ES2331364T3 - Metodo de procesado de tejido simplificado. - Google Patents
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Abstract
Un método de procesado de tejido de uno o más especímenes de tejido para uso en microtomía o histología, incluyendo el método: (a) impregnar inicialmente un espécimen de tejido en una sola mezcla no acuosa que se calienta, teniendo dicha mezcla no acuosa funciones de (i) fijación, (ii) deshidratación y (iii) aclarado e incluyendo al menos una cetona, al menos un alcohol, y aceite mineral; y después (b) impregnar a la cera sustancialmente el espécimen de tejido con una sola solución de cera que se calienta y también está a presión inferior a la presión atmosférica; caracterizado porque el método usa solamente las dos composiciones químicas diferentes.
Description
Método de procesado de tejido simplificado.
La presente invención se refiere a un método de
procesado de tejido de uno o más especímenes de tejido usando
solamente dos composiciones químicas diferentes.
Se han descrito procesos para procesado de
tejido que requieren el uso de más de dos soluciones diferentes,
productos útiles en ellos, y sistemas para procesado de tejido
(véase WO 99/09390, WO 01/44783 y WO 01/44784). Resolvieron la
necesidad del procesado rápido de tejido. Se ha demostrado ahora que
(i) una mezcla no acuosa y (ii) una solución de cera en dos módulos
de reacción separados son suficientes para procesar tejido de forma
rápida y completa.
En contraposición a la invención aquí descrita,
Boon y colaboradores (Eur. J. Morphol. 33:349-358,
1995) usan una solución de isopropanol y una solución de cera de
parafina en dos cámaras de reacción separadas, sometidas cada una a
vacío y calentamiento por microondas, para procesar especímenes de
tejido para histología. Su sistema requiere fijar los especímenes
de tejido antes del procesado y usar una plataforma giratoria para
distribuir energía de microondas. Además, el depósito de vidrio que
contiene los especímenes de tejido también adsorbe energía de
microondas y transfiere calor a la solución situada en él.
Milestone (WO 98/05938) proporciona otra
alternativa para el procesado de tejido en al menos tres pasos:
fijar el espécimen de tejido, deshidratar y aclarar simultáneamente
con agente deshidratante y un agente esencialmente lipófilo, e
impregnar el espécimen de tejido. El calentamiento por microondas se
usa en los dos primeros pasos y se usa presión elevada durante el
paso de deshidratación/aclaramiento. El espécimen de tejido se seca
por calentamiento y presión reducida, y posteriormente se impregna
bajo vacío o, alternativamente, aplicando un ciclo de presión
moderada y vacío moderado.
Hay que reducir el costo de los instrumentos
automatizados para el procesado de tejido y los gastos de su
operación para la prestación eficiente de atención sanitaria. Un
mejor diagnóstico también eleva la confianza de los pacientes de
que su procesado se basará en información fiable y sus médicos
pueden llevar su seguimiento oportunamente. Una reducción de los
costos del equipo puede permitir la compra de instrumentos
adicionales que puedan ser distribuidos por la zona de servicio
(por ejemplo, centros de atención primaria). Los tejidos pueden ser
procesados localmente en dicha red distributiva y posteriormente ser
transportados a un centro de patología especializado para análisis.
En centros médicos y clínicas más pequeñas, el espacio es precioso
y la disminución del tamaño del instrumento automatizado permitirá
su colocación en una sala de dimensiones reducidas.
Por ejemplo, reducir a dos (es decir, un módulo
de calentamiento y un módulo de vacío) el número de módulos en un
sistema de procesado de tejido eliminará la duplicación de
componentes mecánicos y eléctricos y reducirá el tamaño del
sistema. Será más costeable y más fácil de colocar en el
laboratorio. Habrá que almacenar menos composiciones químicas y se
facilitará el entrenamiento del personal en el uso del sistema.
Ahora se describen procesos y sistemas para
procesado de tejido que usan menos composiciones químicas en los
primeros y menos componentes mecánicos y eléctricos en los segundos
en comparación con nuestras invenciones descritas previamente. Ésta
es una mejora sobre los procesos y sistemas descritos en la Patente
de Estados Unidos número 6.207.408 y la Patente de Estados Unidos
6.793.890.
WO-A-01/44783,
en la que se basa la forma en dos partes de la reivindicación 1,
describe un método de endurecer un espécimen de tejido y
posteriormente impregnarlo como preparación para uso en microtomía o
histología. Aunque se describen mezclas no acuosas y soluciones de
cera usadas en el método, el método de procesado de tejido descrito
requiere el uso de más de dos composiciones químicas diferentes.
Según un primer aspecto de la presente invención
se facilita el método de la reivindicación 1.
Los sistemas y métodos de procesado de tejido
preferidos, ilustrados y descritos a continuación que no son parte
de la presente invención, usan solamente dos composiciones químicas
diferentes. También minimizan el número de módulos de reacción en
el sistema que no son parte de la presente invención.
Los sistemas que no son parte de la presente
invención se componen de (a) un primer módulo en el que el contenido
de la reacción se calienta al menos, (b) un segundo módulo en el
que el contenido de la reacción está al menos bajo vacío y
calentado, y opcionalmente (c) un medio de transporte que transfiere
al menos uno o más especímenes de tejido a la vez desde el primer
módulo al segundo módulo. El sistema también puede incluir
estaciones de carga y/o descarga opcionales.
