DE10128400A1

DE10128400A1 - Verfahren zum spezifischen Schnellnachweis fadenförmiger Bakterien

Info

Publication number: DE10128400A1
Application number: DE10128400A
Authority: DE
Inventors: Jiri Snaidr; Claudia Beimfohr
Original assignee: Vermicon AG
Current assignee: Vermicon AG
Priority date: 2001-06-12
Filing date: 2001-06-12
Publication date: 2002-12-19
Also published as: EP1412521A2; WO2002101089A2; CA2450752A1; US20040203029A1; WO2002101089A3; JP2004533252A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum spezifischen Schnellnachweis fadenförmiger Bakterien, z. B. in Belebtschlammproben, durch in situ-Hybridisierung, für das Verfahren geeignete Oligonukleotidsonden sowie Kits, mit denen das Nachweisverfahren durchgeführt werden kann.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum spezifischen Schnellnachweis fadenförmiger Bakterien, z. B. in Belebtschlammproben, durch in situ-Hybridisierung, für das Verfahren geeignete Oligonukleotidsonden, sowie Kits, mit denen das Nachweisverfahren durchgeführt werden kann.

Die biologische Abwasserreinigung hat sich seit ihrer Einführung zu Beginn dieses Jahrhunderts (1913) zu einer Schlüsseltechnologie im Umweltschutzbereich entwickelt. Im Zuge der seitdem kontinuierlich gestiegenen Anforderungen an den Gewässerschutz und den damit einhergehenden Verschärfungen der gesetzlichen Grenzwerte für das Ablaufwasser von Kläranlagen werden nun immer höhere Anforderungen an die Effektivität dieses Verfahrens gestellt. So fordert heute der Gesetzgeber, ausgelöst durch das Algenmassenwachstum und Robbensterben in Nord- und Ostsee im Frühsommer 1988, im Rahmen der bundesweit geltenden Rahmen-Abwasservorschrift vom 01. 01. 1990 weitergehende Reinigungs maßnahmen zur gezielten Reduktion von N- und P- Verbindungen.

Die (vorhandene oder fehlende) Wirksamkeit des Belebtschlammverfahrens bei der Abwasserreinigung ist untrennbar mit der Zusammensetzung der aktiven Bakterienzönose des Belebtschlammes einer Kläranlage verbunden. Um nur ein Beispiel zu nennen: fadenförmige Bakterien beeinflussen maßgeblich die Absetzeigenschaften der Biomasse im Nachklärbecken und damit direkt die Funktionsfähigkeit einer Kläranlage. Bei Anwesenheit und insbesondere bei Massenwachstum einer Reihe unterschiedlicher fadenförmiger Bakterien kommt es zur Oberflächenvergrößerung der Belebtschlammflocken, welche schließlich zu Bläh- und Schwimmschlamm führt. Als Folge kann das gereinigte Wasser nicht länger physikalisch von den Bakterien des Belebtschlammes abgetrennt werden. Eine bakteriologische Verunreini gung des Vorfluters und damit des an die Kläranlage angrenzenden Gewässers ist die Folge. Eine weitere durch fadenförmige Bakterien hervorgerufene Betriebsstörung ist die Bildung ausgeprägter Schaumfraktionen. Diese Schaumfraktionen werden leicht durch Wind abge tragen und tragen dann ebenfalls zu einer bakteriologischen Verunreinigung der Umwelt bei.

Bläh- und Schwimmschlamm sowie die beschriebene Schaumbildung stellen in nahezu der Hälfte aller Kläranlagen ein immer wieder auftretendes ernstzunehmendes Problem dar (Blackbeard et al., A survey of filamentous bulking and foaming in activated sludge plants in South Africa, 1986. Water Pollut. Contr., 85, 90-100), welches durch die Wahl geeigneter Verfahrens- und Prozessparameter verhindert bzw. eingedämmt werden soll. Für die effektive Steuerung des Reinigungsprozesses ist aber die möglichst genaue Kenntnis der Bakterien populationen des Belebtschlammes eine wesentliche Voraussetzung. Insbesondere ist es unabdingbar die problemverursachenden fadenförmigen Bakterien mit geeigneten Verfahren zuverlässig identifizieren zu können.

Unser Wissen über die Bakterien als die eigentlichen Protagonisten des Abwasserreinigungs prozesses ist bis heute sehr beschränkt. Man spricht daher häufig von der Black Box der Abwasserreinigung. Der Hauptgrund für die fehlenden Kenntnisse in diesem Bereich liegt darin, dass für die Untersuchung der Bakterienpopulationen des Belebtschlammes früher zumeist klassische Kultivierungsverfahren verwendet wurden. Da aber trotz optimierter Medien und Kultivierungsverfahren nur 1-15% der in der Probe vorhandenen Bakterien als Reinkultur erhalten werden können (Wagner et al., 1993, Probing activated sludge with proteobacteria-specific oligonucleotides: inadequacy of culture-dependent methods for describing microbial community structure, Appl. Environ. Microbiol., 59, 1520-1525), bleiben bei dieser Art des Nachweisverfahrens bis zu 99% der im Abwasser enthaltenen Bakterien unerkannt. Als Alternative für den Nachweis dieser nicht kultivierbaren Bakterien standen lange Zeit lediglich einfache Verfahren, wie beispielsweise die Gram- und Neisser färbung zur Verfügung. Die Charakterisierung von Bakterien des Belebtschlammes aufgrund ihrer Morphologie und ihres Färbeverhaltens führt aber immer wieder zu Fehlinterpretationen. Dies beruht darauf, dass z. B. unter den fadenförmige Bakterien zahlreiche Spezies eine äußerst variable Morphologie besitzen (von Veen et al., 1973. Bacteriology of activated sludge, in particular the filamentous bacteria, Antonie von Leeuwenhoek, 39, 189-205; Mulder and Deinema, 1992, The sheathed bacteria, In: The Procaryotes, Springer Verlag, New York) und ein ebenso variables Verhalten bei der Gram- sowie der Neisserfärbung (Eikelboom and von Buijsen, 1992, Handbuch für die mikroskopische Schlammuntersuchung, Hirthammer, München) zeigen. Eine fehlerfreie Identifizierung dieser Bakterien ist somit nahezu ausgeschlossen.

