ES2313752T3 - Un metodo de fijacion-deshidratacion-eliminacion de grasa-impregnacion de tejidos de produccion continua, de alta calidad. - Google Patents
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Abstract
Método para el tratamiento continuo de tejidos que comprende (a) proporcionar una muestra de tejido de hasta 3 mm de espesor; (b) fijar, deshidratar y eliminar la grasa de dicha muestra de tejido con energía de microondas y disoluciones no acuosas, siendo al menos una disolución no acuosa una primera disolución compuesta por un alcohol y una cetona en una razón en volumen de alcohol con respecto a cetona entre 1 y 3; (c) impregnar dicha muestra de tejido fijada, deshidratada y desgrasada en presión inferior a la atmosférica mediante una disolución de cera compuesta por parafina; (d) repetir las etapas (a) a (c) con al menos otra muestra de tejido; mediante lo cual se tratan de manera continua muestras de tejido iniciando la etapa (a) para una muestra de tejido tratada posteriormente antes que la etapa (c) se haya completado para una muestra de tejido tratada anteriormente de modo que se trata una muestra de tejido desde la fijación hasta la impregnación en menos de dos horas.
Description
Un método de
fijación-deshidratación-eliminación
de grasa-impregnación de tejidos de producción
continua, de alta calidad.
La presente invención se refiere al tratamiento
de flujo continuo, rápido de tejido para el examen microscópico,
desde la fijación hasta la impregnación.
Los métodos convencionales preparan los tejidos
para histología mediante incubación en disoluciones separadas de
formaldehído al 10% tamponado con fosfato para la fijación, una
serie de concentraciones en aumento de etanol para la
deshidratación y xileno para aclarar el tejido del agente de
deshidratación, antes de la impregnación. Debido al tiempo
requerido para este procedimiento, normalmente 8 horas o más, es
habitual completar estas etapas separadas (fijación,
deshidratación, aclarado e impregnación) durante la noche en
instrumentos mecánicos automatizados diseñados para estas tareas
(véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses números
3.892.197, 4.141.312 y 5.049.510). Un procesador automatizado de
tejido (TISSUE-TEK) típico requiere más de ocho
horas y está programado para tratar lotes de muestras de tejido tal
como sigue
La patente estadounidense
US-A-4 656 047 enseña un método
para el tratamiento asistido por microondas de una muestra de
tejido inferior a 3 mm de espesor que incluye las etapas de
fijación y deshidratación en composiciones no acuosas. Cada
composición de disolvente representa múltiples etapas a la vez por
ejemplo la etapa de deshidratación-impregnación, que
elimina la necesidad de aclarar.
Tal metodología convencional requiere que las
muestras de tejido se envíen desde la sala de operaciones, consulta
médica u otros lugares, a un laboratorio de anatomía patológica en
un día; que las muestras de tejido se preparen durante la noche; y
que el anatomopatólogo dé un diagnóstico basándose en el examen
microscópico de secciones de tejido al día siguiente a primera hora,
casi 24 horas tras enviar la muestra al laboratorio (figura 1).
Además del retraso mínimo de un día en proporcionar al cirujano el
beneficio de un informe del anatomopatólogo, también existen
problemas asociados con el flujo de trabajo limitado en el
laboratorio de anatomía patológica exigido por el tratamiento en
lotes necesario de las muestras, las preocupaciones de seguridad
que suponen los instrumentos que funcionan durante la noche, el
riesgo de posibles fallos instrumentales y la necesidad de
monitorizar los instrumentos, y el desperdicio de usar grandes
volúmenes de reactivos para tal tratamiento cuando se automatiza.
Además, se necesitan medidas caras para evitar la exposición del
personal de laboratorio a humos y sustancias tóxicas asociadas con
los reactivos usados en este procedimiento. Además, el desperdicio
de grandes volúmenes de disolvente y el residuo de parafina
producidos por la metodología convencional contaminan el
medioambiente.
La fijación y el tratamiento convencionales
producen un daño irreversible a la estructura del ADN y
particularmente del ARN que limita la aplicación de técnicas
genéticas para el diagnóstico y la búsqueda. Por consiguiente, la
mayoría de los análisis de ADN y por supuesto de ARN requieren
precauciones especiales con el manejo del material, tal como
congelación inmediata de tejidos frescos, porque el análisis
genético retrospectivo se ve afectado por las técnicas de
tratamiento de tejido convencionales.
El diagnóstico histológico de una sección
congelada presenta múltiples desventajas en comparación con las
secciones preparadas a partir de bloques de parafina: el
portaobjetos preparado a partir de una sección congelada "no
posee... uniformidad de calidad"; "es técnicamente más difícil
que se examinen secciones en serie de la misma muestra"; "debe
procederse con extrema precaución para cortar la muestra con el fin
de asegurar una sección suficientemente fina y para evitar la
posibilidad de dañar detalles de la muestra"; y todos los
portaobjetos deben prepararse "mientras el tejido está en el
estado congelado inicial" porque, "[si] el tejido se
descongela y se vuelve a congelar para su seccionamiento, se daña
gravemente" (patente estadounidense número 3.961.097).
Existe un interés siempre presente en acelerar
el tratamiento del tejido y el análisis para fines de diagnóstico.
Además, un enfoque en asistencia sanitaria reciente se ha referido
a la disminución del coste de diversos procedimientos que incluyen
el tratamiento del tejido. Los costes del tratamiento del tejido se
refieren al tiempo, al espacio requerido para la preparación y el
análisis, a los reactivos (tanto la cantidad requerida para el
tratamiento como descartar el manejo) y al número de personal
requerido. De manera más importante, los pacientes y sus médicos
dependen de la evaluación y del diagnóstico por el anatomopatólogo
para que dirija el tratamiento. La reducción de la cantidad de
tiempo necesaria para completar el tratamiento del tejido reducirá
la ansiedad experimentada durante el periodo entre la obtención de
la muestra y la emisión del informe del anatomopatólogo al
cirujano.
Otros han reconocido la necesidad de acortar el
tiempo requerido para el tratamiento del tejido, pero sólo han
efectuado mejoras modestas en los métodos convencionales. Para
acelerar el tratamiento del tejido, las patentes estadounidenses
números 4.656.047, 4.839.194, y 5.244.787 usan energía de
microondas; las patentes estadounidenses números 3.961.097 y
5.089.288 usan energía ultrasónica; y la patente estadounidense
número 5.023.187 usa energía de infrarrojos. La patente
estadounidense número 5.104.640 daba a conocer una composición no
acuosa de un fijador, un agente estabilizador y un agente de
solubilización que adhiere un frotis de sangre a un portaobjetos.
Sin embargo, las patentes mencionadas no enseñan ni sugieren que el
procedimiento total de preparar portaobjetos de tejido de
diagnóstico pueda llevarse a cabo en menos de dos horas, comenzando
con la fijación y terminando con la impregnación, con producción
continua de las muestras. La presente invención proporciona un
procedimiento de
este tipo.
este tipo.
Es un objeto de la invención proporcionar un
método y composiciones para el tratamiento del tejido que reduce el
tiempo requerido para el tratamiento del tejido y el análisis, y
que reduce el coste de los mismos reduciendo el tiempo requerido.
Esto permite la conversión de la práctica existente a la
histopatología quirúrgica de rápida respuesta para el paciente que
se somete a una operación, e incluso puede permitir el análisis de
diagnóstico inmediato por el anatomopatólogo en las inmediaciones
de la sala de operaciones.
Con respecto al tratamiento y al análisis de
tejido sólido, un portaobjetos de tejido debe ser del orden de 4 a
6 micrómetros para examinarse bajo un microscopio, mientras que el
corte más delgado de tejido fresco que puede obtenerse cortando es
aproximadamente de 1 mm siendo el corte típico del orden de 3 mm.
Con el fin de producir un corte suficientemente fino para el examen
microscópico, es necesario endurecer el tejido de modo que pueda
obtenerse un corte más delgado, por ejemplo, seccionando con un
micrótomo. La presente invención acelera enormemente el
procedimiento de endurecimiento del tejido y por tanto convierte el
tratamiento durante la noche convencional en un procedimiento en
total del orden de 40 minutos. Por tanto, se ha desarrollado un
método sencillo, seguro, de bajo coste, rápido y fiable que permite
la preparación de bloques de tejido impregnado adecuados para el
seccionamiento con micrótomo en menos de dos horas desde el momento
en que se recibe el tejido en el laboratorio de anatomía
patológica. Este método permite el flujo continuo de muestras,
puede adaptarse a la automatización, descarta la necesidad de
formalina y xileno con sus humos nocivos, permite la normalización
del tratamiento del tejido y requiere volúmenes de reactivos
considerablemente más pequeños que los métodos convencionales.
Mediante la presente invención pueden procesarse tejidos tanto
frescos como previamente fijados.
Además de la reducción en el tiempo requerido
para el tratamiento del tejido, la rápida preparación de tejido por
la presente invención puede conservar las estructuras de tejido y
la morfología que se perdían con métodos convencionales.
Además, estudios con tejidos tratados con la
invención dada a conocer en el presente documento indican la mejor
conservación de la extracción de ADN y particularmente de ARN que
con métodos de tratamiento convencionales. Por tanto, los tejidos
obtenidos en hospitales y otros entornos pueden tratarse tanto para
estudios histológicos como genéticos poco después de enviar al
laboratorio, y material de archivo puede estar disponible para
investigación futura y otras aplicaciones. Pueden esperarse mejoras
en el campo del material genético, la estabilidad del material
genético en forma de archivo, el tamaño y la integridad del
material genético y la reducción de la modificación química del
material genético en comparación con la técnica anterior.