El primer módulo de reacción se compone de (i)
una cámara de reacción que se calienta y (ii) una mezcla no acuosa.
La mezcla no acuosa se compone de sustancias químicas diferentes con
al menos tres funciones diferentes: fijación, deshidratación y
aclarado. La cámara de reacción del primer módulo puede estar
compuesta de una fuente de microondas con una sonda/circuitería de
control para regular la energía de microondas que emana de la
fuente. Tal energía puede ser usada para calentar el contenido de la
cámara de reacción a una temperatura preestablecida. El módulo
puede estar compuesto además de un depósito calentado para
precalentar la mezcla no acuosa antes de transferirla a la cámara
de reacción y para mantener la temperatura de la mezcla no acuosa
después de ser transferida desde la cámara de reacción. El espécimen
de tejido se puede endurecer sustancialmente por la composición
química, radiación de microondas, o ambos; y puede ser impregnado
inicialmente por un hidrocarbono líquido (por ejemplo, aceite
mineral) y después sustancialmente impregnado por una cera.
El segundo módulo de reacción se compone de (i)
una cámara de reacción que se calienta y también está conectada a
una bomba de vacío y (ii) una solución de cera. La cámara de
reacción del segundo módulo puede estar compuesta de circuitería de
control y sondas apropiadas para regular la temperatura y presión en
ella. El módulo puede estar compuesto además de un depósito. En el
depósito opcional del segundo módulo se puede fundir cera sólida y
posteriormente mantenerse como una solución hasta que sea
transferida a la cámara de reacción.
Alternativamente, el sistema que no es parte de
la presente invención, se compone de un solo módulo en el que el
contenido de la reacción se calienta al menos sucesivamente y
posteriormente esta al menos bajo vacío y calentado. Uno o más
especímenes de tejido permanecen en la misma cámara de reacción
durante el procesado. Una solución no acuosa y una solución de cera
son transferidas sucesivamente desde dos depósitos separados a la
cámara de reacción. Se puede usar un medio de transporte opcional
para transferir los especímenes de tejido de las estaciones de
carga y/o descarga opcionales.
Otros aspectos y ventajas de la invención serán
evidentes a los expertos en la técnica por la descripción detallada
siguiente y las reivindicaciones, y sus generalizaciones.
La figura 1A es un esquema de un sistema que no
es parte de la presente invención, adecuado para uso en el método
de la invención. Se almacena una mezcla no acuosa en un primer
depósito 1 y es transferida a una retorta de microondas 2 para
contactar los especímenes de tejido. Los especímenes de tejido son
transferidos entonces desde la retorta de microondas 2 a la retorta
al vacío 3. Se almacena una solución de cera en un segundo depósito
4 y es transferida a una retorta al vacío 3 para contactar los
especímenes de tejido.
La figura 1B es un esquema de un sistema
alternativo que no es parte de la presente invención, adecuado para
uso en el método de la invención. Los especímenes de tejido son
procesados en una retorta de microondas/al vacío 5. Se almacena una
mezcla no acuosa en un primer depósito 6 y se almacena una solución
de cera en un segundo depósito 7. La mezcla no acuosa y
posteriormente la solución de cera son transferidas a la retorta de
microondas/al vacío 5 para contactar los especímenes de tejido.
La figura 2 representa las bandas ARN 18S y 28S
después de la separación por electroforesis de gel desnaturalizante.
Se usó ARN extraído de hígado fresco de ratón como el control
positivo (carril C). Se extrajo ARN de tejido de hígado procesado
de dos ratones (carriles 1 y 2 del primer ratón; carriles 3 y 4 del
segundo ratón). Los carriles 1 y 3 se procesaron durante 15 minutos
en cada reacción; los carriles 2 y 4 se procesaron durante 30
minutos en cada reacción.
Con respecto al procesado y análisis de tejido
sólido, una rodaja de tejido debe ser del orden de 3 a 6 micras
para ser examinada al microscopio, mientras que la rodaja más fina
de tejido fresco que se puede obtener por corte es de
aproximadamente 1 mm, siendo la rodaja típica del orden de
aproximadamente 2-3 mm. Con el fin de producir una
rodaja suficientemente fina para examen microscópico, hay que
endurecer el tejido de modo que se pueda obtener una rodaja más
fina (por ejemplo, cortándola con un microtomo).
En la presente invención, el número de (a)
composiciones químicas diferentes y (b) componentes mecánicos y
eléctricos del sistema que no es parte de la presente invención,
requeridos para procesado de tejido se ha reducido en comparación
con la técnica anterior. El sistema que no es parte de la presente
invención se compone de un único primer módulo de reacción en el
que el contenido de la reacción se calienta al menos (por ejemplo,
una unidad de calentamiento); un único segundo módulo de reacción en
el que el contenido de la reacción está al menos bajo vacío (por
ejemplo, una unidad de vacío); y (iii) un medio de transporte que
transfiere al menos uno o más especímenes de tejido a la vez desde
el primer módulo al segundo módulo. Cada módulo se compone de una
cámara de reacción y una composición química que se contiene
opcionalmente dentro de la cámara de reacción.
