientos. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para almacenar ADN en forma de complejo de quitosano/ADN preparado mezclando una disolución de ADN y una disolución de quitosano hidrosoluble, en el que el ADN es ADN genómico de animales, plantas, hongos, bacterias y virus, y el quitosano hidrosoluble tiene un grado de desacetilación del 60% o superior, y un peso molecular de 10 kDa a 500 kDa.

Description

Procedimiento para almacenar ADN usando quitosano, y productos que utilizan los procedimientos.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para almacenar ADN, un procedimiento para analizar el ADN almacenado por el procedimiento anteriormente mencionado y a productos que utilizan los procedimientos. Más concretamente, la invención se refiere a un procedimiento para almacenar ADN en un estado estabilizado a temperatura ambiente durante un tiempo prolongado, a un procedimiento para analizar el ADN almacenado por el procedimiento mencionado anteriormente y a una tarjeta de ID de ADN, tal como una tarjeta de ADN, fabricada de papel o una tarjeta de ADN fabricada de plástico, que se producen usando los procedimientos de almacenamiento y análisis anteriormente mencionados.

Técnica anterior

La suma de todos los genes presentes en los organismos se denomina genomas. Se ha informado que el genoma humano está compuesto por 3 mil millones de bases y que tiene aproximadamente 30.000 genes. Recientemente, se ha completado el proyecto genoma humano, desarrollado para decodificar las secuencias de bases de todo el genoma humano, permitiendo de este modo acceder a trascendentales mejoras en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades refractarias a los tratamientos, usando genes. Por así decirlo, ha comenzado la era de la medicina personalizada y de las medicina predictiva.

Los fenómenos de la vida están determinados por tres cuestiones: (1) la información genética del ADN genómico, (2) la transcripción de los genes y (3) las proteínas expresadas. Para entender y analizar los fenómenos de la vida, y para desarrollar procedimientos para diagnosticar y tratar enfermedades, es importante analizar con precisión las tres cuestiones anteriormente mencionadas. La suma de genes de un individuo se denomina genes o genomas y, por consiguiente, la suma de los genes transcritos (es decir, el ADNm) y la suma de las proteínas expresadas en un individuo se denominan transcriptoma y proteoma, respectivamente. Recientemente, los estudios sobre análisis automatizados de tal información integral progresan de manera activa. Para la automatización de los análisis, resulta útil una micromatriz o un biochip en particular, y los ejemplos representativos de los mismos incluyen un chip de ADN y un chip de proteínas.

Como procedimientos generales para el análisis cualitativo y cuantitativo de la información genética del ADN genómico, pueden mencionarse el análisis de hibridación, el análisis de secuenciación, las micromatrices o chips de ADN, o similares, por medio de PCR, PCR-RFLP (PCR de Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción), clonación y producción de bibliotecas, transferencia southern o similares (Sambrook, J. & Russell, D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (2001)).

Cuando se analiza el ADN de una persona, es posible comprender la salud de la persona y dar un diagnóstico de si la persona contrajo diversas enfermedades tales como cáncer o infecciones, así como predecir la posibilidad de que en el futuro presente brotes de enfermedades genéticas y la transmisión a los hijos de dicha persona. Además, el análisis de ADN es el modo más exacto para probar la identidad y el parentesco de una persona, tal como la paternidad. También resulta útil para demostrar líneas o árboles genealógicos. Por esa razón, el análisis de ADN se ha utilizado de manera inevitable como medio en la medicina forense y para discriminar la idoneidad en la donación de médula ósea, otros órganos internos o similares. Además, el análisis de polimorfismos de nucleótido único (SNP) puede ayudar a predecir la posibilidad que se presenten en el futuro brotes de enfermedades, reacciones a fármacos o similares.

Cuando se reconoció la necesidad de almacenar el ADN para pruebas de ADN futuras, cada país ha establecido fácilmente bancos de ADN, y el número de muestras en el banco de ADN tiende a aumentar en gran parte debido a el almacenamiento de ADN relacionado con los seguros de viajes o seguros de accidentes, almacenamiento del ADN de las fuerzas armadas de EEUU o similares. Sin embargo, el almacenamiento del ADN personal en una organización nacional o en una organización comercial, puede tener un problema tal como el uso inadecuado de la información genética personal. Por otra parte, para almacenar el ADN de manera segura durante un tiempo prolongado por medio de la tecnología existente, se necesitan congeladores y reactivos específicos y, por consiguiente, el coste para almacenar el ADN es importante.

De hecho, cuando el ADN separado y purificado a partir de una célula se deja en reposo a temperatura ambiente, puede presentarse el problema de la rápida degradación del ADN o la segmentación por desoxirribonucleasa (DNAsa). Por consiguiente, resulta importante un procedimiento para almacenar ADN para estudios de genes. Actualmente, como procedimientos para almacenar o transportar ADN, que se utilizan ampliamente, pueden mencionarse un procedimiento para almacenar ADN en estado líquido purificando el ADN separado del fluido corporal tal como sangre, células o tejidos; un procedimiento de almacenamiento en un congelador; un procedimiento de almacenamiento mediante liofilización; un procedimiento de almacenamiento en alcohol 2-propílico; y similares (por ejemplo, Madisen y col., J. Med. Genetics, 27(2), 1987, páginas. 379-390). Sin embargo, en estos procedimientos hay muchas desventajas desde el punto de vista de costes y de pérdidas. El procedimiento para almacenar el ADN purificado en estado líquido resulta fácil para usar el ADN inmediatamente, pero existe el problema de que el ADN se daña fácilmente cuando se almacena durante un tiempo prolongado. El procedimiento para almacenar en un congelador y el procedimiento de liofilización tienen el problema de que el ADN puede dañarse por la repetida congelación y descongelación en el proceso de utilización de la muestra. Además, el procedimiento de almacenamiento usando un reactivo tal como alcohol también resulta problemático en el proceso de pretratamiento y postratamiento, así como otros procedimientos. Por otra parte, el problema más importante en los procedimientos anteriores es que el ADN debe purificarse primero del fluido corporal, tal como sangre, para el almacenamiento.

Los procedimientos descritos anteriormente para almacenar el ADN requieren equipamientos especiales, costosos, tales como congeladores de temperatura ultra baja, nitrógeno líquido, y similares. Por consiguiente, no resultan ventajosos porque los procedimientos pueden imponer una carga desde el punto de vista económico, los procedimientos requieren procesos de pretratamiento y postratamiento cuando se reutiliza el ADN almacenado para el análisis, y el procedimiento podría dañar el ADN por los repetidos procesos de congelación y descongelación.

Además de los procedimientos mencionados anteriormente, se introducen varios productos comercializados tales como una tarjeta FTA o una tarjeta fabricada por Whatman plc., y similares, con el fin de almacenar ADN de plásmido a temperatura ambiente (por ejemplo, documento US-A-5985327 publicado el 16 de noviembre de 1999). Sin embargo, este procedimiento tiene limitaciones en cuanto a su eficacia, y se sugiere almacenar el ADN a -15ºC o a -20ºC en lugar de a temperatura ambiente, por consiguiente no hay una gran ventaja sobre los procedimientos originales, más bien resulta bastante desfavorable en lo que respecta al aumento de costes.

Por consiguiente, es un objeto importante en el campo de la genética molecular y la medicina desarrollar un posible procedimiento para proteger el ADN de la descomposición por desoxirribonucleasas por medio de la formación de un enlace estable con el ADN, almacenar el ADN en un estado estabilizado a temperatura ambiente, y además para aplicar directamente a los estudios y análisis que usan ADN. Los procedimientos de almacenamiento ideales deben incluir: (1) un procedimiento para almacenar de manera estable a temperatura ambiente sin que se produzca degradación del ADN; (2) un procedimiento que sea simple; (3) un procedimiento que sea rentable; (4) el almacenamiento del ADN no debe ser sólo para el mismo ADN separado y purificado, sino también para muestras que contienen fluido corporal, tal como sangre y ADN diversos, que no tengan daños en el ADN; (5) diversas muestras de ADN deben almacenarse en un espacio limitado; (6) un individuo debe poder almacenar su ADN personal; y (7) no debe haber ningún problema en los análisis de los diversos genes en el futuro, y estas pruebas genéticas deben ser útiles para el diagnóstico real o para estudios. Sin embargo, no se han introducido hasta ahora los procedimientos o productos que satisfagan estas condiciones, y no se han podido hallar informes sobre productos para almacenar el ADN personal junto con la información genética de las personas.

El quitosano es un polímero que se produce biológicamente y que tiene excelentes características de estabilidad, biodegradabilidad e idoneidad en un cuerpo vivo, y se utiliza ampliamente en el campo de la medicina. Cuando el quitosano se trata con un ácido, forma una sal de quitosano hidrosoluble que pasa a tener una fuerte carga positiva, por consiguiente, en los últimos años, se ha señalado a la sal de quitosano como un medio importante de administración de fármacos, proteínas y moléculas de ADN. En particular, las formas hidrosolubles del quitosano forman un fuerte enlace con el ADN, que es una sustancia aniónica, para la protección del ADN. Por consiguiente, el quitosano hidrosoluble puede servir como una sustancia medio para administrar genes.

El quitosano es un copolímero de glucosamina y N-acetilglucosamina y se obtiene a partir de la quitina. La quitina se encuentra de manera abundante en crustáceos tales como cangrejos y gambas, y es una sustancia de polímeros naturales de mayor abundancia junto con la celulosa. Quitosano es un término genérico de los polímeros catiónicos que se obtiene sometiendo la quitina a desacetilación con una base fuerte (Errington N., Harding S.E., Varum K.M., Illum L., Int. J. Biol. Macromol., 15, 1123-1127 (1993)).

El quitosano no se disuelve a pH neutro o básico, mientras que forma sales de quitosano o quitosano catiónico cuando reacciona con ácidos tales como ácido glutámico, ácido clorhídrico, ácido láctico o similares. La sal de quitosano se disuelve en agua, y su solubilidad es proporcional al grado de desacetilación y al pH. En el caso del quitosano hidrosoluble, se transforma en un compuesto cargado positivamente por adición de un protón a un grupo amina. Además, el quitosano hidrosoluble puede pasar a un estado liofilizado.

El quitosano hidrosoluble tiene propiedades de formación de una película o un gel con una fuerte carga positiva. Al respecto, el quitosano se utiliza en purificadores para aguas muy sucias, metales pesados y agua potable, y en sustancias antifúngicas. También se lo utiliza como materia prima de bebidas, alimentos saludables y cosméticos. Además, el quitosano se utiliza como un medio importante en el campo farmacéutico. Por ejemplo, el quitosano se utiliza muy ampliamente para la administración de vacunas, para la administración de ADN, para facilitar la administración de proteínas, péptidos y fármacos por medio de la producción por purificación y un sistema de liberación controlada del fármaco, un gel, una película, un agente humectante, un agente de recubrimiento, una microesfera, una microcápsula, bioadhesivos y una membrana mucosa, y similares (Illum L., Pharmaceutical Research, 15, 1326-1331 (1998)).

El quitosano es muy seguro y no muestra efectos secundarios causados por inmunización. Cuando el quitosano se absorbe en un cuerpo vivo, se degrada por medio de lisozima a N-acetilglucosamina, tras lo que se utiliza en la síntesis de glicoproteínas, y a continuación el residuo resultante se descarga en forma de dióxido de carbono (Chandy T., Sharma CP., Biomat. Art. Cells Art. Org., 18, 1-24 (1990)).

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La propiedad más importante del quitosano hidrosoluble o del quitosano catiónico según la invención es que forma un fuerte enlace con el ADN, que es una sustancia aniónica, de modo que puede utilizarse como una protección y un medio de administración de ADN, a saber, como una sustancia para la administración de genes. En el experimento de utilización de un ADN de plásmido, se informa que el quitosano funciona conservando el ADN de manera estable sin descomposición por medio de nucleasas de ADN, tales como DNasa I y DNasa II, y que cuando se inyecta un complejo de quitosano y ADN de plásmido en una célula cultivada in vitro, provoca la expresión de un gen administrado (Lee M., Nah J-W., Kwon Y., Koh J.J., Jo K.S., Kim S.W., Pharmaceutical Research, 18 (4), 427-531 (2001)). El efecto de administración del gen está determinado por (1) el peso molecular del quitosano y (2) la relación del quitosano al ADN, en particular, la relación nitrógeno/fosfato de la molécula con fosfato del ADN aniónico a la molécula con nitrógeno del quitosano catiónico (Borchard G., Advanced Drug Delivering Reviews, 52, 145-150 (2001)).

Está informado que cuando un ADN de plásmido se deja en reposo a temperatura ambiente como tal, el ADN de plásmido se descompone durante varias horas; sin embargo, cuando un ADN de plásmido se mantiene en forma de un complejo con quitosano, es posible almacenar el ADN de plásmido durante 3 meses o más (Leong K.W., Mao H.Q., Turong-Lee V.L., Roy K., Walsh S.M., August J.T., J. controlled ReI., 53, 183-193 (1998)). Mientras tanto, ha habido un informe que indica que cuando un complejo de quitosano y ADN de plásmido se almacena en estado liofilizado, el efecto de administración del gen puede mantenerse hasta después de 4 semanas (Mao H.Q., Turong-Lee V.L., August J.T., Leong K.W., Proc. Intl. Symp. Control. ReI. Bioact. Mater., 24, 671-772 (1997)).