Als logische Konsequenz aus den Schwierigkeiten, welche die traditionellen Verfahren mit dem Nachweis fadenförmiger Bakterien in Belebtschlammproben haben, bieten sich daher alternative Nachweisverfahren auf molekularbiologischer Basis an.

Bei der PCR, der Polymerase-Kettenreaktion, wird mit spezifischen Primern ein charakte ristisches Stück des jeweiligen Bakteriengenoms amplifiziert. Findet der Primer seine Zielstelle, so kommt es zu einer millionenfachen Vermehrung eines Stücks der Erbsubstanz. Bei der anschließenden Analyse, z. B. mittels eines DNA-Fragmente auftrennenden Agarose- Gels kann eine qualitative Bewertung stattfinden. Im einfachsten Fall führt dies zu der Aussage, dass die Zielstellen für die verwendeten Primer in der untersuchten Probe vorhanden waren. Weitere Aussagen sind nicht möglich; diese Zielstellen können sowohl von einem lebenden Bakterium, als auch von einem toten Bakterium oder von nackter DNA stammen. Eine Differenzierung ist hier nicht möglich. Allerdings können diverse im Belebtschlamm vorhandene Stoffe eine Inhibierung des DNA amplifizierenden Enzyms, der Taq-Polymerase, herbeiführen. Dies ist eine häufige Ursache falsch negativer Ergebnisse. Eine Weiterführung der PCR-Technik stellt die quantitative PCR dar, bei der versucht wird, eine Korrelation zwischen Menge an vorhandenen Bakterien und der Menge an amplifizierter DNA herzu stellen. Vorteile der PCR liegen in ihrer hohen Spezifität, leichten Anwendbarkeit und im geringen Zeitaufwand. Wesentliche Nachteile sind ihre hohe Anfälligkeit für Kontamina tionen und damit falsch positive Ergebnisse sowie die bereits erwähnte fehlende Möglichkeit zwischen lebenden und toten Zellen bzw. nackter DNA zu unterscheiden und schließlich die Gefahr falsch negativer Ergebnisse infolge der Anwesenheit inhibitorischer Substanzen.

Auch biochemische Parameter werden zur Bakterienidentifizierung verwendet: So dient die Erstellung von Bakterienprofilen auf der Basis von Quinonbestimmungen dazu, ein möglichst verzerrungsfreies Bild der Bakterienpopulation wiederzugeben (Hiraishi, A. 1988. Respiratory quinone profiles as tools for identifying differnet bacterial populations in activated sludge. J. Gen. Appl. Microbiol. 34: 39-56). Doch auch diese Methode ist von der Kultivierung einzelner Bakterien abhängig, da zur Erstellung der Referenzdatenbank die Quinonprofile der Bakterien in Reinkultur benötigt werden. Überdies vermag die Bestim mung der Bakterienquinonprofile auch keinen wirklichen Eindruck davon zu vermitteln, welche tatsächlichen Populationsverhältnisse in der Probe vorliegen.

Die Detektion der Bakterien mit Antikörpern ist im Unterschied hierzu eine direktere Methode (Brigmon, R. L., G. Bitton, S. G. Zam, and B. O'Brien. 1995. Development and application of a monoclonal antibody against Thiothrix spp. Appl. Environ. Microbiol. 61: 13-20). Fluoreszenzmarkierte Antikörper werden mit der Probe vermengt und erlauben ein hochspezifisches Anheften an die bakteriellen Antigene. Im Epifluoreszenz-Mikroskop werden die Bakterien anhand ihrer emittierten Fluoreszenz anschließend detektiert. Auf diese Weise können Bakterien bis auf Stammebene identifiziert werden. Drei entscheidende Nachteile schränken aber die Anwendbarkeit dieser Methode empfindlich ein: Erstens werden für die Herstellung der Antikörper wiederum Reinkulturen benötigt. Zweitens bereitet der oftmals großvolumige und sperrige Antikörper-Fluoreszenzmolekülkomplex Probleme beim Eindringen in die Zielzellen. Drittens ist die Detektion oftmals zu spezifisch. Die in der Produktion teuren Antikörper detektieren spezifisch oft nur einen bestimmten Bakterien stamm, lassen aber andere Stämme der gleichen Bakterienart unentdeckt. Oft ist aber er keine stammspezifische Detektion der Bakterien notwendig, sondern vielmehr die Detektion einer Bakterienart oder einer ganzen Bakteriengruppe. Viertens ist die Produktion der Antikörper ein relativ langwieriger und teurer Vorgang.

Einen einzigartigen Ansatz, die Spezifität der molekularbiologischen Methoden wie der PCR mit der Möglichkeit der Bakterienvisualisierung, wie sie die Antikörper-Methode ermöglicht, zu verbinden, ohne die Nachteile der jeweiligen Methoden in Kauf nehmen zu müssen, bietet die Methode der Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH; Amann, R. L, W. Ludwig und K.-H. Schleifer, 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbial. Rev. 59, S. 143-169). Hierbei können Bakterienarten, -gattungen oder -gruppen hochspezifisch identifiziert und visualisiert und bei Bedarf auch exakt quantifiziert werden.

