ES2227222T3

ES2227222T3 - Procedimiento para la identificacion, cuantificacion y visualizacion de microorganismos.

Info

Publication number: ES2227222T3
Application number: ES01945099T
Authority: ES
Inventors: Claudia Beimfohr; Jiri Snaidr
Original assignee: Vermicon AG
Current assignee: Vermicon AG
Priority date: 2000-05-08
Filing date: 2001-05-08
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2021-05-08
Also published as: EP1280603B1; WO2001085340A3; WO2001085340A2; DE10022304A1; ATE273752T1; DE50103329D1; DE10022304B4; EP1280603A2; AU2001267413A1

Abstract

Equipo para la detección de microorganismos en una muestra mediante una sonda de ácido nucleico, que comprende un recipiente (recipiente AIO) que contiene un filtro, un recipiente de recogida en el que se puede introducir el recipiente AIO, al menos una sonda de ácido nucleico para la detección específica de un microorganismo, así como dado el caso al menos una sonda de ácido nucleico para la realización de un control negativo y, dado el caso, un tampón de hibridación, en el que se pueden realizar los pasos siguientes en el recipiente AIO: a) fijar sobre un soporte los microorganismos contenidos en la muestra; b) incubar sobre un soporte los microorganismos fijados con moléculas sonda de ácido nucleico detectables; c) eliminar las moléculas sonda de ácido nucleico no hibridadas; y d) liberar las moléculas sonda de ácido nucleico hibridadas.

Description

Procedimiento para la identificación, cuantificación y visualización de microorganismos.

La invención se refiere a un equipo para la detección de microorganismos en una muestra, con el que es posible tanto la visualización como la cuantificación de los microorganismos. Además, la invención se refiere a un procedimiento usando este equipo.

Durante décadas, la identificación de microorganismos sólo se pudo realizar tras el cultivo previo de los microorganismos y con ello su reproducción continua. Este cultivo se realiza, por ejemplo, para virus en sus respectivos organismos huésped, para bacterias, hongos y algas unicelulares, en medios de cultivo. Para la determinación de la cantidad de microorganismos viables en una muestra determinada se seleccionaron medios y/o condiciones que principalmente deberían excluir una determinación selectiva de determinados grupos. Así, por ejemplo, se dispusieron cultivos puros de colonias bacterianas individuales y se identificaron éstas según características fenotípicas, por ejemplo, su morfología y sus productos de metabolismo. Sin embargo, la identificación de microorganismos según cultivos previos está unida a dos desventajas decisivas. En primer lugar, estudios de las más diversas muestras ambientales prueban que en este momento sólo el 0,1 al 14% de todas las bacterias son cultivables y, con ello, detectables. En segundo lugar se muestra que en el cultivo pueden aparecer fuertes desplazamientos de población, es decir, en el laboratorio se favorecen determinados grupos de bacterias y/o se discriminan otros.

Esto no significa sólo que una gran parte de las bacterias no se pueden reconocer en las muestras que se han de estudiar, por ejemplo, muestras ambientales, sino también que aquellas bacterias que se identifican representan en la mayoría de los casos una imagen distorsionada de las verdaderas estructuras de población. Son consecuencia de esto las estimaciones erróneas de las relaciones de población en referencia a la identificación y cuantificación de las bacterias.

A principios de los años noventa se desarrolló un procedimiento de hibridación in situ con sondas de oligonucleótidos marcados con fluorescencia, que se empleó con éxito en muchas muestras ambientales (Amann y col. (1990) J. Bacteriol. 172:762). Este procedimiento llamado "FISH" (hibridación in situ fluorescente) se basa en el hecho de que cada célula comprende secuencias específicas disponibles de ARN ribosómicos (ARNr) muy conservadas, es decir, poco específicas y escasamente conservadas, es decir, específicas del género y la especie. Ya a mitad de los años ochenta se mostró que las secuencias del ARNr 16S y 23S se pueden utilizar para la identificación de microorganismos (Woese (1987) Microbiol. Reviews 51:221; De Long y col. (1989) Science 243:1360). En el procedimiento FISH se encierran en la célula sondas génicas marcadas por fluorescencia, cuyas secuencias son complementarias a una región determinada de la secuencia diana ribosómica. Por regla general las moléculas sonda son fragmentos de ácido desoxirribonucleico de cadena simple, de 16 a 20 bases de longitud, complementarias a una zona diana que es específica de un determinado tipo de bacterias o un género bacteriano. Si la sonda génica marcada por fluorescencia encuentra su secuencia diana en una célula bacteriana, entonces se une a ella y a causa de su fluorescencia las células se pueden detectar en el microscopio de fluorescencia.

Se ha podido mostrar que mediante la hibridación in situ con sondas marcadas por fluorescencia se puede detectar casi el 100% de una población total de bacterias. Es por eso que este procedimiento ya proporciona una mejora esencial frente al estado de la técnica, que sólo hace posible la detección de un máximo del 14% de la población bacteriana de una muestra ambiental. El procedimiento de la hibridación in situ con sondas marcadas por fluorescencia permite además encontrar evidencias sobre la medida de la actividad metabólica, ya que el número de ribosomas por célula se correlaciona con esta actividad. Finalmente, el procedimiento permite hacer visibles bacterias directamente en su lugar de acción, por lo que se pueden reconocer y analizar interacciones entre diferentes poblaciones de bacterias.

En los últimos diez años, la técnica de la hibridación in situ con sondas marcadas por fluorescencia se probó en las muestras más diversas y se aplicó con éxito. Así, mediante el empleo de sondas génicas en suelos, en protozoos, en bio-películas, en el aire, en los mares, en filtros biológicos activados y en aguas residuales de depuradoras se estudiaron las respectivas poblaciones de bacterias y se identificaron nuevas bacterias. El punto clave se encontró en este caso en el análisis de poblaciones de bacterias en la depuración de aguas residuales. Se estudiaron incluso las instalaciones de lecho de contacto sumergido, filtración volumétrica y fango activado, como los tanques de sedimentación secundarios y la correspondiente corriente receptora (Snaidr y col. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63:2884). Mediante la técnica de la hibridación in situ con sondas marcadas por fluorescencia se pudo mostrar que en la obtención de la flora del fango activado mediante cultivo se llega a un desplazamiento del cultivo (Wagner y col. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59:1520). Por eso los procedimientos dependientes del cultivo sólo ofrecen una impresión muy falseada en la composición y dinámica de la biozonosis microbiana. Mediante esta distorsión dependiente del medio de las relaciones reales dentro de la población de bacterias, se sobreestima dramáticamente la importancia de bacterias que sólo juegan un papel secundario en el fango activado de las instalaciones de depuración de aguas residuales, aunque las condiciones de cultivo empleadas están bien ajustadas. Así, se ha podido mostrar que a causa de un artefacto de cultivo tal el género bacteriano Acinetobacter se estimó de forma completamente falsa en lo referente a su papel como eliminador biológico del fosfato en la depuración de aguas residuales.