No obstante, no se han informado hasta el momento estudios sobre la posibilidad de almacenar de manera estable ADN genómico grande de un mamífero con quitosano ni tampoco estudios sobre la posibilidad de almacenar de manera estable el ADN con quitosano durante un tiempo prolongado a temperatura ambiente. Además, no se han fabricado productos producidos para almacenar ADN usando quitosano. Tampoco se ha informado la posibilidad de realizar un análisis de la expresión genética usando el ADN unido a quitosano ni el tema de almacenar el ADN en una forma mixta de quitosano y fluido corporal, en lugar del ADN solo, tal como la sangre. Además, no se han lanzado productos para almacenar, transportar y analizar el ADN genómico de un ser humano o un animal usando quitosano, diferentes de los productos de la invención.

Divulgación Problema técnico

Un aspecto de la invención es que proporciona un procedimiento para almacenar y transportar una muestra de ADN en un estado estabilizado a temperatura ambiente usando quitosano hidrosoluble.

Otro aspecto de la invención es que proporciona un complejo de quitosano hidrosoluble y ADN estabilizado que puede utilizarse en diversos procedimientos de análisis de ADN.

Otro aspecto de la invención, según el procedimiento para almacenar ADN que usa quitosano de la invención, es que proporciona una disolución de quitosano con una propiedad y una concentración adecuadas, que puede formar un enlace estable con el ADN para posibilitar el transporte y el almacenamiento del ADN durante un tiempo prolongado a temperatura ambiente, el estudio y el análisis el ADN de manera fácil y su fácil aplicación.

Aún otro aspecto de la invención es que proporciona un procedimiento para la preparación de una tarjeta de papel que contiene quitosano (una tarjeta de ADN) que puede almacenar quitosano y ADN combinados en estado líquido y un número de muestras de ADN en un espacio mínimo, un procedimiento para realizar un análisis genético tal como PCR, PCR-RFLP, clonación, análisis de secuencias y transferencia southern, pruebas de micromatrices y similares, y un procedimiento para separar el quitosano y el ADN de su estado combinado. En este caso, la tarjeta de ADN puede clasificarse en gran medida en Tipo 1 y Tipo 2: el Tipo 1 conserva el ADN mismo en una tarjeta de papel que contiene quitosano, y el Tipo 2 conserva la muestra biológica que contiene el ADN, tal como sangre, en lugar del ADN mismo, en una tarjeta de papel que comprende quitosano y un tampón de lisis celular. En ambos casos, el objetivo es almacenar el ADN en estado estabilizado durante un tiempo prolongado a temperatura ambiente y realizar diversos análisis genéticos a partir de entonces, de ser necesario.

Otro aspecto de la invención es que proporciona una tarjeta de identificación de ADN (tarjeta de ID de ADN) en la que la muestra de ADN de un individuo se conserva en forma de una mezcla con quitosano, y la información genética de un individuo obtenida realizando pruebas tales como una pruebas genéticas para la identificación personal, pruebas de genotipado HLA, o similares, se guarda en una barra magnética o un chip en la tarjeta de plástico. La tarjeta de ID de ADN de plástico puede utilizarse para almacenar información personal tal como diferentes tarjetas de crédito y tarjetas de débito, tarjetas de entrada a organizaciones importantes, biopasaporte, fuerzas militares o similares, o para compartir la información genética para un transplante de órganos, tal como un transplante de médula ósea.

Solución técnica

En la invención, se estudió un nuevo procedimiento para almacenar ADN genómico grande de animales y plantas, y como resultado, se confirmó que cuando el quitosano hidrosoluble se mezcla con el ADN, se forma un enlace estable que protege al ADN de la descomposición por las desoxirribonucleasas y puede almacenarse durante un tiempo prolongado en un estado estabilizado a temperatura ambiente, y de este modo se completa la invención.

Las condiciones a alcanzar por los procedimientos y los productos de la invención son las siguientes:

1) El ADN debe almacenarse en un estado estabilizado sin degradación a temperatura ambiente;

2) Las muestras de ADN del presente documento deben incluir ADN genómico de seres humanos, animales, plantas y bacterias;

3) el procedimiento debe ser simple y no debe requerir equipamientos o instrumentos especiales para su uso;

4) el coste debe ser económico;

5) el almacenamiento del ADN no sólo debe ser para el ADN mismo separado y purificado, sino también para las muestras biológicas que contienen fluido corporal, tal como la sangre y diversos ADN que no presenten daños en el ADN;

6) la muestra de ADN de almacenarse usando un medio simple tal como un papel o una tarjeta;

7) debe almacenarse un número de muestras de ADN en un espacio limitado;

8) un individuo debe poder almacenar su ADN personal;

9) con respecto a las muestras de ADN, que se almacenaron y transportaron mediante los procedimientos y productos mencionados anteriormente, deben poder realizarse en las mismas diversos análisis genéticos tales como PCR, PCR-RFLP, hibridación, análisis de secuenciación, análisis de SNP y similares, de manera precisa y simple incluso después de un tiempo prolongado, y deben ser útiles para estudios así como para diversos exámenes clínicos; y

10) la tarjeta de ID de ADN debe funcionar como banco de ADN para almacenar el ADN personal y también para almacenar junto con la misma la información genética de la persona.

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A continuación, en el presente documento se describirá la invención de manera detallada en referencia a los dibujos.

La Fig. 1 es un diagrama de bloques que ilustra el proceso de fabricación y análisis de un producto unido de ADN y quitosano hidrosoluble según la invención. Cuando se examinó el proceso para fabricar el producto unido de ADN y quitosano hidrosoluble, con referencia a la Fig. 1, en primer lugar, se estableció la condición óptima para la unión del ADN y el quitosano hidrosoluble, y se analizó el efecto de protección contra las nucleasas de ADN y el cambio de movilidad de la mezcla de ADN y quitosano (S101). A continuación, con respecto a la mezcla de ADN y quitosano en estado líquido, se llevaron a cabo análisis de ensayos de PCR y el efecto del almacenamiento del ADN (S102). Usando los resultados anteriores, se fabricó la tarjeta de ADN de Tipo 1 y se llevaron a cabo análisis de los ensayos de PCR y el efecto del almacenamiento del ADN (S103). De la misma manera, se fabricó la tarjeta de ADN de Tipo 2, y se llevaron a cabo análisis de los ensayos de PCR y el efecto del almacenamiento del ADN (S104). Se analizó la posibilidad de realizar análisis genéticos basándose en las muestras almacenadas durante un tiempo prolongado en las tarjetas de ADN de Tipo 1 y de Tipo 2 fabricadas anteriormente (S105). Posteriormente, se fabricó un kit de PCR del tipo todo incluido que contenía quitosano y se analizó la disponibilidad del mismo (S106). A continuación, se fabricó una tarjeta de ID de ADN de plástico (S107).

En la invención, para formar un complejo estable con ADN, para proteger el ADN de la descomposición por medio de desoxirribonucleasas, y para almacenar el ADN en un estado estabilizado a temperatura ambiente, se usó una disolución de quitosano hidrosoluble con una propiedad y concentración adecuadas, una tarjeta de papel o un kit de PCR que contenía tal disolución y una tarjeta de ID de ADN de plástico, y similares.

Resulta de preferencia que el quitosano utilizado en la invención tenga un peso molecular de 10 a 500 kDa. El quitosano que tiene peso molecular inferior a 10 kDa presenta problemas para formar un enlace estable con el ADN, y el quitosano que tiene peso molecular superior a 500 kDa puede interferir con el análisis de la expresión del gen al usar el ADN. Además, resulta de preferencia el quitosano con un grado de desacetilación del 60% o superior, y cuando el grado de desacetilación es inferior al 60%, se produce un problema en la solubilidad del quitosano con el agua, por consiguiente resulta difícil formar un enlace estable con el ADN. La concentración de una disolución acuosa de quitosano preparada, en términos de relación de peso a volumen (peso/volumen), es del 0,02% hasta el 1%, y de preferencia del 0,1%. La relación de la mezcla al momento de mezclar una disolución acuosa de quitosano y una disolución acuosa de ADN, en términos de la relación de peso de quitosano en la disolución acuosa de quitosano al ADN en la disolución acuosa de ADN, es de 1:0,5 o superior, y de preferencia de 1:0,5 a 1:3 (Ejemplos 1 y 2).

El producto unido de ADN/quitosano según la invención se conserva a una temperatura que va desde la temperatura ambiente hasta -70ºC, que es un intervalo muy amplio, y se almacena en un lugar oscuro sin humedad.

Mientras tanto, el ADN almacenado en una forma unida con el quitosano hidrosoluble según la invención se conserva de manera estable incluso si se produce degradación por desoxirribonucleasas, por consiguiente puede utilizarse para análisis genéticos (véase Ejemplo 2).

Según la invención, los ADN que pueden almacenarse en una mezcla con quitosano incluyen ADN genómicos de seres humanos, animales o plantas, y de bacterias. El tamaño del ADN que puede almacenarse en una mezcla con quitosano varía desde varias decenas a varios miles de millones de bases.

Mientras tanto, una mezcla líquida de ADN unido con el quitosano hidrosoluble según la invención se conserva de manera estable, y la eficacia de un procedimiento para conservar el ADN de la invención se confirmó fácilmente realizando pruebas tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR), clonación, transferencia, análisis de secuenciación y similares.

Según la invención, puede prepararse una tarjeta para almacenar ADN (tarjeta de ADN de Tipo 1) por medio de la mezcla de una concentración apropiada de quitosano y un ácido úrico (en concreto, la relación de volúmenes de la mezcla de 0,1% hasta 1% (p/v) de la disolución de quitosano hidrosoluble a la concentración de 0,5 mM hasta 20 mM del ácido úrico es de 1:1), por adsorción de la mezcla sobre un papel para transferencia y por secado. Usando la tarjeta mencionada anteriormente, puede almacenarse una cantidad de ADN durante un tiempo prolongado y puede transportarse en un espacio mínimo a temperatura ambiente. Como papel utilizado en la preparación de la tarjeta para almacenar ADN, pueden utilizarse diversos papeles para cromatografía o papeles para transferencia que pueden utilizarse en el comercio, y el espesor del papel es de preferencia de aproximadamente 0,3 mm hasta 1,2 mm. La temperatura de almacenamiento adecuada de la tarjeta para almacenar el ADN es la temperatura ambiente, pero es admisible bajar la temperatura hasta -20ºC y hasta -70ºC, y es posible almacenar a temperatura ambiente durante 6 meses o más (Ejemplo 5).

Cuando se lleva a cabo la PCR en la invención, en el caso en el que la mezcla de ADN y quitosano es un líquido, se utiliza la mezcla misma como molde, y en el caso en el que se encuentre en forma de tarjeta, se corta un fragmento de la tarjeta y se utiliza como plantilla para realizar un procedimiento general de amplificación por PCR, clonación y de análisis de secuenciación. Por consiguiente, se confirmó que el ADN se conservó de manera suficientemente estable para llevar a cabo el procedimiento de análisis genético usando el ADN almacenado según el procedimiento de la invención (Ejemplo 5).

Según la invención, puede prepararse una tarjeta para almacenar ADN (tarjeta de ADN de Tipo 2) por adsorción de una mezcla de una disolución de quitosano apropiada con un tampón de lisis celular que comprende Tris, EDTA, SDS y ácido úrico (en concreto, Tris (8 mM), EDTA (0,5 mM), SDS (al 0,1% p/v) y ácido úrico (2 mM)) sobre un papel para transferencia, y por secado. Usando la tarjeta mencionada anteriormente, puede almacenarse el ADN durante un tiempo prolongado y transportarse a temperatura ambiente en un estado de muestra biológica que contiene ADN, tal como la sangre (Ejemplo 6).

Mientras tanto, el ADN almacenado usando la tarjeta de ADN de la invención se conserva de manera estable, y por lo tanto pueden realizarse en el futuro pruebas tales como PCR, PCR-RFLP, clonación, análisis de secuenciación y similares (Ejemplos 7 a 10).

Además, para realizar la transferencia southern, el complejo de ADN y quitosano debe separarse para que el ADN pueda desplazarse en el gel de agarosa. Por consiguiente, el ADN se separa usando una sal catiónica a base de sulfato que no daña el ADN y que no tiene efectos sobre los resultados de la transferencia southern. Ejemplos de la sal catiónica a base de sulfato mencionada anteriormente incluyen dodecilsulfato de sodio (SDS), octilsulfato de sodio (SOS) o bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB) (Ejemplo 9).

Como una aplicación del procedimiento de almacenamiento de ADN usando quitosano de la invención, se preparó un kit de PCR en el que se añadió la polimerasa Taq, un cebador, dNTP y tampón, y similares, a un tubo con quitosano (tubo con todo incluido), y se añadió una muestra tal como ADN o suero al tubo para dar lugar a la reacción de PCR. De modo característico, este kit de PCR puede utilizarse tanto para el almacenamiento del ADN como para el ensayo de PCR (Ejemplo 11).

Además, la invención proporciona una tarjeta de ID de ADN en la que se conserva la muestra de ADN de un individuo en forma de mezcla con quitosano, y se guarda la información genética de un individuo, obtenida realizando un ensayo genético para la identificación personal o una prueba de genotipado de HLA en una barra magnética en la tarjeta de plástico (Ejemplos 12 y 13). La tarjeta de ID de ADN de plástico puede utilizarse como banco de ADN personal así como un banco personal de información genética para identificación personal, transplante de órganos personal, diagnóstico clínico personal o similares.

Descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un diagrama de bloques que muestra un procedimiento para producir y analizar un producto complejo de ADN y quitosano hidrosoluble según la presente invención.

La Fig. 2 es una fotografía de la electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% para un complejo ADN/quitosano, que se obtuvo mezclando ADN genómico aislado de monocito normal de adulto en una concentración de 1 \mug/\mul y una disolución de quitosano hidrosoluble en diversas concentraciones con diversas relaciones (Carril 1: marcador de tamaño (1 kb), Carril 2: solamente ADN, Carril 3: 0,02% (p/v) de la disolución de quitosano hidrosoluble:disolución acuosa de ADN = 1:0,2, Carril 4: 0,02% (p/v) de la disolución de quitosano:disolución acuosa de ADN = 1:0,4, Carril 5: 0,02% (p/v) de la disolución de quitosano:disolución acuosa de ADN = 1:0,6, Carril 6: 0,1% (p/v) de la disolución de quitosano:disolución acuosa de ADN = 1:1, Carril 7: 0,1% (p/v) de la disolución de quitosano:disolución acuosa de ADN = 1:2, Carril 8: 0,1% (p/v) de la disolución de quitosano:disolución acuosa de ADN = 1:3, Carril 9: 0,25% (p/v) de la disolución de quitosano:disolución acuosa de ADN = 1:2,5:, Carril 10: 0,25% (p/v) de la disolución de quitosano:disolución acuosa de ADN = 1:5, Carril 11: 0,25% (p/v) de la disolución de quitosano:disolución acuosa de ADN = 1:7,5).

La Fig. 3 es una fotografía de la electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para un complejo ADN/quitosano, que se obtuvo mezclando un ADN de plásmido (pCMV-beta-galactosidasa) con un tamaño de 4,0 kb en una concentración de 1 \mug/\mul y una disolución de quitosano hidrosoluble en diversas concentraciones con diversas relaciones (Carril 1: marcador de tamaño (1 kb), Carril 2: solamente ADN, Carril 3: 0,02% (p/v) de la disolución de quitosano hidrosoluble:disolución acuosa de ADN = 1:0,2, Carril 4: 0,02% (p/v) de la disolución de quitosano:disolución acuosa de ADN = 1:0,4, Carril 5: 0,02% (p/v) de la disolución de quitosano:disolución acuosa de ADN = 1:0,6, Carril 6: 0,1% (p/v) de la disolución de quitosano:disolución acuosa de ADN = 1:1, Carril 7: 0,1% (p/v) de la disolución de quitosano:disolución acuosa de ADN = 1:2, Carril 8: 0,1% (p/v) de la disolución de quitosano:disolución acuosa de ADN = 1:3, Carril 9: 0,25% (p/v) de la disolución de quitosano:disolución acuosa de ADN = 1:2,5: , Carril 10: 0,25% (p/v) de la disolución de quitosano:disolución acuosa de ADN = 1:5, Carril 11: 0,25% (p/v) de la disolución de quitosano:disolución acuosa de ADN = 1:7,5).

La Fig. 4 es una fotografía que compara y analiza un grado de escisión de ADN en un gel de agarosa al 1% por tratamiento con desoxirribonucleasa (DNAsa I) para ADN genómico de linfocito humano unido a quitosanos, y ADN no unido a quitosano (Carril 1: marcador de tamaños (escalera de 1 kb), Carril 2: solamente ADN, Carril 3: complejo quitosano/ADN, tras 20 minutos, Carril 4: complejo quitosano/ADN, tras 40 minutos, Carril 5: complejo quitosano/ADN, tras 60 minutos, Carril 6: ADN no unido a quitosano, tras 20 minutos, Carril 7: ADN no unido a quitosano, tras 40 minutos, Carril 8: ADN no unido a quitosano, tras 60 minutos).

La Fig. 5 es una fotografía que representa los resultados de la electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de realizar la PCR para genes de beta-Actina con un molde de complejos de ADN/quitosano, que se obtuvo mezclando una disolución de quitosano al 0,1% (p/v) y una concentración 1 \mug/\mul de una disolución acuosa de ADN genómico de leucocito humano en una relación de volúmenes de 1:1, y el ADN genómico de leucocito humano no unido a quitosano, respectivamente (Carril 1: marcador de tamaño (100 pb), Carril 2: control negativo, Carril 3: control positivo (se analizó directamente el ADN genómico de leucocito), Carril 4: análisis tras depositar el ADN genómico sobre la tarjeta de ADN (Tipo 1) y a continuación almacenarla a temperatura ambiente durante un año, Carril 5: análisis tras depositar sangre sobre la tarjeta de ADN (Tipo 2) y a continuación almacenar a temperatura ambiente durante un año, Carril 6: análisis tras adsorber sangre sobre el papel para transferencia y a continuación almacenar a temperatura ambiente durante un año, y Carril 7: análisis tras adsorber ADN genómico de leucocito sobre el papel para transferencia y a continuación almacenar a temperatura ambiente durante un año).

La Fig. 6 es una fotografía que representa los resultados de la electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de realizar la PCR para genes de beta-Actina con un molde de complejos de ADN/quitosano, que se obtuvo mezclando una disolución de quitosano al 0,1% (p/v) y una concentración 1 \mug/\mul de una disolución acuosa de ADN genómico de leucocito humano en una relación de volúmenes de 1:1, y ADN no unido a quitosanos, que se almacenaron ambos durante varios tiempos y a varias temperaturas (Carril 1: marcador de tamaño (100 pb), Carril 2: control negativo, Carril 3: control positivo (ADN que se aisló y se purificó a partir de sangre, y a continuación se realizó directamente la PCR para el mismo), Carril 4: solamente ADN que se había almacenado a -70ºC durante tres meses, Carril 5: solamente ADN que se había almacenado a temperatura ambiente durante una semana, Carril 6: solamente ADN que se había almacenado a temperatura ambiente durante un mes, Carril 7: complejo ADN/quitosano que se había almacenado a temperatura ambiente durante tres semanas, Carril 8: complejo ADN/quitosano que se había almacenado a temperatura ambiente durante tres meses, Carril 9: complejo ADN/quitosano que se había almacenado a temperatura ambiente durante un año, Carril 10: tarjeta de ADN de Tipo 1 con el ADN que se había goteado sobre la misma, que se había almacenado a temperatura ambiente durante tres semanas, y Carril 11: tarjeta de ADN de Tipo 1 con el ADN que se había goteado sobre la misma, que se había almacenado a temperatura ambiente durante tres meses).

La Fig. 7 es una fotografía de la electroforesis en gel de agarosa que representa los resultados de comparar y analizar cada una de las tarjetas de ADN por PCR, que se fabricaron adsorbiendo quitosano en diferentes tipos de papeles de transferencia y dejándolos secar para preparar la tarjeta de ADN de Tipo 1, depositando ADN de leucocito de adulto normal en la misma con una pipeta, y a continuación almacenándolas a temperatura ambiente durante 6 meses (Carril 1: marcador de tamaño (100 pb), Carril 2: control negativo, Carril 3: control positivo (ADN que se aisló y se purificó directamente a partir de sangre), Carril 4: tarjeta de ADN que se había tratado con disolución de quitosano al 0,02% sobre papel de transferencia de 0,3 mm de espesor, Carril 5 del ADN: tarjeta de ADN que se había tratado con disolución de quitosano al 0,02% sobre papel de transferencia de 0,9 mm de espesor, Carril 6: tarjeta de ADN que se había tratado con disolución de quitosano al 0,1% sobre papel de transferencia de 0,3 mm de espesor, Carril 7: tarjeta de ADN que se había tratado con disolución de quitosano al 0,1% sobre papel de transferencia de 0,9 mm de espesor, Carril 8: tarjeta de ADN que se había tratado con disolución de quitosano al 0,25% sobre papel de transferencia de 0,3 mm de espesor, Carril 9: tarjeta de ADN que se había tratado con disolución de quitosano al 0,25% sobre papel de transferencia de 0,9 mm de espesor, Carril 10: tarjeta de ADN sin tratamiento sobre el papel de transferencia de 0,3 mm de espesor, y Carril 11: tarjeta de ADN sin tratamiento sobre el papel de transferencia de 0,9 mm de espesor.

La Fig. 8 muestra los resultados de una prueba de genotipado usando el ensayo RFLP tras la PCR para una muestra de ADN genómico humano, que se había almacenado usando quitosano hidrosoluble y la tarjeta de ADN de Tipo 1 de la presente invención ((a): control positivo, una muestra de ADN aislada y purificada directamente a partir de leucocito de adulto, (b): una muestra de ADN aislada y purificada directamente a partir de leucocito de adulto, y mezclada con la disolución de quitosano de la presente invención, y almacenada a temperatura ambiente durante tres meses, (c) una muestra de ADN aislada y purificada a partir de leucocito de adulto, colocada en la tarjeta de ADN de Tipo 1 de la presente invención para su almacenamiento, y almacenada a temperatura ambiente durante un año) (Carriles 1 y 12: marcador de tamaño de 100 pb, Carril 11: marcador de tamaño de 25 pb, Carriles 2 y 3: ensayos para gentes de Apolipoproteína E (apo E), Carriles 4 y 5: ensayos para genes de angiotensinógeno (AGT), Carriles 6 y 7: ensayos para genes de enzima de conversión de angiotensina (ACE), Carril 8: ensayo para el gen del receptor 1 de angiotensina (AT1R), Carriles 9 y 10: ensayos para genes de óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS), y Carriles 13 y 14: ensayos para genes de MTHFR).

La Fig. 9 muestra los resultados de una prueba de genotipado usando el ensayo PCR-RFLP para las muestras de la tarjeta de ADN de Tipo 2 de la presente invención, que se almacenaron absorbidas sobre la misma ((a): control positivo, una muestra de ADN aislada y purificada directamente a partir de leucocito de adulto, (b): una muestra de ADN que se produjo adsorbiendo sangre de adulto sobre la tarjeta de ADN de Tipo 2 de la presente invención y almacenándola a temperatura ambiente durante tres meses, (c) una muestra de ADN que se produjo adsorbiendo sangre de adulto en la tarjeta de ADN de Tipo 2 de la presente invención y almacenándola a temperatura ambiente) (Carriles 1 y 8: marcadores de tamaño de 100 pb, Carriles 7 y 15: marcadores de tamaño de 25 pb, Carriles 2 y 3: genes de angiotensinógeno, Carriles 4 y 5: genes de enzima de conversión de angiotensina (ACE), Carril 6: gen del receptor 1 de angiotensina (AT1R), Carriles 9 y 10: genes de óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS), Carriles 11 y 12: Genes de MTHFR, y Carriles 13 y 14: genes de Apolipoproteína E (Apo E)).

La Fig. 10 es un gráfico que representa los resultados de la búsqueda del gen de APC (poliposis cólica adenomatosa) por ensayo automático de secuenciación de bases, para el que se realizó PCR, con un molde de ADN genómico de tejido cólico de adulto, que se mezcló con la disolución de quitosano hidrosoluble según el procedimiento de la presente invención, y se almacenó a temperatura ambiente durante un mes, y cuyo producto se clonó.

La Fig. 11 es un gráfico que representa los resultados de la búsqueda del gen p53 por ensayo automático de secuenciación de bases, para el que se realizó PCR, con un molde de ADN genómico de tejido de cáncer de pulmón, que se había depositado sobre la tarjeta de ADN de la presente invención según el procedimiento y se había almacenado a temperatura ambiente durante tres meses, y cuyo producto se clonó.

La Fig. 12 es una fotografía de la electroforesis en gel de agarosa que representa los resultados del aislamiento de quitosano y el ADN de un complejo de quitosano y ADN usando SDS (Carril 1: marcador de tamaño (100 pb), Carril 2: solamente ADN, Carril 3: disolución de quitosano al 0,1% (p/v)/disolución acuosa de ADN (1 \mug/\mul), Carril 4: complejo de disolución de quitosano al 0,1% (p/v)/disolución acuosa de ADN (1 \mug/\mul), que se había tratado con SDS al 0,1% (p/v), Carril 5: complejo de disolución de quitosano al 0,1% (p/v)/disolución acuosa de ADN (1 \mug/\mul), que se había tratado con SDS al 1% (p/v), y Carril 6: complejo de disolución de quitosano al 0,1% (p/v)/disolución acuosa de ADN (1 \mug/\mul), que se había tratado con SDS al 5% (p/v).

La Fig. 13 es una fotografía de la realización de la transferencia Southern para el gen K-ras con un molde de un complejo ADN/quitosano, que se obtuvo mezclando una disolución acuosa de ADN genómico (1 \mug/\mul) del tejido de cáncer pancreático y disolución de quitosano al 0,1% (p/v) en una relación de volúmenes de 1:1 según el procedimiento de la presente invención, y almacenándolo a temperatura ambiente durante tres meses (Carril 1: ADN del tejido de cáncer pancreático que se había almacenado a temperatura ambiente durante un mes, Carril 2: un complejo de ADN de tejido de cáncer pancreático/disolución de quitosano que se había almacenado a temperatura ambiente durante un mes, Carril 3: ADN obtenido de leucocito de sangre periférica de ser humano normal, que se había almacenado a -70ºC durante un mes, y Carril 4: ADN obtenido de leucocito de sangre periférica de ser humano normal, que se había almacenado a temperatura ambiente durante un mes).

