CN101912768B - 吸附储存dna的介质和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种吸附储存DNA的介质和制备方法，吸附储存DNA的介质是用下述方法制成：(1)将阳离子聚合物溶解在质量浓度为0.1％-10％的酸的水溶液中或溶解在水中制成阳离子聚合物溶液；将TE缓冲液与十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，制成A溶液；(2)将滤纸浸没于阳离子聚合物溶液中，浸泡，取出，用蒸馏水清洗，再放入A溶液中浸泡，取出，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质，本发明使用了蛋白变性剂使其具有了抗菌活性。可以直接从吸附了生物样品的该固体介质上提取DNA或应用PCR法进行扩增，用于医学诊断，刑事现场取样，物证保存，亲子鉴定，生物样品的邮寄以及流行病学的检测等。
Description
技术领域
本发明属于生物载体制造领域，特别是涉及一种吸附储存生物样品中的DNA的介质和制备方法。
背景技术
在室温下对各种生物样品进行收集、储存、运输和纯化其核酸并进行PCR、SNP分析、STR分型以及限制酶解作用分析是目前在医学诊断、法医学鉴定、流行病学预防检测等领域常用的操作技术和方法。对于生物样品(特别是血液)中DNA的保存和运输通常需要冷藏，其设备昂贵，操作步骤也繁琐。更重要的是，由于没有有效的方法防止样品中的DNA遭到破坏，所以样品不能长期保存。此外，由于冷藏保存的生物样品中有一些细菌或病毒没被杀灭，对这些生物样品进行检测时，对检测操作人员也是不安全的。在一些偏远、经济落后的地区，病人血液样品不能及时被检测。因此，这些血液样品如何保存及安全地运输到检测设备齐全的单位进行检验也是一个现实问题。鉴于这些问题，澳大利亚人Burgoyne发明了“DNA储存的固体介质和方法”等一系列专利(US Pat 5,807,527；US Pat 5,976,572；US Pat5,972,386；US Pat.NO.5,497,562)，这些专利公开技术的核心内容是以一种吸附性的滤纸(例如美国Whatman 3MM滤纸或No.1滤纸)为基质，与一种弱碱(Tris)、一种螯合剂(EDTA)、一种阴离子去垢剂(SDS)和尿酸结合，形成具有碱性pH值的产品，它可以吸附生物样品，特别是血液样品。被吸附在该固体介质上的血液样品经过洗涤可以提取DNA或进行DNA扩增(PCR)。但我们在实验中发现，应用该发明制备的固体介质在使用过程中DNA出现大量丢失，因为血液样品或其他生物样品在进行PCR之前必须清洗掉杂质和污染物，这是生物样品提取DNA或进行DNA扩增必须的步骤。由于在洗涤该样品过程中大量的DNA被洗脱而损失掉，极大地影响了继续进行的DNA扩增过程。该发明中存在一个重要的问题是生物样品中的DNA是如何吸附在滤纸上？我们知道滤纸(包括美国Whatman 3M滤纸或No.1滤纸)的组成是纯棉纤维或木质纤维，这类纤维的表面动电层电位是负的，而DNA分子也是带负电的生物大分子，特别是在碱性条件下。因此DNA分子与构成滤纸的纤维素之间存在着静电排斥作用，该排斥力远远大于纤维素与DNA分子间的范德华力，使得在洗涤吸附有血液的固体介质时DNA大量丢失。而该专利中并未描述是否对该滤纸或纤维进行了改造或修饰。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供在常温下能过吸附储存DNA，为后续DNA的纯化和扩增提供足够数量模板的一种吸附储存DNA的介质。
本发明的第二个目的是提供一种吸附储存DNA的介质的制备方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种吸附储存DNA的介质，用下述方法制成：
(1)按质量比为1∶1000-10的比例，将阳离子聚合物溶解在质量浓度为0.1％-10％的酸的水溶液中或溶解在水中制成阳离子聚合物溶液；按体积比为1∶1的比例将TE缓冲液与质量浓度为2％-10％的十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，制成A溶液；
(2)将滤纸浸没于所述阳离子聚合物溶液中，浸泡5-10分钟，取出，用蒸馏水清洗1-3次，再放入A溶液中浸泡5-10分钟后取出，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质；