Las composiciones químicas son transferidas
típicamente entre una cámara de reacción del módulo y su depósito
opcional que están en comunicación de fluido uno con otro (por
ejemplo, tubos o tuberías, válvulas, y bombas con circuitería de
control para determinar el tiempo, la velocidad y la dirección de
flujo para una composición química). Uno o más especímenes de
tejido pueden ser endurecidos sustancialmente e impregnados
inicialmente en el primer módulo, y posteriormente los especímenes
de tejido sustancialmente endurecidos son impregnados con cera e
incrustados en un bloque que es capaz de seccionarse. Se puede usar
agitación (por ejemplo, aireación, ciclos de vacío y presión
incrementada, agitación, etc) para acelerar el intercambio entre el
espécimen de tejido y la composición química. La terminación
exitosa del procesado de tejido se indica por la facilidad y
calidad de la sección durante la microtomía y el examen histológico
de las secciones.
Los especímenes de tejido se endurecen con una
mezcla no acuosa de sustancias químicas. Una mezcla adecuada es una
solución no acuosa compuesta de funciones de fijación,
deshidratación y aclarado (por ejemplo, al menos dos o tres
sustancias químicas diferentes). Los agentes ejemplares con
funciones de fijación y/o deshidratación son cetonas, alcoholes, o
su combinación. Para una mezcla no acuosa de fijativo y
deshidratante, la relación en volumen de los dos agentes puede ser
entre aproximadamente 1:10 y aproximadamente 10:1 (aunque tales
extremos pueden cambiar el tiempo de procesado o los resultados
pueden ser menos fiables); más de aproximadamente 1:6,
aproximadamente 1:3, o aproximadamente 1:2; menos de aproximadamente
2:1, aproximadamente 3:1, o aproximadamente 6:1; aproximadamente
1:1, o cualquier rango intermedio (por ejemplo, entre
aproximadamente 1:1 a aproximadamente 6:1). La función de aclarado
la puede realizar un hidrocarbono alifático, benceno, limoneno,
aceite mineral, tolueno, y xilenos; el aceite mineral es un
aclarador preferido porque no es inflamable ni volátil. El espécimen
de tejido puede ser incubado durante al menos aproximadamente 2
minutos, al menos aproximadamente 5 minutos, al menos
aproximadamente 10 minutos, al menos aproximadamente 15 minutos, al
menos aproximadamente 30 minutos, al menos aproximadamente 45
minutos, o al menos aproximadamente 60 minutos. La temperatura de
incubación puede ser entre aproximadamente 30ºC y aproximadamente
80ºC; más de aproximadamente 40ºC, aproximadamente 50ºC,
aproximadamente 55ºC, o aproximadamente 60ºC; menos de
aproximadamente 70ºC o aproximadamente 75ºC; o cualquier rango
intermedio (por ejemplo, entre aproximadamente 55ºC y 75ºC).
Un espécimen de tejido que ha sido endurecido se
impregna posteriormente con una solución de cera. En coherencia con
la deshidratación del espécimen de tejido, la solución de cera tiene
(preferiblemente, el contenido de agua más bajo posible. Así, la
solución de cera se puede preparar antes de la impregnación
calentando la cera para evaporar el agua disuelta y por
desgasificación a presión reducida. La impregnación del espécimen de
tejido puede tener lugar bajo presión inferior a la atmosférica y a
temperatura elevada para quitar los disolventes del espécimen de
tejido y aspirar la solución de cera al espécimen de tejido. El
vacío disminuye el tiempo de impregnación acelerando la difusión y
reduciendo la temperatura de evaporación de los disolventes que
pueda haber en el espécimen. La solución de cera puede incluir
parafina y/u otras ceras, que han sido desgasificadas y
deshidratadas. El espécimen de tejido se puede incubar durante al
menos aproximadamente 3 a aproximadamente 10 minutos, al menos
aproximadamente 15 minutos, al menos aproximadamente 30 minutos, al
menos aproximadamente 45 minutos, o al menos aproximadamente 60
minutos. La solución de cera puede ser un sólido a temperatura
ambiente (por ejemplo, por debajo de aproximadamente 25ºC o
aproximadamente 30ºC) y fundirse por encima de aproximadamente 55ºC
o aproximadamente 60ºC. La temperatura de incubación puede ser entre
aproximadamente 50ºC y aproximadamente 90ºC, más de aproximadamente
55ºC o aproximadamente 60ºC; menos de aproximadamente 75ºC,
aproximadamente 80ºC, o aproximadamente 85ºC; o cualquier rango
intermedio (por ejemplo, entre aproximadamente 55ºC y 85ºC). Se
prefiere que la incubación sea realizada bajo presión reducida (por
ejemplo, aproximadamente 100 torr o por debajo de aproximadamente
760 torr). Antes de la sección, el espécimen de tejido impregnado
puede ser incrustado en el agente impregnante para formar un bloque
de tejido.
La cámara de reacción puede estar compuesta de
cualquier combinación de lo siguiente: un cierre adaptado para
encajar en la cámara de reacción y para aislar la cámara de reacción
del entorno del operador (por ejemplo, una tapa unida o extraíble
de la cámara de reacción); aislamiento térmico para retener calor en
la cámara de reacción; al menos una sonda de temperatura y/o
presión para supervisar las condiciones en la cámara de reacción;
una junta estanca para aislar los componentes electrónicos de las
sustancias químicas en la cámara de reacción; y circuitería de
control que recibe la entrada de al menos una sonda y/o
temporizador. Igualmente, un depósito calentado puede estar
compuesto de cualquier combinación de aislamiento térmico, al menos
una sonda de temperatura y/o presión, una junta estanca, y
circuitería de control que recibe la entrada de al menos una sonda
y/o temporizador. Se prefiere una junta estanca de caucho para la
cámara de reacción (así como el depósito opcional calentado) del
primer módulo para aislar el operador de los humos de la mezcla no
acuosa. Para el segundo módulo, se prefiere un cierre hermético al
vacío para la cámara de reacción.