La Fig. 14 es un diagrama de flujo que muestra un procedimiento para preparar una tarjeta de ID de ADN de plástico que se fabricó usando la tarjeta de ADN de la presente invención.

La Fig. 15 es un esquema que muestra un procedimiento para identificar el genotipo personal usando 15 combinaciones de pruebas STR (repeticiones cortas en tándem), y preparar un perfil del genotipo personal, y codificar los datos del genotipo personal. Es un esquema de un ejemplo de la tarjeta de ID de ADN de plástico de la presente invención.

La Fig. 16 es un esquema que muestra que la tarjeta de ADN de Tipo 1 o de Tipo 2 se incorpora en la parte interior de la tarjeta de PVC en el procedimiento de preparación de la tarjeta de ID de ADN de la presente invención.

La Fig. 17 es un esquema de un ejemplo de la tarjeta de ID de ADN de plástico de la presente invención.

La Fig. 18 es un esquema de un ejemplo de codificación de la información en la tarjeta de ID de ADN de la presente invención.

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La Fig. 19 muestra los resultados de la comparación de amplificaciones por PCR del gen eNOS, que es uno de los genes de enfermedades geriátricas, en una tarjeta de ID de ADN de plástico (para sangre) que se preparó a temperatura elevada y presión elevada, cuando la sangre y el ADNg se almacenaron en la tarjeta de ID de ADN de plástico (Carriles 1 y 7: marcadores de tamaño (100 pb), Carril 2: tarjeta de ID de ADN sobre la que se había depositado sangre (para sangre), Carril 3: tarjeta de ID de ADN sobre la que se había depositado ADNg (para sangre), Carril 4: tarjeta de ID de ADN (para sangre) sobre la que se había depositado sangre, y un revestimiento de plástico, Carril 5: tarjeta de ID de ADN (para sangre) sobre la que se había depositado ADNg, y un revestimiento de plástico, y Carril 6: control negativo).

La Fig. 20 muestra los resultados de las amplificaciones por PCR del gen eNOS, que es uno de los genes de enfermedades geriátricas, usando tarjetas de ID de ADN de plástico, que se trataron con temperatura elevada sin presión de manera artificial en el laboratorio, y las que se prepararon de manera práctica a temperatura elevada y a presión elevada, cambiando el tiempo para colocar la muestra (Carril 1: tarjeta de ID de ADN para ADN en la que el ADN se había cargado a temperatura ambiente, Carril 2: tarjeta de ID de ADN para ADN en la que el ADN se había cargado tras la combustión a 180ºC durante 30 minutos, Carril 3: tarjeta de ID de ADN para ADN en la que el ADN se había cargado tras la combustión a 180ºC durante 1 hora, Carril 4: tarjeta de ID de ADN que se había tratado a 180ºC durante 1 hora tras cargar el ADN a temperatura ambiente, Carril 5: tarjeta de ID de ADN que se había tratado a 180ºC durante 30 minutos tras cargar el ADN, Carril 6: tarjeta de ID de ADN que se había tratado a 180ºC durante 1 hora tras cargar el ADN, Carril 7: tarjeta de ID de ADN para sangre, que se había producido a presión elevada (125 bares) y temperatura elevada (180ºC), y cargada a continuación con sangre, Carril 8: tarjeta de ID de ADN para sangre, que se había producido a presión elevada (125 bares) y temperatura elevada (180ºC), y cargada a continuación con ADN, Carril 9: tarjeta de ID de ADN para sangre, que se había cargado con sangre y a continuación preparado a presión elevada (125 bares) y temperatura elevada (180ºC), Carril 10: tarjeta de ID de ADN para sangre, que se había cargado con ADN, y a continuación preparado a presión elevada (125 bares) y temperatura elevada (180ºC)).

La Fig. 21 muestra los resultados de la amplificación por PCR del gen eNOS, que es uno de los genes de enfermedades geriátricas, usando una tarjeta de ID de ADN de plástico que se había preparado a temperatura elevada y presión elevada, específicamente, un fragmento de tarjeta para ADN y para sangre, cuyo ADNg 150 n\mug/\mul y sangre se habían depositado, respectivamente, cambiando la cantidad depositada, y a continuación almacenado (Carril 1: control negativo, Carril 2: control positivo (ADNg de sangre), Carril 3: tarjeta de ID de ADN (para ADN) en la que el ADNg (5 1) se había cargado a temperatura ambiente, Carril 4: tarjeta de ID de ADN (para ADN) en la que se había cargado el ADNg (10 1), Carril 5: tarjeta de ID de ADN (para ADN) en la que se había cargado el ADNg (50 1), Carril 6: tarjeta de ID de ADN (para ADN) en la que se había cargado sangre (10 1), Carril 7: tarjeta de ID de ADN (para ADN) en la que se
había cargado sangre (50 1), Carril 8: tarjeta de ID de ADN (para ADN) en la que se había cargado sangre (100 1).

La Fig. 22 muestra los resultados de la amplificación por PCR del gen de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS), que es uno de los genes de enfermedades geriátricas, usando una muestra conservada en tarjetas de ID de ADN que se prepararon a temperatura elevada y presión elevada, en las que algunos de los fragmentos de las tarjetas se trataron con un tampón de lavado como un proceso de pretratamiento en la amplificación por PCR, y otros no se trataron (Carriles 1 y 10: marcadores de tamaño de 100 pb, Carril 2: control negativo, Carril 3: fragmento de tarjeta que se había producido tratando una tarjeta de recogida en la que se había almacenado ADN, con un tampón de lavado a temperatura ambiente durante cuatro días, Carril 4: fragmento de tarjeta que se había producido tratando una tarjeta de recogida en la que se había almacenado ADN, y que contenía BPB (azul de bromofenol) con un tampón de lavado a temperatura ambiente durante cuatro días, Carril 5: fragmento de tarjeta que se había producido tratando una tarjeta de ID de ADN de plástico en la que se había almacenado ADN, con un tampón de lavado tras dejarla a temperatura ambiente durante cuatro días, Carril 6: fragmento de tarjeta que se había producido depositando complejo de quitosano al 0,1%/ADN sobre papel de 3 mm, esterilizándolo con autoclave, dejándolo a temperatura ambiente durante cuatro días, y tratándolo con un tampón de lavado, Carril 7: fragmento de tarjeta que se había producido depositando complejo de quitosano al 0,1%/ADN sobre una tarjeta de recogida, dejándola a temperatura ambiente durante cuatro días, y tratándola con un tampón de lavado, Carril 8: fragmento de tarjeta que se había producido depositando complejo de quitosano al 0,1%/ADN sobre una tarjeta de recogida con BPB, dejándola a temperatura ambiente durante cuatro días, y tratándola con un tampón de lavado, Carril 9: fragmento de tarjeta que se había producido depositando complejo de quitosano al 0,1%/ADN sobre una tarjeta de ID de ADN de plástico, dejándola a temperatura ambiente durante cuatro días, y tratándola con un tampón de lavado, Carril 11: fragmento de tarjeta que se había producido almacenando una tarjeta de recogida en la que se había almacenado ADN como sangre a temperatura ambiente durante cuatro días, sin tratarla con un tampón de lavado, Carril 12: fragmento de tarjeta que se había producido almacenando una tarjeta de recogida con BPB en la que se había almacenado ADN como sangre a temperatura ambiente durante cuatro días, sin tratarla con un tampón de lavado, Carril 13: fragmento de tarjeta que se había producido almacenando una tarjeta de ID de ADN de plástico en la que se había almacenado ADN como sangre a temperatura ambiente durante cuatro días y sin tratarla con un tampón de lavado, Carril 14: fragmento de tarjeta que se había producido depositando complejo de quitosano al 0,1%/ADN sobre papel de 3 mm, esterilizándolo con autoclave, dejándolo a temperatura ambiente durante cuatro días, y sin tratarlo con un tampón de lavado, Carril 15: fragmento de tarjeta que se había producido depositando complejo de quitosano al 0,1%/ADN sobre una tarjeta de recogida, esterilizándola con autoclave, dejándola a temperatura ambiente durante cuatro días, y sin tratarla con un tampón de lavado, Carril 16: fragmento de tarjeta que se había producido depositando complejo de quitosano al 0,1%/ADN sobre una tarjeta de recogida con BPB, dejándola a temperatura ambiente durante cuatro días, y sin tratarla con un tampón de lavado, Carril 17: fragmento de tarjeta que se había producido depositando complejo de quitosano al 0,1%/ADN sobre una tarjeta de ID de ADN de plástico, dejándola a temperatura ambiente durante cuatro días, y sin tratarla con un tampón de lavado.

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Mejor modo

La presente invención se ilustrará además con los siguientes ejemplos. No obstante, el alcance de la presente invención no se limita a los mismos.

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Ejemplo 1 Ensayo de cambio de movilidad de un complejo de ADN y quitosano a través de la electroforesis en gel de agarosa

Para establecer las propiedades, la concentración y la condición de mezcla adecuadas del quitosano para formar un complejo estable cuando se mezcla con ADN, se mezcló quitosano hidrosoluble de diferentes concentraciones con el ADN total aislado a partir de monocito de sangre de adulto normal en diferentes relaciones, y a continuación se llevó a cabo el ensayo de cambio de movilidad del ADN unido al quitosano a través de electroforesis en gel de agarosa. Además, se llevó a cabo el ensayo de cambio de movilidad del ADN unido al quitosano de la misma manera que para el ADN genómico de tejido hepático de ratón y ADN de plásmido (pCMV-beta-galactosidasa) con un tamaño de 4,0 kb. El procedimiento para el experimento y los resultados son los siguientes.

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A. Aislamiento y preparación del ADN

Se aisló el ADN total de la célula de leucocito de adulto normal, el experimento se realizó usando agua tridestilada según un procedimiento conocido (Sambrook J & Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press. 2001: 7.1-7.88).

Se recogió sangre periférica venosa en un tubo que contenía citrato de sodio (tubo vaccutainer CTAD, Nº de catálogo #367946, Becton & Dickinson, EEUU), y se separó el plasma y la capa leucocitaria de monocitos por centrifugación. El ADN de monocitos, de los que la mayoría son linfocitos, se aisló usando un minikit para ADN de sangre QIAamp (Qiagen, Alemania) en el siguiente procedimiento.

Se colocaron 20 \mul de proteína cinasa K (proteasa de QIAGEN) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, de manera consecutiva se añadieron al mismo 200 \mul de la capa leucocitaria y 200 \mul de tampón AL y se mezcló por medio de vórtice durante 15 segundos. Se dejó en reposo a 56ºC durante 10 minutos y se centrifugó para recoger la disolución pegada al tapón del tubo. Se añadieron al tubo 200 \mul de etanol, se mezcló por medio de vórtice durante 15 segundos y se añadió toda la disolución a una columna de centrifugación de QIAamp que se centrifugó a 8.000 rpm durante un minuto. A continuación, se insertó un tubo de recogida de 2 ml en la columna, a éste se le añadieron 500 \mul de un tampón AW1 y se centrifugó nuevamente a 8.000 rpm durante un minuto. El filtrado obtenido de esta manera se desechó, se proporcionó un nuevo tubo y se centrifugó además a velocidad máxima durante un minuto. Una vez más, se insertó un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se añadieron al mismo 200 \mul de agua destilada o de un tampón AE, se dejó en reposo a temperatura ambiente durante un minuto y a continuación se centrifugó a 8.000 rpm durante un minuto para eluir el ADN. Se midió la concentración del ADN aislado de esta manera usando un espectrofotómetro, y se compararon las relaciones A260/A280 para hallar la pureza de ADN aislado. En esta etapa, la pureza del ADN debe ser tal que A260/280 sea de 1,6 a 1,8 tras la medición con espectrofotómetro. A partir del procedimiento anterior, puede obtenerse una media de 6 \mug de ADN puro partiendo de 200 \mul de sangre humana.

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B. Preparación del quitosano

Si un quitosano hidrosoluble es un producto cuyo grado de desacetilación es del 60% o superior y el peso molecular es de 10 kDa a 500 kDa, puede utilizarse para las aplicaciones de la presente invención, específicamente para formar un complejo estable con ADN. Muchos productos de quitosano hidrosoluble que corresponden a éstos están disponibles comercialmente. Entre ellos, en la presente invención, se adquirió un producto de quitosano hidrosoluble cuya tasa de desacetilación media es del 90,1% y cuyo peso medio molecular promedio es de aproximadamente 300 kDa, de Jakwang Co. Ltd. (Ansungsi, República de Corea), y se disolvió en agua tridestilada esterilizada. Además de este quitosano, pueden usarse otros quitosanos hidrosoluble que tengan propiedades similares.

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C. Procedimiento para la preparación de un complejo de quitosano y ADN

Se disolvió el quitosano hidrosoluble en agua tridestilada esterilizada, y se preparó en diferentes concentraciones desde 0,02% hasta 0,05%, 0,1%, 0,25%, 0,5% y 1% en peso frente a la relación de volumen (p/v) para la prueba. Aquí, el ADN se diluyó con agua tridestilada esterilizada hasta las concentraciones de 500 n\mug/\mul y 1 \mug/\mul, y a continuación se utilizó.

En un tubo de centrífuga de 1,5 ml se mezcló la disolución de ADN y las disoluciones de quitosano en diferentes concentraciones como se describió anteriormente en diferentes relaciones de volumen, y se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 15 minutos para inducir la formación de un complejo.