Aunque la hibridación in situ con las nuevas sondas marcadas por fluorescencia desarrolladas permite un análisis rápido y preciso de las poblaciones de bacterias en las aguas residuales, aún no se ha podido poner en práctica. Las razones para ello son el elevado precio de compra de los instrumentos técnicos necesarios, como el microscopio de fluorescencia, la necesidad de equipos cualificados, que se tienen que ocupar de la realización y utilización, así como la pequeña cantidad de medidas de referencia que resultan de ello. Además, es necesario un gasto de tiempo elevado para el recuento de las poblaciones de bacterias detectadas (cuantificación). Además, el recuento requiere un gran nivel de experiencia, ya que se tiene que diferenciar entre señales verdaderas (realmente ha tenido lugar la unión de las sondas) y falsas (auto-fluorescencia, sin células).

En el procedimiento de la hibridación FISH descrito anteriormente se realizan respectivamente en cámaras separadas los pasos de fijación de las células, hibridación, así como el paso siguiente de lavado antes de la identificación de las células marcadas. La hibridación se realiza en un portaobjetos, las sondas entran en las células y permanecen sujetas en sus sitios diana. Tras un paso de lavado para eliminar las moléculas sonda de ácido nucleico no hibridadas, se identifican las células marcadas.

En el procedimiento descrito en la solicitud de patente internacional WO 99/18234 para el análisis microbiológico cualitativo y cuantitativo de poblaciones en una muestra, la fijación de la célula también se realiza aparte. A diferencia del procedimiento de hibridación FISH descrito anteriormente en este procedimiento del estado de la técnica se realiza la hibridación en una suspensión. Aquí, las sondas de ácido nucleico también entran en las células y permanecen sujetas en sus sitios diana. Tras un paso de lavado para eliminar las sondas de ácido nucleico no hibridadas, las sondas unidas específicamente se extraen y a continuación se cuantifican.

Es desventajoso en el procedimiento descrito anteriormente que en la eliminación del sobrenadante tras la hibridación, normalmente mediante pipeteado, también se extrae una parte de las células marcadas, lo que conduce a un falseamiento de la señal de medida. Por el mismo motivo son problemáticos los tratamientos celulares, como por ejemplo un tratamiento de etanol para la deshidratación de las células o un tratamiento de lisozima para células gram positivas, ya que los pasos de centrifugación necesarios para ello con la siguiente eliminación del sobrenadante conducen frecuentemente a pérdidas celulares graves. Sin embargo, en caso de que no se realicen los tratamientos celulares esto tiene como consecuencia una menor intensidad de señal. Además, el especialista conoce muchas especies bacterianas (por ejemplo, Microthrix parvicella), en las que sin pre-tratamiento no se puede realizar una penetración de la cubierta celular. Finalmente, con el procedimiento descrito en la solicitud de patente internacional WO 99/18234 muchas especies de bacterias no se pueden identificar y cuantificar o sólo en una cantidad insuficiente a causa de las bajas intensidades de señal, limitadas por la hibridación en suspensión.

Por eso, el objetivo de la presente invención es preparar un procedimiento con el que sea posible una cuantificación rápida y precisa sin pérdidas celulares. Además, es deseable preparar un equipo con el que sea posible la realización de forma sencilla en un paso tanto de los pasos de identificación y visualización como de los pasos de identificación y cuantificación de las células marcadas.

Estos objetivos se alcanzan mediante los objetos de las reivindicaciones independientes.

En las reivindicaciones subordinadas se describen configuraciones ventajosas.

Se prepara un procedimiento según la invención para la detección de microorganismos en una muestra mediante sondas de ácido nucleico, en el que el procedimiento comprende los pasos siguientes:

a): fijar sobre un soporte los microorganismos contenidos en una muestra;

b): incubar sobre un soporte los microorganismos fijados con moléculas sonda de ácido nucleico detectables;

c): eliminar las moléculas sonda de ácido nucleico no hibridadas;

d): identificar las moléculas sonda de ácido nucleico hibridadas y/o

e): liberar las moléculas sonda de ácido nucleico hibridadas y, a continuación, cuantificar las moléculas sonda de ácido nucleico liberadas.

De este modo todas las reacciones tienen lugar en un solo recipiente, es decir, la incubación de los microorganismos fijados, la eliminación de las moléculas sonda de ácido nucleico no hibridadas, así como la liberación de las moléculas sonda de ácido nucleico hibridadas en caso de que las células marcadas se tengan que cuantificar. En una forma de realización preferible se realiza también en este recipiente la fijación de los microorganismos contenidos en la muestra (paso a). Con ello, mediante el procedimiento según la invención se describe en primer lugar un procedimiento con el que es posible la fijación, identificación y visualización de microorganismos y/o la fijación, identificación y cuantificación de estos microorganismos en un mismo recipiente. En el procedimiento según la invención se excluyen completamente las pérdidas celulares por un lavado inadecuado, como en el procedimiento FISH al lavar el portaobjetos, o por eliminación, como en el procedimiento descrito en la solicitud de patente internacional WO 99/18234 por la eliminación del sobrenadante del sedimento.

En una forma de realización preferible, la muestra que se tiene que estudiar se introduce con la pipeta en un recipiente (a continuación denominado también recipiente todo en uno (AIO)). El recipiente, preferentemente con un filtro como soporte, se introduce en un recipiente de recogida. La muestra se centrifuga y el sedimento se fija directamente en el recipiente AIO. El recipiente AIO con las células fijadas se puede almacenar o bien se puede volver a utilizar directamente. Como las células se retienen en el filtro del recipiente AIO éstas se pueden volver a tratar otra vez para una entrada efectiva de las sondas, por ejemplo, mediante tratamiento de lisozima en células gram positivas y/o mediante un tratamiento de etanol para la deshidratación de las células. La hibridación in situ siguiente se realiza también en el recipiente AIO. Así, entran sondas génicas marcadas específicas en las células y se sujetan a sus secuencias diana. A continuación se introduce un tampón de lavado para la eliminación de las sondas sobrantes y se vuelve a centrifugar. Si se desea una visualización se saca el filtro y se observa bajo un microscopio de fluorescencia. Si se desea una cuantificación, las células hibridadas que quedan en el filtro se tratan con un tampón de liberación. Así se liberan las sondas unidas específicamente. Si el nuevo paso de centrifugación se realiza con un recipiente de recogida no utilizado, a continuación se puede medir así el filtrado allí recogido. De este modo se pueden identificar y cuantificar los microorganismos que se encuentran en la muestra.

Ambos procesos de identificación y visualización (paso b), así como identificación y cuantificación (paso e) se pueden realizar de forma alternativa o uno tras otro en este orden. En caso deseado la fijación también se puede realizar en el recipiente AIO. Las células así fijadas se pueden almacenar en el recipiente AIO hasta su uso.

Las ventajas del procedimiento según la invención frente al procedimiento FISH son, por un lado, la muy sencilla manipulación, ya que en este procedimiento todos los pasos se realizan en un mismo recipiente de reacción, y por otro lado la rentabilidad, ya que no son necesarias cámaras de hibridación y lavado separadas.

Como filtro se usa preferiblemente un filtro de celulosa regenerada. Otros materiales de filtro apropiados son, por ejemplo, nitrato de celulosa, acetato de celulosa, nitrocelulosa, ésteres mezclados, policarbonato, óxido de aluminio, poliamida y similares. Otros materiales del filtro convencionales pueden conducir a un fondo muy elevado en la visualización y sobre todo en la cuantificación, ya que en el paso de liberación a menudo se liberan partículas del filtro.