Un objeto de la invención es proporcionar un
método y un aparato para el tratamiento rápido del tejido para
histología con producción continua. "Producción continua",
significa el acceso al sistema con muestras adicionales, minutos
después. Por lo tanto, en cualquier momento dado hay muestras de
tejido en diferentes fases de tratamiento. En otras palabras, con
este método, hay producción continua y flujo de muestras a lo largo
de diversas etapas del tratamiento del tejido. En contraste con
este método, actualmente se requiere el tratamiento en lotes porque
la metodología convencional tarda ocho horas o más. Las muestras se
colocan en instrumentos automatizados, a los que no se puede
acceder con muestras adicionales hasta que se completa todo el
ciclo de instrumentos. Todas estas muestras de tejido están en la
misma fase del tratamiento en cualquier etapa dada del ciclo de
instrumentos.
Aún otro objeto de la invención es proporcionar
reactivos no acuosos para el tratamiento rápido, de flujo continuo
de tejidos para histología.
Un objeto adicional de la invención es eliminar
la necesidad de sustancias tóxicas tales como formalina y xileno
en el tratamiento de tejidos.
Según un aspecto de la invención, una muestra de
tejido se fija, se deshidrata y se le elimina la grasa. Una mezcla
adecuada para su uso es una disolución no acuosa que comprende
agentes fijadores y de deshidratación, preferiblemente una cetona y
un alcohol; la razón en volumen de alcohol con respecto a cetona
puede estar entre aproximadamente 1:1 y aproximadamente 3:1. La
muestra de tejido se incuba durante aproximadamente 25 minutos o
menos, más preferiblemente durante aproximadamente 15 minutos o
menos e incluso más preferiblemente durante aproximadamente 5
minutos o menos. La incubación es preferiblemente entre
aproximadamente 30ºC y 65ºC, más preferiblemente entre
aproximadamente 40ºC y 55ºC, y lo más preferiblemente entre
aproximadamente 45ºC y 50ºC.
Otro aspecto de la invención es la fijación, la
deshidratación, la eliminación de grasa y el aclarado de una
muestra de tejido. Una disolución preferida en este aspecto de la
invención es alcohol y un agente de aclarado. Este procedimiento
puede llevarse a cabo aproximadamente en 5 minutos o menos.
Aún en otro aspecto de la invención, una muestra
de tejido se aclara y se impregna en una disolución única que
comprende un agente de aclarado y un agente de impregnación.
Preferiblemente, este procedimiento puede llevarse a cabo
aproximadamente en 5 minutos o menos. Antes del seccionamiento, la
muestra de tejido impregnada puede incrustarse en el agente de
impregnación.
Una muestra de tejido que se ha fijado,
deshidratado y desgrasado puede impregnarse entonces en una
disolución de cera. Consecuente con la deshidratación de la muestra
de tejido, la disolución de cera tiene preferiblemente el
contenido en agua más bajo posible. Por tanto, la disolución de
cera puede prepararse antes de la impregnación calentando la cera
para evaporar cualquier agua disuelta y desgasificando a presión
reducida. La impregnación de la muestra de tejido puede tener lugar
a menos de la presión atmosférica del lugar y a temperatura elevada
para eliminar cualquier disolvente de la muestra de tejido y
extraer la disolución de cera en la muestra de tejido. El vacío
disminuye el tiempo de impregnación acelerando la difusión y
reduciendo la temperatura de evaporación de cualquier disolvente
que pueda estar presente en la muestra. La disolución de cera puede
comprender aceite mineral y/o parafina desgasificada. La
impregnación de la muestra de tejido puede completarse en
aproximadamente 15 minutos o menos; preferiblemente, completarse en
aproximadamente 10 minutos o menos. Antes del seccionamiento, la
muestra de tejido impregnada puede incrustarse en el agente de
impregnación para formar un bloque de tejido.
Otra realización de la invención es el
tratamiento de una muestra de tejido desde la fijación hasta la
impregnación en una serie de disoluciones, al menos algunas de las
cuales son mezclas que realizan más de una tarea al mismo tiempo:
fijación, deshidratación, eliminación de grasa e impregnación. La
mezcla puede incluir un fijador, un agente deshidratante y un
disolvente de grasa (por ejemplo, cetona y alcohol). Otra
disolución puede incluir fijador, agente deshidratante, disolvente
de grasa y agente de aclarado. Aún otra disolución puede incluir un
agente de aclarado y un agente de impregnación. La muestra de
tejido puede impregnarse en una disolución de cera compuesta por
una mezcla de diferentes longitudes de cadena (por ejemplo, a
temperatura ambiente, aceite mineral que es líquido y parafina que
es sólida). Preferiblemente, una mezcla contiene al menos dos
productos químicos diferentes (por ejemplo, dos alcoholes).
El tiempo de tratamiento puede reducirse
mediante una mezcla no acuosa (por ejemplo,
fijador-agente
deshidratante-disolvente de grasa,
fijador-agente
deshidratante-disolvente de
grasa-agente de aclarado, agente de
aclarado-agente de impregnación), energía de
microondas como fuente para lograr un calentamiento uniforme dentro
de la muestra de tejido y la reducción de la presión usando una
fuente de vacío. La difusión de la disolución en la muestra de
tejido y el intercambio químico pueden favorecerse mediante
agitación mecánica, calor, presión reducida o una combinación de
los mismos.
Las etapas anteriores pueden acelerarse
añadiendo un potenciador de la fijación, un tensioactivo o ambos a
las disoluciones usadas en el procedimiento. El potenciador de la
fijación pueden ser polietilenglicol (PEG), mono y dimetilenglicol,
propilenglicol, polivinilpirrolidona o similares; el polímero usado
puede tener un peso molecular promedio de entre aproximadamente 100
y aproximadamente 500, preferiblemente un peso molecular de
aproximadamente 300. El tensioactivo puede ser dimetilsulfóxido
(DMSO), ésteres de polioxietilensorbitano (por ejemplo, TWEEN 80),
dimetilsulfosuccinato de sodio, detergentes domésticos suaves o
similares.
El fijador puede ser una cetona (por ejemplo,
acetona, metil etil cetona), aldehído (por ejemplo, acetilaldehído,
formaldehído, glutaraldehído, glioxal), alcohol (por ejemplo,
metanol, etanol, isopropanol), ácido acético, citrato y acetatos de
plomo, sales mercúricas, ácido crómico y sus sales, ácido pícrico,
tetróxido de osmio o similares.
La muestra de tejido puede deshidratarse con
alcohol metílico, alcohol isopropílico, alcohol etílico, alcohol
propílico, butanol, isobutanol, etilbutanol, dioxano, etilenglicol,
acetona, alcohol amílico o similares.
Puede eliminarse grasa de la muestra de tejido
con un disolvente orgánico tal como, por ejemplo, acetona o
cloroformo.
El agente de aclarado puede ser limoneno,
benceno, tolueno, cloroformo, éter de petróleo, bisulfuro de
carbono, tetracloruro de carbono, dioxano, aceite de clavo, aceite
de cedro o similares.
La muestra de tejido puede impregnarse y/o
incrustarse en parafina, aceite mineral, ceras no solubles en agua,
celoidina, polietilenglicoles, alcohol polivinílico, agar,
gelatina, nitrocelulosas, resinas de metacrilato, resinas
epoxídicas, otros medios de plástico o similares.
En el contexto de la invención, una "muestra
de tejido" es un trozo de tejido que puede tratarse mediante los
métodos dados a conocer en el presente documento. También puede
referirse a células individuales de cualquier líquido biológico
(por ejemplo, ascitis, sangre, exudado pleural), o suspensiones
celulares obtenidas de la aspiración de órganos sólidos o el lavado
de cavidades corporales. Pueden sedimentarse células individuales
mediante sedimentación o centrifugación flotante antes del
tratamiento.
Los métodos de la invención son especialmente
adecuados para muestras de tejido en las que debe conservarse el
contacto célula-célula, la organización tisular, la
estructura de órgano o una combinación de los mismos. Una muestra
de este tipo es un corte de tejido preferiblemente de
aproximadamente 3 mm o menos en su dimensión más pequeña, más
preferiblemente de aproximadamente 2 mm o menos, incluso más
preferiblemente de aproximadamente 1,5 mm o menos y lo más
preferiblemente de aproximadamente 1 mm o menos.
La muestra de tejido puede ser fresca,
parcialmente fijada (por ejemplo, fijación en formalina al 10%
durante 2-3 horas) o fijada (por ejemplo, fijación
durante la noche en formalina al 10% o cualquier otro fijador). La
invención anterior permite el tratamiento de una muestra de tejido
desde la fijación hasta la impregnación en menos de aproximadamente
dos horas, preferiblemente menos de aproximadamente 90 minutos,
más preferiblemente menos de aproximadamente una hora, incluso más
preferiblemente menos de aproximadamente 45 minutos y lo más
preferiblemente menos de aproximadamente 30 minutos. Si la muestra
de tejido está fijada o parcialmente fijada, entonces el tiempo de
tratamiento puede acortarse en consecuencia. El tejido puede
transportarse desde la sala de operaciones hasta el laboratorio de
patología en una disolución acuosa; tal disolución de transporte
puede consistir en volúmenes iguales de un tampón acuoso y la
mezcla no acuosa descrita en el presente documento.
Tras la impregnación, la muestra de tejido puede
incrustarse para producir un bloque. El agente usado para
incrustar la muestra de tejido es preferiblemente el mismo que el
material usado para la impregnación, pero también puede usarse un
agente de impregnación diferente. La muestra de tejido bloqueada
puede montarse sobre un micrótomo para producir secciones de tejido
de entre aproximadamente 1 micrómetro y aproximadamente 50
micrómetros, preferiblemente entre aproximadamente 2 micrómetros y
aproximadamente 10 micrómetros. Las secciones de tejido pueden
tratarse adicionalmente para la tinción histoquímica, unión a
anticuerpo, hibridación/amplificación de ácido nucleico in
situ o una combinación de las mismas. Entonces se examinan
normalmente las muestras de tejido mediante microscopía, pero
pueden usarse otras técnicas para detectar propiedades celulares
para examinar la muestra de tejido tratada (por ejemplo, citometría
automatizada, autorradiografía, electroforesis de ácido
nucleico).