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D. Ensayo de cambio de movilidad de un complejo de ADN y quitosano mediante la electroforesis en gel de agarosa

El complejo de ADN/quitosano obtenido por la mezcla de una concentración 1 \mug/\mul de ADN genómico aislado de monocito de adulto normal y ADN de plásmido, y las disoluciones de quitosano hidrosoluble en diferentes concentraciones en diferentes relaciones se cargaron en gel de agarosa al 0,8% según el procedimiento anterior, y se sometieron a electroforesis a 100 V. Los resultados se mostraron en las Figuras 2 y 3, respectivamente. Los resultados mostraron que cuando se sometió el ADN solo, que no estaba mezclado con quitosano, a electroforesis, el ADN se desplazó normalmente y las bandas de ADNr se observaron a 18s y 28s, mientras que cuando se mezcló una disolución acuosa de ADN (1 \mug/\mul) con una disolución de quitosano al 0,02%, 0,1% ó 0,25%, respectivamente en cada relación de volúmenes de 1:0,2, 1:1 ó 1:2,5 o más (en este momento, la relación en peso del quitosano y del ADN en la mezcla es de 1:1 o más), el ADN se unió completamente al quitosano de manera que nunca se desplazó sobre el gel de agarosa. Por consiguiente, se tomó como patrón en el siguiente experimento que la composición de un complejo de quitosano y ADN era tal que la disolución de quitosano al 0,1% se mezclaba con la disolución de ADN de una concentración de 1 \mug/\mul en una relación de volúmenes de 1:1 (en esta etapa, la relación de peso de quitosano y ADN en la mezcla es de 1:1). No obstante, esto sólo es un ejemplo de composición, y la composición adecuada puede ser algo distinta según las propiedades del producto de quitosano utilizado.

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Ejemplo 2 Ensayo de protección de la desoxirribonucleasa del quitosano

Para determinar si el quitosano hidrosoluble puede proteger el ADN de la desoxirribonucleasa (DNAsa), y establecer las condiciones adecuadas, se trató el ADN que se había tratado con una disolución de quitosano, y el ADN que no se había tratado, con desoxirribonucleasa, respectivamente, y se observó el efecto a través de la electroforesis en gel de agarosa.

El procedimiento y los resultados fueron los siguientes. Se realizó el mismo experimento de manera repetida con ADN genómico de linfocito humano y con ADN genómico de tejido hepático de ratón.

Se separaron ocho tubos en dos grupos. En un grupo, se mezcló el quitosano (20 g) disuelto en agua destilada y ADN (10 g) se en un tubo de microcentrífuga (1,5 ml) para producir un complejo. En el otro grupo, se añadió sólo ADN (10 g) al tubo, sin quitosano. A cada uno de los tubos del primer y segundo grupo, se le añadieron 5 \mul de desoxirribonucleasa (DNAsa I), que se disolvió hasta una concentración de 1 unidad/l, y a continuación se añadió agua destilada hasta un volumen final de 100 \mul. A continuación, se mantuvieron para la reacción en un incubador a 37ºC durante 0 minutos, 20 minutos, 40 minutos y 60 minutos, respectivamente. Inmediatamente tras finalizar la reacción, se añadieron 25 \mul de la disolución de parada y se mezclaron bien para inactivar la DNAsa I. A cada uno de los cuatro tubos en los que se había inactivado la reacción, se añadieron 110 \mul de tampón de TE (Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM) y se mezclaron, a continuación se mantuvieron para la reacción a 60ºC durante la noche. A continuación, se añadieron 150 \mul de fenol/cloroformo y se mezclaron por medio de vórtice durante un minuto, y se centrifugaron a temperatura ambiente durante 5 a 8 minutos. A continuación, se recogió el sobrenadante, se colocó en un tubo de microcentrífuga y se extrajo. Se añadieron 300 \mul de EtOH anhidro y 15 \mul de NH4OAc 3M a los mismos, y se dejaron en reposo previamente a -70ºC en un congelador durante 20 a 30 minutos. A continuación, se centrifugó el resultante a 4ºC a 12.000 rpm durante 20 minutos, y el líquido se desechó por aspiración. Las pellas sedimentadas se lavaron nuevamente con etanol al 70%, se secaron y se disolvieron en 20 \mul de agua destilada, que no tenía DNAsa. Se recogieron 10 (aproximadamente 1 \mug de ADN) del resultante de los ocho tubos obtenidos de esta manera, respectivamente, y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Los resultados se mostraron en la Fig. 4.

A partir de la Fig. 4, se encontró que el ADN que no se había tratado con quitosano, estaba prácticamente escindido 40 minutos después del tratamiento con DNAsa I, mientras que el ADN que se había tratado con quitosano, no estaba escindido 40 minutos después del tratamiento con DNAsa, y la mayor parte permanecía en los pocillos. Estos resultados muestran que si se mezclan el quitosano y el ADN incluso en una relación de pesos de 1:0,5 según el procedimiento de la presente invención, también se suprime con eficacia la escisión del ADN por una desoxirribonucleasa, y el procedimiento según la presente invención es eficaz para el almacenamiento del ADN.

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Ejemplo 3 Investigación de la posibilidad de amplificación de genes para un complejo de ADN y quitosano

Usando el complejo líquido de quitosano hidrosoluble y ADN preparado según los Ejemplos 1 y 2, se realizó la PCR para determinar si el gen diana se amplificaba adecuadamente, y para determinar de ese modo si el procedimiento para almacenar el ADN de la presente invención no tiene efectos perjudiciales en el ensayo genético, y para establecer las condiciones adecuadas para usar el ADN almacenado por el procedimiento de almacenamiento de ADN según la presente invención en reacciones de PCR. Se realizó la PCR con la diana de cada gen de beta-Actina para el ADN genómico de leucocito humano. El procedimiento y los resultados fueron los siguientes.

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La reacción de PCR se realizó usando 100 ng del ADN sujeto como molde añadiendo 10 pmol del cebador directo y cebador inverso del gen diana, respectivamente, y añadiendo a continuación desoxinucleótido 2,5 mM (dNTPs), 1 unidad de polimerasa Taq y 10 x tampón de polimerasa (KCl 500 mM, Tris-Cl 100 mM, MgCl_{2} 15 mM, gelatina al 0,1%). La PCR se realizó usando un termociclador GeneAmp 2700 (Perkin-Elmer Biosystems, Inc., EEUU), en primer lugar bajo la condición de: primero a 95ºC durante 5 minutos, a continuación cuarenta veces bajo la condición de 95ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos y, finalmente a 72ºC durante 7 minutos, para dar los productos de PCR.

Con cada molde de las muestras de ADN genómico de ser humano y de ratón preparados mezclando quitosano al 0,1% y ADN (1 \mug/\mul) en una relación de volúmenes de 1:1, y el ADN que no se había mezclado con quitosano, se llevó a cabo la PCR para el gen de beta-Actina. Los resultados de la electroforesis en gel de agarosa al 1,5% se mostraron en la Fig. 5. Los que se habían mezclado con quitosano mostraron una fuerte banda de ADN del gen de beta-Actina de un tamaño de 661 pb en el mismo nivel. Esto muestra que el medio mezclado con quitosano de la presente invención no tiene efectos perjudiciales en la PCR, y puede utilizarse de manera provechosa para buscar la expresión del gen.

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Ejemplo 4 Experimento de amplificación por PCR de un complejo de ADN y quitosano, que se almacenó a temperatura ambiente durante un período de tiempo prolongado

A partir de los resultados anteriores, se encontró que el quitosano hidrosoluble está unido prácticamente en su totalidad al ADN, y conserva el ADN de manera estable del ataque de la desoxirribonucleasa. En el presente ejemplo, se determinó que cuando el complejo de quitosano hidrosoluble y ADN se almacenaba en forma líquida a temperatura ambiente durante un período de tiempo prolongado, el ADN almacenado se mantenía sin escindir haciendo posible la realización de la amplificación y el ensayo genético. Esto se llevó a cabo por medio de ensayos por PCR de la siguiente manera.

Se mezcló 1 \mul de la disolución de quitosano hidrosoluble al 0,1% (p/v) y 1 \mul del ADN genómico de monocito de sangre de adulto normal (500 n\mug/\mul) para formar un complejo, y se añadieron 8 \mul de agua destilada para ajustar el volumen final a 10 \mul. De esta manera, se prepararon 24 muestras en los tubos de centrífuga y se almacenaron a temperatura ambiente. Se ajustó 1 \mul del mismo ADN de leucocito, que no se había tratado con quitosano, a un volumen final de 10 \mul, para preparar 9 muestras. Tres de estas muestras se almacenaron a -70ºC y las seis muestras restantes se almacenaron a temperatura ambiente. Para los ADN que se mezclaron con el quitosano hidrosoluble y se almacenaron en el tubo a temperatura ambiente, se realizó la reacción de PCR según el procedimiento del Ejemplo 3 para tres muestras de ADN, respectivamente en los puntos temporales de una semana, dos semanas, tres semanas, cuatro semanas, tres meses, seis meses, nueve meses y un año, respectivamente para determinar si el gen diana se amplificaba apropiadamente. Para las tres muestras que se habían almacenado a -70ºC entre las muestras de ADN que no se habían mezclado con quitosano, se llevó a cabo la PCR tras tres meses, y para cada una de las tres muestras de ADN que se habían almacenado a temperatura ambiente, se llevó a cabo la PCR tras tres meses y un año, respectivamente. La Fig. 6 es una fotografía que representa los resultados de la electroforesis en gel de agarosa al 0,8% para el gen de beta-Actina tras realizar la PCR.

A partir de la Fig. 6, se encontró que cuando el ADN se almacenaba en un tubo de microcentrífuga a temperatura ambiente durante tres meses y durante un año, no unido al quitosano (desnudo), el gen de beta-Actina, que es un gen constitutivo, no se expresaba nunca. Por el contrario, cuando la muestra del ADN se almacenó unida al quitosano en un tubo como un líquido a temperatura ambiente durante una semana a un año, se detectó claramente el gen de beta-Actina. Se encontró que para la muestra de ADN que se había almacenado a -70ºC sin unión al quitosano según el procedimiento convencional, la cantidad de beta-Actina amplificada era similar a la de la muestra de ADN que se almacenó unido al quitosano a temperatura ambiente según el procedimiento de la presente invención.

Tales resultados mostraron que el procedimiento de almacenamiento de ADN en el líquido unido al quitosano hidrosoluble según el procedimiento de la presente invención, puede mantener el ADN estable durante al menos un año, que el ADN almacenado no tiene problemas para ser utilizado en el ensayo de PCR, y que el procedimiento puede almacenar el ADN de manera estable de modo similar al procedimiento convencional de almacenamiento del congelador de baja temperatura. La temperatura de almacenamiento en el presente ejemplo varía desde la temperatura ambiente hasta -70ºC. Resulta de preferencia el almacenamiento en un lugar oscuro y en ausencia de humedad.

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Ejemplo 5 Preparación de la tarjeta de ADN (Tipo 1) en la que el quitosano está adsorbido sobre papel, e investigación de la posibilidad de amplificación del gen por medio de la misma

Para almacenar y transportar ADN de múltiples muestras a temperatura ambiente en un espacio mínimo, y para ayudar con el ensayo automático, se ha desarrollado una tarjeta en la que el quitosano se absorbe sobre un papel adecuado, que se denominó tarjeta de ADN. La tarjeta de ADN se presenta en diferentes tipos, y entre ellos, una tarjeta de papel cuyo uso es almacenar el ADN mismo, se denominó tarjeta de ADN de Tipo 1.

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Para seleccionar la concentración más eficaz de la disolución de quitosano hidrosoluble y el espesor adecuado del papel, se realizó el siguiente experimento.

Se sumergieron diversos tipos de papeles para transferencia en concentraciones de disolución de quitosano hidrosoluble del 0,02%, 0,1% ó 0,25% (p/v) durante un período del tiempo suficiente, y se secaron para utilizar en la producción de tarjetas de ADN. En esta etapa, el papel se seleccionó de papeles para transferencia que están disponibles en el comercio de diferentes compañías tales como Whatman plc. (RU) o Schleicher & Schuell GmbH (Alemania), y tenía un espesor adecuado. En la presente invención, los papeles para transferencia de 0,3 mm, 0,9 mm y 1,2 mm de espesor se adquirieron de Whatman plc. y se utilizaron. El tipo y tamaño de la tarjeta de ADN para almacenar el ADN con quitosano puede prepararse de varias maneras dependiendo del uso. El papel de transferencia sobre el que se adsorbió el quitosano, se cortó del mismo tamaño de la placa de 24 pocillos, 96 pocillos y de 384 pocillos (placa multipocillos) (8,1 cm 12,3 cm), que son por lo general muy utilizadas, y se imprimieron y marcaron el pocillo y la partición sobre el papel como la placa. En cada uno de los pocillos, se depositó una muestra de ADN con una pipeta, y se almacenó durante una semana a un año o más a temperatura ambiente. De esta manera, una tarjeta de ADN puede almacenar de 24 a 96, hasta 384 trozos de muestras de ADN.

Un procedimiento para producir la tarjeta de ADN por inmersión en quitosano hidrosoluble es el siguiente.

