CN116103280B - 样本保存液及其在染色体非整倍体筛查和/或转录组检测中的应用 - Google Patents

样本保存液及其在染色体非整倍体筛查和/或转录组检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及样本保存液及其在染色体非整倍体筛查和/或转录组检测中的应用。本发明提供的样本保存液，由Tris‑HCl溶液、EDTA溶液、KCl溶液、Triton‑X 100、DTT溶液、HEPES‑NaOH、Primer、甘油、蛋白酶K和核糖核酸酶抑制蛋白组成，其能够对活检物的DNA和RNA长期有效保存，避免样本在运输过程中因反复冻融而导致的核酸物质释放和降解。从而为对同一份胚胎活检物平行检测染色体非整倍性和高质量的转录组测序提供保证。实验表明，该保存液保存后的样品进行检测，可以真实反映胚胎CNV核型信息，RNAseq基因检测数量达到6000个以上。

Description

样本保存液及其在染色体非整倍体筛查和/或转录组检测中 的应用
技术领域
本发明涉及遗传基因检测技术领域技术领域，尤其涉及样本保存液及其在染色体非整倍体筛查和/或转录组检测中的应用。
背景技术
越来越多的研究显示，基于NGS的PGT-A技术可以通过对3-5个外滋养层细胞，进行全面的24条染色体非整倍性筛查，可有效降低流产率，改善临床妊娠结局。但即便是移植经过PGT-A筛选后整倍体胚胎，其妊娠率也只有50％左右，这表明影响胚胎成功妊娠的因素不仅仅只限于胚胎自身的染色体DNA层面。而胚胎着床包括贴壁，粘附，浸润三个极其复杂的过程，整个过程由源自胚胎和母体的内分泌、旁分泌或自分泌调节。相关研究已阐明，介导囊胚-子宫内膜对话的关键信号网络利用重要分子和事件，调控胚胎-子宫应答。所以除关注胚胎整倍性以外，尚需关注调控整倍体胚胎介导妊娠过程中的RNA转录组调控变化，基因表达网络，揭示整倍体胚胎的发育潜能以及植入潜能。
虽然有很多基于植入前胚胎转录组相关的研究，但都是针对胚胎体外发育短于14天的数据，仅仅解释了胚胎细胞分化相关的标志基因；以及早期胚胎发育各个阶段合子基因激活(ZGA)过程的重要调控以及关键驱动基因。并未与胚胎非整倍性以及移植后的临床结局相关联。
2015年，Karin.L等人阐述成功植入并活产的胚胎与植入失败的胚胎存在181个表达差异的基因，但是该研究的患者并不是PGT-A适应症的患者，更无法对研究的胚胎进行染色体非整倍性的评估，所以只是单方面分析了RNAseq的数据，并没有关注胚胎遗传学的发育潜能。2018年，Aristotelis.T等人通过对已知PGT核型的胚胎进行RNAseq，第一次探究了DNA与RNA共测序结果，初步揭示整倍体胚胎与非整倍体胚胎转录组存在显著差异，但这项研究是回顾性的研究，并不是对同一份活检物检测，且是对整个胚胎检测，RNAseq实验消耗完了所有的可检测样本。DNA和RNA检测的不同步性，不同时间点的活检，冷冻复苏过程以及胚胎自身的嵌合问题都阻碍着揭示活细胞状态下真实的转录组特性的探索。
虽然单细胞转录组测序技术得到了长足发展，并且可以通过偶联生物素的oligodT的磁珠来分离mRNA，或者显微镜下手动分离细胞核来实现基因组和转录组的同时测序。但是以上两种方法的检测复杂度高，试剂成本昂贵，需要借助高精尖的设备且成功率有一定限制。所以微量的胚胎活检物(3-5个细胞)是平行检测DNA和RNA的技术壁垒，如何对微量细胞同时实现基因组和转录组的同时检测，且在检测转录组的同时不失真的准确检测胚胎染色体非整备性也对临床形成很大的技术挑战。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供样本保存液及其在染色体非整倍体筛查和/或转录组检测中的应用，该样本保存液能够避免样本在运输过程中因反复冻融而导致的核酸物质释放和降解，为对同一份样品平行检测染色体非整倍性和高质量的转录组测序提供保证。
本发明提供的样本保存液中各组分的工作浓度为：