\newpage
La figura 1 es un diagrama de flujo que muestra
que transcurren casi 24 horas entre el momento en el que se
obtiene una muestra de tejido por un cirujano y el momento en el
que un patólogo puede preparar un diagnóstico a partir del examen
microscópico de secciones del tejido;
la figura 2 es un diagrama de flujo que muestra
que, con la presente invención, puede estar disponible el
diagnóstico del patólogo para el cirujano que proporcionó la
muestra de tejido en aproximadamente 2 horas o menos;
la figura 3 es una vista en planta esquemática
de una instalación de tratamiento de tejidos para su uso en la
invención
la figura 4 muestra un baño con agitador a modo
de ejemplo para su uso en la invención
la figura 5 muestra un horno microondas a modo
de ejemplo para su uso en la invención
la figura 6 muestra un baño de parafina a modo
de ejemplo para su uso en la invención;
la figura 7 es una ilustración esquemática de
una unidad de microondas/impregnación para su uso en la
invención;
la figura 8 es una ilustración esquemática de
una guía de corte proporcionada para su uso en la invención
la figura 9 es una vista en corte de una pinza
de tejido y un montaje de corte para su uso en la invención;
la figura 10 es una ilustración esquemática de
un soporte de tejido para su uso en la invención
la figura 11 es una ilustración esquemática de
un portatejidos
la figura 12 muestra un recipiente que aloja y
transporta tejido con el portatejidos para su uso en la invención;
y las figuras 13A-13B muestran electroforesis en
gel de agarosa de ADN y ARN, respectivamente, preparadas a partir
de muestras de tejido tratadas. En la figura 13A, el carril 1
contiene patrones de peso molecular, el carril 2 contiene una
muestra diluida de una muestra de tejido tratada según la presente
invención, los carriles 3-4 contienen muestras de
ADN de muestras de tejido tratadas según la presente invención y
los carriles 5-6 contienen muestras de ADN de
muestras de tejido tratadas según un método convencional. En la
figura 13B: los carriles 1,4 y 6 son blancos, los carriles
2-3 son muestras de muestras de tejido tratadas
según un método convencional, el carril 5 contiene una muestra de
ARN de una muestra de tejido tratada según la presente invención y
el carril 7 contiene ARN control.
Se da conocer un procedimiento y un aparato para
el tratamiento histológico continuo, rápido de tejidos. Pueden
realizarse las etapas de fijación, deshidratación, eliminación de
grasa e impregnación en menos de aproximadamente dos horas; esto
permite a un anatomopatólogo evaluar muestras poco después de
recibirlas, tal vez mientras el paciente todavía está en la sala de
operación o de recuperación. Puede reducirse la ansiedad del
paciente reduciendo el tiempo requerido para el diagnóstico
anatomopatológico. Se lleva a cabo el tratamiento rápido y continuo
mediante la disminución del espesor de las muestras de tejido, uso
de disoluciones no acuosas compuestas por mezclas, intercambio de
disolución a temperatura elevada y con agitación, calentamiento
uniforme de tejidos y disoluciones con radiación de microondas,
impregnación en presión de vacío, o una combinación de los
mismos.
Se requieren la fijación, la deshidratación y la
eliminación de grasa para la preparación de tejido antes de la
impregnación. Se facilitan estas etapas recortando el tejido hasta
un tamaño adecuado antes del tratamiento y usar soportes que
contienen tales bloques de tejido y permite su fácil transferencia
entre disoluciones para la fijación, deshidratación, eliminación de
grasa e impregnación.
La fijación inicia el endurecimiento de la
muestra de tejido y puede conservar la morfología celular
reticulando proteínas y deteniendo la degradación celular. Sin la
fijación química, las enzimas endógenas catabolizarán y lisarán la
célula y la microanatomía del tejido se alterará. Tales fijadores
pueden ser una cetona, un aldehído, un alcohol, un ácido acético,
metales pesados, ácido crómico, ácido pícrico, o tetróxido de
osmio. Indicaciones de que la fijación fue inadecuada pueden
incluir: disociación de estructuras de tejido, burbujas en las
secciones de tejido, tinción mala e irregular, células contraídas,
citoplasma amontonado, condensación y cromatina nuclear menos
definida, y autólisis/hemólisis de eritrocitos.
La deshidratación elimina el agua de la muestra
de tejido para promover el endurecimiento. La sustitución de agua
en la muestra de tejido por un agente de deshidratación también
facilita la sustitución posterior del agente de deshidratación por
el material usado para la impregnación. Se potencia este
intercambio de disolución usando un disolvente volátil para la
deshidratación. El agente de deshidratación pueden ser alcoholes de
bajo peso molecular, cetonas, dioxano, alquilenglicoles o
polialquilenglicoles. El no lograr la deshidratación de la muestra
puede conducir a la impregnación inadecuada, mala formación de
cinta durante el seccionado, hendiduras en secciones de tejido,
disociación de estructuras, cristales de agua en secciones de
tejido y mala tinción.
Se elimina la grasa en la muestra de tejido con
un disolvente porque la grasa perjudica el aclarado y la
impregnación. La eliminación de grasa inadecuada puede dar como
resultado la extensión de artefactos de secciones de tejido,
arrugamiento de las secciones de tejido y mala tinción.
Opcionalmente, se aclara la muestra de tejido.
El agente de aclarado extrae el agente de deshidratación de la
muestra de tejido y reduce su opacidad. Los ejemplos de agentes de
aclarado incluyen limoneno, benceno, tolueno, cloroformo, éter de
petróleo, bisulfuro de carbono, tetracloruro de carbono, dioxano,
aceite de clavo o aceite de cedro.
Finalmente, una vez que la muestra de tejido
está fijada y deshidratada de manera adecuada, se endurece mediante
impregnación con un agente tal como cera, celoidina,
polialquilenglicoles, poli(alcoholes vinílicos), agar,
gelatina, nitrocelulosas, resinas de metacrilato, resinas
epoxídicas u otros plásticos. Se requiere el endurecimiento
apropiado de la muestra de tejido con la conservación adecuada de
la morfología celular antes de colocar la muestra impregnada en un
bloque y obtener secciones de diez micrómetros o más delgadas con
un cuchillo de micrótomo. Los materiales de impregnación preferidos
son fórmulas de cera comerciales, mezclas de ceras de diferentes
puntos de fusión (por ejemplo, aceite mineral líquido y parafina
sólida), Paraplast, Bioloid, Embedol, plásticos y similares. Se ha
elegido la parafina para su uso en los ejemplos en el presente
documento porque es barata, fácil de manejar y el seccionado de
cintas se facilita por la coherencia de estructuras proporcionada
por este material.
Si el tratamiento de la muestra de tejido está
incompleto, los cortes de secciones por el cuchillo del micrótomo
aparecerán partidos o "fragmentados". El tratamiento de
tejidos se considera que no logra cuando se encuentra uno o más de
los siguientes problemas: los bloques de tejido incrustado son
demasiado blandos o demasiando duros, las secciones caen o muestran
una cantidad de compresión diferente del agente de incrustación,
las secciones parecen blandas, no logran formarse cintas de tejido
o están torcidas, las secciones se desmenuzan o se rompen, los
eritrocitos están lisados o se amontona el citoplasma, condensación
de cromatina, tinción basófila del nucléolo, células contraídas,
extensión de artefactos y efecto apolillado.
Para las secciones impregnadas con cera sobre
portaobjetos de vidrio, debe fundirse la cera y eliminarse antes de
la tinción o inmunohistoquímica. Se vuelve a hidratar la sección de
tejido y se analiza entonces tal como se describe a continuación
con tintes o anticuerpos. Tras completar la tinción o desarrollar
la reacción histoquímica, puede cubrirse con un cubreobjetos el
portaobjetos y verse en un microscopio. Alternativamente, puede
estudiarse la muestra teñida o marcada con anticuerpo con un
instrumento para citometría. Pueden almacenarse los bloques de
tejido para fines de archivo o estudios retrospectivos.
La presente invención es compatible con la
preparación de ácidos nucleicos, ADN o ARN, a partir de tejidos
tratados. Por tanto, es posible el estudio genético de muestras
recogidas de manera rutinaria en el laboratorio de anatomía
patológica clínica. El poder combinado de estas tecnologías será
importante. Pueden correlacionarse observaciones histológicas con
genéticas analizando una sección mediante tinción o
inmunohistoquímica, y preparando los ácidos nucleicos a partir de
una sección adyacente para el análisis genético. Por ejemplo,
pueden compararse regiones enfermas y normales de la misma sección
para detectar diferencias genéticas (por ejemplo, mutaciones,
niveles de transcripción), puede caracterizarse la progresión de la
enfermedad comparando diferencias genéticas en muestras tomadas en
varios puntos de tiempo, y puede evaluarse la evolución del tumor
siguiendo el acumulo de diferencias genéticas desde un cáncer
primario hasta la metástasis.
Muchas características distinguen la presente
invención: (a) corte fino de los tejidos antes del tratamiento; (b)
entrada continua de muestras de tejido y flujo continuo a través
del sistema; (c) eliminación del agua de las disoluciones (es decir,
disoluciones no acuosas); (d) fijación, deshidratación, eliminación
de grasa, aclarado e impregnación de tejido realizadas con
calentamiento uniforme (por ejemplo, energía de microondas); (e)
disoluciones de mezclas para
fijar-deshidratar-eliminar la grasa,
fijar-deshidratar-eliminar la
grasa-aclarar y aclarar-impregnar; y
(f) impregnación de tejido en presión reducida con agente de
impregnación desgasificado. Estas características hacen la presente
invención simple, práctica, fácil de poner en práctica y
susceptible de automatización.