Die FISH-Technik basiert auf der Tatsache, dass es in Bakterienzellen bestimmte Moleküle gibt, die aufgrund ihrer lebenswichtigen Funktion im Laufe der Evolution nur wenig mutiert wurden: Die 16S und die 23S ribosomale Ribonukleinsäure (rRNS). Beide sind Bestandteile der Ribosomen, den Orten der Proteinbiosynthese, und können aufgrund ihrer ubiquitären Verbreitung, ihrer Größe, und ihrer strukturellen und funktionellen Konstanz als spezifische Marker dienen (Woese, C. R., 1987. Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51, S. 221-271).

Ausgehend von einer vergleichenden Sequenzanalyse können phylogenetische Beziehungen allein aufgrund dieser Daten aufgestellt werden. Dazu müssen diese Sequenzdaten in ein Alignment gebracht werden. Im Alignment, welches sich auf Kenntnisse über die Sekundärstruktur und Tertiärstruktur dieser Makromoleküle stützt, werden die homologen Positionen der ribosomalen Nukleinsäuren in Einklang miteinander gebracht.

Ausgehend von diesen Daten können phylogenetische Berechnungen durchgeführt werden. Der Einsatz modernster Computertechnologie macht es möglich, auch großangelegte Berechnungen schnell und effektiv auszuführen, sowie große Datenbanken, welche die Alignment-Sequenzen der 16S-rRNA und 23S-rRNA beinhalten, anzulegen. Durch den schnellen Zugriff auf dieses Datenmaterial können neu erhaltene Sequenzen in kurzer Zeit phylogenetisch analysiert werden. Diese rRNA Datenbanken können dazu verwendet werden, art- und gattungsspezifische Gensonden zu konstruieren. Hierbei werden alle verfügbaren rRNA Sequenzen miteinander verglichen und für bestimmte Sequenzstellen Sonden entworfen, die spezifisch eine Bakterienart, -gattung oder -gruppe erfassen.

Bei der FISH (Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung)-Technik werden diese Gensonden, die zu einer bestimmten Region auf der ribosomalen Zielsequenz komplementär sind, in die Zelle geschleust. Die Gensonden sind i. d. R. kleine, 16-20 Basen lange, einzelsträngige Desoxy ribonukleinsäurestücke und richten sich gegen eine Zielregion, welche typisch für eine Bakterienart oder eine Bakteriengruppe ist. Findet die fluoreszenzmarkierte Gensonde in einer Bakterienzelle ihre Zielsequenz, so bindet sie daran und die Zellen können aufgrund ihrer Fluoreszenz im Fluoreszenzmikroskop detektiert werden.

Wie weiter oben bereits angedeutet, liefern kultivierungsabhängige Verfahren nur einen sehr verfälschten Einblick in die Zusammensetzung und Dynamik der mikrobiellen Biozönose. Durch die FISH-Technik konnte gezeigt werden, dass es z. B. bei der Erfassung der Belebt schlammflora durch Kultivierung zu einem Kultivierungsshift kommt (Wagner, M., R. Amann, H. Lemmer, and K. H. Schleifer. 1993. Probing activated sludge with oligonucleo tides specific for proteobacteria: inadequacy of culture-dependent methods for describing microbial community structure. Appl. Environ. Microbiol. 59: 1520-1525).

Durch diese mediumabhängige Verzerrung der realen Verhältnisse innerhalb der Bakterien population werden Bakterien, die im Belebtschlamm eine untergeordnete Rolle spielen, aber den verwendeten Kultivierungsbedingungen gut angepasst sind, in ihrer Bedeutung dramatisch überschätzt. So konnte gezeigt werden, dass aufgrund eines solchen Kultivie rungsartefaktes die Bakteriengattung Acinetobacter bezüglich ihrer Rolle als biologischer Phosphatentferner in der Abwasserreinigung völlig falsch eingeschätzt wurde. Als Folge solcher Fehlbewertungen entstehen kostenintensive, fehlerbehaftete bzw. unpräzise Modellierungen von Anlagen. Die Effizienz und Reproduzierbarkeit solcher Simulations berechnungen ist gering.

Die Vorteile der FISH-Technik gegenüber der Bakterienidentifizierung mittels Kultivierung sind vielfältig. Erstens können mit Gensonden sehr viel mehr Zellen detektiert werden. Während durch die Kultivierung maximal nur 15% der Bakterienpopulation einer Probe sichtbar gemacht werden können, erlaubt die FISH-Technik in vielen Proben eine Detektion bis zu 100% der Bakteriengesamtpopulation. Zweitens kann der aktive Anteil einer Popula tion durch das Verhältnis der gegen alle Bakterien gerichteten Sonde und einer unspezifischen Zellfärbung bestimmt werden. Drittens werden die Bakterien direkt am Ort ihres Wirkens (in situ) sichtbar gemacht. Mögliche Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Bakterienpopu lationen können so erkannt und analysiert werden. Viertens ist die Detektion von Bakterien mittels der FISH-Technik sehr viel schneller als mittels Kultivierung. Benötigt die Identifizie rung von Bakterien mittels Kultivierung, sofern sie überhaupt möglich ist, i. d. R. mehrere Tage, so vergehen von der Probennahme bis zur Bakterienidentifizierung sogar auf Artebene mittels der FISH-Technik nur wenige Stunden. Fünftens können Gensonden in ihrer Spezifität fast beliebig frei gewählt werden. Einzelne Arten können genauso gut mit einer Sonde erfasst werden, wie ganze Gattungen oder Bakteriengruppen. Sechstens können Bakterienarten oder ganze Bakterienpopulationen direkt in der Probe exakt quantifiziert werden. Der Umweg über eine Kultivierung und eine damit verbundene nur unzureichende Quantifizierung muss nicht gegangen werden.