En una realización preferida, la mezcla no
acuosa se premezcla y almacena en una botella antes del uso. Se
abre la botella y se aspira al menos parte de su contenido a un
primer depósito para ser pretratada. Se funde cera sólida en un
segundo depósito, y posteriormente la solución de cera es aspirada a
la cámara de reacción del segundo módulo. La mezcla no acuosa es
transferida entre el depósito y la cámara de reacción del primer
módulo durante el procesado de tejido; en contraposición, la
solución de cera se mantiene en la cámara de reacción del segundo
módulo durante el procesado de tejido. Al final de la día, la mezcla
no acuosa es aspirada de nuevo a la botella, la solución de cera es
aspirada de nuevo al segundo depósito, y las soluciones se disponen
o almacenan de forma segura para reutiliza-
ción.
ción.
Alternativamente, se puede usar una sola cámara
de reacción dentro de un módulo que combina tanto funciones de
calentamiento como de vacío en una sola unidad. A continuación, la
mezcla no acuosa y la solución de cera son transferidas desde
depósitos primero y segundo separados, respectivamente, a la cámara
de reacción y de nuevo a ellos.
Tal sistema puede ser operado manualmente o
automatizado (es decir, transferencia del espécimen de tejido entre
módulos con un medio de transporte mecánico). Un sistema
automatizado puede estar compuesto además por una estación de carga
y/o descarga. Los especímenes de tejido pueden ser cargados en el
sistema y ser procesados en lotes o como especímenes separados. Los
especímenes de tejido pueden entrar en el sistema en la estación de
carga y salir del sistema por la estación de descarga donde son
recogidos opcionalmente. La circuitería de control (por ejemplo,
hardware y software) puede ser usada para programar el movimiento
del (de los) espécimen(es) de tejido en el sistema, para
evitar el acceso a los módulos de reacción durante la operación,
para modificar los parámetros de reacción (por ejemplo, el tiempo,
la temperatura, la presión, o las cantidades de sustancias químicas
del proceso), o cualquier combinación de los mismos.
Aquí, un "espécimen de tejido" es una pieza
de tejido que puede ser procesada por los métodos aquí descritos.
También se puede referir a células únicas de cualquier fluido
biológico (por ejemplo, ascitis, sangre, exudado pleural), o
suspensiones de células obtenidas de la aspiración de órganos
sólidos o lavado de cavidades corporales. Las células únicas pueden
ser pelitizadas por centrifugación flotante o sedimentación antes
del procesado. Las piezas sólidas (es decir, rodajas de tejido) son
procesadas comúnmente para histología y patología.
La función de fijación la realizan cetonas (por
ejemplo, acetona, metil etil cetona); aldehídos (por ejemplo,
acetilaldehído, formaldehído, glutaraldehído, glioxal); alcoholes de
peso molecular bajo (por ejemplo, metanol, isopropanol, etanol,
propanol, butanol, isobutanol, etil butanol, alcohol amílico); o
análogos. El fijativo en la mezcla no acuosa puede ser más de
aproximadamente 15% (v/v), 20% (v/v), aproximadamente 25% (v/v),
aproximadamente 30% (v/v), aproximadamente 35% (v/v), o
aproximadamente 40% (v/v); menos de aproximadamente 35% (v/v),
aproximadamente 40% (v/v), aproximadamente 45% (v/v),
aproximadamente 50% (v/v), aproximadamente 55% (v/v),
aproximadamente 60% (v/v), o aproximadamente 65% (v/v); o cualquier
rango intermedio (por ejemplo, entre aproximadamente 20% y 60%). La
función de deshidratación se realiza con alcoholes de peso molecular
bajo (por ejemplo, metanol, isopropanol, etanol, propanol, butanol,
isobutanol, etil butanol, alcohol amílico); cetonas (por ejemplo,
acetona, metil etil cetona); o análogos. El deshidratante en la
mezcla no acuosa puede ser más de aproximadamente 15% (v/v), 20%
(v/v), aproximadamente 25% (v/v), aproximadamente 30% (v/v),
aproximadamente 35% (v/v), o aproximadamente 40% (v/v); menos de
aproximadamente 35% (v/v), aproximadamente 40% (v/v),
aproximadamente 45% (v/v), aproximadamente 50% (v/v),
aproximadamente 55% (v/v), aproximadamente 60% (v/v), o
aproximadamente 65% (v/v); o cualquier rango intermedio (por
ejemplo, entre aproximadamente 20% y 60%). En contraposición a la
fijación convencional con aldehídos (por ejemplo, formalina), se
considera que el uso de cetonas y alcoholes actúa como fijativos
estabilizando físicamente proteínas (por ejemplo, precipitación) sin
combinarse químicamente con ellas. Se usa un aceite mineral para
una función de aclarado. El aclarador puede ser más de
aproximadamente 10% o aproximadamente 15% (v/v) de la mezcla no
acuosa; puede ser menos de aproximadamente 25% o aproximadamente 30%
(v/v) de la mezcla no acuosa. El procesado puede ser acelerado por
adición de un surfactante: por ejemplo, dimetil sulfóxido (DMSO),
ésteres de polioxietilen sorbitán (por ejemplo, TWEEN 80), dimetil
sulfocinato sódico, detergentes domésticos suaves, o análogos. La
mezcla no acuosa también se puede tamponar mediante el uso apropiado
de ácido y base.