Tris-HCl15mM～33mM、EDTA1mM～3.5mM、KCl10mM～30mM、TritonX-100 0.1vol％～0.5vol％、DTT 10mM～20mM、HEPES-NaOH0.3mM～0.7mM、Primer 0.05μM～0.5μM、甘油0.5vol％～2vol％、蛋白酶K1mg/mL～5mg/mL和核糖核酸酶抑制蛋白0.8U～1.2U。
本发明所述的样本保存液中各组分选择合理，相对于其他不恰当浓度下的保存液，本发明提供的保存液能够更好的维持样本中核酸物质(包括DNA和RNA)的稳定，从而使对同一份样本进行染色体非整倍性和高质量的转录组测序变成可能。获得的数据丰富、准确、可靠。本发明提供的样本保存液以母液形式存储，所述母液中各组分的浓度是工作浓度的1～10倍，例如，母液浓度为工作浓度的1倍、2倍、5倍或10倍。
一些具体实施例中，所述样本保存液中各组分的工作浓度为：
Tris-HCl15mM、EDTA1mM、KCl10mM、TritonX-100 0.1vol％、DTT10mM、HEPES-NaOH0.3mM、Primer 0.05μM、甘油0.5vol％、蛋白酶K1mg/mL和核糖核酸酶抑制蛋白0.8U；
另一些具体实施例中，所述样本保存液中各组分的工作浓度为：Tris-HCl33mM、EDTA3.5mM、KCl30mM、TritonX-100 0.5vol％、DTT 20mM、HEPES-NaOH 0.7mM、Primer 0.5μM、甘油2vol％、蛋白酶K 5mg/mL和核糖核酸酶抑制蛋白1.2U；
另一些具体实施例中，所述样本保存液中各组分的工作浓度为：Tris-HCl20mM、EDTA2mM、KCl20mM、TritonX-100 0.2vol％、DTT 15mM、HEPES-NaOH 0.5mM、Primer 0.2μM、甘油1.25vol％、蛋白酶K2mg/mL和核糖核酸酶抑制蛋白1U。
在本发明中，Primer的作用是防止样本核酸物质的降解，使全基因组扩增更为充分。试验表明，相对于其他序列的Primer，本发明试剂中的Primer能够更好的与保存液中的其它组分配合，从而使样本在保存后仍能获得良好的检测效果。具体实施例中，Primer的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。具体序列为：GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGN NNNNGGG。
本发明中所述样本保存液的配置方法包括配置2～10倍工作浓度的母液。具体包括：将Tris-HCl溶液、EDTA溶液、KCl溶液、Triton-X 100、DTT溶液、HEPES-NaOH溶液混合，然后用无核酸酶水定容后，涡旋混匀10次以上，配制得到母液，再加入Primer、甘油、蛋白酶K和核糖核酸酶抑制蛋白以及无核酸酶水二次定容后得到最终的工作液。
进一步的，本发明还提供了所述的样本保存液在保存染色体检测样本中的应用。
本发明中，所述染色体检测样本为来自动物的样本，或来自人类的样本。其中，来自人类的染色体检测样本为胚胎细胞、体细胞或肿瘤细胞。
所述染色体检测包括对样本进行DNA层面染色体非整倍性的检测，和RNA层面转录表达谱的检测。本发明中，所述DNA层面染色体非整倍性的检测，和RNA层面转录表达谱的检测采用本领域技术人员熟知的方式进行，本发明对此不做限定。凡采用本发明提供的保存液保存的样本，皆可获得良好的检测效果。
本发明还提供了染色体检测以及转录组检测的试剂组合，其包括如前所述的样本保存液、DNA文库构建试剂、cDNA扩增与文库构建试剂盒。
本发明中，所述DNA文库构建试剂和cDNA扩增与文库构建试剂为本领域熟知的试剂，本发明对此不做限定，皆可以与本发明所述的样本保存液配合，构建获得质量良好的文库。
更进一步的，本发明还提供了染色体检测样品的保存方法，其将样本置于本发明所述的样本保存液，冷冻保存。
本发明中，所述冷冻保存的温度为-80℃～-20℃。一些实施例中，每7μL保存液可以保存3～5个细胞。
本发明还提供了一种染色体的检测方法，其将本发明所述保存方法保存的样品裂解后，分别构建DNA文库和cDNA文库，然后分别进行DNA层面染色体非整倍性的检测，和RNA层面转录表达谱的检测。