Se esterilizó un papel para transferencia de 0,3 mm de espesor de Whatman plc. y se secó en un autoclave a alta temperatura. A continuación, se mezcló una disolución de quitosano hidrosoluble en una concentración del 0,1% (p/v) y disolución de ácido úrico 2 mM, que se habían producido previamente, en una relación de volúmenes de 1:1, se sumer-
gió el papel durante un período de tiempo suficiente y a continuación se secó para producir la tarjeta de ADN

\hbox{de Tipo 1.}

En la tarjeta de ADN de Tipo 1 preparada como se indicó anteriormente, se depositó ADN genómico humano, y se conservó durante un período determinado. De la tarjeta de ADN almacenado, en la que se había transferido y almacenado ADN de genoma humano durante un largo tiempo, se tomó un fragmento de tarjeta de aproximadamente 1 mm a 2 mm de diámetro usando un punzón, un fórceps o una pinza, y se añadió a un tubo para realizar la PCR. Con un molde de este fragmento de tarjeta, se realizó la PCR para el gen de beta-Actina según el procedimiento del Ejemplo 3. El procedimiento de esta reacción de PCR fue el siguiente.

1. De una tarjeta de papel sumergida en quitosano en la que se había almacenado ADN, se tomó un fragmento de aproximadamente 1,2 mm de diámetro usando un punzón, etc. y se añadió a un tubo para PCR.

2. Se añadieron 200 \mul de un tampón TE (Tris-Cl 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH = 8,0), se mezcló, y a continuación se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos. A continuación, se retiró completamente el tampón TE usando una pipeta.

3. El segundo procedimiento se repitió dos veces.

4. Se secó a temperatura ambiente durante 1 hora o a 56ºC durante 10 minutos.

5. Al fragmento de tarjeta que se había tratado por medio de los procedimientos anteriores, se le añadió una muestra de PCR de una composición adecuada y el gen de beta Actina se amplificó por PCR según el procedimiento del Ejemplo 3.

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La Fig. 7 muestra los resultados de una fotografía del experimento de electroforesis en gel de agarosa, que representa los resultados de la comparación y el análisis por medio de PCR. Se encontró que para todas las tarjetas de ADN que se habían producido por inmersión en una disolución de quitosano al 0,1%, el gen diana se expresaba fuertemente, y que cuanto mayor espesor tuviera el papel, tal como 0,9 mm o 1,2 mm, más productos de PCR se producían. Además, cuando se conservó adsorbido en la tarjeta de ADN de la presente invención, el gen de beta-Actina se amplificaba fuertemente en PCR incluso tras un largo período, tal como tres meses a un año, a temperatura ambiente, de manera similar al almacenamiento a -70ºC.

Tales resultados muestran que cuando se conservan en la tarjeta de ADN según la invención, múltiples muestras de ADN diversas pueden conservarse de manera estable incluso a temperatura ambiente durante mucho tiempo, y pueden realizarse ensayos tras un período de tiempo prolongado. Por consiguiente, se encontró que la tarjeta de ADN de la invención es útil para almacenar y para transportar múltiples muestras de ADN diversos manera simple a temperatura ambiente durante un período de tiempo prolongado, y además es también útil para diversos ensayos genéticos tales como PCR o secuenciación de bases como se mostró en el presente ejemplo y en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 6 Preparación de una tarjeta de ADN (Tipo 2) en la que el quitosano y el tampón de lisis celular están adsorbidos sobre el papel e investigación de la posibilidad de amplificación del gen por medio de la misma

Esta tarjeta de ADN de Tipo 2 se produjo adsorbiendo el quitosano y un tampón de lisis celular sobre diferentes tipos de papeles para transferencia y secándolos. Esta tarjeta de ADN de Tipo 2 se diseñó para ser utilizada en el almacenamiento de muestras como líquido corporal que contiene células, tal como la sangre, y para amplificarlas a continuación por PCR para el ensayo genético. Sobre esta tarjeta de ADN de Tipo 2, se depositó sangre humana, y después de un determinado período de tiempo, se comparó y analizó el rendimiento por medio de PCR.

La tarjeta de papel para transferencia preparada como en el Ejemplo 5 se sumergió en la disolución de quitosano hidrosoluble y el tampón de lisis celular durante un período de tiempo suficiente y se secó para producir una tarjeta de ADN. En esta etapa, los papeles para transferencia de 0,3 mm, 0,9 mm y 1,2 mm en espesor se adquirieron de Whatman plc. y se utilizaron. El siguiente es un procedimiento para producir la tarjeta de ADN de Tipo 2 para almacenamiento en forma de sangre.

Se esterilizó un papel para transferencia de 0,3 mm de espesor de Whatman plc. a alta temperatura y se secó. A continuación, se mezcló la disolución de quitosano hidrosoluble en una concentración del 0,1% (p/v) y el tampón de lisis celular (EDTA 0,5 mM, Tris-Cl 8 mM, ácido úrico 2 mM, SDS al 1% (p/v)), que se habían producido previamente, en una relación de volúmenes de 1:1, y se sumergió el papel durante un período de tiempo suficiente, y a continuación se secó para producir la tarjeta de ADN de Tipo 2.

De la tarjeta de ADN anterior, se tomó un fragmento de la tarjeta de aproximadamente 1 mm a 2 mm de diámetro y se añadió a un tubo para realizar la PCR como en el Ejemplo 5. Con un molde de este fragmento de tarjeta, se llevó a cabo la PCR para el gen de beta-Actina. El procedimiento para esta reacción de PCR fue el siguiente.

1. De una tarjeta de papel sumergido en quitosano en la que se conservó ADN, se tomó un fragmento de aproximadamente 1,2 mm de diámetro usando un punzón, etc. y se añadió a un tubo para PCR.

2. Se añadieron 200 \mul de una disolución de lavado (reactivo de purificación GG; EDTA 0,5 mM, Tris-Cl 8 mM, ácido úrico 2 mM, SDS al 1% (p/v)), se mezcló y se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos. A continuación, se retiró completamente la disolución de lavado usando una pipeta.

3. El segundo procedimiento se repitió tres veces.

4. A continuación, se añadieron 200 \mul de un tampón TE (Tris-Cl 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH = 8,0), se mezcló y se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos. A continuación, se retiró completamente el tampón TE usando una pipeta.

5. El cuarto procedimiento se repitió dos o tres veces.

6. Se secó a temperatura ambiente durante 1 hora o a 56ºC durante 10 minutos.

7. Al fragmento de la tarjeta que se había tratado por medio de los procedimientos anteriores, se le añadió una muestra de PCR de una composición adecuada y se amplificó el gen de beta-Actina por PCR del mismo modo que en el Ejemplo 2.

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Como resultado del experimento, se encontró que para todas las tarjetas de ADN de Tipo 2, el gen diana se expresaba fuertemente, y que cuanto mayor espesor tuviera el papel, tal como 0,9 mm ó 1,2 mm, más productos de PCR se producían. Además, cuando se conservó adsorbido en la tarjeta de ADN de la presente invención, el gen de beta-Actina se amplificaba fuertemente en la PCR incluso tras un período de tiempo prolongado tal como tres meses a un año a temperatura ambiente. Tales resultados muestran que la muestra de ADN puede conservarse de manera estable a temperatura ambiente durante un período de tiempo prolongado como sangre sin necesidad de aislar y purificar el ADN cuando se conserva en la tarjeta de ADN según la invención, y que pueden realizarse ensayos con la misma después de un tiempo prolongado. Por consiguiente, se encontró que la tarjeta de ADN de la invención es útil para almacenar y transportar de manera fácil muestras de ADN en forma de sangre a temperatura ambiente durante mucho tiempo, y además es también útil para diversos ensayos genéticos tales como PCR o similares.

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Ejemplo 7 Clonación del gen diana para un complejo de ADN y quitosano almacenado durante un período de tiempo prolongado e investigación de la posibilidad de realizar secuenciación de bases

Se llevó a cabo la PCR para un complejo de quitosano/ADN que se había almacenado como líquido a temperatura ambiente durante un período de tiempo prolongado según el Ejemplo 4, y se clonó el producto obtenido. A continuación, se determinó por secuenciación de bases automática si el ADN almacenado según el procedimiento de la invención podía mantenerse de manera estable y utilizarse tras el almacenamiento.

Con un molde de una muestra de ADN genómico de un tejido cólico de adulto, que se había almacenado como mezcla con quitosano hidrosoluble al 0,1% según el procedimiento de la invención a temperatura ambiente durante tres meses, se llevó a cabo la PCR para el gen de poliposis cólica adenomatosa (APC). El producto se clonó en un vector plasmídico y a continuación se buscó nuevamente por secuenciación de bases. El procedimiento fue el siguiente.

Es importante ajustar el producto de PCR del gen a una concentración adecuada para utilizarlo como molde en la reacción de secuenciación. En la invención, se usaron 10 ng del gen de APC. A un tubo de PCR, se le añadió el producto de PCR de cada exón del gen de APC, 3,2 pmol de cualquiera de los cebadores, directo o inverso, y 8 \mul y de la mezcla de reacción (mezcla de reacción lista del terminator; Perkin-Elmer, EEUU) y se añadió agua destilada esterilizada hasta un volumen final de 20 \mul y se mezcló bien. Se llevó a cabo la reacción de secuenciación por ciclos para la mezcla usando un termociclador GeneAmp 2700, 25 veces a 96ºC durante 10 segundos, 50ºC durante 5 segundos y 60ºC durante 6 minutos. Se realizó la precipitación del producto de reacción obtenido con etanol y se centrifugó para eliminar el didesoxinucleótido marcado con fluorescencia (ddNTPs) en el cebador libre y la mezcla de reacción (mezcla de reacción lista del terminador) y se secó. El ADN obtenido de esta manera se mezcló con una mezcla de formamida: EDTA 25 mM (pH 8,0): dextrano azul y 10 \mul de un tampón de carga, y se desnaturalizó en agua a ebullición durante 5 minutos. A continuación, se colocó la muestra en hielo y se añadió la muestra de ADN desnaturalizado a cada pocillo de las placas, que se habían tratado previamente con gel "long ranger" al 5,5% (BMA, Nº de catálogo, EEUU). La electroforesis se realizó durante 2 a 4 horas y la secuenciación de bases se llevó a cabo usando un programa informático de un secuenciador automático ABI Prism 377 (Perkin-Elmer Biosystems,
EEUU).

Los resultados de la secuenciación automática de bases para el gen de APC se muestran en la Fig. 10.

Como resultado de la secuenciación, se encontró que el gen normal de APC se había amplificado exactamente y, por consiguiente, el complejo líquido de ADN y quitosano, según el procedimiento de la invención, conserva el ADN de manera estable incluso tras el almacenamiento a temperatura ambiente durante un tiempo prolongado para llevar a cabo la clonación y la secuenciación de bases, que significa que es también útil para las pruebas de mutación del gen y para la investigación del cáncer.

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Ejemplo 8 Investigación de la posibilidad de realizar clonación de genes y secuenciación de bases para el ADN almacenado en la tarjeta de ADN durante un período de tiempo prolongado

Se determinó si para la muestra de ADN conservada adsorbida en la tarjeta de ADN a temperatura ambiente durante un período de tiempo prolongado, podía llevarse a cabo de manera adecuada la clonación para el producto obtenido por PCR y la secuenciación automática de bases.

Con un molde de una muestra de ADN genómico de un tejido de cáncer de pulmón humano, que se había almacenado depositada sobre la tarjeta de ADN preparada según el Ejemplo 5 durante tres meses, se llevó a cabo la PCR para el gen supresor de tumores p53. El producto se clonó en un vector plasmídico y a continuación se buscó nuevamente por secuenciación automática de bases. El procedimiento fue el mismo que el del Ejemplo 7. Los resultados se muestran en la Fig. 11.

Como resultado, se encontró que el gen mutagénico p53 se había amplificado exactamente (Fig. 11), y que cuando el ADN se conservó usando la tarjeta de ADN preparada según el procedimiento de la invención, el ADN se conservó permitiendo la clonación y la secuenciación automática de bases a partir del mismo incluso tras un período de tiempo prolongado, por consiguiente resulta también útil para las pruebas de mutación del gen y para la investigación del cáncer.

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Ejemplo 9 Transferencia southern con un molde de un complejo de ADN/quitosano

Al analizar la presencia y la cantidad de un gen específico por un ensayo de hibridación tal como la transferencia Southern, y similares, usando un complejo de ADN y quitosano almacenado según el procedimiento de la invención, el ADN unido al quitosano no se desplaza en la electroforesis en gel de agarosa, por lo que resulta difícil llevar a cabo un ensayo de transferencia. Por consiguiente, para el ensayo de transferencia, la muestra de ADN debe utilizarse con el quitosano eliminado. Por consiguiente, en la invención, se ha establecido un procedimiento para eliminar el quitosano sin dañar el ADN del ADN que está unido al quitosano.

Como se describió anteriormente, el quitosano hidrosoluble es una sal catiónica y se une al ADN, de manera que el quitosano puede aislarse del ADN por medio del tratamiento con una sal catiónica fuerte como el sulfato de SDS (dodecilsulfato de sodio), SOS (octilsulfato de sodio) y CTAB (bromuro de cetiltrimetil amonio). En este caso, la sal catiónica no deber ser costosa y no debe tener efecto en el ensayo de transferencia, sin producir daños en el ADN. Por consiguiente, en la invención, se utilizó SDS (Sigma Co., EEUU), que no es costoso y no tiene efecto en una reacción de hibridación entre el ADN y la sonda.