Se usa la tinción de
hematoxilina-eosina para estudio histológico y
puede considerarse un patrón para la comparación por
anatomopatólogos. Además, se ha encontrado que la presente
invención es compatible con otros tintes incluyendo tintes de
tricromo, reticulina, mucicarmina y elásticos tal como se describen
en referencias generales tales como Thompson (Selected
Histochemical and Histopathological Methods, C.C. Thomas,
Springfield, Illinois, 1966), Sheehan y Hrapchak (Theory and
Practice of Histotechnology, C.V. Mosby, St. Louis, Missouri,
1973), y Bancroft y Stevens (Theory and Practice of Histological
Techniques, Churchill Livingstone, Nueva York, Nueva York, 1982).
Tales procedimientos de tinción llevarán entre 30 minutos y varias
horas para completarse, aunque procedimientos de tinción rápida
están disponibles de Fisher Scientific que requieren solamente
cinco minutos para llevarse a cabo.
Puede obtenerse tejido a partir de una autopsia,
una biopsia (por ejemplo, biopsia por endoscopia), o a partir de
una cirugía. Para cirugía de cáncer, la capacidad de proporcionar
un diagnóstico anatomopatológico a partir de una sección de tejido
teñida proporcionará al cirujano información que puede usarse antes
de la salida del paciente de la sala de operación. Por ejemplo, una
indicación del anatomopatólogo de que el cáncer está limitado al
tejido resecado puede permitir al cirujano hacer un tratamiento
conservador y conservar el tejido sano vecino. Alternativamente, un
hallazgo por el anatomopatólogo de que el cáncer no está limitado
al órgano resecado permitiría un tratamiento quirúrgico más agresivo
mientras que el paciente todavía está en la sala de operación.
Se han tratado más de 20.000 muestras de tejido
con éxito mediante la presente invención, incluyendo: cerebro,
mama, carcinoma (por ejemplo, intestino, nasofaringe, mama, pulmón,
estomago), cartílago, corazón, riñón, hígado, linfoma, meningioma,
placenta, próstata, timo, amígdala, cordón umbilical y útero. El
tejido mineralizado (por ejemplo, hueso, diente) requeriría
descalcificación antes del tratamiento mediante la presente
invención. Por ejemplo, puede descalcificarse el tejido con una
disolución de ácido clorhídrico/ácido etilendiaminotetraacético
(EDTA) de Stephens Scientific (Allegiance Healthcare Supply, nº de
catálogo 1209-1A) según las instrucciones del
fabricante.
También pueden usarse las secciones de tejido
tratadas mediante la presente invención en inmunohistoquímica. La
presente invención proporciona muestras de tejido en las que se
recupera un antígeno y se conserva, puede optimizarse la elección
del fijador para la recuperación y la conservación de antígenos
particulares. Se bloquean los sitios de unión no específicos, se
une el antígeno mediante anticuerpo específico (es decir, el
anticuerpo primario) y se elimina el anticuerpo no unido. Si se
marca con una sonda o un resto generador de señal, puede detectarse
el anticuerpo primario directamente pero se prefiere unir la sonda
a una proteína (por ejemplo, un anticuerpo secundario) que se une
específicamente al anticuerpo primario. Puede llevarse el
anticuerpo secundario frente a la región constante de la cadena
pesada o ligera del anticuerpo primario. Esto amplifica la señal
generada mediante un conjugado antígeno-anticuerpo
porque cada anticuerpo primario se unirá a muchos anticuerpos
secundarios. Alternativamente, puede producirse la amplificación a
través de otras interacciones específicas tales como
biotina-estreptavidina. Se realiza la unión de
anticuerpo en un pequeño volumen para reducir la utilización de
reactivos caros y mantener una buena tasa de unión; se reduce la
evaporación de este pequeño volumen mediante incubación en una
camera de humedad. El resto generador de señal es preferiblemente
una enzima que no está presente en el tejido de otra manera. Por
ejemplo, pueden unirse fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano al
anticuerpo secundario o conjugarse a estreptavidina. Están
disponibles sustratos para
estas enzimas que generan un producto cromogénico, fluorescente o luminiscente que pueden detectarse visualmente.
estas enzimas que generan un producto cromogénico, fluorescente o luminiscente que pueden detectarse visualmente.
Puede usarse el patrón de tinción para el
antígeno para localizar la expresión del antígeno en el contexto de
estructuras celulares reveladas mediante la contratinción. La
expresión de antígeno puede identificar el tipo de célula o tejido,
la fase de desarrollo, los marcadores de pronóstico de tumores, los
procesos metabólicos degenerativos, o infección por un
patógeno.
También puede visualizarse la unión
antígeno-anticuerpo con sondas radioactivas,
fluorescentes o de metal coloidal mediante autorradiografía,
microscopia epifluorescente o microscopia electrónica,
respectivamente. Pueden usarse sondas similares para detectar ácido
nucleico en la sección de tejido mediante hibridación in
situ para identificar mutaciones genéticas o transcriptos;
alternativamente, puede extraerse el ácido nucleico (ADN o ARN) a
partir de secciones
de tejido y analizarse directamente mediante inmunotransferencia, o amplificarse antes del análisis genético adicional.
de tejido y analizarse directamente mediante inmunotransferencia, o amplificarse antes del análisis genético adicional.
Las mutaciones pueden ser germinales y usarse
para trazar la predisposición genética a la enfermedad, o las
mutaciones pueden ser somáticas y usarse para determinar
alteraciones genéticas en la patogénesis de la enfermedad. La
enfermedad puede ser un trastorno metabólico o neurológico, tumor
maligno, defecto de desarrollo o provocada por un agente
infeccioso. La presente invención conserva el material para el
análisis genético mediante un procedimiento simple y almacenamiento
a temperatura ambiente.
Se prevé que la presente invención conservará el
tejido que dará mayores cantidades de ácido nucleico con un peso
molecular promedio superior que los tejidos tratados mediante
procedimientos convencionales.
Según un sistema a modo de ejemplo para el
tratamiento de tejidos proporcionado según la presente invención,
puede proporcionarse una serie estaciones de tratamiento de
tejidos, por ejemplo, en una única zona o unidad de tratamiento de
tejidos. Se ilustra una instalación adecuada de tratamiento de
tejidos a modo de ejemplo no limitativo en la figura 3.
La primera etapa en el procedimiento, que puede
llevarse a cabo en la instalación de tratamiento de tejidos u otro
lugar, es para preparar una muestra de tejido adecuada para el
endurecimiento y el examen final. Normalmente, se prepara un corte
del tejido de interés. Se obtiene el corte más fino posible, de
aproximadamente 1 a 3 mm y preferiblemente de 1 a 2 mm de espesor.
El tiempo de tratamiento es proporcional al tamaño del tejido
muestra que va a tratarse. Se coloca el corte de tejido en un
portatejidos en el que el tejido está contenido durante las etapas
de tratamiento inmediatamente siguientes. A continuación se coloca
el portatejidos en una primera disolución proporcionada según la
presente invención.
A modo de ejemplo, puede colocarse el soporte 10
en un vaso 12 de precipitados convencional, que tiene la primera
disolución 14 en el mismo, preferiblemente por sí ya que el
tratamiento descrito es uno sustancialmente continuo, o junto con
un número limitado de otros, portatejidos similares. Entonces se
coloca el vaso 12 de precipitados en un baño 16 con agitador, tal
como se ilustra en la figura 4, para agitar suavemente y calentar
el mismo. Se usó para este fin un baño con
incubador-agitador LAB-LINE/DUBNOFF.
En lugar de agua, ya que es nuestro objetivo minimizar la humedad a
la que las muestras de tejido están expuestas y, de hecho, en
última instancia para deshidratar la misma, se ha proporcionado
glicerina como el fluido 18 conductor de temperatura en el baño 16
con agitador. La glicerina tiene la ventaja de ser un conductor
eficaz de energía térmica, pero no se evapora. La evaporación
aumentaría de modo no deseado la humedad del entorno en el que se
trata el tejido, y requeriría reabastecimiento periódico. Porque la
glicerina no necesita reabastecimiento ni añade humedad al entorno,
es la más preferida. Para esta fase del procedimiento, la muestra
de tejido (en el soporte 10) se dispone en la primera disolución,
en el baño 18 con agitador durante aproximadamente de
3-15 minutos.
De manera deseable también se proporciona
agitación suplementaria durante la etapa de baño con agitador.
Actualmente, se proporciona una bomba (A) externa (figura 3) con un
tubo (no mostrado) desde la misma insertado en el vaso 12 de
precipitados de disolución u otro recipiente para burbujear y por
tanto agitar su contenido. Puede proporcionarse una placa o
boquilla de difusión de aeración para proporcionar una agitación de
disolución más uniforme según se considere necesario o
deseable.
Para garantizar que el portatejidos 10 y los
vasos 12 de precipitados que contienen la primera disolución
permanezcan erguidos y en una disposición deseada, hemos modificado
el baño con agitador convencional para proporcionar alambres o
soportes 20 transversales, por ejemplo, cuatro alambres, que
definen, por ejemplo, cinco canales longitudinales en los que
pueden disponerse vasos 12 de precipitados que contienen
portatejidos. Por tanto, por ejemplo, pueden añadirse regularmente
vasos 12 de precipitados que contienen muestra al baño 18 con
agitador y retirarse a su vez del mismo muestras de tejido tratadas
de manera suficiente para un tratamiento adicional tal como se
describe a continuación en el presente documento, añadiendo nuevas
muestras en el extremo izquierdo del baño con agitador y retirando
las muestras tratadas de manera suficiente del extremo derecho del
mismo.