Auch den traditionellen Färbeverfahren (Gram- und Neisserfärbung) erweist sich die FISH- Technik als deutlich überlegen. Insbesondere der Versuch einer Charakterisierung fadenför miger Bakterien aus industriellen Kläranlagen mittels dieser traditionellen Verfahren muss als gescheitert angesehen werden. Zahlreiche Bakterien wurden hier beispielsweise aufgrund ihrer Morphologie und ihres Färbeverhaltens zunächst der Spezies Nostocoida limicola Typ II zugeordnet. Hierbei handelt es sich um gram-positive Bakterien mit einem hohen G+C- Verhältnis ihrer DNA (Blackall et al., 2000, "Candidatus Nostocoida limicola", a filamentous bacterium from activated sludge, Int. J. Syst. Evolut. Microbiol. 50, 703-709).

Die Analyse dieser fadenförmigen Bakterien mit der FISH-Technik ergab dagegen, dass die meisten dieser Bakterien nichts mit den als Nostocoida limicola Typ II bezeichneten Filamenten gemein haben. In den meisten Fällen gehörten die fälschlich als Nostocoida limicola identifizierten Filamente aus industriellen Kläranlagen zur Alpha-Subklasse der Proteobacteria.

Die FISH-Technik ist demnach ein überragendes Werkzeug, um Bakterien schnell und äußerst spezifisch direkt in einer Probe nachzuweisen. Sie ist im Gegensatz zu Kultivie rungsverfahren eine direkte Methode und erlaubt gegenüber anderen modernen Verfahren nicht nur die Visualisierung der Bakterien, sondern darüber hinaus auch deren exakte Quantifizierung.

Die FISH-Analyse wird grundsätzlich auf einem Objektträger durchgeführt, da bei der Aus wertung die Bakterien durch Bestrahlung mit einem hochenergetischen Licht visualisiert, also sichtbar gemacht werden.

Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum spezifischen Schnellnachweis fadenförmiger Bakterien z. B. in Belebtschlammproben umfasst somit die folgenden Schritte:

- Fixierung der in der Probe enthaltenen Bakterien,
- Inkubation der fixierten Bakterien mit Nukleinsäuresondenmolekülen, um eine Hybridisierung herbeizuführen,
- Entfernen bzw. Abwaschen der nicht hybridisierten Nukleinsäuresondenmoleküle, und
- Detektieren der mit den Nukleinsäuresondenmolekülen hybridisierten Bakterien.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter "Fixieren" der Bakterien eine Behandlung verstanden, mit der die Bakterienhülle für Nukleinsäuresonden durchlässig gemacht wird. Zur Fixierung wird üblicherweise Ethanol verwendet. Kann die Zellwand mit diesen Maßnahmen nicht von den Nukleinsäuresonden penetriert werden, so sind dem Fachmann ausreichend weitere Maßnahmen bekannt, die zu demselben Ergebnis führen. Dazu zählen beispielsweise Methanol, Mischungen von Alkoholen, eine niederprozentige Paraformaldehydlösung oder eine verdünnte Formaldehydlösung oder ähnliches. Es können sich enzymatische Schritte zum vollständigen Aufschluss der Bakterien anschließen. Als Enzyme sind hier beispielsweise zu nennen Lysozym, Proteinase K und Mutanolysin. Dem Fachmann sind hier ausreichend geeignete Verfahren bekannt und er wird auf einfache Weise feststellen können, welches Mittel für den Zellaufschluß je nach Bakterium besonders gut geeignet ist.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden für die "Hybridisierung" die fixierten Bakterien mit fluoreszenzmarkierten Nukleinsäuresonden inkubiert. Diese Nukleinsäure sonden, die aus einem Oligonukleotid und einem daran gebundenen Marker bestehen, können dann die Zellhülle penetrieren und sich an die der Nukleinsäuresonde entsprechenden Zielsequenz im Zellinneren binden. Die Bindung ist als Ausbildung von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Nukleinsäurestücken zu verstehen.

Die Nukleinsäuresonde kann dabei komplementär zu einer chromosomalen oder episomalen DNA sein, aber auch zu einer mRNA oder rRNA des nachzuweisenden Mikroorganismus. Von Vorteil ist es, eine Nukleinsäuresonde zu wählen, die zu einem Bereich komplementär ist, der in einer Kopiezahl von mehr als 1 im nachzuweisenden Mikroorganismus vorliegt. Die nachzuweisende Sequenz liegt bevorzugt 500-100 000 mal pro Zelle vor, besonders bevorzugt 1000-50 000 mal. Aus diesem Grunde wird bevorzugt die rRNA als Zielstelle verwendet, da die Ribosomen in der Zelle als Orte der Proteinbiosynthese vieltausendfach in jeder aktiven Zelle vorliegen.

Bei der Nukleinsäuresonde im Sinne der Erfindung kann es sich um eine DNA- oder RNA- Sonde handeln, die in der Regel zwischen 12 und 1000 Nukleotide umfassen wird, bevorzugt zwischen 12 und 50, besonders bevorzugt zwischen 17 und 25 Nukleotide. Die Auswahl der Nukleinsäuresonden geschieht nach den Gesichtspunkten, ob eine komplementäre Sequenz in dem nachzuweisenden Mikroorganismus vorliegt. Durch diese Auswahl einer definierten Sequenz, kann dadurch eine Bakterienart, eine Bakteriengattung oder eine ganze Bakterien gruppe erfasst werden. Komplementarität sollte bei einer Sonde von 15 Nukleotiden über 100% der Sequenz gegeben sein. Bei Oligonukleotiden mit mehr als 15 Nukleotiden sind ein bis mehrere Fehlpaarungsstellen erlaubt.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis der nachfolgend benannten fadenförmigen Bakterien: 021 N Kanagawa group I, 021N Kanagawa group II, 021N Kanagawa group III, 021N like from BIO33 EU21, Alisphaera europaea EU24 Nostocoida limicola-like, Alisphaera (europaea, PPx3, MC2), Alisphaera MC2 MACOBS-Clone 2 (BIO36), Bactothrix amylovora (EU3, EU4, EU8, EU9, EU11), Chloroflexus aurantiacus, Curtunema variabilis (Type 0041), Cytophaga, EPT5 australian 021N isolate (EU21), EPT5 australian 021N isolate, EU23 from SAN3, Flexibacter, Herpetosiphon, Herpetosiphon aurantiacus, Leptothrix discophora, Megathrix sidereus EU26 Nostocoida/021N-like, Megathrix tenacis (EU12, EU5, EU6, EU15, EU13, EU14), Nostocoida limicola (EU24), Nostocoida limicola-like Rhodobacter sphaeroides next relative, Thiothrix (021N-Gruppe und EU1, EU2, EU10), Thiothrix ramosa, Type 0411 (CF), Type 0803 haben die erfindungs gemäßen Nukleinsondenmoleküle die folgenden Längen und Sequenzen (alle Nukleinsonden moleküle sind in 5'-3'-Richtung notiert):