La radiación de microondas también puede asistir
el endurecimiento del tejido de manera física más bien que química.
La combinación de procesos físico y químico puede disminuir el
tiempo de procesado y/o aumentar la calidad del espécimen. El
efecto de un procesado físico o químico concreto puede ser
determinado notando el efecto de omitir el procesado en el
procesado de tejido.
Finalmente, el espécimen de tejido se impregna
con una sola solución de cera, tal como fórmulas de cera
comerciales, mezclas de ceras de diferentes puntos de fusión (las
ceras son sólidas a temperatura ambiente y tienen puntos de fusión
que dependen de sus longitudes de cadena, mientras que el aceite
mineral es líquido a temperatura ambiente), y análogos.
El espécimen de tejido puede ser fresco,
parcialmente fijado (por ejemplo, fijación en 10% de formalina
durante 2-3 horas), o fijado (por ejemplo, durante
fijación nocturna en 10% de formalina o cualquier otro fijativo).
El proceso anterior permite el procesado de un espécimen de tejido
desde la fijación a la impregnación en menos de aproximadamente dos
horas, menos de aproximadamente 90 minutos, menos de aproximadamente
60 minutos, menos de aproximadamente 30 minutos, o menos de
aproximadamente 15 minutos. El tiempo requerido para que la
solución alcance en cada paso la temperatura apropiada es
insignificante en comparación con el tiempo de incubación para cada
paso, y puede ser despreciado al calcular el tiempo total del
procesado. En particular, pequeñas biopsias y tejidos de menos de
aproximadamente 1,5 mm de grosor, así como los que contienen poca
grasa o nula, podrían ser procesados rápidamente. El tejido puede
ser transportado desde la sala de quirófano al laboratorio de
patología en una mezcla no acuosa como se describe en WO
2004/033622: UM-FIX en el sentido en que se usa
aquí es aproximadamente 10% de polietilen glicol (PEG) de peso
molecular bajo, y aproximadamente 90% de metanol. Este conservante
también se caracterizó en Vincek y colaboradores (Lab. Invest.
83:1-9, 2003). Con la excepción del PEG presente en
el tejido conservado en UM-FIX y que es transportado
al proceso de la presente invención, no se usa PEG y no parece ser
necesario para el procesado de tejido. Esto simplifica la química de
la presente invención y reduce el número de incubaciones que son
necesarias en comparación con el proceso anterior.
Después de la impregnación, el espécimen de
tejido puede ser incrustado para producir un bloque. El agente
usado para incrustar el espécimen de tejido es preferiblemente el
mismo que el material usado para impregnación, pero también se
puede usar un agente de impregnación diferente. El espécimen de
tejido bloqueado se puede montar en un microtomo para producir
secciones de tejido de entre aproximadamente 1 micra y
aproximadamente 50 micras, o entre aproximadamente 2 micras y
aproximadamente 10 micras. Las secciones de tejido se pueden
procesar más para tinción histoquímica, unión de anticuerpos,
hibridización o amplificación de ácido nucleico in situ, o
su combinación. Los especímenes de tejido se examinan entonces
típicamente por microscopía, pero se puede usar otras técnicas para
detectar propiedades celulares con el fin de examinar el espécimen
de tejido procesado (por ejemplo, citometría automatizada,
autorradiografía, electroforesis de ácido nucleico). Se pueden
almacenar bloques de tejido a efectos de archivo o estudios
retrospectivos.
Los fenotipos celulares (por ejemplo,
reactividad con anticuerpo específico de célula, tinción química)
pueden ser analizados extrayendo el material incrustado (por
ejemplo, desparafinización) y diseccionando tejidos (por ejemplo,
digestión proteolítica y desagregación mecánica). Se puede dispersar
células únicas en una pulverización y analizar en un citómetro de
flujo. Alternativamente, el tejido desparafinizado se puede montar
en un portaobjetos de microscopio, diseccionar con un láser y/o
micromanipulador en poblaciones celulares sustancialmente
homogéneas, y los diferentes tipos de células pueden ser analizados
por técnicas físicas, químicas o genéticas.
La presente invención es compatible con la
preparación de ácidos nucleicos, ADN o ARN, procedentes de tejidos
procesados. Así, es posible el estudio genético de especímenes
recogidos rutinariamente en el laboratorio clínico de patología. La
potencia combinada de estas tecnologías será grande. Las
observaciones histológicas se puede correlacionar con la genética
analizando una sección por tinción o inmunohistoquímica, y
preparando ácidos nucleicos de un adyacente sección para análisis
genético. Por ejemplo, se pueden comparar las regiones enfermas y
normales de la misma sección para detectar diferencias genéticas
(por ejemplo, mutaciones, niveles de transcripción), el progreso de
la enfermedad puede ser caracterizado comparando diferencias
genéticas en muestras tomadas en varios momentos, y la evolución
tumoral puede ser conocida siguiendo la acumulación de diferencias
genéticas de cáncer primario a metástasis. Se puede obtener células
sustancialmente homogéneas o simplemente enriquecidas
clasificándolas con un citómetro de flujo o microdisección.