A continuación se expone el portamuestras 10 de
tejido a una serie de fluidos mientras se agita simultáneamente y
se somete a radiación por microondas. En la realización propuesta
actualmente, se proporcionan tres unidades de microondas, tal como
se muestra en la figura 3, teniendo cada una una disolución
diferente en la que el soporte que contiene muestra de tejido se
sumerge durante un periodo recomendado. En la alternativa, puede
proporcionarse una única fuente de energía de microondas. Sin
embargo, esto requeriría la colocación secuencial de las
disoluciones respectivas para recibir el portatejidos. Aunque para
una única muestra de tejido tal colocación y sustitución de
disolución no aumentaría significativamente la duración del ciclo
de tratamiento de tejido, puede apreciarse que el uso de un único
microondas que recibe múltiples disoluciones, puede impedir la
continuidad del procedimiento con respecto a las muestras
posteriores. De hecho, cuando se proporciona una serie de unidades
de microondas, a medida que una muestra de tejido dada se mueve de
un microondas al siguiente que tiene la siguiente disolución,
entonces puede recibirse una muestra de tejido posterior en la
primera unidad de microondas. Por tanto, proporcionar una unidad
para cada una de las disoluciones respectivas significa que no es
necesario mantener en espera una muestra de tejido posterior
mientras se han completado todas las etapas de tratamiento por
microondas de la muestra anterior. Sin embargo, debe entenderse que
con el impedimento de continuidad observado, las tres unidades de
microondas ilustradas puede reducirse a dos o incluso una.
Igualmente, pueden combinarse o subcombinarse otras etapas en el
procedimiento según se considere necesario o deseable desde un
punto de vista de equilibro de continuidad del procedimiento frente
a posible reducción en mano de obra, equipo, requisitos de espacio,
etc. Una unidad más compacta de este tipo a modo de ejemplo se
trata con más detalle a continuación, con referencia a la figura
7.
Con referencia ahora a la figura 5, se ilustra
una unidad 22 de microondas a modo de ejemplo para el tratamiento
del tejido. Para aplicar radiación de microondas, se usan
actualmente hornos microondas de laboratorio obtenidos de Energy
Beam Sciences, Inc. Se han usado dos modelos de procesador de
microondas, H-2800 y H-2500. Puede
utilizarse cualquiera de los modelos u otro sistema similar de este
tipo. A modo de ejemplo, se utiliza Pyrex u otro recipiente 24 de
fluido transparente que puede someterse a microondas para contener
respectivamente las disoluciones segunda, tercera y cuarta
proporcionadas según la invención en cada una de las tres unidades
de microondas (figura 3). Se coloca una sonda 26 de temperatura en
la disolución para garantizar que la temperatura del baño
respectivo está dentro del intervalo deseado. Además, para
proporcionar la agitación, que acelera el tratamiento del tejido,
se proporciona aeración. Las unidades microondas que se han usado
incluyen un tubo 28 para la aeración. Puede insertarse un único
tubo en el baño, pero para una agitación más uniforme y completa,
lo que más se prefiere es proporcionar una placa de difusión o
cabeza de boquilla (no mostrada en detalle) en colaboración con el
tubo 28 de gas para difundir las burbujas de agitación, por
ejemplo, a través de una parte sustancial del diámetro del
recipiente de disolución para la agitación uniforme de todo el
volumen de disolución. Tales boquillas y placas de difusión se
conocen bien y pueden proporcionarse, por ejemplo, en la base del
recipiente de disolución.
Convencionalmente, se desgasifica parafina como
parte del procedimiento de tratamiento del tejido. La
desgasificación elimina los disolventes orgánicos de la parafina.
Para potenciar este procedimiento, y para volver a utilizar la
parafina en el sistema se propone una desgasificación continua.
Esto se logra manteniendo el vacío dentro del Pyrex 32 cubierto a
640 mm de Hg.
Tras las tres etapas secuenciales que emplean
radiación por microondas, se coloca(n) el/los portamuestras
de tejido en un baño de parafina, tal como se muestra en la figura
6. Actualmente, se proporciona un baño de parafina que comprende
tres estaciones (vasos de precipitados) 30 de baño de parafina
dentro de un recipiente 32 Pyrex cubierto. Para los fines de
control de la temperatura, el recipiente 32 Pyrex se coloca, por
ejemplo, en un baño 34 de agua de marca Poly Science. Aplicando una
grasa o similar a los bordes interiores de los flancos tanto en la
tapa como en el recipiente, puede proporcionarse un acoplamiento
estanco al aire entre la tapa y el recipiente y por tanto puede
extraerse un vacío a través de un conector 36 de manguito
mecanizado proporcionado en la tapa. Hay recipientes de la marca
Pyrex de este tipo adecuadas disponibles de Fisher Scientific. Se
usó el modelo número 01-092-25. Para
crear un vacío en el recipiente 32 Pyrex, se acopla una bomba 38 de
presión/vacío convencional a un tubo 40 que a su vez se acopla a un
conector 36. Existe una bomba motorizada adecuada de este tipo
disponible de Fisher Scientific y tiene por ejemplo un máximo de
100 psi. Preferiblemente se proporciona agitación durante la etapa
de baño de parafina, ya sea mediante agitación por vibración,
ultrasonidos o potencialmente mediante aeración.
\newpage
A continuación debe incrustarse la muestra de
tejido. Con ese fin se usa un sistema (I) de consola de
incrustación Tissue-Tek convencional (figura 3)
disponible de Miles/Sakura, por ejemplo modelo número 4708.
Entonces se corta la muestra de tejido
incrustada de una manera convencional con un micrótomo (L) (figura
3) y se hace flotar (M) para su colocación, se usa un instrumento
Leitz 1512 Microtome, y el Lipshaw Electric Tissue Float modelo
375.
Tras disponer el corte sobre el portaobjetos, se
calienta el portaobjetos para eliminar la parafina. Se usó un
instrumento Isotemp Oven de la serie 300 disponible de Fisher (K)
(figura 3).
A continuación se tiñen los portaobjetos. Para
acelerar el procedimiento de tinción, se propone usar un
instrumento (0) de tinción automático (figura 3) para reducir el
número de personal y tiempo requerido. Un procedimiento no continuo
puede usar el instrumento de tinción diversificado de Sakura
DRS-601 que tiñe los portaobjetos en lotes; de modo
alternativo, un procedimiento continuo puede usar un instrumento de
tinción automático de Leica XL que contiene una fase de
desparafinado de modo que puede omitirse la incubación separada en
un horno. Entonces se cubre la muestra de tejido fijada y teñida,
por ejemplo con el cubreobjetos Tissue-Tek,
fabricante número 4764 (R)
(figura 3).
(figura 3).
Tal como se describió anteriormente, el sistema
para llevar a cabo la deshidratación y la impregnación según la
invención puede ser una serie de unidades diferenciadas. En la
alternativa, tal como se observó anteriormente, pueden llevarse a
cabo una o más etapas en una única unidad o componente de
tratamiento. Tal como también se trató anteriormente, el número de
unidades proporcionadas y las etapas llevadas a cabo por cada
unidad afecta a la continuidad de la unidad de tratamiento. Por
tanto, en entornos de poco volumen, una única unidad para llevar a
cabo una pluralidad de etapas del tratamiento del tejido puede ser
ventajosa y no afectará significativamente a la continuidad del
tratamiento del tejido. En entornos de sistemas de mayor volumen,
pueden preferirse dos o más unidades.
En la figura 7 se ilustra una unidad 42
combinada a modo de ejemplo. La unidad 42 combinada incluye de
hecho dos subunidades; una unidad 44 de procesador de microondas y
una unidad 46 de impregnador. La unidad 44 de procesador de
microondas se proporciona para sumergir secuencialmente el tejido
que está tratándose en disolución A, disolución B y disolución C,
en cada caso agitando la disolución y exponiendo el tejido a
energía de microondas. Por tanto, en la realización ilustrada, se
proporciona un recipiente 48 para recibir por ejemplo una o más
bandejas 50 sobre las cuales puede colocarse uno o más portatejidos
10. El recipiente 48 está acoplado de manera fluida a una fuente de
cada una de las disoluciones para la deshidratación del tejido. Por
tanto, una vez colocado(s) el/los portatejidos sobre
la(s) bandeja(s) 50 respectiva(s), se
transporta disolución A al recipiente 48 y se aplica energía de
microondas al mismo de manera simultánea a la agitación por medio,
por ejemplo, de un tubo de aireación (no mostrado en la figura 7).
Tras haber transcurrido un tiempo de exposición suficiente, se
drena la disolución A y preferiblemente se aclaran los portatejidos
o bien con disolución B o bien con una combinación de disolución A
y disolución B de manera que se elimina sustancialmente la
disolución A residual. Entonces se alimenta disolución B al
recipiente 48 tras lo cual vuelven a aplicarse energía de
microondas y agitación durante un periodo recomendado. Al finalizar
la administración de disolución B, se devuelve la disolución B al
recipiente de almacenamiento para la misma y se lavan las muestras
de tejido o bien con disolución C o bien con una combinación de
disolución B y disolución C. Posteriormente, se alimenta disolución
C al recipiente 48, se aplican agitación y energía de microondas, y
finalmente se drena la disolución C. Entonces las muestras de
tejido están listas para la impregnación.
En la realización ilustrada la impregnación se
lleva a cabo en una segunda subunidad 46 del montaje. Esto permite
que se lleve a cabo la impregnación mientras que se
somete(n) muestra(s) de tejido a aplicación de
energía de microondas. Si se proporciona una única unidad, entonces
el recipiente usado para el tratamiento por microondas puede usarse
para la impregnación sin embargo no se aplicará energía de
microondas al mismo durante las etapas de impregnación.