或将所述阳离子聚合物溶液喷淋在滤纸表面，使全部滤纸均匀喷湿，放置5-10分钟后再均匀喷淋A溶液，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质；
或按质量比为1∶10-200的比例，将所述阳离子聚合物溶液加入均匀的造滤纸原浆内，搅拌均匀，放置5-15分钟后，再加入A溶液，所述造滤纸原浆与所述A溶液的质量比为100-10∶1，搅拌均匀，抄片，脱水，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质。
所述阳离子聚合物为脱乙酰度为5％～99％的壳聚糖、羧基壳聚糖、羧甲基壳聚糖、季铵化壳聚糖、烷基化壳聚糖、壳聚糖交联物、接枝共聚壳聚糖、分子量为300～300,000的多聚赖氨酸、分子量为400Da～75kDa聚乙烯亚胺、季铵化聚乙烯亚胺或聚乙二醇化的聚乙烯亚胺。
所述酸为醋酸、柠檬酸或马来酸。
所述滤纸为木浆滤纸或棉纤维滤纸。
一种吸附储存DNA的介质的制备方法，由下述步骤组成：
(1)按质量比为1∶1000-10的比例，将阳离子聚合物溶解在质量浓度为0.1％-10％的酸的水溶液中或溶解在水中制成阳离子聚合物溶液；按体积比为1∶1的比例将TE缓冲液与质量浓度为2％-10％的十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，制成A溶液；
(2)将滤纸浸没于所述阳离子聚合物溶液中，浸泡5-10分钟，取出，用蒸馏水清洗1-3次，再放入A溶液中浸泡5-10分钟后取出，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质；
或将所述阳离子聚合物溶液喷淋在滤纸表面，使全部滤纸均匀喷湿，放置5-10分钟后再均匀喷淋A溶液，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质；
或按质量比为1∶10-200的比例，将所述阳离子聚合物溶液加入均匀的造滤纸原浆内，搅拌均匀，放置5-15分钟后，再加入A溶液，所述造滤纸原浆与所述A溶液的质量比为100-10∶1，搅拌均匀，抄片，脱水，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质。
所述阳离子聚合物为脱乙酰度为5％～99％的壳聚糖、羧基壳聚糖、羧甲基壳聚糖、季铵化壳聚糖、烷基化壳聚糖、壳聚糖交联物、接枝共聚壳聚糖、分子量为300～300,000的多聚赖氨酸、分子量为400Da～75kDa聚乙烯亚胺、季铵化聚乙烯亚胺或聚乙二醇化的聚乙烯亚胺。
所述酸为醋酸、柠檬酸或马来酸。
所述滤纸为木浆滤纸或棉纤维滤纸。
本发明用阳离子聚合物作为桥梁分子对普通滤纸进行修饰，使得经过修饰的滤纸具有吸附、固定DNA的功能并能长期保存，并使得在提取DNA过程中的洗涤步骤中DNA的损失量降到极小，很好地适应了后续DNA扩增的要求。本发明的一种吸附储存DNA的介质中使用了蛋白变性剂使其具有了抗菌活性。可以直接从吸附了生物样品的该固体介质上提取DNA或应用PCR法进行扩增，用于医学诊断，刑事现场取样，物证保存，亲子鉴定，生物样品的邮寄以及流行病学的检测等。
附图说明
图1为壳聚糖浸渍的滤纸收集和提取血液DNA用于STR结果。
图2为普通滤纸及本发明吸附储存DNA的介质收集的DNA做模板进行PCR的结果。
在图2中M为DNA marker；电泳2、3道为使用普通滤纸收集的血液提取DNA做模板进行PCR的结果；电泳1、4道为用本发明的吸附储存DNA的介质收集血液提取的DNA做模板进行PCR的结果；电泳5道为普通滤纸收集的唾液提取DNA做模板进行PCR的结果；电泳6道为本发明吸附储存DNA的介质收集的唾液提取DNA做模板进行PCR的结果；电泳7道为本发明吸附储存DNA的介质收集的血样经高温高湿条件下储存6个月后的PCR结果；电泳8道为普通滤纸收集的血样经高温高湿条件下储存6个月后的PCR结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种吸附储存DNA的介质，用下述方法制成：
(1)称取分子量5.6万、脱乙酰度85％的壳聚糖，用质量浓度为1％的醋酸水溶液配制成质量百分比为0.5％的壳聚糖溶液；配制TE缓冲液(25mM Tris-HCL/10mM EDTA，pH8.0)500ml，配制质量浓度为5％的十六烷基三甲基溴化铵水溶液500ml，将TE缓冲液与十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合；制成A溶液；
(2)取定量滤纸若干，浸于壳聚糖溶液中10分钟，取出，用蒸馏水冲洗2次，再放入A溶液中浸泡10分钟，取出，40～50℃烘干，即制成一种吸附储存DNA的介质。