Las mutaciones pueden ser germinales y usarse
para el seguimiento de la predisposición genética a la enfermedad,
o las mutaciones pueden ser somáticas y usarse para determinar
alteraciones genéticas en patogénesis de la enfermedad. La
enfermedad puede ser una anomalía metabólica o neurológica,
malignidad, defecto de desarrollo, o producida por un agente
infeccioso. La presente invención conserva material para análisis
genético por un procedimiento simple y almacenamiento a temperatura
ambiente. Puede ser analizado por hibridización in situ o se
pueden extraer ácidos nucleicos del tejido.
La tinción hematoxilina-eosina
es utilizada comúnmente para estudios histológicos y puede ser
considerada un estándar para comparación por patólogos. Además, la
presente invención puede ser compatible con otras tinciones
incluyendo tricromo, reticulina, mucicarmina, y tinciones elásticas
como las descritas en las referencias generales, tal como Thompson
(Selected Histochemical and Histopathological Methods, C.C. Thomas,
Springfield, Illinois, 1966), Sheehan y Hrapchak (Theory and
Practice of Histotechnology, C.V. Mosby, St. Louis, Missouri,
1973), y Bancroft y Stevens (Theory and Practice of histological
Techniques, Churchill Livingstone, Nueva York, Nueva York, 1982).
Se tardaría entre 30 minutos y varias horas en completar tales
procedimientos de tinción, aunque Fisher Scientific ofrece
procedimientos de tinción rápidos cuya realización solamente
requiere cinco minutos.
Se puede obtener tejido de una autopsia, una
biopsia (por ejemplo, biopsia endoscópica), o de cirugía. Los
pequeños especímenes, tales como biopsias con punzón o aguja,
obtenidos con un trocar son adecuados para la presente invención.
Para cirugía del cáncer, la capacidad de proporcionar un diagnóstico
patológico de una sección de tejido teñida proporcionará al
cirujano información que puede ser usada antes de que el paciente
salga de la sala de quirófano. Por ejemplo, una indicación del
patólogo de que el cáncer está confinado al tejido reseccionado
puede permitir al cirujano ser conservador en el tratamiento y
conservar tejido sano contiguo. Alternativamente, el hallazgo por
parte del patólogo de que el cáncer no está confinado a un órgano
reseccionado permitiría un tratamiento quirúrgico más agresivo
mientras el paciente todavía está en la sala de quirófano. En
contraposición al procesado histológico convencional de tejido
congelado, el procesado de tejido fresco según la invención puede
proporcionar especímenes de tejido con
mejor morfología y reducir la necesidad de confirmación posterior por parte del patólogo que observa el tejido fijado.
mejor morfología y reducir la necesidad de confirmación posterior por parte del patólogo que observa el tejido fijado.
Los ejemplos de tejidos que pueden ser
procesados según la invención incluyen: apéndice, vejiga, hueso,
intestino, cerebro, mama, carcinoma, cérvix (epitelio escamoso),
vesícula biliar, corazón, riñón, hígado, pulmón, ovario, glándula
parótida, placenta, próstata, piel, bazo, testículo, glándula
tiroidea, amígdala, y útero (miometrio y endometrio). Los tejidos
linforreticular y graso pueden ser procesados según la invención. El
tejido mineralizado requeriría descalcificación antes del procesado
por el proceso de la presente invención. El análisis posterior
incluiría detectar mutaciones de ADN y expresión de ARN, genómica,
histología, inmunoquímica y proteómica.
Las secciones de tejido procesado por el proceso
de la presente invención también pueden ser usadas en
inmunohistoquímica. El proceso de la presente invención proporciona
especímenes de tejido en que el antígeno se recupera y conserva, la
opción de fijativo puede ser optimizada para recuperación y
conservación de antígenos concretos. Se bloquean los lugares de
unión no específicos, el anticuerpo específico (es decir, el
anticuerpo primario) se une a antígeno, y se extrae el anticuerpo
no unido. Si está etiquetado con una sonda o radical de generación
de señal, el anticuerpo primario puede ser detectado directamente,
pero es preferible unir la sonda a una proteína (por ejemplo, un
anticuerpo secundario) que se una específicamente al anticuerpo
primario. El anticuerpo secundario puede ser elevado contra la
región constante de cadena pesada o ligera del anticuerpo primario.
Esto amplifica la señal generada por un conjugado
antígeno-anticuerpo porque cada anticuerpo primario
unirá muchos anticuerpos secundarios. Alternativamente, la
amplificación puede tener lugar a través de otras interacciones
específicas tal como biotina-estreptavidina. La
unión de anticuerpos se lleva a cabo en un pequeño volumen para
reducir la utilización de reactivos caros y mantener una alta tasa
de unión; la evaporación de este pequeño volumen se reduce por
incubación en una cámara de humedad. El radical de generación de
señal es preferiblemente una enzima que no está presente de otro
modo en el tejido. Por ejemplo, se puede unir fosfatasa alcalina y
peroxidasa de rábano al anticuerpo secundario o conjugado a
estreptavidina. Disponemos de sustratos para estas enzimas que
generan un producto cromogénico, fluorescente o luminiscente que
puede ser detectado visualmente.
La configuración de tinción para antígeno puede
ser usada para localizar la expresión del antígeno en el contexto
de estructuras celulares reveladas por contratinción. La expresión
de antígeno puede identificar el tipo de célula o tejido, la etapa
de desarrollo, marcadores prognósticos tumorales, procesos
metabólicos degenerativos, o infección por un patógeno.