Son ventajas del procedimiento según la invención frente al procedimiento descrito en la solicitud de patente internacional WO 99/18234 la manipulación muy sencilla, así como la ejecutabilidad muy rápida. Además, especialmente en la fijación sobre un filtro de los microorganismos contenidos en la muestra, no aparecen pérdidas celulares mediante una necesaria eliminación del sobrenadante, como en el procedimiento mencionado anteriormente, por lo que se obtienen resultados precisos estandarizables. Mediante el paso de las disoluciones de incubación y/o lavado a través de un filtro se evita que se extraigan eventualmente células liberadas en una eliminación del sobrenadante generalmente necesaria y se produzcan así pérdidas celulares. Además, antes de la hibridación se pueden realizar también tratamientos celulares, como un paso de etanol o un tratamiento enzimático (por ejemplo, con lisozima) para células gram positivas, sin pérdidas celulares. En el procedimiento mencionado anteriormente la renuncia a un pre-tratamiento de este tipo conduce a menor flexibilidad referente a la rotura de células, así como a una menor intensidad de señal sin el paso de etanol. En caso de que en el procedimiento mencionado anteriormente se renuncie a un pre-tratamiento de este tipo, la consecuencia son pérdidas celulares graves. Finalmente, el procedimiento según la invención frente al procedimiento descrito en el documento WO 99/18234 presenta la ventaja de que una hibridación de microorganismos que se fijaron antes en un soporte conduce a intensidades de señal esencialmente más elevadas que una hibridación en suspensión como la que se describe allí.

En otra forma de realización preferible de la presente invención el procedimiento según la invención se puede aplicar también en formato micro-título y con ello de forma automatizable. Para ello un filtro correspondientemente pequeño se sitúa sobre la placa de micro-título, el recipiente AIO según la invención corresponde en este caso al pocillo de micro-título con el filtro como suelo. La placa de micro-título se centrifuga o se filtran los fluidos con ayuda de un aparato de filtración al vacío. Entonces las sondas de ácido nucleico marcadas extraídas se encuentran en el pocillo de la placa de micro-título.

Según la invención, para otro aspecto de la presente invención se prepara un equipo para la realización del procedimiento para la detección de microorganismos en una muestra. El contenido de un equipo tal se dirige esencialmente a la naturaleza del microorganismo que se tiene que detectar. Comprende como componente más importante una sonda de ácido nucleico específica respectivamente para el microorganismo que se tiene que detectar, así como preferiblemente otra sonda de ácido nucleico con la que se puede realizar un control negativo. Además, comprende preferiblemente un tampón de hibridación y dado el caso un tampón de lisis. La selección del tampón de hibridación depende en primer lugar de la longitud de las sondas de ácido nucleico usadas. Así, como sabe el especialista, para la hibridación de una sonda de ácido nucleico de 15 nucleótidos de longitud se deben seleccionar condiciones menos restrictivas que para la hibridación de una sonda de 75 nucleótidos de longitud. Se citan ejemplos de condiciones de hibridación, por ejemplo, en Stahl & Amann (1991) en Stackebrandt y Goodfellow (Hrsg.), Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics; John wiley & Sons Ltd., Chichester, Reino Unido.

La composición del tampón de lisis depende siempre de los microorganismos respectivos. Así, para la lisis de cápsulas de virus, paredes celulares de bacterias gram positivas o gram negativas y membranas celulares de levaduras o algas son necesarias respectivamente condiciones ligeramente diferentes, que se pueden comprobar sin más en la bibliografía.

Por consiguiente, se prepara un equipo con el que se puede realizar el procedimiento según la invención descrito anteriormente. El equipo según la invención comprende en una forma de realización preferible al menos un tampón de hibridación, al menos una sonda de ácido nucleico para la detección específica de un microorganismo, al menos una sonda de ácido nucleico para la realización de un control negativo, un recipiente (recipiente AIO) y dado el caso un recipiente de recogida, en el cual se puede introducir el recipiente AIO, realizándose en el recipiente AIO los siguientes pasos:

a): fijar sobre un soporte los microorganismos contenidos en una muestra, especialmente un filtro, con especial preferencia un filtro de celulosa regenerada;

c): eliminar las moléculas sonda de ácido nucleico no hibridadas; y

d): liberar las moléculas sonda de ácido nucleico hibridadas.

El soporte, preferiblemente el filtro, en una forma de realización preferible del recipiente AIO se puede extraer del recipiente, de manera que la visualización de las células marcadas, por ejemplo bajo un microscopio de epifluorescencia, se puede realizar de forma sencilla. Además, el recipiente AIO y/o el recipiente de recogida se pueden cerrar preferiblemente, para permitir un centrifugado seguro.

En una forma de realización preferible, el equipo según la invención contiene sondas específicas para la detección de bacterias filamentosas del grupo de las bacterias verdes, que no contienen azufre, de bacterias del tipo Nostocoida limicola y bacterias filamentosas del tipo Rhodobacter sphaeroides.

En el marco de la presente invención se entiende por "fijación" de microorganismos un tratamiento con el que las cubiertas que rodean a los respectivos microorganismos se deben hacer tan permeables que la sonda de ácido nucleico con el marcaje, dado el caso unido covalentemente, pueda penetrar a través de la cubierta para así poder alcanzar las secuencias diana en el interior de las células. La cubierta puede ser, por ejemplo, la cubierta lipídica que rodea un virus, la pared celular de una bacteria o la membrana celular de un microorganismo unicelular. Para la fijación se usa normalmente una disolución de paraformaldehído de bajo porcentaje. Si en un caso particular la cubierta protectora que rodea un microorganismo no se pudiera hacer penetrable con una disolución de paraformaldehído, el especialista conoce suficientes condiciones más que conducen al mismo resultado. Entre ellas se cuentan, por ejemplo, formaldehído, metanol, mezclas de alcoholes con paraformaldehído, tratamientos enzimáticos, tratamiento de ultrasonidos, etc. En una forma de realización preferible de la presente invención se realiza la fijación con etanol, con especial preferencia con etanol al 50%.

Una sonda de ácido nucleico en el sentido de la invención puede ser una sonda de ADN o ARN, que por regla general contiene entre 12 y 1000 nucleótidos, con preferencia entre 12 y 100 ó 15 y 50, con especial preferencia entre 17 y 25 nucleótidos. La sonda de ácido nucleico se selecciona de manera que hay una para su secuencia complementaria en el microorganismo que se tiene que detectar y/o en el grupo de microorganismos que se tienen que detectar. En una sonda de sólo unos 15 nucleótidos la complementariedad se debería dar en lo posible a lo largo de la secuencia completa, en oligonuclótidos con más de 15 nucleótidos se permiten uno hasta varios sitios de apareamiento erróneos. Sin embargo se tiene que garantizar que la molécula de las sondas de ácido nucleico se hibrida realmente con la secuencia diana en condiciones de hibridación moderadas y/o restrictivas. Son condiciones moderadas en el sentido de la invención, por ejemplo, formamida inferior al 20% en un tampón de hibridación como el que se describe en el ejemplo 1. Son condiciones restrictivas en el sentido de la invención, por ejemplo formamida al 20-80% en el tampón descrito en el ejemplo 1.

La duración de la hibridación asciende normalmente entre 10 minutos y 12 horas; la hibridación se realiza preferiblemente durante aproximadamente 2 horas. La temperatura de hibridación asciende preferiblemente a un valor entre 44ºC y 48ºC, con especial preferencia 46ºC, en el que el parámetro de la temperatura de hibridación como también la concentración en sales y detergentes en la disolución de hibridación se pueden optimizar con dependencia de la sonda y/o las sondas, especialmente su(s) longitud(es) y el grado de complementariedad con la secuencia diana en la célula que se tiene que detectar. Aquí el especialista está familiarizado con los cálculos relevantes.