本发明中，所述裂解的条件包括75℃10min，95℃4min，22℃保持。
研究表明，裂解不当会严重影响DNACNV方面的检出能力，而采用本发明所述的保存液保存，能够维持核酸在裂解过程中的稳定性，同时保证了对RNA的保护以及DNA的释放。
本发明提供的样本保存液，由Tris-HCl溶液、EDTA溶液、KCl溶液、Triton-X100、DTT溶液、HEPES-NaOH、Primer、甘油、蛋白酶K和核糖核酸酶抑制蛋白组成，其能够对活检物的DNA和RNA长期有效保存，避免样本在运输过程中因反复冻融而导致的核酸物质释放和降解。从而为对同一份胚胎活检物平行检测染色体非整倍性和高质量的转录组测序提供保证。实验表明，该保存液保存后的样品进行检测，可以真实反映胚胎CNV核型信息，RNAseq基因检测数量达到6000个以上。
附图说明
图1示不同组别保护液保存样品检测CNV图谱；
图2示不同样品的CNV图谱；
图3示不同样品的PGT检测结果。
具体实施方式
本发明提供了样本保存液及其在染色体非整倍体筛查和/或转录组检测中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例样品的保存
按照下表组方配制保存液
配置过程：吸取1MTris-HCl溶液(1.5mL-3.3mL)；0.5MEDTA溶液(0.2mL-0.7mL)；1MKCl溶液(1mL-3mL)；100％ Triton-X 100(0.1mL-0.5mL)；1MDTT溶液(1mL-2mL)；1M HEPES-NaOH ph7.5(0.03mL-0.07mL)；然后用无核酸酶水补足体积至10mL，充分涡旋混匀10次以上，配制得到保存液母液；
最后用无核酸酶水将样本保存液母液稀释成1×样本保存液，如配置50mL1×样本保存液，需要吸取100μMPrimer溶液(0.025mL-0.25mL，其中Primer的序列为GTGAGTGATGGTTGAGGTAGTGTGGAGNNNNNGGG)；100％ Glycerol(0.25mL-1mL)；20mg/mLProteinase K(2.5mL-12.5mL)；40U核糖核酸酶抑制蛋白(1mL-1.5mL)，无核酸酶水补足体积至10至50mL充分涡旋混匀，2000rpm瞬时离心3～5sec后分装7μL至0.2mLPCR管中备用。配置好的保存液，须立即置于冰箱冷冻保存，-20℃1个月，-80℃6个月
分别取7uL各组保存液，每份保存液中分别加入3～5个单细胞(人B淋巴细胞系GM12878，肿瘤细胞系或者胚胎活检物)，立即置于在-80℃保存。
对比例 样品的保存
按照下表组方配制各组对比例的保存液：
此外，选择目前常规保存液作为对照，其配方为：
原料名称 溶液配方(范围)
Tris-HCl 20mM-50mM
EDTA 1mM-3.5mM
NaCl 1mM-4mM
Triton X-100 0.1％-0.5％
DTT 5mM-30mM
Primer 10μM-20μM
细胞的保存同实施例1。
DNA/RNA共检测方法
1.向实施例和对比例中各组含有样本的PCR管，样本装量不超过2uL，总体积约9uL直接放入PCR仪器中，按照下面程序75℃-10min 95℃-4min，22℃-hold，对样本进行裂解。
2.反应结束后，快速瞬时离心，吸取上层3.5uL裂解混合液到微量RNA样本制备试剂盒(KT110700724)的1.5uL细胞裂解中，轻轻吹打混匀，放置冰上或者-80℃冰箱保存等待RNAseq检测。
3.DNA层面染色体非整倍性的检测
3.1快速离心，取出上层的3.5uL样本后，保留原管的裂解产物约5uL。
预扩增：
3.2从-20℃冰箱取出缓冲液2和预扩增酶，室温解冻，将缓冲液2涡旋震荡混匀，瞬时离心(微型离心机，2000转，3-5sec)，备用。
3.3根据反应体系和反应的数量(N)，按照下表制备预扩增混合液。
试剂名称 体积(N＝反应样本数量)
缓冲液2 30μL×(N+1)
预扩增酶 1μL×(N+1)
总体积 31L×(N+1)