实施例2
用本发明的介质收集和提取血液DNA用于STR基因座分型
取志愿者的全血1滴(约0.2ml)滴于经实施例1制备一种吸附储存DNA的介质上，自然吹干，装入信封，常温下存放7天，从该滤纸上取直径1.2mm的带血滤纸于离心管(或96孔PCR板中)；加200ul灭菌去离子水，浸泡5min，吸出浸泡液，重复洗2次；100℃干燥10min，待扩增；在DNA提取管(或孔)中构建10ul PCR体系，于AB-9700型扩增仪中扩增28个循环；取1ul扩增产物，于AB-3130XL型基因分析仪中进行STR分型检测。获得16个STR基因座DNA分型结果，且峰高均衡，图谱指标良好，无丢峰现象出现(图1)。
实施例3
一种吸附储存DNA的介质，用下述方法制成：
(1)按质量比为1∶100的比例，将脱乙酰度为85％的壳聚糖溶解在质量浓度为5％的柠檬酸水溶液中制成阳离子聚合物溶液；按体积比为1∶1的比例将TE缓冲液与质量浓度为8％的十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，制成A溶液；
(2)将木浆滤纸浸没于阳离子聚合物溶液中，浸泡6分钟，取出，用蒸馏水清洗2次，再放入A溶液中浸泡8分钟后取出，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质。
本实施例也可以选脱乙酰度为5％的壳聚糖、脱乙酰度为50％的壳聚糖或脱乙酰度为99％的壳聚糖替代脱乙酰度为85％的壳聚糖组成新的实施例。
实施例4
一种吸附储存DNA的介质，用下述方法制成：
(1)按质量比为1∶10的比例，将羧基壳聚糖溶解在10％的醋酸的水溶液中制成阳离子聚合物溶液；按体积比为1∶1的比例将TE缓冲液与质量浓度为5％的十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，制成A溶液；
(2)将木浆滤纸浸没于所述阳离子聚合物溶液中，浸泡5分钟，取出，用蒸馏水清洗1次，再放入A溶液中浸泡10分钟后取出，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质。
实施例5
一种吸附储存DNA的介质，用下述方法制成：
(1)按质量比为1∶1000的比例，将羧甲基壳聚糖溶解在0.1％的柠檬酸的水溶液中制成阳离子聚合物溶液；按体积比为1∶1的比例将TE缓冲液与质量浓度为10％的十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，制成A溶液；
(2)将棉纤维滤纸浸没于所述阳离子聚合物溶液中，浸泡10分钟，取出，用蒸馏水清洗3次，再放入A溶液中浸泡5分钟后取出，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质。
实施例6
一种吸附储存DNA的介质，用下述方法制成：
(1)按质量比为1∶500的比例，将季铵化壳聚糖溶解在0.5％的柠檬酸的水溶液中制成阳离子聚合物溶液；按体积比为1∶1的比例将TE缓冲液与质量浓度为6％的十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，制成A溶液；
(2)将棉纤维滤纸浸没于所述阳离子聚合物溶液中，浸泡5分钟，取出，用蒸馏水清洗2次，再放入A溶液中浸泡6分钟后取出，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质。
实施例7
一种吸附储存DNA的介质，用下述方法制成：
(1)按质量比为1∶500的比例，将烷基化壳聚糖溶解在10％的柠檬酸的水溶液中制成阳离子聚合物溶液；按体积比为1∶1的比例将TE缓冲液与质量浓度为2％的十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，制成A溶液；
(2)将所述阳离子聚合物溶液喷淋在滤纸表面，使全部滤纸均匀喷湿，放置8分钟后再均匀喷淋A溶液，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质。
实施例8
一种吸附储存DNA的介质，用下述方法制成：
(1)按质量比为1∶500的比例，将壳聚糖交联物溶解在5％的马来酸的水溶液中制成阳离子聚合物溶液；按体积比为1∶1的比例将TE缓冲液与质量浓度为10％的十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，制成A溶液；