Se almacenó un complejo de ADN/quitosano obtenido mezclando una disolución de quitosano y un ADN de tejido de cáncer pancreático, según el procedimiento de la invención, a temperatura ambiente durante tres meses. A continuación, se mezclaron 5 a 10 \mug del complejo ADN/quitosano con SDS al 5% (p/v) y se sometió a electroforesis en gel de agarosa para la transferencia Southern. Se realizó la transferencia Southern para el gen K-ras por un procedimiento conocido (Sambrook J & Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001). Los resultados se mostraron en la Fig. 12 y Fig. 13, respectivamente.

A partir de la Fig. 12, se encontró que en un caso de electroforesis con SDS al 5%, se aislaron el ADN y el quitosano y el ADN se desplazó en el gel.

Además, la Fig. 13 mostró en los resultados de la transferencia Southern que el gen K-ras se había expresado fuertemente para ambos ADN, el que se había almacenado a -70ºC sin unión al quitosano y el ADN que se conservó bajo la forma de quitosano/ADN durante 6 meses. Por consiguiente, se estableció un procedimiento para realizar la transferencia Southern usando el ADN almacenado durante un período de tiempo prolongado según el procedimiento de almacenamiento de ADN de la invención. Además, se encontró que el ADN almacenado según el procedimiento de la invención es útil para un ensayo de hibridación.

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Ejemplo 10 Investigación de la posibilidad de realizar un ensayo de PCR-RFLP del gen para el ADN almacenado en la tarjeta de ADN durante un tiempo prolongado

Se realizó la PCR para una muestra de ADN genómico humano conservada usando la tarjeta de ADN de Tipo 1 de la invención, y a continuación se probó si era posible realizar la prueba de genotipado para la misma usando un ensayo RFLP (polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción). Los resultados del genotipado usando el ensayo RFLP tras la PCR de la tarjeta de ADN de Tipo 1 se muestran en la Fig. 8. Además, se investigó si era posible realizar el genotipado usando un ensayo de PCR-RFLP para la muestra humana que se había almacenado como sangre en la tarjeta de ADN de Tipo 2 de la presente invención. Los resultados se muestran en la Fig. 9. Para demostrar que la tarjeta de ADN de la invención puede utilizarse de manera práctica en el diagnóstico de genes, se amplificó por PCR un gen asociado con el ataque de enfermedades cardiovasculares, y se trató con las siguientes enzimas de restricción específicas. Los resultados se analizaron por medio de electroforesis. Como resultado, se encontró que no tiene ningún problema en una búsqueda con genotipos múltiples.

El presente ejemplo se describirá a continuación en detalle.

Usando la tarjeta de ADN de Tipo 1 y la tarjeta de ADN de Tipo 2 y la tarjeta de ID de ADN de plástico de la invención, se prepararon los siguientes seis genes, que están asociados con enfermedades geriátricas, respectivamente en un tubo de PCR usando disoluciones de reacción como se muestra en la siguiente tabla.

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TABLA 1

1

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El tubo de PCR que contenía la disolución de reacción, que se había preparado como anteriormente, se añadió a un termociclador PE2700 (Perkin Elmer, EEUU), y se realizó la amplificación según cada gen de la siguiente manera.

1. Para el gen eNOS1/2, MTHFR1/2, AGT1/2, AT1R, ACE1:

95ºC/5 min, 35 ciclos (95ºC/30 seg, 58ºC/30 seg, 72ºC/40 seg), 72ºC /10 min.

2. Para el gen ACE2 y APOE1/2:

95ºC/5 min, 35 ciclos (95ºC/30 seg, 65ºC/30 seg, 72ºC/40 seg), 72ºC /10 min.

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El producto de PCR obtenido de esta manera para cada gen se confirmó realizando la electroforesis en el gel de agarosa al 1,2% que contenía EtBr. El tamaño del producto de cada gen se muestra en la siguiente Tabla 2.

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TABLA 2

3

Para llevar a cabo el ensayo RFLP con el producto de PCR obtenido de esta manera, primero, se purificaron los productos de PCR de otros cinco genes (eNOS, MTHFR, AGT, AT1R y APOE) excepto solamente el gen ACE usando un kit DNA Clean & Concentrator (Zymo Research Corporation, CA. EEUU) de la siguiente manera.

1. Al producto de PCR (aproximadamente 25 1), se le añadió la disolución de unión del ADN en volumen doble, es decir, 50 \mul.

2. A una columna de centrifugación Zymo, que se había proporcionado previamente, se le añadió toda la mezcla según el punto 1 anterior y se centrifugó a 13.000 rpm durante 30 segundos.

3. Se retiró con una pipeta la disolución recogida en un tubo de recogida.

4. Se añadió a la columna 200 \mul de un tampón de lavado y se centrifugó a 13.000 rpm durante 30 segundos (se repitió dos veces).

5. Se eliminó totalmente el tampón de lavado restante centrifugándolo en un tubo vacío a 13.000 rpm durante 40 segundos.

6. Se retiró el tubo de recogida y se proporcionó un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml para una columna nueva, a continuación se añadieron al mismo 20 \mul de agua tridestilada esterilizada y se centrifugó a 13.000 rpm durante 40 segundos para la elución. Como alternativa, puede utilizarse agua tridestilada esterilizada calentada a 65ºC o similar.

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Para los productos de PCR que se purificaron y se obtuvieron en el procedimiento anterior, se preparó una enzima de restricción correspondiente para cada gen de la tabla siguiente bajo la condición correspondiente a cada enzima de restricción. A continuación, se mantuvieron para la reacción en un baño de agua a 37ºC durante 4 a 6 horas, y posteriormente, se investigó el riesgo de cada gen por electroforesis en gel de agarosa al 2,5%.

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TABLA 3

5

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Ejemplo 11 Producción del kit de PCR que contiene quitosano

Como una aplicación del procedimiento de almacenamiento de ADN usando quitosano de la invención, se produjo un kit de PCR en el que se añadió polimerasa Taq, un cebador, dNTP y un tampón, y similares, a un tubo con quitosano (tubo con todo incluido), y se añadió una muestra tal como ADN o suero al tubo para dar lugar a una reacción de PCR. De manera característica, este kit de PCR puede utilizarse tanto para el almacenamiento del ADN como para el ensayo de PCR.

En el presente ejemplo, usando el ADN obtenido de la sangre de pacientes con hepatitis tipo B, se investigó la presencia del virus de hepatitis tipo B con el kit de PCR de la invención. El kit también puede aplicarse al diagnóstico de cáncer por medio del diagnóstico de un gen asociado al cáncer, o para el diagnóstico de patógenos en virus de hepatitis tipo B o infección por virus del papiloma humano, infecciones de transmisión sexual, otras infecciones bacterianas y similares.

El uso del presente kit es el siguiente.

Se añadieron de 1 a 3 \mug de molde de ADN a un tubo con todo incluido, que contenía 10 \mul de tampón de PCR de una etapa 5 GG TM y polimerasa Taq tipo "hot start" (AmpliTaq Gold, Perkin Elmer, EEUU), 2,0 \mul de mezcla de dNTP 10 mM, 1,0 \mul de cada uno de los cebadores, directo e inverso, (5 pmol) del gen diana y una concentración de quitosano al 0,1%. Se llenó el kit con agua destilada hasta un volumen total de 50 1, y se mezcló bien, y a continuación se llevó a cabo la PCR. En primer lugar, se llevó a cabo la reacción de transcripción inversa a 50ºC durante 30 minutos, se realizó la desnaturalización a 95ºC durante 15 minutos, seguida por un total de 25 a 40 ciclos de 94ºC durante un minuto, 53ºC durante 40 segundos y 72ºC durante un minuto, a continuación se completó la amplificación de PCR con la reacción de 72ºC durante 10 minutos. Como resultado, se encontró la presencia de ADN del virus de hepatitis Tipo B usando el kit de PCR de la invención (no se adjuntan datos).

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Ejemplo 12 Producción de tarjeta de ID de ADN de plástico

La Fig. 14 es un diagrama de flujo que muestra un procedimiento para preparar una tarjeta de ID de ADN de plástico usando la tarjeta de ADN de la invención. Los procedimientos se llevaron a cabo según el diagrama de flujo de la Fig. 14 para desarrollar una tarjeta de ID de ADN de material plástico.

1. Recepción de la muestra personal transportada tal como sangre o células orales, la tarjeta de ADN y similar, y datos de fotografía personal (S201).

2. Aislamiento del ADN genómico de la muestra y prueba de determinación del grupo sanguíneo (S202).

3. Ensayo de genotipo HLA usando el ADN genómico extraído, prueba genes de identificación personal por STR y análisis de los resultados (S203). La Fig. 15 es un esquema que muestra un procedimiento de identificación del genotipo personal usando 15 combinaciones de pruebas STR, preparación del perfil de genotipo personal y codificación de los datos del genotipo personal.

4. Incorporación de una tarjeta de ADN de papel para adjuntar con la tarjeta de plástico, y preparación del marco de la tarjeta de ID de ADN añadiendo calor y presión (S205). La Fig. 16 es un esquema que muestra la incorporación de la tarjeta de ADN de Tipo 1 o Tipo 2 en una tarjeta de PVC en el proceso de preparación de la tarjeta de ID de ADN de la invención. Como se muestra en la Fig. 16, se coloca una capa blanda de PVC en la parte inferior, y se coloca la tarjeta de ADN de Tipo 1 o Tipo 2 sobre la misma. A continuación, se coloca la capa núcleo de PVC sobre la misma, que tiene un agujero del tamaño de la tarjeta de ADN del papel (debe prepararse un agujero del tamaño de la tarjeta debido al espesor de la tarjeta de papel, y como el papel y el PVC están hechos de sustancias diferentes entre sí, no se incorporan juntos en la incorporación por calor. Específicamente, la tarjeta de papel se inserta en este agujero). En su parte superior, se deja una capa núcleo de PVC que tiene otros dos agujeros pequeños (son para inyectar el ADN o la sangre en la tarjeta de ADN de papel, que debe ubicarse en la tarjeta de papel, ya que prácticamente no queda ningún espacio vacío desde la incorporación de la tarjeta por calor). Finalmente, se coloca sobre la misma una capa blanda de PVC. A continuación se calienta bajo alta presión (100 hasta 140 bares) a alta temperatura, de 160 a 180ºC, durante 8 a 30 minutos para incorporarlas. En esta etapa, la ubicación de la tarjeta de ADN de papel es opuesta a la de la barra magnética, y también es opuesta a la de la transcripción de la fotografía. La Fig. 17 es un esquema de un ejemplo de tarjeta de ID de ADN de plástico de la invención.

5. Depósito del ADN personal o la sangre en la tarjeta de ID de ADN de plástico y la tarjeta de almacenamiento, producidas en S204 (S205). El depósito del ADN o la sangre en la tarjeta de ID de ADN de plástico se lleva a cabo inyectando ADN o sangre en la tarjeta de ID de ADN de papel a través del agujero de la capa núcleo de PVC penetrando en la capa blanda de PVC usando una aguja. Tras la inyección, el agujero causado por la aguja se bloquea por medio de un holograma, etiqueta o similar.

6. Codificación de los datos analizados en la barra magnética o en el chip de la tarjeta de ID de ADN de plástico (S206). La barra magnética está normalmente constituida por tres pistas. La primera pista es la pista en la que puede escribirse en inglés, que tiene 78 bits disponibles. La segunda pista tiene 38 bits disponibles, y la tercera pista tiene 107 bits disponibles. Por consiguiente, como se mostró en la Fig. 17, en la primera pista se codifica una breve información personal (por ejemplo: cáncer de próstata C61 o hipertrofia prostática benigna N40), y los resultados de STR o del tipo HLA están codificados en la tercera pista. Sin embargo, en caso de conexión con bancos o similares, el procedimiento de codificación de la tarjeta de ID de ADN de plástico es que la información genética queda registrada sólo en el servidor principal y se codifica del modo que lo solicita el banco, y los datos de información genética personal y similares se transmiten desde este servidor principal usando un sistema POS. Este procedimiento es para maximizar otras utilidades de la tarjeta de ID de ADN de plástico de la invención (S206). La Fig. 18 es un esquema de un ejemplo de información codificada en la tarjeta de ID de ADN de la invención.

7. Transcripción de la fotografía personal y breve información personal para grabarlas en la tarjeta de ID de ADN de plástico mediante el procedimiento de estampado en relieve (S207).

8. Ingreso de datos personales en un superordenador (para servidor), asignación de código de ID personal específico de la tarjeta de ID de ADN de plástico, y configuración de la contraseña personal (S208).

9. Construcción y Operación del sistema POS para permitir el acceso a la información a la persona según las condiciones de mantenimiento de la seguridad usando una ID y una contraseña, las que se graban en la tarjeta de ID de ADN de plástico, localmente o en el extranjero, de ser necesario para cada persona, hospital, organización o banco, o similares (S2019).

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La Fig. 15 es un esquema de un ejemplo de tarjeta de ID de ADN de plástico de la invención. En el frente de la tarjeta están grabados la fotografía personal y el nombre, breve información personal (al nivel que un hospital pueda manejar de manera inmediata en una emergencia) y la dirección. En el reverso de la tarjeta, hay una banda magnética en la que está codificada la información genética personal, y está diseñada para albergar la firma y el sitio de almacenamiento del ADN.