3.4向步骤3.1的细胞裂解产物中分别加入30μL预扩增混合液，涡旋振荡，瞬时离心(微型离心机，2000转，10-15sec)。
按照下表设定预扩增程序，“热盖”选择“On105℃”，将步骤3.4的样本放置在PCR仪中完成预扩增反应。
3.5指数扩增
从-20℃冰箱取出缓冲液3和扩增酶，室温解冻，将缓冲液3涡旋震荡混匀，瞬时离心(微型离心机，2000转，3-5sec)。根据反应体系和反应的数量(N)，按照下表制备扩增混合液。
试剂名称 体积(N＝反应样本数量)
缓冲液3 30μL×(N+1)
扩增酶 0.8μL×(N+1)
总体积 30.8μL×(N+1)
3.6向步骤3.4预扩增产物中加入30μL扩增混合液(此时溶液总体积约为65μL)和1μL标签引物，涡旋震荡混匀，瞬时离心(微型离心机，2000转，10-15sec)。
按照下表设定预扩增程序，“热盖”选择“On 105℃”，将步骤3.6的样本放置在PCR仪中完成指数扩增反应。
3.7文库纯化
3.7.1提前从4℃冰箱中取出磁珠平衡至室温，涡旋振荡磁珠，使其充分混匀。
3.7.2分别向每管文库中加入1倍体积的磁珠，涡旋震荡混匀，瞬时离心(微型离心机，2000转，3-5sec)，室温静置5min。
3.7.3将离心管放于磁力架上使磁珠与上清液分离，约5min后，溶液变得澄清，小心吸取上清并弃除，千万不要吹打含有目的片段的磁珠。注意：不要吸到磁珠。
3.7.4继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温放置30sec，小心弃除上清。
3.7.5重复步骤3.7.4一次。
3.7.6保持离心管于磁力架上开盖状态，室温放置5-10min，使乙醇完全挥发干净，保证其充分晾干。
3.7.7加入17.5μL无核酸酶水，将离心管从磁力架上取下，涡旋振荡使磁珠完全重悬(15-30sec)，瞬时离心(微型离心机，2000转，3-5sec)，室温放置5min，将离心管置于磁力架中使磁珠和液体分离，约5min后，溶液澄清，小心吸取15μL上清至新的1.5mL离心管中。
4.RNA层面转录表达谱的检测
对第2步分装后，形成的5uL保存液进行RNAseq检测。
4.1取一新的0.2mL PCR管中加入13.3μL RT Buffer(微量RNA样本制备试剂盒KT110700724中组分)。
4.2将上述第2步的保存液和4.1中的RT Buffer置于预热的PCR仪中孵育，条件如下：
温度 时间
72℃ 3min
立即置于冰盒上 2min
4.3向72℃孵育后的RT buffer中加入1.7μL RT Enzyme Mix(微量RNA样本制备试剂盒KT110700724中组分)，标记为“RT Mix”，移液器缓慢吹打混匀，瞬时离心，置于冰上备用。
4.4向每个含有样本的PCR管中，加入15μL“RT Mix”，移液器缓慢吹打混匀10次，瞬时离心后立即置于冰盒上，在预热的PCR仪上孵育样本，条件如下：
4.5取30μL PCR Mix(微量RNA样本制备试剂盒KT110700724中组分)加入到上一步的扩增产物中(此时溶液体积为50μL)，涡旋震荡混匀，瞬时离心后放入PCR仪中扩增，反应条件如下：
4.6cDNA纯化
4.6.1分别向每管中加入1倍体积的磁珠，涡旋震荡混匀，瞬时离心(微型离心机，2000转，3-5sec)，室温静置5min。
4.6.2将离心管放于磁力架上使磁珠与上清液分离，约5min后，溶液变得澄清，小心吸取上清并弃除，千万不要吹打含有目的片段的磁珠。注意：不要吸到磁珠。
4.6.3继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入200μL新鲜配置的80％乙醇，室温放置30sec，小心弃除上清。
4.6.4重复步骤4.6.3一次。
4.6.5保持离心管于磁力架上开盖状态，室温放置5-10min，使乙醇完全挥发干净，保证其充分晾干。
4.6.6加入17.5μL无核酸酶水，将离心管从磁力架上取下，涡旋振荡使磁珠完全重悬(15-30sec)，瞬时离心(微型离心机，2000转，3-5sec)，室温放置5min，将离心管置于磁力架中使磁珠和液体分离，约5min后，溶液澄清，小心吸取15μL上清至新的1.5mL离心管中。