(2)将所述阳离子聚合物溶液喷淋在滤纸表面，使全部滤纸均匀喷湿，放置10分钟后再均匀喷淋A溶液，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质。
实验证明，壳聚糖交联物的分子量不同，都可以用本实施例的方法制备成吸附储存DNA的介质。
实施例9
一种吸附储存DNA的介质，用下述方法制成：
(1)按质量比为1∶500的比例，将接枝共聚壳聚糖溶解在0.1％的马来酸的水溶液中制成阳离子聚合物溶液；按体积比为1∶1的比例将TE缓冲液与质量浓度为9％的十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，制成A溶液；
(2)将所述阳离子聚合物溶液喷淋在滤纸表面，使全部滤纸均匀喷湿，放置5分钟后再均匀喷淋A溶液，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质。
实验证明，接枝共聚壳聚糖的分子量不同，都可以用本实施例的方法制备成吸附储存DNA的介质。
实施例10
一种吸附储存DNA的介质，用下述方法制成：
(1)按质量比为1∶500的比例，将多聚赖氨酸溶解在水中制成阳离子聚合物溶液；按体积比为1∶1的比例将TE缓冲液与质量浓度为8％的十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，制成A溶液；
(2)将所述阳离子聚合物溶液喷淋在滤纸表面，使全部滤纸均匀喷湿，放置10分钟后再均匀喷淋A溶液，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质。
实验证明，多聚赖氨酸的分子量不同(分子量在300～300,000中的任一种)，都可以用本实施例的方法制备成吸附储存DNA的介质。
实施例11
一种吸附储存DNA的介质，用下述方法制成：
(1)按质量比为1∶500的比例，将聚乙烯亚胺溶解在水中制成阳离子聚合物溶液；按体积比为1∶1的比例将TE缓冲液与质量浓度为5％的十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，制成A溶液；
(2)按质量比为1∶100的比例，将所述阳离子聚合物溶液加入均匀的造滤纸原浆内，搅拌均匀，放置10分钟后，再加入A溶液，所述造滤纸原浆与所述A溶液的质量比为50∶1，搅拌均匀，抄片，脱水，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质。
实验证明，聚乙烯亚胺的分子量不同(分子量为400Da～75kDa中的任一种)，都可以用本实施例的方法制备成吸附储存DNA的介质。
实施例12
一种吸附储存DNA的介质，用下述方法制成：
(1)按质量比为1∶500的比例，将季铵化聚乙烯亚胺溶解在水中制成阳离子聚合物溶液；按体积比为1∶1的比例将TE缓冲液与质量浓度为7％的十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，制成A溶液；
(2)按质量比为1∶10的比例，将所述阳离子聚合物溶液加入均匀的造滤纸原浆内，搅拌均匀，放置5分钟后，再加入A溶液，所述造滤纸原浆与所述A溶液的质量比为10∶1，搅拌均匀，抄片，脱水，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质。
实施例13
一种吸附储存DNA的介质，用下述方法制成：
(1)按质量比为1∶500的比例，将聚乙二醇化的聚乙烯亚胺溶解在水中制成阳离子聚合物溶液；按体积比为1∶1的比例将TE缓冲液与质量浓度为6％的十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，制成A溶液；
(2)按质量比为1∶200的比例，将所述阳离子聚合物溶液加入均匀的造滤纸原浆内，搅拌均匀，放置15分钟后，再加入A溶液，所述造滤纸原浆与所述A溶液的质量比为100∶1，搅拌均匀，抄片，脱水，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质。
实验证明，实施例3-实施例13之一制备的吸附储存DNA的介质都能吸附储存DNA，再采用实施例2的方法用于STR基因座分型，都能获得结果，且峰高均衡，图谱指标良好，无丢峰现象出现。
实施例14、收集和提取唾液中DNA用于基因分型