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Ejemplo 13 Experimento de amplificación genética a partir de un fragmento de la tarjeta de ADN de papel en la que se conserva incorporada en la tarjeta de ADN de plástico

Se determinó si el gen podía amplificarse a partir del ADN que se había almacenado en la tarjeta de ADN de papel Tipo 1 o Tipo 2, que se había incorporado en una tarjeta de ADN de plástico, que se ha había producido anteriormente mediante el tratamiento a alta temperatura y alta presión, por amplificación del gen eNOS, que es uno de los genes de enfermedades geriátricas, mediante PCR. El procedimiento se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 10 anterior.

Se incorporó la tarjeta de ADN de Tipo 1 y la tarjeta de ADN de Tipo 2, respectivamente en una tarjeta de ID de ADN de plástico que se había preparado a alta temperatura y alta presión, para almacenar el ADN genómico humano y la sangre, sumergidas en cada una de ellas. A continuación, utilizando estas tarjetas de ID de ADN de plástico, se amplificó el gen eNOS, que es uno de los genes de enfermedades geriátricas, por PCR para realizar la comparación. Los resultados se mostraron en la Fig. 19. A través de este experimento, se encontró que cuando se utilizaba en la invención la tarjeta de ADN de Tipo 2 para absorber la sangre, la muestra de sangre debía depositarse, y que primero debía quitarse el revestimiento plástico de la tarjeta de ID de ADN de plástico en la amplificación por PCR.

La Fig. 20 muestra los resultados de la amplificación por PCR par el gen eNOS, que es uno de los genes de enfermedades geriátricas, usando una tarjeta de ID de ADN de plástico que se trató con alta temperatura sin presión artificialmente en un laboratorio, y usando una que se preparó prácticamente a alta temperatura y alta presión, para comparar el caso en el que se añade una muestra antes de la preparación de la tarjeta con el caso en el que se añade una muestra después de la preparación de la tarjeta. A través de este experimento, los resultados obtenidos mostraron que es mejor depositar una muestra en la tarjeta de ID de ADN de plástico preparada previamente, independientemente de que la muestra a almacenar sea ADN o sangre.

Se pegó la tarjeta de ADN de Tipo 1 para depositar ADN y la tarjeta de ADN de Tipo 2 para depositar sangre, respectivamente en una tarjeta de plástico, que se preparó a alta temperatura y alta presión para preparar una tarjeta de ID de ADN. Para encontrar la concentración adecuada y la cantidad de muestras a depositar en cada una de ellas, en el caso de ADN genómico, la muestra de ADN se depositó en una concentración de 150 ng/? en varios volúmenes utilizando la preparación de fragmento de tarjeta como anteriormente, y se amplificó el gen eNOS por PCR y se ensayó. Los resultados se mostraron en la Fig. 21. A través de este experimento, se encontró que no es adecuado cargar la sangre en la tarjeta de ADN de Tipo 1 (para ADN) y que pueden cargarse al menos 1,5 \mug o similar al depositar ADN.

Se comparó la diferencia y se analizó por amplificación del gen eNOS, que es uno de los genes de enfermedades geriátricas, por PCR, entre el caso en el que el fragmento de la tarjeta se trató con un tampón de lavado como un proceso de pretratamiento y el caso en el que no se realizó tratamiento en la amplificación por PCR de la muestra conservada en una tarjeta de ADN de plástico preparada a alta temperatura y alta presión. Los resultados se mostraron en la Fig. 22. Como resultado, la amplificación por PCR se realizó mejor cuando el fragmento de la tarjeta no se había tratado previamente con un tampón de lavado en la PCR utilizando una tarjeta de ID de ADN de plástico.

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Aplicabilidad industrial

El procedimiento de almacenamiento de ADN utilizando quitosano hidrosoluble según la presente invención, es excelente con respecto a la eficacia de almacenamiento del ADN, y hace posible el almacenamiento del ADN de manera estable a temperatura ambiente durante mucho tiempo a diferencia el procedimiento convencional. Usando el presente procedimiento, es posible almacenar y transportar ADN genómico de grandes plantas y animales, y ADN genómico de hongos, bacterias y virus a temperatura ambiente de manera estable durante un largo tiempo. El ADN almacenado según el presente procedimiento es útil para todos los ensayos genéticos tales como PCR y RFLP, clonación, secuenciación de bases, transferencia Southern y similares. Además, puede utilizarse ampliamente en un kit de PCR y similar, y es simple y económico. Especialmente, la tarjeta de ADN de Tipo 1 de la invención es muy útil para almacenar y transportar múltiples muestras de ADN a temperatura ambiente durante mucho tiempo, y la tarjeta de ADN de Tipo 2 puede almacenar diversas muestras biológicas que contienen ADN, tales como la sangre, sin que se produzcan daños en el ADN durante mucho tiempo a temperatura ambiente. Además, para la muestra que se conserva en estas tarjetas de ADN, pueden realizarse diversos ensayos genéticos, tales como PCR y PCR-RFLP, hibridación, secuenciación de bases, ensayos de SNP y similares, de forma precisa y simple incluso después de un largo tiempo, que es muy útil en investigaciones básicas y también en diversos tratamientos clínicos. Además, la tarjeta de ID de ADN de la invención puede desempeñar una función de banco de ADN que almacena las moléculas de ADN personales, y también es útil para la identificación personal y el tratamiento médico, tal como para trasplante de órganos y similares, también mediante el almacenamiento de la información genética personal.

Claims (24)

1. Un procedimiento para almacenar ADN en forma de complejo de quitosano/ADN preparado mezclando una disolución de ADN y una disolución de quitosano hidrosoluble, en el que el ADN es ADN genómico de animales, plantas, hongos, bacterias y virus, y el quitosano hidrosoluble tiene un grado de desacetilación del 60% o superior, y un peso molecular de 10 kDa a 500 kDa.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la concentración de una disolución acuosa de quitosano hidrosoluble es del 0,02% (p/v) al 1% (p/v) y la relación de pesos del quitosano hidrosoluble al ADN en la mezcla es de 1:0,5 o superior.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la concentración de una disolución acuosa de quitosano hidrosoluble es del 0,02% (p/v) al 0,25% (p/v), la concentración de una disolución de ADN es de 1 \mug/\mul o inferior, y la relación de pesos del quitosano hidrosoluble al ADN en la mezcla es de 1:0,5 a 1:3.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el complejo del ADN y el quitosano se almacena a temperaturas desde -70ºC hasta temperatura ambiente.

5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el complejo de ADN unido a quitosano se almacena en estado líquido.

6. Una tarjeta de ADN de tipo papel para almacenar ADN, en la que la tarjeta de ADN se prepara por inmersión en una composición que comprende quitosano hidrosoluble y ácido úrico y por secado, y el ADN se conserva goteando una disolución de ADN sobre la tarjeta a medida que el ADN se une con el quitosano hidrosoluble, y el ADN es ADN genómico de animales, plantas, hongos, bacterias o virus.

7. Una tarjeta de ADN de tipo papel para almacenar ADN, en la que la tarjeta de ADN se prepara por inmersión en una composición que comprende quitosano hidrosoluble y un tampón de lisis celular que contiene ácido úrico y por secado, y el ADN se almacena goteando muestra biológica que contiene ADN genómico sobre la tarjeta a medida que el ADN se une con el quitosano hidrosoluble.

8. La tarjeta de ADN de tipo papel según la reivindicación 6 ó 7, en la que el papel es para transferencia o cromatografía y el espesor del mismo es de 0,3 a 1,2 mm.

9. La tarjeta de ADN de tipo papel según la reivindicación 6 ó 7, en la que la tarjeta está marcada con 6, 24, 96 ó 384 pocillos que tienen el tamaño de cada pocillo de un diámetro de 12,3 cm x 8,1 cm, y la muestra de ADN o sangre se gotea y almacena en cada pocillo.

10. La tarjeta de ADN de tipo papel según la reivindicación 6, en la que la composición se prepara mezclando 0,1% a 1% (p/v) de quitosano hidrosoluble con 0,5 mM a 20 mM de ácido úrico en la relación de volúmenes 1:1.

11. La tarjeta de ADN de tipo papel según la reivindicación 7, en la que el tampón de lisis celular comprende Tris (8 mM), EDTA (0,5 mM), SDS (al 0,1% p/v) y ácido úrico (2 mM).

12. Un procedimiento para el ensayo de PCR sobre la tarjeta de ADN que comprende las etapas de:

a)

añadir un fragmento de una tarjeta de ADN de la reivindicación 6 a un tubo de PCR;

b)

añadir un tampón TE (10 mM de Tris-Cl, 0,1 mM de EDTA, pH = 8,0) al tubo y dejar el tubo en reposo durante 5 minutos a temperatura ambiente tras la mezcla, y a continuación desechar el tampón TE usando una pipeta;

c)

repetir la etapa b) dos veces;

d)

secar el tubo durante 1 hora a temperatura ambiente o durante 10 minutos a 56ºC; y

e)

añadir las muestras de PCR al tubo y amplificar a través de PCR.

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13. Un procedimiento para el ensayo de PCR sobre la tarjeta de ADN que comprende las etapas de:

a)

añadir un fragmento de la tarjeta de ADN de la reivindicación 7 a un tubo de PCR;

b)

añadir un tampón de lavado (reactivo de purificación GG; 0,5 mM de EDTA, 8 mM de Tris-Cl, 2 mM de ácido úrico, 1% (p/v) de SDS) al tubo y dejar el tubo en reposo durante 5 minutos a temperatura ambiente tras la mezcla, y a continuación desechar el tampón de lavado usando una pipeta;

c)

repetir la etapa b) tres veces;

d)

añadir un tampón TE (10 mM de Tris-Cl, 0,1 mM de EDTA, pH = 8,0) al tubo y dejar el tubo en reposo durante 5 minutos a temperatura ambiente tras la mezcla, y a continuación desechar el tampón TE usando una pipeta;

e)

repetir la etapa d) dos o tres veces;

f)

secar el tubo durante una hora a temperatura ambiente o durante 10 minutos a 56ºC; y

g)

añadir las muestras de PCR al tubo y amplificar a través de PCR.

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14. Un procedimiento para análisis, en el que el ADN almacenado según el procedimiento de almacenamiento de la reivindicación 5 o almacenado en una tarjeta de ADN según la reivindicación 6 ó 7 se usa en PCR-RFLP, clonación, síntesis de bibliotecas, análisis de secuenciación o transferencia southern.

15. Un procedimiento para analizar ADN, en el que el ADN separado de un complejo de quitosano/ADN en estado líquido almacenado según el procedimiento de almacenamiento de la reivindicación 5 o el complejo de quitosano/ADN almacenado en la tarjeta de ADN según la reivindicación 6 ó 7 usando una sal catiónica a base de sulfato se usa en el análisis genético.

16. El procedimiento para analizar ADN, según la reivindicación 15, en el que las sales catiónicas a base de sulfato incluyen SDS (dodecilsulfato de sodio), SOS (octilsulfato de sodio) y CTAB (bromuro de cetiltrimetil amonio).

17. Un kit de PCR que comprende un tubo que contiene oligo d(T), un cebador, DNA polimerasa Taq, una disolución de tampón de reacción, dNTP y quitosano hidrosoluble, en el que el tubo contiene además ADN genómico o la muestra de suero, y el tubo se usa para llevar a cabo la PCR.

18. Una tarjeta de ID de ADN, en la que la mezcla de quitosano y ADN genómico de un individuo se almacena en una porción de la misma según el procedimiento de almacenamiento de ADN de la reivindicación 1, y la información genética del individuo se guarda en una barra magnética o en un chip incluido.

19. La tarjeta de ID de ADN según la reivindicación 18, en la que el material básico de la tarjeta de ID de ADN es un plástico.

20. Un procedimiento para la preparación de una tarjeta de ID de ADN que comprende las etapas de:

a)

apilar las tarjetas de papel de ADN de la reivindicación 6 ó 7 sobre una capa blanda de PVC;

b)

apilar una primera capa núcleo de PVC, que tiene un agujero del mismo tamaño que la tarjeta de papel de ADN, en la tarjeta de papel de ADN;

c)

apilar una segunda capa núcleo de PVC, que tiene dos agujeros más pequeños que el agujero de la primera capa núcleo de PVC, sobre el agujero de la primera capa núcleo de PVC;

d)

apilar una capa blanda de PVC sobre la segunda capa núcleo de PVC; y

e)

añadir calor y presión a las capas apiladas para que se adhieran unas a otras por calor.

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21. La tarjeta de ID de ADN según la reivindicación 19, que comprende:

una primera capa blanda de PVC; una tarjeta de papel de ADN; una primera capa núcleo de PVC que tiene un agujero de igual tamaño que el tamaño de la tarjeta de papel de ADN; una segunda capa núcleo de PVC que tiene agujeros a través de los que se gotea el ADN o las muestras biológicas que contienen ADN sobre la tarjeta de papel de ADN; y una segunda capa blanda de PVC,

en la que la barra magnética está ubicada en el lado opuesto al lado en el que se almacena el ADN o la muestra biológica en la tarjeta de papel de ADN.

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22. La tarjeta de ID de ADN según la reivindicación 21, en la que la información, el código de enfermedades, el STR o tipo de HLA de un individuo están codificados en la barra magnética.

23. La tarjeta de ID de ADN según la reivindicación 18, en la que la cantidad de ADNg goteado en la tarjeta de ID de ADN es de 1,5 \mug o mayor.

24. Un procedimiento para analizar por medio de PCR la tarjeta de ID de ADN, en el que los fragmentos de la tarjeta de ID de ADN de la reivindicación 18 se usan en la amplificación por PCR sin recibir tratamiento con un tampón de lavado.