4.7DNA片段化
4.7.1从-20℃冰箱取出DNA片段化缓冲液与DNA片段化酶(DNA片段化试剂盒KT100804248中组分)置于冰盒上解冻，DNA片段化酶轻弹混匀，DNA片段化缓冲液涡旋混匀。
4.7.2DNA片段化酶与DNA片段化缓冲液瞬时离心后置于冰上，备用。
4.7.3按照下表配制反应体系：
试剂名称 体积
DNA片段化缓冲液 1μL
cDNA XμL
无核酸酶水 (7-X)μL
总体积 8μL
4.7.4向上述体系中加入2μL DNA片段化酶，轻柔吹打6～8次混匀(请勿涡旋振荡)，瞬时离心后置于冰上，备用。
4.7.5将上述PCR管立即转移至4℃预冷的PCR仪中，热盖温度设置为70℃，拧紧热盖，按照下表设置反应参数：
温度 时间 循环
4℃ 1min 1
32℃ 15min 1
65℃ 30min 1
4℃ Forever 1
4.7.6当反应程序结束，PCR仪温度降至4℃后，将样本取出并置于冰盒上。立即进行下一步实验操作。
4.8末端修复
4.8.1从-20℃冰箱取出末端修复缓冲液与末端修复酶(基因测序文库试剂盒XK-038-48中组分)，末端修复缓冲液室温解冻，涡旋振荡混匀，末端修复酶轻弹混匀。
4.8.2末端修复缓冲液与末端修复酶瞬时离心后置于冰上，备用。
4.8.3根据样本数目，按照下表制备末端修复混合液：
试剂名称 体积
末端修复缓冲液 3.25μL
末端修复酶 1μL
片段化的DNA 10μL
无核酸酶水 18.25μL
总体积 32.5μL
4.8.4将上述PCR管放置于PCR仪中，“热盖”选择“On,105℃”，拧紧热盖，按照下表设置反应参数：
温度 时间 循环
12℃ 15min 1
37℃ 15min 1
72℃ 20min 1
4℃ Forever 1
4.9接头连接
4.9.1取出连接缓冲液及接头(基因测序文库试剂盒XK-038-48中组分)，置于冰盒上解冻，涡旋振荡混匀，瞬时离心，备用。
4.9.2根据样本数目，按照下表制备接头连接反应混合液：
试剂名称 体积
连接缓冲液 7μL
连接酶 1μL
接头 1.25μL
总体积 9.25μL
4.9.3涡旋振荡混匀接头连接反应混合液，瞬时离心后分装9.25μL至步骤4.8.4获得的末端修复反应液中，涡旋振荡混匀，瞬时离心，此时反应液总体积为41.75μL。
4.9.4将上述PCR管放置于PCR仪中，“热盖”选择“off”，拧紧热盖，按照下表设置反应参数：
温度 时间 循环
20℃ 15min 1
4℃ Forever 1
4.10 DNA纯化
4.10.1提前取出磁珠(基因测序文库试剂盒XK-038-48中组分)平衡至室温。
4.10.2涡旋振荡磁珠20sec，使其充分混匀。
4.10.3向步骤4.9.4获得的接头连接反应液中加入8.25μL无核酸酶水将体积补至50μL。
4.10.4将上述50μL反应液转移至1.5mL离心管中，加入50μL磁珠，涡旋振荡5sec后，室温静置5min。
4.10.5瞬时离心后将离心管固定于磁力架上静置5min，直至溶液澄清，小心吸取上清液并弃除，期间避免接触磁珠。
4.10.6保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入200μL左右新配置的80％乙醇使其没过磁珠，室温放置30sec，之后弃除上清，保留磁珠。加乙醇时请勿吹散磁珠。
4.10.7重复步骤4.10.6一次。
4.10.8保持离心管固定于磁力架上，室温静置5～10min左右使乙醇完全挥发。
4.10.9将离心管从磁力架上取下，加入14μL洗脱液(基因测序文库试剂盒XK-038-48中组分)，移液器吹打混匀使磁珠完全重悬，室温静置5min。
4.10.10瞬时离心后将离心管固定于磁力架上静置5min，直至溶液澄清，吸取11.5μL上清至新的PCR管中。
4.11PCR富集