En el marco del procedimiento según la invención, una disolución de hibridación típica tiene una concentración de sal de 0,1 mol/l a 1,5 mol/l, con preferencia de 0,9 mol/l, en el que la sal es preferiblemente cloruro sódico. Además, normalmente el tampón de hibridación comprende un detergente, como por ejemplo dodecilsulfato sódico (SDS) en una concentración de 0,001-0,1%, preferiblemente en una concentración de 0,01%, y Tris/HCl en un intervalo de concentración de 0,001-0,1 mol/l, preferiblemente en una concentración de 0,02 mol/l. El valor de pH de Tris/HCl asciende normalmente a valores entre 6 y 10, siendo preferible un pH de aproximadamente 8,0. Como se menciona arriba, la disolución de hibridación puede contener además formamida entre 0% y 80%, según qué grado de restricción se desea y/o se necesita.

La sonda de ácido nucleico debería estar presente en el tampón de hibridación si es posible en una cantidad de 15 ng hasta 1000 ng, conteniéndose esta cantidad en un volumen en la disolución de hibridación entre 8 \mul y 100 \mul, preferiblemente en 80 \mul. Con especial preferencia la concentración de las sondas asciende a 125 ng/80 \mul de la disolución de hibridación.

Tras realizar la hibridación se deberían eliminar las moléculas sonda no hibridadas y sobrantes, lo que se realiza normalmente mediante una disolución de lavado convencional y/o un tampón de lavado convencional. Este tampón de lavado contiene usualmente 0,001-0,1% de un detergente como SDS, siendo preferible una concentración de 0,01%, y Tris/HCl en una concentración de 0,001-0,1 mol/l, preferiblemente 0,02 mol/l, encontrándose el valor de pH de Tris/HCl en el intervalo de 6,0 a 10,0, preferiblemente a 8,0. Además, el tampón de lavado contiene normalmente NaCl, ascendiendo la concentración de 0,003 mol/l a 0,9 mol/l, preferiblemente de 0,01 mol/l a 0,9 mol/l, según la astringencia necesaria. Adicionalmente la disolución de lavado puede contener EDTA, ascendiendo preferiblemente la concentración a 0,005 mol/l.

El "lavado" de las moléculas sonda no unidas se realiza normalmente a una temperatura en el intervalo de 44ºC a 52ºC, preferiblemente de 46ºC a 50ºC y con especial preferencia a 48ºC durante 10-40 minutos, preferiblemente durante 20 minutos.

Tras realizar la hibridación in situ y a continuación la eliminación de las moléculas sonda de ácido nucleico no hibridado mediante los pasos de lavado descritos arriba, se realiza la separación de las moléculas sonda hibridadas para la detección y en caso deseado la cuantificación de las moléculas sonda hibridadas. Para este paso de extracción son apropiados aquellos medios de extracción que garantizan una desnaturalización de la sonda de la secuencia diana a una determinada temperatura, sin deteriorar las moléculas sonda en la proporción del valor nominal. Por eso, como disolución de liberación y/o tampón de liberación es preferible usar agua, o sea H_{2}O_{dest/bidest}, o agua ligeramente tamponada, o sea por ejemplo Tris/HCl en el intervalo de concentración de 0,001 mol/l a 1,0 mol/l, con especial preferencia en una concentración de 0,01 mol/l, ascendiendo el pH de Tris/HCl de 7,0 a 11,0, preferiblemente 9,0. Además, en el marco de esta invención también es apropiado el DMSO (dimetilsulfóxido) y 1 x SSC, pH 10,0 (+/- 2,0) como medio de extracción, en el que el 1 x SSC se prepara de forma apropiada mediante la dilución de una disolución madre 20 x SSC (175,2 g NaCl, 88,2 g citrato sódico, llenando con agua hasta 1 L).

La liberación de las moléculas sonda se realiza normalmente durante 5 a 30 minutos, preferiblemente 15 minutos. Así, la extracción de las sondas se realiza en un intervalo de temperatura de 50-100ºC, preferiblemente a aproximadamente 80ºC. En cada caso se debería intentar realizar la extracción a una temperatura que garantizara una separación efectiva pero al mismo tiempo fuera suave para las moléculas sonda. Como las sondas se afectan por el tratamiento de extracción tanto menos cuanto menor es la temperatura, es preferible una temperatura < 100ºC, especialmente <90ºC.

Como medio de extracción son preferibles especialmente H_{2}O_{bidest} o Tris/HCl 0,01 mol/l frente a la formamida, que en el estado de la técnica se recomienda por regla general como medio de extracción. Renunciando a la formamida en el paso de extracción no sólo se obtiene un tratamiento más suave para las sondas marcadas, adicionalmente también se obtienen ventajas en lo referente al potencial de riesgo, ya que la formamida es una sustancia tóxica tipo 3. Además, el uso de formamida tiene un coste más elevado en comparación con el agua o agua ligeramente tamponada.

La selección de la sonda de ácido nucleico respectiva se realiza dependiendo del microorganismo que se tiene que detectar: por ejemplo, si sólo se tienen que detectar microorganismos de la especie Streptococcus salivarius, aunque no microorganismos de la especie Streptococcus thermophilus, el especialista seleccionará una secuencia apropiada, que aparezca en Streptococcus salivarius y por el contrario no aparezca en Streptococcus thermophilus. Típicamente estas secuencias se seleccionan entre ARNr 16S o 23S. Por el contrario, si se desea incluir todas las bacterias del género Streptococcus se selecciona una secuencia común a Streptococcus salivarius, Streptococcus thermophilus, así como a otras especies del género Streptococcus. En la bibliografía ya se encuentran publicados muchos ejemplos de tales secuencias, véase por ejemplo, Beimfohr y col. (1993) System Appl. Microbiol. 16:450. Además, la sonda de ácido nucleico puede ser complementaria a un ADN cromosómico o episómico, aunque también a un ARNm o ARNr del microorganismo que se tiene que detectar. Así, es preferible seleccionar sondas de ácido nucleico que son complementarias en un intervalo que se encuentra en un número de copias superior a 1 en el microorganismo que se tiene que detectar. La secuencia que se tiene que detectar se encuentra preferiblemente 500-100000 veces por célula, con especial preferencia 1000-50000 veces. Este es otro motivo por el que las sondas de ácido nucleico son complementarias preferiblemente a un ARNr: los ARN ribosómicos son componentes de los ribosomas, los cuales, como realizan la síntesis de moléculas de proteínas, están disponibles muchos miles de veces en cada célula activa.

Según la invención, la sonda de ácido nucleico se incuba con los microorganismos fijados en el sentido mencionado arriba, para permitir así una entrada de las moléculas sonda de ácido nucleico en el microorganismo y la hibridación de moléculas sonda de ácido nucleico con los ácidos nucleicos del microorganismo. A continuación, las moléculas sonda de ácido nucleico no hibridadas se eliminan mediante los pasos de lavado normales. En caso de que se desee una cuantificación, en oposición al procedimiento FISH convencional, no sólo se dejan las moléculas sonda de ácido nucleico hibridadas in situ, o sea en el respectivo microorganismo, sino que se libera otra vez del ácido nucleico que se tiene que determinar, se separa de los componentes celulares, se detecta y se cuantifica.