La unión antígeno-anticuerpo
también puede ser visualizada con sondas metálicas fluorescentes,
radioactivas o coloidales por epifluorescencia, autorradiografía, o
microscopía electrónica. Se puede usar sondas similares para
detectar ácido nucleico en el tejido seccionado por hibridización
in situ para identificar mutaciones genéticas o
transcriptos; alternativamente, el ácido nucleico (ADN o ARN) puede
ser extraído de secciones de tejido y analizado directamente por
hibridación, o amplificado antes de un análisis genético
adicional.
El procesado de tejido puede estar integrado con
otros sistemas automatizados que no son parte de la presente
invención: por ejemplo, un sistema de embeber y seccionar que
produce un bloque de tejido embebido en parafina; un sistema de
microtomía, tinción y cobertura que proporciona rodajas conteniendo
secciones de tejido; un sistema de desarrollo que visualiza señales
histoquímicas y/o inmunoquímicas en las secciones de tejido; un
citómetro de flujo que analiza y/o clasifica células únicas por sus
fenotipos en poblaciones sustancialmente homogéneas o simplemente
enriquecidas; un sistema de microdisección que separa tejidos en
poblaciones sustancialmente homogéneas; un sistema de formación de
imágenes que explora secciones de tejido en una rodaja, digitaliza
señales visualizadas a través de un microscopio, y posteriormente
manipula, guarda y transmite las imágenes; y sus combinaciones. Las
células o los tejidos, especialmente los clasificados y/o separados
en poblaciones sustancialmente homogéneas, pueden ser analizados
además por sus secuencias de ADN o ARN, mutaciones genéticas,
cambios en el nivel o configuración de expresión génica, cambios en
el nivel o configuración de expresión de proteínas, y sus
combinaciones. La integración del sistema y la gestión de datos se
facilita identificando especímenes de tejido o sus soportes por
caracteres alfanuméricos, código de barras, identificación por
radiofrecuencia (RFID), u otro método de etiquetado. Se puede usar
las mismas o diferentes etiquetas para identificar un espécimen de
tejido particular cuando pasa a través de una serie de sistemas
automatizados. Las etiquetas y otra información acerca del
espécimen (por ejemplo, nombre del paciente, fecha, posición en el
centro, enfermedad u otra anomalía patológica, tipo de tejido,
diagnóstico, fenotipo, genotipo, caracterización genómica o
proteómica) pueden ser introducidas en un sistema de gestión de
base de datos para guardar, manipular y recuperar los datos. La
búsqueda de dicha información en la base a datos puede probar o
refutar correlaciones según criterios estadísticos, y sugerir
investigaciones adicionales.
Un paso inicial en el proceso, que se puede
llevar a cabo en el quirófano, laboratorio de patología, o en otro
lugar, es preparar un espécimen de tejido adecuado para
endurecimiento y, en último término, examen. Se prepara típicamente
una rodaja del tejido de interés. Se puede obtener una rodaja fina o
muestra de trocar para procesado: aproximadamente 0,5 mm a
aproximadamente 1 mm de grosor, aproximadamente 1 mm a
aproximadamente 3 mm de grosor, aproximadamente 1 mm a
aproximadamente 2,5 mm de grosor, o aproximadamente 1,5 mm a
aproximadamente 2 mm de grosor. La rodaja de tejido se coloca en un
casete de tejido u otro soporte en que se coloca el tejido durante
el procesado posterior hasta que el espécimen endurecido esté
preparado para seccionarlo. Alternativamente, se prepara un
espécimen de tejido marcando o cortando tejido con un trocar (por
ejemplo, para biopsia). Para facilitar el manejo de muchas casetes,
las casetes se pueden colocar en un soporte o cesta. La casete o el
soporte se colocan después en una mezcla no acuosa según la presente
invención.
Se expone una casete o soporte de tejido a la
mezcla no acuosa que endurece el tejido mientras se agita
simultáneamente y somete a radiación de microondas. Se necesita una
sola unidad de microondas porque solamente se necesita una solución
de endurecimiento. La solución de endurecimiento puede permanecer en
la cámara de reacción durante varios ciclos de procesado de tejido
o puede ser transferida entre la cámara de reacción y una cámara de
almacenamiento a intervalos (por ejemplo, pasarse a la cámara de
almacenamiento después de cada ciclo de endurecimiento, cuando
todos los especímenes de tejido hayan sido procesados, o al final de
las operaciones del día). Un soporte de especímenes de tejido o
casetes conteniendo un espécimen de tejido sólido puede ser
transferido entre cámaras de reacción manualmente, o por un
transporte de inducido o pista.
Para realizar agitación que acelere el procesado
de tejido, se lleva a cabo aireación. Se puede introducir un tubo
directamente en la mezcla no acuosa debajo de los especímenes de
tejido, pero para agitación más uniforme y completa, se puede usar
una chapa de difusión en la parte inferior de la cámara de reacción
y a través de una porción sustancial de su diámetro para agitar
uniformemente todo el volumen de la solución. La agitación también
se puede llevar a cabo por ciclos de presión y vacío (PN) (por
ejemplo, períodos de aproximadamente 10 a 30 segundos a presión
baja, reducción a vacío parcial, y presión baja de nuevo) o
bombeando solución a y del receptáculo (por ejemplo, haciendo
circular la solución a través del receptáculo) o usando ciclos
PN.
La casete de tejido o soporte se coloca en una
solución de cera contenida en una unidad de vacío.