Según el procedimiento de impregnación
propuesto, se aplica una serie de disoluciones de parafina, por
ejemplo, 3 ó 4, a los portatejidos dispuestos por ejemplo sobre
bandejas 52 adecuadas en un recipiente 54, para proporcionar baños
de parafina secuenciales para realizar la impregnación de la
muestra de tejido como una etapa final en el procedimiento de
preparación de tejido. En la subunidad 46 de impregnador, se
colocan las muestras de tejido a vacío a una temperatura elevada
controlada. Preferiblemente también se agitan las muestras de
tejidos durante esta etapa con un agitador magnético, ultrasonidos
o burbujeador de aire.
Las etapas de incrustación restantes, etc. de
preparación de portaobjetos se llevan a cabo tal como se expuso
anteriormente con referencia a la figura 3.
Se han desarrollado aparatos e instrumentos
especializados para facilitar el tratamiento del tejido en general.
Estos instrumentos y aparatos se describen en el presente documento
a continuación.
Tal como se observó anteriormente, es difícil
cortar un corte fino de una muestra de tejido sólida. Por otra
parte, es deseable, en cuanto a la minimización del tiempo de
deshidratación y de fijación, cortar el tejido lo más finamente
posible antes del procedimiento de deshidratación. Para facilitar
la creación de un corte fino se han propuesto tres instrumentos
para ayudar al anatomopatólogo. Uno, denominado por conveniencia en
el presente documento como una guía 60 de corte, tal como se
ilustra en la figura 8, está en forma de una placa 62 de metal fina
del orden de, por ejemplo, 1 a 2 mm de espesor, que tiene un
recorte 64 con un ancho de, por ejemplo, una uña de pulgar
(aproximadamente 1 cm^{2}). Se define un tope 66 al final del
recorte o muesca 64 para servir como tope de cuchillo o cuchilla.
Para facilitar recoger la guía 60 de corte de una superficie lisa y
otra superficie de corte, puede proporcionarse un borde 68 en el
extremo de la placa 62 de metal, alejado de la muesca de corte.
Para proporcionar un corte de tejido fino, se coloca un segmento
mayor de tejido sobre el recorte o muesca 64 de modo que se dispone
un corte del mismo en la muesca. Entonces se aplica presión a la
superficie expuesta del tejido y se coloca un instrumento de corte
contra, y se desliza horizontalmente a lo largo de, la placa de
guía de corte de manera que se corta el tejido dispuesto en la
muesca 64 del resto del tejido. El ajuste de la cuchilla de corte
con el tope 66 de cuchilla completa el procedimiento de corte y el
grueso del tejido, dispuesto sobre el corte, se coloca a un lado.
Entonces puede colocarse el resto del tejido, dispuesto en la
ranura, en un portatejidos adecuado para la deshidratación y la
impregnación.
Tal como puede apreciarse, la guía 60 de corte
facilita la producción de un corte fino de tejido de espesor
generalmente uniforme que puede tratarse adicionalmente.
Como otra alternativa para producir un corte
fino de tejido, se ha propuesto proporcionar placas o bloques 70
lisos en el extremo de pinzas 72 por lo demás convencionales, tal
como se ilustra esquemáticamente en la figura 9. Los bloques pueden
fijarse permanente o temporalmente a los extremos de las pinzas.
Esto proporciona superficies 74 de apriete lisas, bastante grandes.
El tejido que va a cortarse puede colocarse entre los bloques 70 de
apriete y una cuchilla afilada que se hace pasar entre los bloques
de apriete para cortar el tejido. Cortando cerca de una de las dos
superficies 74 lisas generalmente planas, puede proporcionarse un
corte de tejido fino de espesor generalmente uniforme. Las
superficies lisas paralelas bastante grandes proporcionan una
distribución de presión uniforme sujetando así el tejido en
posición durante el procedimiento de corte garantizando entonces un
corte uniforme que conserva preferiblemente la integridad del
tejido.
Para sujetar el tejido en posición durante el
corte también se ha propuesto un instrumento 92 de tipo tenedor de
tres púas, ilustrado en la figura 10. En la realización ilustrada,
las púas 94 están separadas entre sí por aproximadamente un
centímetro y cada una tiene una punta 96 afilada, puntiaguda para
facilitar la penetración del tejido con una perturbación mínima. Al
sujetar el tejido en una plancha de cortar con las púas 94 del
instrumento 92, pueden obtenerse porciones adecuadas de tejido
cortando en paralelo a o entre las púas. En la realización
ilustrada, el instrumento 92 se caracteriza porque las púas tienen
una longitud del orden de 5-10 cm para adaptarse a
una variedad de muestras y un mango de aproximadamente 8
centímetros de longitud, él mismo separado de las púas por
2-4 centímetros, para facilitar la manipulación del
instrumento y un agarre seguro durante el corte. Se ha encontrado
que el instrumento 92 de tipo tenedor es particularmente ventajoso
para obtener secciones de órganos tales como el intestino y la
vesícula biliar. De hecho, la fijación de tales muestras con púas
94 evita que las diversas capas de tejido se deslicen entre sí
durante el procedimiento de corte.
También se ha propuesto proporcionar un soporte
y una unidad de recepción de tejido para su uso en la sala de
operaciones, para facilitar el transporte de tejido,
particularmente segmentos muy pequeños de tejido, por ejemplo los
obtenidos mediante biopsia con aguja. Cuando se coloca tal tejido
sometido a biopsia directamente, por ejemplo, en un recipiente de
disolución adecuada, a menudo puede ser difícil para el técnico de
laboratorio retirar la muestra de tejido de un minuto del
recipiente y en particular garantizar que se retira todo el tejido
sometido a biopsia. Por tanto, tal como se ilustra en las figuras
11 y 12, se ha propuesto proporcionar portatejidos 10' para la sala
de operaciones para alojar inmediatamente tales muestras de tejido
de un minuto.
Para contener tales muestras de tejido dentro
del portatejidos 10', se han proporcionado láminas finas de
material 80 de esponja de biopsia, que es una espuma plástica de
células abiertas, al menos una de las cuales tiene rebajes 82 de
profundidad parcial definidos en la misma para proporcionar, junto
con la otra esponja de biopsia un compartimento para alojar el
tejido sometido a biopsia. Por tanto, en la sala de operaciones
puede disponerse el tejido sometido a biopsia inmediatamente en la
porción 82 rebajada de las esponjas 80 de biopsia y cerrarse el
portatejidos 10'. Para mantener la integridad del tejido para el
transporte al laboratorio de tratamiento, se coloca el portatejidos
10' dentro del recipiente de disolución adecuada. Para facilitar
la recuperación del soporte y garantizar que se mantiene totalmente
sumergido en la disolución, se ha proporcionado un recipiente 86 de
muestras que tiene un soporte 88 de columna que sobresale desde la
tapa 90 y que tiene una estructura en la punta de la misma 90 para
acoplarse con una estructura 84 complementaria en el portatejidos
10'. La figura 12 muestra el portatejidos 10' fijado por su
superficie superior. Sin embargo, son posibles puntos de fijación
alternativos tales como la superficie inferior o el lado con
bisagra del soporte. Además, pueden fijarse dos o más soportes al
soporte 88 de columna.
Por tanto el portatejidos 10' con el tejido
sometido a biopsia en el mismo puede fijarse temporalmente al
extremo distal del soporte 88 de columna e insertarse en una
disolución adecuada para su transporte. En el laboratorio de
tratamiento del tejido, se retira la tapa 90 del recipiente 86 y se
retira el portatejidos 10' de la columna 88. Puede proporcionarse
cualquier elemento de sujeción adecuado tal como elemento de
sujeción de tipo velcro, cierre rápido de plástico, conectores de
portaobjetos de cola de milano u otra estructura de ajuste
cooperativo para fijar el portatejidos 10' a la columna 88 de
soporte. La disolución dentro del recipiente 86 de muestra puede
ser una disolución de transporte (acuosa) o la primera disolución
(no acuosa). Sería conveniente proporcionar el recipiente de
muestra en la sala de operaciones con el soporte fijado al exterior
del recipiente y entonces dar la vuelta a la tapa de modo que el
soporte se sumerge en la disolución dentro del recipiente tras
colocar el tejido dentro del soporte.
La presente invención tendrá muchas ventajas
sobre métodos convencionales en las áreas de la práctica de
patología, atención al paciente, investigación biomédica y
educación.
La disponibilidad de diagnóstico microscópico de
muestras de tejido en el plazo de aproximadamente 40 minutos a
aproximadamente 2 horas tras la recepción permitirá una interacción
clínica rápida, o incluso a tiempo real, entre la intervención
quirúrgica y la evaluación patológica. Esto puede provocar mejoras
significativas en la atención al paciente eliminando o reduciendo
hasta un mínimo la ansiedad del paciente durante la espera del
diagnóstico de enfermedad, pronóstico y planeamiento de
tratamiento.
En consecuencia, habrá una reordenación drástica
del flujo de trabajo en los laboratorios de patología. El espacio
de laboratorio clínico, experiencia anatomopatológica, y el
personal de oficina y técnico se utilizará más eficazmente. El
flujo de trabajo continuo mejorará la accesibilidad y capacidad de
respuesta de anatomopatólogos que tratan y evalúan muestras,
reducirá el número de anatomopatólogos necesarios para tratar y
evaluar muestras, y también puede mejorar la educación médica,
particularmente la accesibilidad y capacidad de respuesta de
programas de residencia.
El volumen menor de reactivos dará como
resultado ahorros de coste. La eliminación de formaldehído y xileno
y la reducción de requisito de otros productos químicos peligrosos
proporcionarán beneficios para el medioambiente y aumentará la
seguridad en el laboratorio.