Es una condición tanto para la identificación como para la cuantificación que la molécula sonda de ácido nucleico usada según la invención se pueda detectar. Esta detectabilidad se puede asegurar, por ejemplo, mediante unión covalente de la molécula sonda de ácido nucleico con un marcador detectable. Se usan como marcadores detectables normalmente grupos fluorescentes, por ejemplo, Cy-2, Cy-3 o Cy-5, FITC, CT, TRITC o Fluos-Prime, todos completamente conocidos por el especialista; en la tabla 1 siguiente se indican algunos marcadores, la mitad de la totalidad, sus propiedades y fuentes de referencia

TABLA 1

FLUOS:	\begin{minipage}[t]{130mm} éster de 5,(6)-carboxifluoresceína-N-hidroxisuccinimida (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania); \varepsilon= 7,50 x 104 mol^{-1}l^{-1}, Abs_{máx} a 494 nm; Em_{max} a 518 nm, PM= 473.\end{minipage}
TRITC:	\begin{minipage}[t]{130mm} trimetilrodamin-5,6-isotiocianato (Isomer G. Molecular Probes Inc., Eugene, EUA, Lambda, Graz, Austria); \varepsilon= 1,07 x 105 mol^{-1}l^{-1}, Abs_{máx} a 537 nm; Em_{max} a 566 nm, PM= 479.\end{minipage}
CT:	\begin{minipage}[t]{130mm} éster de 5,(6)-carboxitetrametilrodamin-N-hidroxisuccinimida (Molecular Probes Inc., Eugene, EUA); \varepsilon= 0,87 x 105 mol^{-1}l^{-1}, Abs_{máx} a 537 nm; Em_{max} a 566 nm.\end{minipage}
CY-3:	\begin{minipage}[t]{130mm} NHS-éster de Cy5.18 (Biological Detection Systems, Pittsburg, EUA); (Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, EUA); \varepsilon= 1,5 x 105 mol^{-1}l^{-1}, Abs_{máx} a 532 nm; Em_{max} a 565 nm, PM= 765,95.\end{minipage}
CY-5:	\begin{minipage}[t]{130mm} NHS-éster de Cy5.18 (Biological Detection Systems, Pittsburg, EUA); (Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, EUA); \varepsilon= > 2 x 105 mol^{-1}l^{-1}, Abs_{máx} a 650 nm; Em_{max} a 667 nm, PM= 791,99.\end{minipage}

De forma alternativa se usan grupos quimioluminiscentes o marcajes radioactivos, por ejemplo, ^{35}S, ^{32}P, ^{33}P, ^{125}J. Sin embargo, la detectabilidad también se puede dar mediante acoplamiento de la molécula de la sonda de ácido nucleico con una molécula activa enzimáticamente, por ejemplo, fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida, peroxidasa, peroxidasa de rábano, \beta-D-galactosidasa o glucosaoxidasa. Para cada uno de estos enzimas se conoce una lista de cromógenos que pueden reaccionar en lugar de los sustratos naturales y se pueden transformar en productos de color o bien fluorescentes. En la tabla 2 siguiente se citan ejemplos de tales cromógenos.

TABLA 2

Enzimas: Cromógenos

1. Fosfatasa alcalina y fosfatasa ácida: 4-metilumbeliferilfosfato (*), bis(4-metilumbeliferilfosfato), (*)3-O-metilfluoresceína, sal triamónica de flavon-3-difosfato (*), sal disódica de p-nitrofenilfosfato

2. Peroxidasa: Hidrocloruro de tiramina (*), ácido 3-(p-hidroxifenil)-propiónico (*), alcohol p-hidroxifeniletílico (*), ácido 2,2'-azino-di-3-etilenzotiazolinsulfónico (ABTS), dihidrocloruro de orto-fenilendiamina, o-dianisidina, ácido 5-aminosalicílico, p-ucresol (*), 3,3'-dimetiloxibencidina, 3-metil-2-benzotiazolinhidrazona, tetrametilbencidina

3. Peroxidasa de rábano: H_{2}O_{2} + diamoniobencidina H_{2}O_{2} + tetrametilbencidina

4. \beta-D-galactosidasa: o-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido, 4-metilumbeliferil-\beta-D-galactósido

5. Glucosaoxidasa: ABTS, glucosa y azul de tiazolilo

* fluorescencia

Finalmente, es posible configurar las moléculas sonda de ácido nucleico de manera que en sus extremos 5' ó 3' esté disponible otra secuencia de ácido nucleico apropiada para la hibridación. Esta secuencia de ácido nucleico comprende por su parte aproximadamente 15 a 1000, preferiblemente 15 a 50 nucleótidos. Esta segunda zona de ácido nucleico puede ser reconocida por su parte por sondas de oligonucleótidos que son detectables mediante uno de los medios mencionados arriba.

Otra posibilidad consiste en el acoplamiento de las moléculas sonda de ácido nucleico detectables con un hapteno. Tras la liberación de las moléculas sonda de ácido nucleico del ácido nucleico diana, se pueden poner en contacto las moléculas sonda de ácido nucleico presentes con los anticuerpos detectables que se reconocen con el hapteno. Un ejemplo conocido de un hapteno tal es la digoxigenina o sus derivados. El especialista conoce muchas otras posibilidades además de los ejemplos citados para detectar y cuantificar un oligonucleótido usado para la hibridación.

El gran número de marcajes posibles permite también la detección simultánea de dos o más poblaciones diferentes superpuestas o no superpuestas. Así, usando dos marcadores fluorescentes diferentes se puede detectar Streptococcus salivarius junto a Streptococcus thermophilus, o Streptococcus salivarius junto a la población total de estreptococos.

El microorganismo que se tiene que detectar mediante el procedimiento según la invención puede ser un microorganismo procariótico o eucariótico. En la mayoría de los casos se desean detectar microorganismos unicelulares. Son microorganismos relevantes, sobre todo, las levaduras, las bacterias, las algas o los hongos.

En una forma de realización especialmente preferible de la presente invención los microorganismos son bacterias filamentosas del grupo de las bacterias verdes, que no contienen azufre, bacterias del tipo Nostocoida limicola y bacterias filamentosa del tipo Rhodobacter sphaeroides.

El procedimiento según la invención se puede aplicar de múltiples formas. Así, por ejemplo, es apropiado para analizar en muestras ambientales la presencia de determinados microorganismos. Estas muestras ambientales se pueden tomar del agua, del suelo o del aire. Para la detección de determinadas bacterias en muestras ambientales normalmente no es necesario ningún tipo de cultivo previo.

Otra área de aplicación para el procedimiento según la invención es el control de muestras de alimentos. En formas de realización preferibles se toman las muestras de alimentos de leche o productos lácteos (yogurt, quark, queso, mantequilla, suero de mantequilla), agua potable, bebidas (zumos, limonada, cerveza), productos de pastelería o productos cárnicos. Para la detección de microorganismos en alimentos puede ser deseable o incluso prescribirse un cultivo previo. Así, por ejemplo, para la detección de una única salmonela en 25 ml de leche es necesario cultivar ésta un periodo de tiempo para a continuación tener con fiabilidad también una o más salmonelas en el volumen de muestra.