4.11.1向步骤4.10.10中的PCR管中分别加入12.5μL扩增混合液(基因测序文库试剂盒XK-038-48中组分)和1μL标签引物(NGS通用Index试剂盒(Illumina)YK001-001～YK001-004中组分)，并记录每个样本对应的标签引物编号，涡旋振荡混匀，瞬时离心，此时反应总体积为25μL。
4.11.2将上述PCR管放置于PCR仪中，“热盖”选择“On,105℃”，拧紧热盖，按照下表设置反应参数：
4.12PCR产物纯化
4.12.1涡旋振荡磁珠(基因测序文库试剂盒XK-038-48中组分)20sec，使其充分混匀。
4.12.2将步骤4.11.2获得的反应液转移至1.5mL离心管，加入等体积(25μL)磁珠，涡旋振荡5sec后室温静置5min。
4.12.3瞬时离心后将离心管固定于磁力架上静置5min，直至溶液澄清，小心吸取上清液并弃除，期间避免接触磁珠。
4.12.4保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入200μL左右新鲜配制的80％乙醇，使其没过磁珠，室温放置30sec，之后弃除上清液，保留磁珠。加乙醇时请勿吹散磁珠。
4.12.5重复步骤4.12.4一次。
4.12.6保持离心管固定于磁力架上，室温静置5～10min使乙醇完全挥发。
4.12.7将离心管从磁力架上取下，加入17.5μL洗脱液(基因测序文库试剂盒XK-038-48中组分)，涡旋振荡使磁珠完全重悬，室温静置5min。
4.12.8瞬时离心后将离心管固定于磁力架上静置5min，直至溶液澄清，吸取15μL上清至新的PCR管中，即为制备完成的文库，于-20℃保存(避免反复冻融)或进行下一步文库混合。
效果验证
取实施例中A1，A2，A3和对比例B，C，D，E中各配方的保存液，各取7μL，分别加入3～5个单细胞(人B淋巴细胞系GM12878)，每组各设置三个重复。
另以常规保存液中添加pg级核酸以及未添加任何细胞或核酸为实验对照，分别记作PC和NC组。
各组混合样本在-80℃保存15天后，取出再进行实验，分别验证CNV结果以及RNAseq的稳定性。实验方案如下表：
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CNV结果质控如下(图1)
/>
RNAseq结果质控如下：
/>
结果显示：本发明的配方A3保存液保存样本后，CNV检测结果最优，CV小于0.1，其他关键指标也符合预期，并且A3配方对应的RNAseq数据也最稳定，检测基因数量平均可达13000以上。
虽然B组配方可以满足CNV的检测，但是RNA有较多降解，检测基因数量小于6000个。C组配方虽然可满足正常的RNAseq基因检测数量，但是由于核糖核酸酶抑制蛋白的浓度增加而严重影响了CNV的检测。
D组配方在proteinase K低浓度情况下，导致了DNA检测失败，变异系数CV值极大不能报出CNV。虽然可以满足RNA的检测，但是相比于A3最优配方，其基因检出量在11000左右，略低于最佳A3配方的基因检出。E组配方在proteinase K高浓度情况下，可以检测出有效CNV，但是高浓度也导致了对RNA保护性缺失，RNAseq数据很差，只检测了5000左右的基因数量。
常规保存液中的pg级核酸可以成功检测CNV，但是不能对RNA有有效保护，所以检测出的基因量较少只有3000左右。
实施例2
对已知核型的两个肿瘤细胞系(SK-BR-3，RT112)，各取挑取3-5个细胞，放入实施例1中的A3本保存液中，-20℃保存15天。然后用于PGT-A检测以及RNAseq。具体如下表：
细胞系 样本编号 细胞数量 保存液体积 保存温度 保存时间
SK-BR-3 1 3-5 7uL -20℃ 15天
SK-BR-3 2 3-5 7uL -20℃ 15天
RT112 3 3-5 7uL -20℃ 15天
RT112 4 3-5 7uL -20℃ 15天
1、基于Chrominst的PGT-CNV检测结果显示，样本1和2与肿瘤细胞系SK-BR-3核型一致，样本3和4与肿瘤细胞系RT112的核型一致。
2、基于微量RNA样本制备试剂盒(KT110700724)的RNAseq数据结果：