Sequenz 5'-3'

wobei "S" für "G+C" steht.

Gegenstand der Erfindung sind auch Abwandlungen der obigen Oligonukleotidsequenzen. Hierunter fallen insbesondere

a) Nukleinsäuremoleküle, die (i) mit einer der obigen Oligonukleotidsequenzen (SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 42) in mindestens 60%, bevorzugt in mindestens 80%, bevor zugter in mindestens 90% und besonders bevorzugt in mindestens 92, 94, 96%, der Basen übereinstimmen oder (ii) sich von obigen Oligonukleotidsequenzen durch eine Deletion und/oder Addition unterscheiden, und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von fadenförmigen Bakterien ermöglichen. Dabei bedeutet "spezifische Hybridisierung", daß unter den hier beschriebenen oder den dem Durchschnittsfachmann im Zusammenhang mit in situ-Hybridisierungstechniken bekannten Hybridisierungsbedingungen nur die ribosomale RNA der Ziel- Organismen, nicht aber die rRNA von Nicht-Ziel-Organismen an das Oligonukleotid bindet.
b) Nukleinsäuremoleküle, die mit den unter a) genannten Nukleinsäuremolekülen oder einer der Sonden SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 42 unter stringenten Bedingungen hybridisieren.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresondenmoleküle können im Rahmen des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens mit verschiedenen Hybridisierungslösungen eingesetzt werden. Verschiedene organische Lösungsmittel können hierbei in Konzentrationen von 0-80% eingesetzt werden. Durch das Einhalten von stringenten Hybridisierungsbedingungen wird gewährleistet, dass das Nukleinsäuresondenmolekül auch tatsächlich mit der Zielsequenz hybridisiert. Moderate Bedingungen im Sinne der Erfindung sind z. B. 0% Formamid in einem Hybridisierungspuffer wie er nachfolgend beschrieben ist. Stringente Bedingungen im Sinne der Erfindung sind beispielsweise 20-80% Formamid im Hybridisierungspuffer.

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält eine typische Hybridisierungslösung 35% Formamid und hat eine Salzkonzentration von 0,1 M bis 1,5 M, bevorzugt von 0,9 M, wobei es sich bei dem Salz vorzugsweise um Natriumchlorid handelt. Weiter umfasst die Hybridisierungslösung üblicherweise ein Detergens, wie z. B. Natriumdodecylsulfat (SDS), in einer Konzentration von 0,001% bis 0,2%, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,01%. Zum Puffern der Hybridisierungslösung können verschiedene Verbindungen wie Tris-HCl, Natrium-Citrat, PIPES oder HEPES verwendet werden, die üblicherweise Konzentrationen von 0,01-0,1 M eingesetzt werden, in einem pH-Wert-Bereich von 6,0-9,0. Die bevorzugte erfindungsgemäße Ausführung der Hybridisierungslösung beinhaltet 0,02 M Tris-HCl, pH 8,0.

Die Konzentration der Nukleinsäuresonde im Hybridisierungspuffer ist abhängig von der Art ihrer Markierung und der Anzahl der Zielstrukturen. Um eine schnelle und effiziente Hybridisierung zu ermöglichen, sollte die Anzahl der Nukleinsäuresondenmoleküle die Anzahl der Zielstrukturen um mehrere Größenordnungen überschreiten. Allerdings ist bei der Fluoreszenz in situ-Hybridisierung (FISH) darauf zu achten, dass eine zu hohe Menge an fluoreszenzmarkierten Nukleinsäuresondenmolekülen zu erhöhter Hintergrundfluoreszenz führt. Die Konzentration der Nukleinsäuresondenmoleküle sollte deshalb in einem Bereich zwischen 0,5-500 ng/µl liegen. Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugte Konzentration beträgt 1-10 ng jedes verwendeten Nukleinsäuresondenmoleküls pro µl Hybridisierungslösung. Das verwendete Volumen der Hybridisierungslösung sollte zwischen 8 µl und 100 ml liegen, bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt es 40 µl.

Die Dauer der Hybridisierung beträgt üblicherweise zwischen zehn Minuten und zwölf Stunden; bevorzugt erfolgt die Hybridisierung für etwa 1,5 Stunden. Die Hybridisierungs temperatur beträgt bevorzugt zwischen 44°C und 48°C, besonders bevorzugt 46°C, wobei der Parameter der Hybridisierungstemperatur, wie auch die Konzentration an Salzen und Detergenzien in der Hybridisierungslösung in Abhängigkeit von den Nukleinsäuresonden, insbesondere deren Längen und dem Grad der Komplementarität zur Zielsequenz in der nachzuweisenden Zelle optimiert werden kann. Der Fachmann ist mit hier einschlägigen Berechnungen vertraut. Bei den oben beschriebenen Bedingungen handelt es sich um stringente Hybridisierungsbedingungen.