El procedimiento según la invención se puede emplear además para el análisis de muestras médicas. Así, es apropiado tanto para el análisis de muestras de tejidos, por ejemplo, material de biopsias de pulmón, tejido tumoral o inflamado, de secreciones como sudor, saliva, esperma y flujos de la nariz, la uretra o la vagina, así como para análisis de deposiciones y orina.

Otra área de aplicación importante para el presente procedimiento es el análisis de aguas residuales, por ejemplo, fangos activados, fangos inactivos o fango anaerobio. Además, es apropiado para analizar biopelículas en instalaciones industriales, así como también para analizar biopelículas que se forman de forma natural o biopelículas que se forman en la depuración de aguas residuales. Finalmente también es apropiado para el análisis y controles de calidad de productos farmacéuticos y cosméticos, por ejemplo, de pomadas, cremas, tinturas, jugos, etc.

Aunque la invención se ha descrito esencialmente en referencia a moléculas sonda marcadas por fluorescencia, se entiende que las ventajas mencionadas también se dan con el uso de otros marcadores.

Los ejemplos y figuras siguientes sirven para explicar la invención y no se deben interpretar de forma restrictiva.

Ejemplo 1 Identificación y visualización de bacterias filamentosas del tipo Nostocoida limicola en muestras de fango activado

Paso A

Fijación de las células

Para la fijación de las células se necesitan recipientes de reacción de 2 ml, así como una centrífuga de mesa (14000 rpm).

Para la fijación de las células con paraformaldehído se usaron las disoluciones siguientes:

-: Disolución madre de PBS (Na_{x}PO_{4})

: 200 mmol/l NaH_{2}PO_{4}

: 200 mmol/l NaH_{2}PO_{4} (pH 7,2-7,4)

-: Disolución 3 x PBS

: 390 mmol/l NaCl

: 30 mmol/l Na_{x}PO_{4} (disolución madre de PBS)(pH 7,2-7,4)

-: Disolución 1 x PBS

: 130 mmol/l NaCl

: 10 mmol/l Na_{x}PO_{4} (disolución madre de PBS)(pH 7,2-7,4)

-: disolución de etanol al 96%

La fijación de las células se realizó de la siguiente manera:

1.: Adición de una parte de disolución de etanol al 96% a una parte de muestra de fango activado acabada de recoger (por ejemplo, 10 ml de disolución de etanol al 96% a 10 ml de fango activado).

2.: Incubación durante 1 hora a 4ºC.

De esta manera se obtuvo una muestra de fango activado fijada.

Paso B

Hibridación

Para la hibridación in situ se necesitan:

-: centrífuga de mesa (14000 revoluciones por minuto)

-: fluorímetro

-: 1 bloque térmico y 1 baño de agua, o 2 bloques térmicos

-: horno de hibridación

-: recipiente todo en uno con recipiente de recogida

-: formamida (Merck, Darmstadt, Alemania)

-: disoluciones de trabajo de sondas de 50 ng/\mul cada una: NLI-654: 5'-ACC AGC CCC TGA TAC CCT-3'

-: tampón de liberación: 0,01 mol/l de Tris/HCl (pH 9,0)

-: tampón de hibridación (2 ml con contenido de formamida al 20%)

	5 mol/l NaCl	360 \mul
	1 mol/l Tris/HCl pH 8,0	40 \mul
	formamida	400 \mul
	SDS al 10% (m/v)	2 \mul
	H_{2}O_{bidest}	1200 \mul

-: tampón de lavado (2 ml)

	5 mol/l NaCl	86 \mul
	1 mol/l Tris/HCl pH 8,0	40 \mul
	0,5 mol/l EDTA pH 8,0	20 \mul
	SDS al 10% (m/v)	2 \mul
	H_{2}O_{bidest}	1850 \mul

Realización

Se pipetearon 5 a 500 \mul de la suspensión de células fijadas en el centro de un recipiente AIO y se centrifugaron a 14000 revoluciones por minuto durante 6 minutos. El filtrado se desechó. En el sedimento se pipetearon 500 \mul de una disolución de etanol al 50% y se incubó 2 minutos. Tras una nueva centrifugación (2 minutos a 14000 revoluciones por minuto) se incubó el sedimento durante 2 minutos con una disolución de etanol al 70% y se realizó de nuevo una centrifugación (2 minutos a 14000 revoluciones por minuto). Después se pipetearon en el sedimento 500 \mul de una disolución de etanol al 96% y se incubó durante 2 minutos. Tras un paso siguiente de centrifugación (5 minutos a 14000 revoluciones por minuto) se incubó el recipiente AIO durante 5 minutos a 80ºC en un bloque térmico. Tras la adición de 20 \mul del tampón de hibridación pre-calentado a 46ºC se introdujeron 2 \mul de cada sonda de oligonucleótido (concentración 50 ng/\mul). A continuación se cerró la tapa del recipiente AIO y se incubó a 46ºC durante 2 horas. A continuación los recipientes AIO se centrifugaron a 14000 revoluciones por minuto durante 6 minutos y se desechó el filtrado. Tras el lavado durante 20 minutos a 48ºC con 100 \mul de tampón de lavado pre-calentado a 48ºC se centrifugó a 14000 rpm durante 6 minutos. Entonces se sacó el filtro del recipiente AIO, se depositó sobre un portaobjetos, se recubrió con un reactivo anti-decoloración y se observó bajo un microscopio de epifluorescencia. Las células rojas brillantes corresponden a la bacteria del tipo Nostocoida limicola del grupo de las bacterias verdes, que no contienen azufre.

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Ejemplo 2 Cuantificación relativa de bacterias filamentosas del tipo Rhodobacter sphaeroides en el fango activado

Paso A

Fijación de las células

Para la fijación de las células se necesitan recipientes de reacción de 2 ml, así como una centrífuga de mesa (14000 revoluciones/minuto).

-: Disolución madre de PBS (Na_{x}PO_{4})

: 200 mmol/l NaH_{2}PO_{4}

: 200 mmol/l NaH_{2}PO_{4} (pH 7,2-7,4)

-: Disolución 3 x PBS

: 390 mmol/l NaCl

: 30 mmol/l Na_{x}PO_{4} (disolución madre de PBS)(pH 7,2-7,4)

-: Disolución 1 x PBS

: 130 mmol/l NaCl

: 10 mmol/l Na_{x}PO_{4} (disolución madre de PBS)(pH 7,2-7,4)

-: disolución de paraformaldehído al 4%:

: se puede preparar mediante adición de 3 g de paraformaldehído a 30 ml de H_{2}O_{bidest} calentada a 60ºC; a continuación adición gota a gota de 1 mol/l de NaOH hasta la disolución completa del paraformaldehído; a continuación introducción de 16,6 ml de 3 x PBS, enfriado de la disolución a aproximadamente 20ºC; ajuste del valor de pH con 1 mol/l HCl a 7,2-7,4; filtración estéril de la disolución de PFA acabada sobre un filtro de 0,2 \mum (MILLIPORE, Eschborn) y conservación a 4ºC durante aproximadamente 1 día.

La fijación de las células se realizó de la siguiente manera:

1.: Adición de tres partes de disolución de paraformaldehído al 4% a una parte de muestra de fango activado acabada de recoger (por ejemplo, 30 ml de disolución de paraformaldehído al 4% a 10 ml de fango activado).