La normalización de los procedimientos de
fijación y tratamiento de tejido facilitará la comparación de
muestras de diferentes laboratorios. Se eliminarán artefactos en
histología debido al uso de formaldehído y/o tratamiento
prolongado; permitiendo por tanto una evaluación más precisa de la
morfología microscópica de tejidos normales y enfermos. De manera
similar, se mejorará la tinción y recuperación de antígenos. Para
el análisis genético, se eliminarán las mutaciones de ADN inducidas
por formaldehído y puede potenciarse la extracción de ácido
nucleico a partir de material de archivo. La viabilidad de estudios
de ARN a partir de tejido almacenado, incrustado en parafina,
fijado abre caminos ilimitados para aplicaciones de diagnóstico y
de investigación.
Se pretende que los siguientes ejemplos sean
ilustrativos de la presente invención; sin embargo la práctica de
la invención no se limita de ninguna manera a los mismos.
De referencia, no según la presente
invención
Se guardaron cortes de dos mm de espesor o más
delgados de tejido fresco o fijado previamente en portatejidos y se
colocaron en una primera disolución no acuosa de:
- alcohol isopropílico al 40%,
- acetona al 40%,
- polietilenglicol al 20% (peso molecular promedio 300), y
- dimetilsulfóxido (DMSO) al 1% (es decir, 10 ml por litro de la mezcla anterior).
Se incubaron las muestras de tejidos durante 15
min. a una temperatura de baño de glicerina entre 45ºC y 50ºC. Se
colocó la disolución de 400 ml para la fijación en un vaso de
precipitados de 500 ml en un agitador de baño de agua
(desplazamiento lineal de 5 cm/s). Se proporcionó agitación
adicional de la disolución de fijación burbujeando con una bomba de
aire.
Se llevan a cabo la fijación, deshidratación,
eliminación de grasa, aclarado e impregnación mediante exposición
secuencial de la muestra de tejido a tres disoluciones diferentes
(las segunda, tercera y cuarta disoluciones descritas
anteriormente), una en cada uno de los tres hornos microondas de
Energy Beam Sciences. Se coloca una disolución de un litro de
alcohol isopropílico al 70% y polietilenglicol al 30% (peso
molecular promedio 300) en el primer horno (modelo H2800) en un
vaso de precipitados de 1500 ml, la disolución en el segundo horno
(modelo H2800) consiste en un litro de alcohol isopropílico al 70%
y de xileno al 30% en un vaso de precipitados de 1500 ml, y el
tercer horno (modelo H2500) contiene una disolución de 1000 ml de
xileno y 300 g de parafina en un vaso de precipitados de 1500 ml.
Se añaden diez ml de DMSO por litro a estas tres disoluciones. Se
realiza el calentamiento a 60ºC mediante radiación de microondas
durante 15 minutos en el primer horno, y durante 5 minutos en cada
uno de los segundo y tercer hornos (fijándose al 75% de potencia
con un ciclo de 2 segundos).
Para continuar la impregnación con parafina tras
completar las etapas de radiación de microondas, se incubaron las
secciones de tejido en cuatro baños de 500 ml de parafina fundida
dentro de un desecador grande cargado con parafina que está apoyado
en un baño de glicerina a 75ºC. Se transfirieron las secciones de
tejido desde un baño de parafina hasta el siguiente a intervalos de
3 minutos, durante un tiempo de impregnación total de 12 minutos.
Se midió cada intervalo de 3 minutos a partir del tiempo en el que
la lectura de presión era de aproximadamente 640 mm de Hg. No se
usó agitación durante esta etapa.
Se llevaron a acabo la fijación, deshidratación,
eliminación de grasa e impregnación con parafina de secciones de
tejido frescas o fijadas, de aproximadamente 1 mm de espesor, en 40
minutos mediante la exposición de estas secciones de tejido a
cuatro etapas sucesivas tal como sigue.
Etapa
1
En este ejemplo, la primera disolución consistía
en:
- alcohol isopropílico al 60%,
- acetona al 10%,
- polietilenglicol al 30% (peso molecular promedio 300), y
- dimetilsulfóxido (DMSO) añadido a una concentración aproximada del 1% del volumen total. Un litro de esta disolución es suficiente para fijar 60 muestras de tejido contenidas en portatejidos. Se incubaron las muestras a 55ºC en un procesador comercial de microondas para tejidos (H2500 o H2800, Energy Beam Sciences) durante 5 min. en cada una de las series de tres baños que contenían la primera disolución (incubación total de 15 min.); se obtuvo la agitación de la disolución burbujeando para acelerar el intercambio de disolución.
Etapa
2
Se incubaron las muestras en una disolución de
alcohol isopropílico al 70%, acetona al 30%, y DMSO añadido a una
concentración aproximada del 1% a 60ºC. Se calentaron las muestras
en un procesador de microondas para tejidos (H2800, Energy Beam
Sciences) durante 5 min. en cada uno de los dos vasos de
precipitados que contenían la disolución (incubación total de 10
min.), que se agitaron burbujeando.
Etapa
3
Tras la irradiación de microondas, se inició la
impregnación mediante incubación en una disolución de cera de
aceite mineral al 25% y de parafina fundida al 75% colocada en un
desecador grande que está apoyado en un baño de glicerina a 60ºC o
70ºC, a vacío de aproximadamente 200 mm de Hg, durante 5 min. Se
desgasificó la parafina antes de su uso tal como se describe en el
ejemplo 1.
Etapa
4
Se completó la impregnación mediante incubación
en cuatro baños de parafina fundida colocados dentro de un
desecador grande que está apoyado en un baño de glicerina a 75ºC.
Se transfirieron las secciones de tejido desde un baño de parafina
hasta el siguiente s intervalos de 3 min., durante un tiempo de
total de impregnación de 12 min. Se midió cada intervalo de tres
min. para el tiempo en el que la lectura de presión es de
aproximadamente 640 mm de Hg.
En este ejemplo se añadieron 6 ml de una
disolución madre de indicador de color (10 g de azul de metileno en
1000 ml de alcohol isopropílico) a cada una de las disoluciones de
alcohol isopropílico y acetona. Las muestras de tejido adquieren
una tinción azul que facilita su manejo durante la impregnación y
manejo; también puede monitorizarse la penetración de la muestra de
tejido mediante la observación de un color azul uniforme a lo largo
de la muestra de tejido.
Pueden llevarse a cabo la fijación,
deshidratación, eliminación de grasa e impregnación con parafina de
secciones de tejido frescas o fijadas, de hasta aproximadamente 1 a
2 mm de espesor, en 65 minutos tal como sigue.
Etapa
1
En este ejemplo, la primera disolución consiste
en:
- alcohol isopropílico al 40%,
- acetona al 40%,
- polietilenglicol al 20% (peso molecular promedio de 300),
- ácido acético glacial añadido a una concentración aproximada del 0,5% del volumen total, y
\newpage
- dimetilsulfóxido (DMSO) añadido a una concentración aproximada del 1% del volumen total. Un litro de esta disolución es suficiente para fijar 60 muestras de tejido contenidas en portatejidos. Se incuban las muestras a 65ºC en un procesador comercial de microondas para tejidos (H2500 o H2800, Energy Beam Sciences) durante 15 min. en un vaso de precipitados de 1500 ml que contiene la primera disolución; se obtiene la agitación de la disolución burbujeando para acelerar el intercambio de disolución.
Etapa
2
Se incuban las muestras en una disolución de
alcohol isopropílico al 55%, acetona al 25%, polietilenglicol al
10% (peso molecular promedio de 300), aceite mineral de baja
viscosidad al 10%, ácido acético glacial añadido a una
concentración aproximada del 0,5% del volumen total, y DMSO añadido
a una concentración aproximada del 1%. Se calientan las muestras a
65ºC en un procesador comercial de microondas para tejidos (H2800,
Energy Beam Sciences) durante 15 min. en un vaso de precipitados de
1500 ml que contiene la disolución, que se agita burbujeando.
Etapa
3
Se incuban las muestras en una disolución de
alcohol isopropílico al 55%, acetona al 25%, aceite mineral de baja
viscosidad al 20%, ácido acético glacial añadido a una
concentración aproximada del 0,5% del volumen total y DMSO añadido
a una concentración aproximada del 1% del volumen total. Se
calientan las muestras a 65ºC en un procesador comercial de
microondas para tejidos (H2800, Energy Beam Sciences) durante 5
minutos en un vaso de precipitados de 1500 ml que contiene la
disolución, que se agita burbujeando.
Etapa
4
Tras la irradiación de microondas, se inicia la
impregnación mediante incubación en dos baños de una disolución de
cera de aceite mineral de baja viscosidad al 30% y de parafina
fundida al 70% colocada en un desecador grande que está apoyado en
un baño de glicerina a 60ºC, a un vacío de aproximadamente 640 mm
de Hg, durante 5 min. en cada baño.
Etapa
5
Se completa la impregnación mediante incubación
en cuatro baños de parafina fundida colocados dentro de un
desecador grande que está apoyado en un baño de glicerina a
aproximadamente de 75ºC a 80ºC y una presión reducida de
aproximadamente 640 mm de Hg, durante 5 min. cada uno. Se
transfirieron las secciones de tejido desde un baño de parafina
hasta el siguiente en intervalos de 5 min., durante un tiempo total
de impregnación de 20 min. Se midió cada intervalo de 5 min. para
el tiempo en el que la lectura de presión es de aproximadamente 640
mm de Hg.
Ejemplo 2 de
referencia
Se cortan secciones de parafina en un micrótomo
hasta un espesor de 3 micrómetros, se colocan en un baño de agua y
se hacen flotar sobre un portaobjetos de vidrio. Se fundió la
parafina colocando los portaobjetos o bien en un horno a 58ºC
durante 30 minutos o bien preferiblemente en un horno a 37ºC
durante aproximadamente 18 horas o durante la noche, y entonces se
les eliminó la cera en un baño de xileno durante 10 minutos. Se
volvieron a hidratar los portaobjetos en disoluciones de etanol
decrecientes durante 1 min. cada una (dos baños de absoluto, dos
baños al 95% y un baño al 90%) y se enjuagaron sumergiéndolos en
agua corriente durante 2 minutos.