Nach erfolgter Hybridisierung sollen die nicht hybridisierten und überschüssigen Nuklein säuresondenmoleküle entfernt bzw. abgewaschen werden, was üblicherweise mittels einer herkömmlichen Waschlösung erfolgt. Diese Waschlösung kann, falls gewünscht, 0,001-0,1% eines Detergens wie SDS, wobei eine Konzentration von 0,01% bevorzugt wird, sowie Tris- HCl in einer Konzentration von 0,001-0,1 M, bevorzugt 0,02 M, enthalten, wobei der pH- Wert von Tris-HCl im Bereich von 6,0 bis 9,0, vorzugsweise bei 8,0 liegt. Ein Detergens kann enthalten sein, ist aber nicht zwingend erforderlich. Weiter enthält die Waschlösung üb licherweise NaCl, wobei die Konzentration je nach benötigter Stringenz von 0,003 M bis 0,9 M, bevorzugt von 0,01 M bis 0,9 M, beträgt. Besonders bevorzugt ist eine NaCl- Konzentration von 0,07 M. Des weiteren kann die Waschlösung EDTA enthalten, wobei die Konzentration vorzugsweise 0,005 M beträgt. Ferner kann die Waschlösung auch dem Fachmann geläufige Konservierungsmittel in geeigneten Mengen enthalten.

Das "Abwaschen" der nicht gebundenen Nukleinsäuresondenmoleküle erfolgt üblicherweise bei einer Temperatur im Bereich von 44°C bis 52°C, bevorzugt von 44°C bis 50°C und besonders bevorzugt bei 46°C für eine Dauer von 10-40 Minuten, vorzugsweise für 15 Minuten.

Die spezifisch hybridisierten Nukleinsäuresondenmoleküle können anschließend in den jeweiligen Zellen detektiert werden. Voraussetzung hierfür ist, dass das Nukleinsäuresonden molekül nachweisbar ist, z. B. dadurch dass das Nukleinsäuresondenmolekül durch kovalente Bindung mit einen Marker verknüpft ist. Als detektierbare Marker werden z. B. fluoreszie rende Gruppen wie z. B. CY2 (erhältlich von Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, USA), CY3 (ebenfalls erhältlich von Amersham Life Sciences), CY5 (ebenfalls zu beziehen von Amersham Life Sciences), FITC (Molecular Probes Inc., Eugene, USA), FLUOS (erhältlich von Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland), TRITC (erhältlich von Molecular Probes Inc. Eugene, USA), 6FAM oder FLUOS-PRIME verwendet, die dem Fachmann alle wohlbekannt sind. Auch chemische Marker, radioaktive Marker oder enzymatische Marker wie Meerrettich-Peroxidase, saure Phosphatase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, können verwendet werden. Für jedes dieser Enzyme ist eine Reihe von Chromogenen bekannt, die anstelle des natürlichen Substrates umgesetzt werden können, und entweder zu farbigen oder zu fluoreszierenden Produkten umgesetzt werden können.

Beispiele für solche Chromogene sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben:

Tabelle

Enzyme
Chromogen
1. Alkalische Phosphatase und saure Phosphatase	4-Methylumbelliferylphosphat (Fluoreszenz), Bis(4-Methyiumbelliferylphosphat), (Fluoreszenz) 3-O-Methylfluoreszein, Flavon-3-Diphosphattriammoniumsalz (Fluoreszenz), p-Nitrophenylphosphatdinatriumsalz
2. Peroxidase	Tyraminhydrochlorid (Fluoreszenz), 3-(p-Hydroxyphenyl)-Propionsäure (Fluoreszenz), p-Hydroxyphenethylalkohol (Fluoreszenz), 2,2'-Azino-di-3-ethylbenzthiazolinsulfonsäure (ABTS), ortho-Phenylendiamindihydrochlorid, o-Dianisidin, 5-Aminosalicylsäure, p-Ucresol (Fluoreszenz), 3,3'-dimethyloxybenzidin, 3-Methyl-2-benzothiazolinhydrazon, Tetramethylbenzidin
3. Meerrettichperoxidase	H₂O₂ + Diammoniumbenzidin H₂O₂ + Tetramethylbenzidin
4. β-D-Galaktosidase	o-Nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid, 4-Methylumbelliferyl-β-D-galaktosid
5. Glukoseoxidase	ABTS, Glukose und Thiazolylblau

Schließlich ist es möglich, die Nukleinsäuresondenmoleküle so zu gestalten, dass an ihrem 5'- oder 3'-Ende eine weitere zur Hybridisierung geeignete Nukleinsäuresequenz vorhanden ist. Diese Nukleinsäuresequenz umfasst wiederum ca. 15 bis 1000, bevorzugt 15-50 Nukleo tide. Dieser zweite Nukleinsäurebereich kann wiederum von einem Nukleinsäuresonden molekül erkannt werden, welches durch eines der oben erwähnten Mittel nachweisbar ist.

Eine weitere Möglichkeit besteht in der Kopplung der nachweisbaren Nukleinsäuresonden moleküle mit einem Hapten, das anschließend mit einem das Hapten erkennenden Antikörper in Kontakt gebracht werden kann. Als Beispiel für solch ein Hapten kann Digoxigenin angeführt werden. Dem Fachmann sind über die angegebenen Beispiele auch noch weitere wohlbekannt.

Die abschließende Auswertung ist abhängig von der Art der Markierung der verwendeten Sonde möglich mit einem Lichtmikroskop, Epifluoreszenzmikroskop, Chemoluminometer, Fluorometer u. a.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht erstmals den eindeutigen und spezifischen Nachweis der weiter oben beschriebenen fadenförmigen Bakterien und somit erstmalig die Unterscheidung von Fäden, welche sich mit klassischen Verfahren (also etwa der morpholo gischen Charakterisierung oder der Gram- oder Neisser-Färbung) nicht voneinander unter scheiden lassen.