2.: Incubación durante 3 horas a 4ºC.

3.: Centrifugación a 8000 revoluciones por minuto durante 6 minutos.

4.: Desecho del sobrenadante y resuspensión completa del sedimento en 1 ml de 1 x PBS.

5.: Centrifugación a 8000 revoluciones por minuto durante 6 minutos.

6.: Desecho del sobrenadante (el sedimento permanece en la cápsula)

7.: Resuspensión del sedimento con 250 \mul de 1 x PBS

8.: Adición de 250 \mul de etanol frío a -18ºC.

9.: Lavado básico y dado el caso almacenamiento a -18ºC.

De esta manera se obtuvo una muestra de fango activado fijada.

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Paso B

Hibridación

Para la hibridación in situ se necesitan:

-: centrífuga de mesa (14000 revoluciones por minuto)

-: fluorímetro

-: 1 bloque térmico y 1 baño de agua, o 2 bloques térmicos

-: horno de hibridación

-: recipiente todo en uno con recipiente de recogida

-: formamida (Merck, Darmstadt, Alemania)

-: disoluciones de trabajo de sondas de 50 ng/\mul cada una: Rho-645: 5'-TCT CGA CCT CAA GAA CAG-3' EUB-338: 5'-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'

-: tampón de liberación: 0,01 mol/l de Tris/HCl (pH 9,0)

-: tampón de hibridación (2 ml con contenido de formamida al 20%)

-: tampón de lavado (2 ml)

Realización

Se pipetearon 5 a 500 \mul de la suspensión de células fijadas en el centro de un recipiente AIO y se centrifugaron a 14000 revoluciones por minuto durante 6 minutos. El filtrado se desechó. El recipiente AIO se incubó en un bloque térmico durante 5 minutos a 80ºC. Tras la adición de 20 \mul del tampón de hibridación pre-calentado a 46ºC se introdujeron 2 \mul de cada sonda de oligonucleótido (concentración 50 ng/\mul). A continuación se cerró la tapa del recipiente AIO y se incubó a 46ºC durante dos horas. Entonces los recipientes AIO se centrifugaron a 14000 rpm durante 6 minutos. Tras el lavado durante 20 minutos a 48ºC con 100 \mul de tampón de lavado pre-calentado a 48ºC se centrifugó a 14000 rpm durante 6 minutos. El recipiente AIO se transfirió a un recipiente de recogida no utilizado, se llenó con 120 \mul de tampón de liberación y se incubó 15 minutos a 80ºC. A continuación el recipiente de recogida se centrifugó junto con la unidad de filtrado a 14000 rpm durante 6 minutos, se eliminó la unidad de filtrado y el filtrado se almacenó sobre hielo en la oscuridad. La fluorescencia del filtrado se cuantificó en un fluorímetro. Las cantidades de fluorescencia que se midieron para la sonda Rho-645 se corresponden con la cantidad relativa de bacterias filamentosas del tipo Rhodobacter sphaeroides de la muestra analizada. Estas cantidades se compararon con las cantidades que se pudieron medir con la sonda EUB-338 marcada con un colorante diferente y aplicada en la misma muestra. A partir de la relación obtenida de estos dos valores se obtiene la cantidad relativa de bacterias filamentosas analizadas del tipo Rhodobacter sphaeroides.

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Ejemplo 3 Detección en muestras de agua de bacterias filamentosas del grupo de las bacterias verdes que no contienen azufre

Paso A

Fijación de las células

Equipo de laboratorio:

-: Recipiente todo en uno (recipiente AIO)

-: Centrífuga de mesa (14000 revoluciones por minuto)

Disoluciones usadas para la fijación de las células con PFA:

-: Formaldehído

-: Disolución 1 x PBS

: 130 mmol/l NaCl

: 10 mmol/l Na_{x}PO_{4} (disolución madre de PBS)(pH 7,2-7,4)

Realización

Tras la adición de 500 \mul de la muestra de agua en el recipiente AIO se centrifugó a 14000 rpm durante 5 minutos. A continuación, se añadieron 100 \mul de formaldehído al 1% y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido por una centrifugación a 14000 rpm durante 5 minutos. Entonces se introdujeron 500 \mul de 1 x PBS y se volvió a centrifugar a 14000 rpm durante 5 minutos. Tras desechar el centrifugado, el recipiente AIO se almacenó a -20ºC o se volvió a usar inmediatamente.

Paso B

Hibridación

Equipo de laboratorio:

-: centrífuga de mesa (14000 rpm)

-: fluorímetro

-: 1 bloque térmico y 1 baño de agua o alternativamente 2 bloques térmicos

-: horno de hibridación

Materiales:

-: recipiente todo en uno con recipiente de recogida

-: formamida (Merck, Darmstadt)

-: disoluciones de trabajo de sondas de 50 ng/\mul cada una:

: PPx4-1425: 5'-TCACGGACTTCAGGCGTT-3' (marcado con Cy3)

: PPx4-47: 5'-TGCGACTTGCATGCATTAGG-3' (marcado con FLUOS)

-: tampón de liberación (2 ml): 0,01 mol/l de Tris/HCl (pH 9,0)

-: tampón de hibridación (2 ml con contenido de formamida al 35%)

	5 mol/l NaCl	360 \mul
	1 mol/l Tris/HCl (pH 8,0)	40 \mul
	formamida	700 \mul
	SDS al 10% (m/v)	2 \mul
	H_{2}O_{bidest}	900 \mul

- tampón de lavado (2 ml)

	5 mol/l NaCl	28 \mul
	1 mol/l Tris/HCl (pH 8,0)	40 \mul
	0,5 mol/l EDTA (pH 8,0)	20 \mul
	SDS al 10% (m/v)	2 \mul
	H_{2}O_{bidest}	1910 \mul

Realización

El recipiente AIO con la suspensión de células fijada se centrifugó a 14000 rpm durante 5 minutos. A continuación se desechó el filtrado en el recipiente de recogida y se pipetearon en el sedimento 500 \mul de una disolución de etanol al 50% y se incubó durante 2 minutos. Tras la nueva centrifugación (14000 rpm, 2 minutos) se incubó el sedimento durante 2 minutos con 500 \mul de una disolución de etanol al 70% y de nuevo realizó una centrifugación (14000 rpm, 2 minutos). Después se pipetearon otra vez al sedimento 500 \mul de una disolución de etanol al 96% y se incubó durante 2 minutos. Tras un paso siguiente de centrifugación (14000 rpm, 5 minutos) el recipiente AIO se incubó en un bloque térmico durante 5 minutos a 80ºC. Tras la adición de 20 \mul del tampón de hibridación pre-calentado a 46ºC se introdujeron 2 \mul de cada sonda de oligonucleótido (concentración 50 ng/\mul). A continuación se cerró la tapa del recipiente AIO y se incubó 2 horas a 46ºC. A continuación los recipientes AIO se centrifugaron a 14000 rpm durante 6 minutos y se desechó el sobrenadante. Tras el lavado durante 20 minutos a 48ºC con 100 \mul de tampón de lavado pre-calentado a 48ºC se centrifugó a 14000 rpm durante 6 minutos. Entonces se sacó el filtro del recipiente AIO, se depositó sobre un portaobjetos, se recubrió con un reactivo anti-decoloración y se observó bajo un microscopio de epifluorescencia. Las células rojas brillantes corresponden a las bacterias filamentosas del grupo de las bacterias verdes, que no contienen azufre.