志愿者唾液约1ml直接滴于实施例4制备的一种吸附储存DNA的介质上，自然吹干，装入信封，常温下存放7天，从该滤纸上取3个直径1.2mm的带唾液纸片于离心管(或96孔PCR板中)；加200ul灭菌去离子水，浸泡5min，吸出浸泡液，重复洗1-2次；100℃干燥5-10min，加盖(或封膜)待扩增；在DNA提取管(孔)中构建25ul PCR体系；扩增产物通过凝胶电泳(图2)显示应用该发明的滤纸收集的唾液提取的DNA可以很好地应用于基因分型和鉴定。
实验证明，实施例1、实施例3或实施例5-实施例13之一制备的吸附储存DNA的介质都能吸附储存DNA，用本实施例的方法用于基因分型和鉴定。
实例施15、高温高湿条件保存的血液DNA用于PCR
取志愿者的全血1滴(约0.2ml)滴于实施例1制备的吸附储存DNA的介质，自然吹干，装入信封，放入恒温恒湿箱，温度40℃，相对湿度92.5％，在此条件下存放6个月，取出，按实施例2的方法用于STR基因座分型，所得16个STR基因座DNA分型良好，与常温下存放的比较没有差异。
Claims (4)
1.一种吸附储存DNA的介质，其特征是用下述方法制成：
(1)按质量比为1∶1000-10的比例，将阳离子聚合物溶解在质量浓度为0.1％-10％的酸的水溶液中或溶解在水中制成阳离子聚合物溶液；按体积比为1∶1的比例将TE缓冲液与质量浓度为2％-10％的十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，制成A溶液；
(2)将滤纸浸没于所述阳离子聚合物溶液中，浸泡5-10分钟，取出，用蒸馏水清洗1-3次，再放入A溶液中浸泡5-10分钟后取出，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质；
或将所述阳离子聚合物溶液喷淋在滤纸表面，使全部滤纸均匀喷湿，放置5-10分钟后再均匀喷淋A溶液，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质；
或按质量比为1∶10-200的比例，将所述阳离子聚合物溶液加入均匀的造滤纸原浆内，搅拌均匀，放置5-15分钟后，再加入A溶液，所述造滤纸原浆与所述A溶液的质量比为100-10∶1，搅拌均匀，抄片，脱水，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质；所述阳离子聚合物为脱乙酰度为5％～99％的壳聚糖、羧基壳聚糖、羧甲基壳聚糖、季铵化壳聚糖、烷基化壳聚糖、壳聚糖交联物、接枝共聚壳聚糖、分子量为300～300,000的多聚赖氨酸、分子量为400Da～75kDa聚乙烯亚胺、季铵化聚乙烯亚胺或聚乙二醇化的聚乙烯亚胺；所述酸为醋酸、柠檬酸或马来酸。
2.根据权利要求1所述的一种吸附储存DNA的介质，其特征是所述滤纸为木浆滤纸或棉纤维滤纸。
3.一种吸附储存DNA的介质的制备方法，其特征由下述步骤组成：
(1)按质量比为1∶1000-10的比例，将阳离子聚合物溶解在质量浓度为0.1％-10％的酸的水溶液中或溶解在水中制成阳离子聚合物溶液；按体积比为1∶1的比例将TE缓冲液与质量浓度为2％-10％的十六烷基三甲基溴化铵水溶液混合，制成A溶液；
(2)将滤纸浸没于所述阳离子聚合物溶液中，浸泡5-10分钟，取出，用蒸馏水清洗1-3次，再放入A溶液中浸泡5-10分钟后取出，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质；
或将所述阳离子聚合物溶液喷淋在滤纸表面，使全部滤纸均匀喷湿，放置5-10分钟后再均匀喷淋A溶液，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质；
或按质量比为1∶10-200的比例，将所述阳离子聚合物溶液加入均匀的造滤纸原浆内，搅拌均匀，放置5-15分钟后，再加入A溶液，所述造滤纸原浆与所述A溶液的质量比为100-10∶1，搅拌均匀，抄片，脱水，干燥，即制成一种吸附储存DNA的介质；所述阳离子聚合物为脱乙酰度为5％～99％的壳聚糖、羧基壳聚糖、羧甲基壳聚糖、季铵化壳聚糖、烷基化壳聚糖、壳聚糖交联物、接枝共聚壳聚糖、分子量为300～300,000的多聚赖氨酸、分子量为400Da～75kDa聚乙烯亚胺、季铵化聚乙烯亚胺或聚乙二醇化的聚乙烯亚胺；所述酸为醋酸、柠檬酸或马来酸。
4.根据权利要求3所述的一种吸附储存DNA的介质的制备方法，其特征是所述滤纸为木浆滤纸或棉纤维滤纸。
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| CN101912768A (zh) | 2010-12-15 |
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