Ein wichtiger Vorteil des in dieser Anmeldung beschriebenen Verfahrens zum spezifischen Schnellnachweis fadenförmiger Bakterien z. B. in Belebtschlammproben gegenüber den weiter oben beschriebenen traditionellen Nachweismethoden ist die Schnelligkeit. Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt das Ergebnis innerhalb von drei Stunden vor.

Ein weiterer Vorteil liegt in der Spezifität dieses Verfahrens. Durch die verwendeten Nukleinsäuresondenmoleküle können sowohl spezifisch ganze Gattungen oder Gruppen als auch hochspezifisch einzelne Spezies innerhalb dieser Gattungen nachgewiesen und visualisiert werden. Durch die Visualisierung der Bakterien kann eine gleichzeitige visuelle Kontrolle stattfinden. Falsch positive Ergebnisse sind somit ausgeschlossen.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Möglichkeit des gleichzeitigen spezifischen Nachweises unterschiedlichster fadenförmiger Bakterien. Dies ist durch die Verwendung unterschiedlich markierter Nukleinsäuresondenmoleküle leicht und zuverlässig möglich.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der aufgrund der Visualisierung der Bakterien sich ergebenden Möglichkeit zur einfachen und exakten Quantifizierung der in einer Probe enthaltenen Bakterien.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der leichten Handhabbarkeit. So können durch die Verfahren leicht große Mengen an Proben auf das Vorhandensein der genannten Bakterien getestet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann vielfältig angewendet werden. Außer zur Analyse von Belebtschlammproben kann das Verfahren auch zur Analyse zahlreicher weiterer Umweltproben, die aus Luft, Wasser oder Boden entnommen sind, verwendet werden.

Erfindungsgemäß werden weiterhin Kits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Verfügung gestellt. Die in diesen Kits enthaltene Hybridisierungsanordnung ist z. B. in der deutschen Patentanmeldung 100 61 655.0 beschrieben. Auf die in diesem Dokument enthaltene Offenbarung bezüglich der in situ-Hybridisierungsanordnung wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.

Außer der beschriebenen Hybridisierungsanordnung (als VIT-Reactor bezeichnet) umfassen die Kits als wichtigsten Bestandteil die jeweilige Hybridisierungslösung mit den weiter oben beschriebenen für die nachzuweisenden Mikroorganismen spezifischen Nukleinsäuresonden molekülen (als VIT-Lösung bezeichnet). Weiterhin ist jeweils enthalten der entsprechende Hybridisierungspuffer (Solution C) und ein Konzentrat der entsprechenden Waschlösung (Solution D). Weiterhin sind enthalten gegebenenfalls Fixierungslösungen (Solution A und Solution B), zusätzliche Zellaufschlusslösungen (Breaker) sowie gegebenenfalls eine Einbettlösung (Finisher). Finisher sind im Handel erhältlich, sie verhindern u. a. das rasche Ausbleichen fluoreszierender Sonden unter dem Fluoreszenzmikroskop. Gegebenenfalls sind Lösungen zur parallelen Durchführung einer Positivkontrolle (Positive Control) sowie einer Negativkontrolle (Negative Control) enthalten.

Das folgende Beispiel soll die Erfindung erläutern, ohne sie einzuschränken:

Beispiel Spezifischer Schnellnachweis fadenförmiger Bakterien z. B. in Belebtschlammproben

Ein geeignetes Aliquot des zu untersuchenden Probenmaterials wird auf den Objektträger aufgebracht und getrocknet (46°C, 30 min oder bis vollständig trocken).

Anschließend werden die getrockneten Zellen schrittweise dehydratisiert.

Hierzu wird zunächst eine Fixierungslösung (Solution A (50% Ethanol), bevorzugt 40 µl) aufgebracht und der Objektträger erneut getrocknet (46°C, 30 min oder bis vollständig trocken).

Anschließend werden die getrockneten Zellen vollständig dehydratisiert durch Zusatz einer weiteren Fixierungslösung (Solution B (Ethanol absolut), bevorzugt 40 µl). Der Objektträger wird erneut getrocknet (Raumtemperatur, 3 min oder bis vollständig trocken). Zum vollständigen Zellaufschluss kann ein geeignetes Volumen einer hierfür geeigneten Enzymlösung (Breaker, bevorzugt 40 µl) auf den Objektträger aufgebracht werden. Der Objektträger wird anschließend inkubiert (10-30 min. 4-25°C).

Die Enzymlösung wird durch Eintauchen des Objektträgers in ein mit destilliertem Wasser gefülltes Gefäß, bevorzugt den VIT-Reactor, abgewaschen und der Objektträger anschließend in seitlicher Stellung getrocknet (46°C, 30 min oder bis vollständig trocken).

Anschließend wird auf die fixierten, dehydratisierten Zellen die Hybridisierungslösung (VIT- Lösung) mit den weiter oben beschriebenen für die jeweils nachzuweisenden Mikroorganis men spezifischen Nukleinsäuresondenmolekülen aufgebracht. Das bevorzugte Volumen beträgt 40 µl. Der Objektträger wird anschließend in einer mit Hybridisierungspuffer (Solution C, entspricht der Hybridisierungslösung ohne Oligonukleotid) befeuchteten Kammer, bevorzugt dem VIT-Reactor, inkubiert (46°C, 90 min).

Anschließend wird der Objektträger aus der Kammer, bevorzugt dem VIT-Reactor, entnommen, die Kammer, bevorzugt der VIT-Reactor, mit Waschlösung befüllt (Solution D, 1 : 10 verdünnt in destilliertem Wasser) und der Objektträger in dieser inkubiert (46°C, 15 min).

Anschließend wird der VIT-Reactor mit destilliertem Wasser befüllt, der Objektträger kurz eingetaucht und anschließend in seitlicher Stellung getrocknet (46°C, 30 min oder bis vollständig trocken).