综合以上结果显示：微量的两种肿瘤细胞系细胞，于-20℃保存在该保存液中15天后，PGT-CNV可以稳定检出，且与已知核型相符；RNAseq数据显示可以检测到14000个以上的基因数量。所以该保存液即保护了细胞本身核基因组的完整性，又有效阻止了微量细胞的RNA降解，并且实现了对同一份样本DNA和RNA有效实时同步检测，为进一步胚胎植入前活检样本的PGT与RNAseq共检测奠定基础。
实施例3
对已经进行PGT-A检测的胚胎样本(已知PGTA核型)进行二次活检，将二次活检物保存到实施例1制备的A3保存液中，-20℃保存10天。
对上述列表中的样本采取按照DNA/RNA共检测样本的检测方法进行检测。
PGT检测结果
RNAseq数据结果
综合以上结果显示：对已经进行过胚胎植入前检测的样本进行再次活检取样后保存如DNA/RNA共检测样本保存液中，于-20℃保存15天后，PGT-CNV可以稳定检出，且与已知核型完全一致；RNAseq数据显示可以检测到12000个以上的基因数量。
所以该保存液即保护了细胞本身核基因组的完整性，又有效阻止了微量细胞的RNA降解，并且实现了对同一份样本DNA和RNA有效实时同步检测，为进一步大规模开展胚胎植入前活检样本的PGT与RNAseq共检测以及机制研究奠定基础。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.维持DNA和RNA稳定的样本保存液，其特征在于，其中各组分的工作浓度为：
Tris-HCl 15mM、EDTA 1mM、KCl 10mM、TritonX-100 0.1vol%、DTT 10mM、pH7.5的HEPES-NaOH 0.3mM、Primer 0.05μM、甘油 0.5vol%、蛋白酶 K 1mg/mL和核糖核酸酶抑制蛋白 0.8 U；
或为Tris-HCl 33mM、EDTA 3.5mM、KCl 30mM、TritonX-100 0.5vol%、DTT 20mM、pH7.5的HEPES-NaOH 0.7mM、Primer 0.5μM、甘油 2vol%、蛋白酶 K 5mg/mL和核糖核酸酶抑制蛋白 1.2 U；
或为Tris-HCl 20 mM、EDTA 2mM、KCl 20mM、TritonX-100 0.2vol%、DTT 15mM、pH7.5的HEPES-NaOH 0.5mM、Primer 0.2μM、甘油 1.25vol%、蛋白酶 K 2mg/mL和核糖核酸酶抑制蛋白 1 U；
其中Primer的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的样本保存液的配置方法，其特征在于，包括配置2~10倍工作浓度的母液：将Tris-HCl溶液、EDTA溶液、KCl溶液、Triton-X 100、DTT溶液、pH7.5的HEPES-NaOH溶液混合，然后用无核酸酶水定容后，涡旋混匀10次以上，加入Primer、甘油、蛋白酶K和核糖核酸酶抑制蛋白，配制得到保存液。
3.权利要求1所述的样本保存液在保存染色体检测样本中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述染色体检测样本为胚胎细胞、体细胞或肿瘤细胞，所述染色体检测包括对样本进行DNA层面染色体非整倍性的检测，和RNA层面转录表达谱的检测。
5.染色体检测和转录组检测试剂组合，其特征在于，包括权利要求1所述的样本保存液、DNA文库构建试剂、cDNA扩增与文库构建试剂。
6.染色体检测样品的保存方法，其特征在于，将样本置于权利要求1所述的样本保存液，冷冻保存。
7.染色体的检测方法，其特征在于，将以权利要求6所述保存方法保存的样品裂解后，分别构建DNA文库和cDNA文库，然后分别进行DNA层面染色体非整倍性的检测，和RNA层面转录表达谱的检测。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述裂解的条件包括75℃ 10min，95℃ 4min，22℃保持。
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