Figuras:

La figura 1 muestra el paso a) de una forma de realización preferible del procedimiento según la invención, en el que los microorganismos contenidos en una muestra se fijaron sobre un soporte en un recipiente AIO.

La figura 2 muestra el paso b) del procedimiento según la invención, en el que los microorganismos fijados se incubaron con sondas de ácido nucleico detectables sobre un soporte.

La figura 3 muestra los pasos c)-e) del procedimiento según la invención. Tras la eliminación de las moléculas sonda de ácido nucleico no hibridadas se pueden identificar las moléculas sonda de ácido nucleico hibridadas tras la extracción del filtro. De forma alternativa o adicional se pueden cuantificar las moléculas sonda de ácido nucleico liberadas mediante la adición de un tampón de liberación.

La figura 4 muestra una comparación del recipiente AIO (todo en uno) como componente del equipo según la invención, así como el procedimiento según la invención con el procedimiento de hibridación FISH y/o FISH rápido, así como los dispositivos necesarios para ello.

<110> Vermicon AG

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Procedimiento para la identificación, cuantificación y visualización de microorganismos

\vskip0.400000\baselineskip

<130> V 7333

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip0.400000\baselineskip

<150> DE 100 22 304

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-05-08

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> Patente In.Ver.2.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia sintética

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia sintética: sonda de oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accagcccct gataccct

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia sintética

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia sintética: sonda de oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctcgacctc aagaacag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia sintética

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia sintética: sonda de oligonucleótido

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgcctccc gtaggagt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia sintética

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia sintética: sonda de oligonucleótido

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

tcacggactt caggcgtt

\hfill

18

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<210> 5

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia sintética

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia sintética: sonda de oligonucleótido

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<400> 5

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcgacttgc atgcattagg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

Claims

1. Equipo para la detección de microorganismos en una muestra mediante una sonda de ácido nucleico, que comprende un recipiente (recipiente AIO) que contiene un filtro, un recipiente de recogida en el que se puede introducir el recipiente AIO, al menos una sonda de ácido nucleico para la detección específica de un microorganismo, así como dado el caso al menos una sonda de ácido nucleico para la realización de un control negativo y, dado el caso, un tampón de hibridación, en el que se pueden realizar los pasos siguientes en el recipiente AIO:

a): fijar sobre un soporte los microorganismos contenidos en la muestra;

c): eliminar las moléculas sonda de ácido nucleico no hibridadas; y

d): liberar las moléculas sonda de ácido nucleico hibridadas.

2. Equipo según la reivindicación 1, en el que el filtro es de celulosa regenerada.

3. Equipo según la reivindicación 1 ó 2, en el que el filtro se puede extraer del recipiente.

4. Equipo según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el recipiente AIO y/o el recipiente de recogida se pueden cerrar.

5. Equipo según una de las reivindicaciones precedentes, que comprende al menos los ácidos nucleicos 5'-TCACGGACTTCAGGCGTT-3' y/o 5'-TGCGACTTGCATGCATTAGG-3' como sondas específicas para la detección de bacterias filamentosas del grupo de las bacterias verdes, que no contienen azufre, al menos un ácido nucleico 5'-ACCAGCCCCTGATACCCT-3' como sonda específica para la detección de bacterias del tipo Nostocoida limicola y/o al menos el ácido nucleico 5'-TCTCGACCTCAAGAACAG-3' como sonda específica para la detección de bacterias filamentosas del tipo Rhodobacter sphaeroides.

6. Procedimiento para la detección de microorganismos en una muestra mediante una sonda de ácido nucleico, que comprende los pasos siguientes:

a): fijar sobre un filtro los microorganismos contenidos en la muestra;

b): incubar sobre el filtro los microorganismos fijados con moléculas sonda de ácido nucleico detectables;

c): eliminar las moléculas sonda de ácido nucleico no hibridadas; y

d1): identificar las moléculas sonda de ácido nucleico hibridadas y/o

d2): liberar y cuantificar las moléculas sonda de ácido nucleico liberadas, realizándose al menos los pasos b) y c), así como la liberación en el paso d2) en un recipiente (recipiente AIO) que contiene el filtro e introduciéndose el recipiente al menos en los pasos c) y d2) en un recipiente de recogida.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el paso a) también se realiza en el recipiente AIO.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 ó 7, en el que el filtro es de celulosa regenerada.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 8, en el que se extrae el filtro para la identificación de las moléculas sonda de ácido nucleico hibridadas.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 9, en el que para la realización del paso d2) las moléculas sonda de ácido nucleico liberadas se recogen en el recipiente de recogida.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 10, en el que la liberación de las moléculas sonda de ácido nucleico hibridadas se realiza sin el empleo de formamida.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 11, en el que la disolución de liberación usada en el paso d2) se selecciona del grupo compuesto por agua, agua tamponada, DMSO y SSC.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la disolución de liberación es 0,001-1,0 mol/l Tris/HCl, pH 9,0 +/- 2,0.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la disolución de liberación es 0,01 mol/l Tris/HCl, pH 9,0 +/- 2,0.

15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 14, en el que el paso d2) se realiza a una temperatura de 50-100ºC.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que el paso d2) se realiza a una temperatura por debajo de 100ºC.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que el paso d2) se realiza a una temperatura de aproximadamente 80ºC.

18. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 17, en el que la sonda de ácido nucleico es complementaria a un ADN cromosómico o episómico, un ARNm o ARNr de un microorganismo que se tiene que detectar.

19. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 18, en el que la sonda de ácido nucleico se une de forma covalente con un marcador detectable.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que el marcador detectable se selecciona del grupo de los siguientes marcadores:

- marcador fluorescente,

- marcador quimioluminiscente,

- marcador radioactivo,

- grupo activo enzimáticamente,

- hapteno,

- ácido nucleico detectable mediante hibridación.

21. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 20, en el que el microorganismo es un microorganismo unicelular.

22. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 21, en el que el microorganismo es una levadura, una bacteria, un alga o un hongo.

23. Procedimiento según la reivindicación 22, en el que el microorganismo es una bacteria filamentosa del grupo de las bacterias verdes que no contienen azufre, una bacteria del tipo Nostocoida limicola o una bacteria filamentosa del tipo Rhodobacter sphaeroides.

24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 23, en el que la muestra se extrae de una muestra ambiental de agua, suelo o aire.

25. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 23, en el que la muestra es una muestra de alimentos.

26. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que la muestra se extrae de leche o productos lácteos, agua potable, bebidas, productos de pastelería o productos cárnicos.

27. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 23, en el que la muestra es una muestra médica.

28. Procedimiento según la reivindicación 27, en el que la muestra se obtiene de tejidos, secreciones o deposiciones.

29. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 23, en el que la muestra se obtiene de aguas residuales.

30. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que la muestra se obtiene de fango activado, fango no activado o fango anaerobio.

31. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 23, en el que la muestra se obtiene de una biopelícula.

32. Procedimiento según la reivindicación 31, en el que la biopelícula se obtiene de una instalación industrial, que se formó en la depuración de aguas residuales o es una biopelícula natural.

33. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 23, en el que la muestra se obtiene de un producto farmacéutico o cosmético.

34. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 33, en el que el procedimiento se realiza de forma automatizable en formato de micro-título.