Anschließend wird der Objektträger in einem geeigneten Medium (Finisher) eingebettet.

Abschließend wird die Probe mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops analysiert.

Sequenzprotokoll

sämtliche Sequenzen in 5' → 3'-Richtung)

Claims

1. Oligonukleotid, das eine Nukleotidsequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (jeweils in 5' → 3'-Richtung)

1. Oligonukleotiden, die mit den obigen Oligonukleotiden unter i) in mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 80% und besonders bevorzugt mindestens 90, 92, 94, 96%, übereinstimmen und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von fadenförmigen Bakterienzellen ermöglichen,
2. Oligonukleotiden, die sich von den obigen Oligonukleotiden unter i) durch eine Deletion und/oder Addition unterscheiden und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von fadenförmigen Bakterienzellen ermöglichen, und
3. Oligonukleotiden, die mit den vorgenannten Oligonukleotiden unter i), ii) und iii) unter stringenten Bedingungen hybridisieren.

2. Verfahren zum Nachweis von fadenförmigen Bakterien in einer Probe, umfassend die Schritte

a) Fixieren der in der Probe enthaltenen fadenförmigen Bakterien,
b) Inkubieren der fixierten Bakterien mit mindestens einem Oligonukleotid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus
- a) den Oligonukleotiden nach Anspruch 1,
- b) Oligonukleotiden, die mit den Oligonukleotiden nach Anspruch 1 in mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 80% und besonders bevorzugt mindestens 90, 92, 94, 96%, übereinstimmen und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von fadenförmigen Bakterienzellen ermöglichen,
- c) Oligonukleotiden, die sich von den Oligonukleotiden nach Anspruch 1 durch eine Deletion und/oder Addition unterscheiden und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von fadenförmigen Bakterienzellen ermöglichen, und
- d) Oligonukleotiden, die mit den vorgenannten Oligonukleotiden unter stringenten Bedingungen hybridisieren, um eine Hybridisierung herbeizuführen,
c) Entfernen nicht hybridisierter Oligonukleotide,
d) Detektieren und Visualisieren sowie gegebenenfalls Quantifizieren der fadenförmigen Bakterienzellen mit den hybridisierten Oligonukleotiden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Oligonukleotid mit einem detektierbaren Marker, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

a) Fluoreszenzmarker,
b) Chemolumineszenzmarker,
c) radioaktive Marker,
d) enzymatisch aktive Gruppen,
e) Hapten,
f) durch Hybridisierung nachweisbare Nukleinsäuren

gekoppelt ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Probe eine Belebtschlammprobe ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei das Detektieren mittels Epifluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie erfolgt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei es sich bei den fadenförmigen Bakterien um Bakterien folgender Bezeichnung handelt:
021N Kanagawa group I, 021N Kanagawa group II, 021N Kanagawa group III, 021N like from BIO33 EU21, Alisphaera europaea EU24 Nostocoida limicola-like, Alisphaera (europaea, PPx3, MC2), Alisphaera MC2 MACOBS-Clone 2 (BIO36), Bactothrix amylovora (EU3, EU4, EU8, EU9, EU11), Chloroflexus aurantiacus, Curtunema variabilis (Type 0041), Cytophaga, EPTS australian 021N isolate (EU21), EPTS australian 021N isolate, EU23 from SAN3, Flexibacter, Herpetosiphon, Herpetosiphon aurantiacus, Leptothrix discophora, Megathrix sidereus EU26 Nostocoida/021N-like, Megathrix tenacis (EU12, EU5, EU6, EU15, EU13, EU14), (EU1, EU2, EU10), Nostocoida limicola (EU24), Nostocoida limicola-like Rhodobacter sphaeroides next relative, Thiothrix 021N-Gruppe und EU1, EU2, EU10), Thiothrix ramosa, Type 0411 (CF), Type 0803.

7. Verwendung eines Oligonukleotids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus,

a) den Oligonukleotiden nach Anspruch 1,
b) Oligonukleotiden, die mit den Oligonukleotiden nach Anspruch 1 in mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 80% und besonders bevorzugt mindestens 90, 92, 94, 96%, übereinstimmen und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von fadenförmigen Bakterienzellen ermöglichen,
c) Oligonukleotiden, die sich von den Oligonukleotiden nach Anspruch 1 durch eine Deletion und/oder Addition unterscheiden und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von fadenförmigen Bakterienzellen ermöglichen, und
d) Oligonukleotiden, die mit den vorgenannten Oligonukleotiden unter stringenten Bedingungen hybridisieren,

zum Nachweis von fadenförmigen Bakterien in einer Probe.

8. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 2 bis 6, enthaltend mindestens ein Oligonukleotid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

a) den Oligonukleotiden nach Anspruch 1,
b) Oligonukleotiden, die mit den Oligonukleotiden nach Anspruch 1 in mindestens 60%, vorzugsweise mindestens 80% und besonders bevorzugt mindestens 90, 92, 94, 96%, übereinstimmen und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von fadenförmigen Bakterienzellen ermöglichen,
c) Oligonukleotiden, die sich von den Oligonukleotiden nach Anspruch 1 durch eine Deletion und/oder Addition unterscheiden und eine spezifische Hybridisierung mit Nukleinsäuresequenzen von fadenförmigen Bakterienzellen ermöglichen, und
d) Oligonukleotiden, die mit den vorgenannten Oligonukleotiden unter stringenten Bedingungen hybridisieren.

9. Kit nach Anspruch 8, in dem das mindestens eine Oligonukleotid in einer Hybridisierungslösung enthalten ist.

10. Kit nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, weiter enthaltend eine Waschlösung und gegebenenfalls eine oder mehrere Fixierungslösungen sowie gegebenenfalls eine Zellaufschluß- bzw. Enzymlösung.