Se bloqueó la peroxidasa endógena con una
disolución de peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}) al 6% y
metanol, o 35 ml de H_{2}O_{2} al 6% con 140 ml de metanol, se
incubó durante 15 min. Se enjuagaron los portaobjetos
sumergiéndolos en agua corriente durante 2 min. y en PBS durante 2
min., después se secaron.
Se transfirieron los portaobjetos a una cámara
de humedad y se añadió suero de caballo normal (NHS) para bloquear
durante 10 min. Se decantó el suero de caballo normal en exceso del
portaobjetos y se incubó un anticuerpo primario específico durante
30 min. sobre la sección de tejido en una cámara de humedad a
temperatura ambiente. Se lavaron los portaobjetos con PBS con
movimiento hacia atrás y hacia adelante usando un frasco lavador,
se sumergieron en un baño de PBS durante 2 min., y se eliminó por
secado el PBS en exceso de cada portaobjetos. Se añadió disolución
de unión (también conocida como anticuerpo secundario o anticuerpo
anti-ratón o anti-conejo
biotinilado) a cada sección de tejido y se incubó durante 25 min.
en una cámara de humedad. Se lavaron los portaobjetos con PBS
usando un frasco lavador, se sumergieron en un baño de PBS durante
2 min., y se eliminó por secado el PBS en exceso de cada
portaobjetos.
Se desarrolló la señal según las instrucciones
del fabricante (Vector Laboratories). Se añadió una disolución de
ABC a la sección de tejido y se incubó durante 25 min. en una
cámara de humedad. Se lavaron los portaobjetos con PBS en un frasco
lavador y sumergieron en una rejilla en un baño de PBS durante 2
min. Se sumergió la rejilla en un baño de cromógeno DAB durante 6
min., después se sumergió bajo agua corriente para lavar
cuidadosamente durante 4 min. Se contratiñeron las secciones de
tejido con hematoxilina (el tiempo de tinción dependerá de la
antigüedad de la hematoxilina) durante desde 15 s hasta 90 s. Se
lavaron los portaobjetos bajo agua corriente durante 3 min. para
eliminar la contratinción en exceso, se deshidrataron en baños de
alcohol (durante aproximadamente 10 s en cada uno) desde el 85%
hasta el 100%, se limpiaron en xileno y se cubrieron con
cubreobjetos.
Se ha demostrado una mejor reactividad
antigénica para el receptor de progesterona, antígeno relacionado
con el factor VIII, CD-31, CD-68,
citoqueratina-7, cromogranina y antígeno de músculo
liso, probablemente debido a la mejor conservación del
antígeno.
| Conejo (R) | Microondas (M) | Incubación de 30' |
| Ratón (MigG) | Tripsina (T) | Incubación de 45' |
| Ratón (MigM) | Proteasa (P) | Incubación de 90' |
| Cabra (G) | Verde rápido (FG, Fast Green) |
Se colocaron dos secciones de tejido de seis
micrómetros en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se añadieron
800 \mul de xileno y se mezclaron mediante agitación con vórtex,
se añadieron 400 \mul de etanol absoluto y se mezclaron mediante
agitación con vórtex, se centrifugó el tubo durante 5 minutos en
una microcentrífuga de alta velocidad y se decantó el sobrenadante.
Al sedimento, se le añadieron 800 \mul de etanol absoluto y se
mezclaron mediante agitación con vórtex.
Se decantó el sobrenadante tras la
centrifugación tal como anteriormente y se añadieron 100 \mul de
una disolución de proteinasa K/detergente (NP40 al 1% o Triton
X-100, 2,4 \mul de proteinasa K 2,5 mg/ml) al
sedimento y se incubó a 55ºC durante una hora. Se inactivó la
proteinasa K mediante incubación a 95ºC durante 10 min. Se conserva
el sobrenadante que contiene ADN tras la centrifugación en la
microcentrífuga durante 5 min. Este material está listo para PCR.
Debe precipitarse y extraerse adicionalmente si se planea una
transferencia de tipo Southern. Se requerirán más secciones para
obtener ADN suficiente para los análisis de restricción.
La figura 13A muestra que la cantidad y calidad
del ADN amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), son comparables entre muestras preparadas según la presente
invención (ejemplo 1) y mediante tratamiento convencional de
tejidos (Tissue-Tek VIP histoprocessor,
Miles-Sakura, usado según las instrucciones del
fabricante).
Se cortaron diez secciones (de 7 \mum cada
una) de un bloque de parafina usando cuchillas desechables; se
prepararon los bloques según la presente invención y mediante
tratamiento convencional de tejidos tal como se describe en el
ejemplo 5. Se colocaron en tubos Falcon de 50 ml, se desparafinaron
con 20 ml de xileno y el tejido restante se lavó entonces dos
veces con alcohol absoluto durante 30 minutos. Se suspendió el
tejido a 0,5 g/ml en una disolución que contenía tiocianato de
guanidinio 4 M, citrato de Na 25 mM pH 7,0,
N-laurilsarcosina al 0,5%, y 0,1 M de
2-mercaptoetanol. Se mezcló la disolución mediante
agitación con vórtex y se fragmentó el ADN mediante pase a través
de una aguja de jeringa de calibre 18 a 22.
Se puso cuidadosamente la disolución que
contenía ARN en 2,8 ml de CsCl 5,7 M en varios tubos de centrífuga
de 5 ml (Sorvall), y se sedimentó el ARN mediante centrifugación en
un rotor SW55Ti a 35.000 rpm y 18ºC durante 14 horas en una
ultracentrífuga Beckman L8-53. Se eliminó
cuidadosamente la fracción superior para dejar un sedimento de ARN
en el fondo del tubo. Se resuspendió el sedimento con agua libre de
ribonucleasa, y se centrifugó el tubo Eppendorf a 14.000 rpm
durante 10 min. Se conservó el sobrenadante que contenía ARN y se
midió la absorbancia de UV: coeficiente de extinción 1 DO_{280}/cm
es 40 \mug/ml de ARN, la razón DO_{260}/DO_{280} debe estar
entre aproximadamente 1,8 y aproximadamente 2,0. Se extrajo un total
de 45 \mug de ARN a partir de muestras de tejido preparadas según
la presente invención mientras que no pudo detectarse ARN a partir
de muestras de tejido tratadas de manera convencional (figura
13B).
Aunque la presente invención se ha descrito en
relación con lo que se considera actualmente que son realizaciones
preferidas y prácticas, se entiende que la presente invención no ha
de limitarse ni restringirse a las realizaciones dadas a conocer
pero, por el contrario, se pretende cubrir diversas modificaciones
y disposiciones equivalentes incluidas dentro del alcance de las
reivindicaciones adjuntas.
Por tanto, ha de entenderse que variaciones en
la invención descrita serán obvias para los expertos en la técnica
sin apartarse de los aspectos novedosos de la presente invención y
se pretende incluir tales variaciones dentro del alcance de las
reivindicaciones a continuación.
Claims (14)
1. Método para el tratamiento continuo de
tejidos que comprende
- (a)
- proporcionar una muestra de tejido de hasta 3 mm de espesor;
- (b)
- fijar, deshidratar y eliminar la grasa de dicha muestra de tejido con energía de microondas y disoluciones no acuosas, siendo al menos una disolución no acuosa una primera disolución compuesta por un alcohol y una cetona en una razón en volumen de alcohol con respecto a cetona entre 1 y 3;
- (c)
- impregnar dicha muestra de tejido fijada, deshidratada y desgrasada en presión inferior a la atmosférica mediante una disolución de cera compuesta por parafina;
- (d)
- repetir las etapas (a) a (c) con al menos otra muestra de tejido;
mediante lo cual se tratan de
manera continua muestras de tejido iniciando la etapa (a) para una
muestra de tejido tratada posteriormente antes que la etapa (c) se
haya completado para una muestra de tejido tratada anteriormente de
modo que se trata una muestra de tejido desde la fijación hasta la
impregnación en menos de dos
horas.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha muestra de tejido se corta hasta un espesor de entre 1 mm y
2 mm, antes del tratamiento.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
dicha muestra de tejido se corta hasta un espesor de
aproximadamente 1,5 mm antes del tratamiento.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, que comprende además seccionar dicha
muestra de tejido fijada, deshidratada, desgrasada e impregnada
para proporcionar una sección de tejido de entre 1 micrómetro y 50
micrómetros.
5. Método según cualquiera de la reivindicación
1 a 4, en el que dicha muestra de tejido se incuba en dicha
primera disolución durante menos de 25 minutos.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha primera disolución está
compuesta además por polímeros de peso molecular promedio entre 100
y 500.
7. Método según la reivindicación 6, en el que
dicha primera disolución está compuesta por acetona, alcohol
isopropílico y polietilenglicol.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, que comprende además aclarar dicha muestra
de tejido en una disolución no acuosa compuesta por agente de
aclarado.
9. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que se tratan muestras de tejido sin
usar formalina.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que se tratan muestras de tejido sin
usar xileno.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha muestra de tejido fijada,
deshidratada y desgrasada se impregna con ceras de diferentes
puntos de fusión.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
dicha muestra de tejido fijada, deshidratada y desgrasada se
impregna con una disolución de cera compuesta por aceite mineral y
parafina.
13. Método según la reivindicación 1, en el que
dicha muestra de tejido fijada, deshidratada y desgrasada se
impregna en parafina fundida durante menos de 15 minutos.
14. Método según la reivindicación 1, que
comprende además colocar dicha sección de tejido sobre un
portaobjetos para histología y entonces eliminar la cera del
portaobjetos.
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