Convencionalmente, se desgasifica cera como parte del procedimiento
de procesado de tejido. La desgasificación quita disolventes
orgánicos y humedad excedente de la cera. Para mejorar este proceso
y reutilizar la cera en el sistema, se puede llevar a cabo
desgasificación continua bajo vacío.
A continuación se embebe el espécimen de tejido
(preferiblemente con un embebedor automatizado). El espécimen de
tejido embebido se secciona entonces con un microtomo e inunda con
agua para colocación en un portaobjetos de vidrio de microscopio
(preferiblemente con un seccionador automatizado). Después de
colocar la sección en el portaobjetos, el portaobjetos se calienta
para fundir la parafina y adherir las secciones al vidrio. Los
postaobjetos se tiñe entonces (preferiblemente con un dispositivo de
tinción automatizado) y cubre (preferiblemente con un cubridor
automatizado).
En una ilustración preferida, que no es parte de
la presente invención, el sistema para endurecer e impregnar un
espécimen de tejido se puede limitar a dos módulos discretos: una
unidad de microondas y una unidad de vacío. El espécimen de tejido
se pone en contacto con la mezcla no acuosa que endurece tejido
fijado o no fijado en la unidad de microondas. La impregnación del
espécimen de tejido endurecido se termina en la unidad de vacío.
Solamente se requiere una unidad de vacío para impregnación. La
agitación se puede llevar a cabo con un dispositivo mecánico que
produce aireación, agitación o vibración, o transferencia de energía
ultrasónica a la solución. Alternativamente, se puede usar una
bomba para agitación usando ciclos P/V o haciendo circular la
solución.
Una unidad de microondas de la invención se
compone de (i) una fuente de la energía de microondas (por ejemplo,
magnetrón, clistrón, tubo de ondas progresivas), (ii) una guía de
ondas que transmite la energía de microondas desde la fuente a una
cámara de reacción, estando adaptadas sus dimensiones y forma para
esta finalidad, y (iii) una cámara de reacción que recibe la
energía de microondas transmitida y está adaptada para procesar un
espécimen de tejido por al menos fijación química, deshidratación y
desgrasado. La cámara de reacción puede contener una pluralidad de
diferentes especímenes de tejido. Preferiblemente, la geometría
interior de la cámara de reacción está configurada para lograr la
distribución uniforme de la energía de microondas y el
calentamiento de su contenido. La uniformidad se logra primariamente
mediante la consideración de dos factores.
Primero: se hace que la circunferencia de la
cámara de reacción sea un número integral de longitudes de onda
medias de la radiación de microondas en la cámara. Con una
disposición apropiada de la entrada de guía de ondas a la cámara de
reacción, se excitará un modo que se propagará alrededor de la pared
exterior. Este tipo de modo se caracteriza porque el campo de
microondas está predominantemente cerca de la pared exterior. Se
produce un fenómeno similar en acústica donde las ondas sonoras
avanzan muy eficientemente junto a las paredes sólidas. Estos tipos
de modos se denominan modos de galería de murmullos.
Una segunda consideración es la distancia radial
entre el límite de la solución en la cámara de reacción y su pared.
La espaciación óptima se determina empíricamente cambiando dicha
espaciación. Si la espaciación es demasiado estrecha, la radiación
de microondas es absorbida primariamente cerca de la entrada de guía
de ondas a la cámara de reacción. Si la espaciación es demasiado
ancha, la cámara de reacción es una cavidad resonante y es sensible
a la cantidad de mezcla no acuosa y sólidos (por ejemplo,
especímenes de tejido, casetes, y cesta) que contiene. Con la
espaciación apropiada se logra un calentamiento eficiente de la
solución y sólidos en un amplio rango de alturas del contenido
medido por un sensor de nivel fuera de la cámara de reacción (es
decir, sus volúmenes). Un 10% tan sólo de la altura completa (es
decir, volumen total) todavía permite un calentamiento eficiente
del contenido.
Igualmente, la fuente y la guía de ondas están
configuradas para lograr mínima pérdida de energía durante la
transmisión de la radiación de microondas. La unidad de microondas
está configurada con una guía de ondas de manera que no tenga más
de aproximadamente 2% de pérdida de energía desde la fuente a la
cámara de reacción. Una pérdida más alta de energía requeriría el
uso de un blindaje caro y otros dispositivos de protección para la
fuente de la energía de microondas.
El calentamiento puede ser controlado mediante
el encendido-apagado de la potencia en ciclos de
aproximadamente 10 a 25 segundos porque las características de
calentamiento del cátodo de la fuente de microondas requieren un
tiempo mínimo. Pero esto puede quemar el tejido, de modo que el
calentamiento puede ser controlado a través de una fuente de
corriente variable que permita la variación continua de la potencia
distribuida por la fuente de microondas a la cámara de reacción.
Tal quemazón o cocción excesiva la tipifica la tinción homogénea de
estructuras de tejido sin distinguir características celulares. Se
prefiere la última para reducir la salida de potencia máxima.
La unidad de microondas también puede estar
compuesta de cualquier combinación de un depósito adaptado para
encajar en la cámara de reacción y para recibir al menos un
espécimen de tejido (por ejemplo, una cesta); al menos una sonda de
temperatura y/o presión para supervisar las condiciones presentes en
la cámara de reacción; una o más sondas de energía para supervisar
la energía de microondas enviada por la fuente, transmitida a
través de la guía de ondas, y/o recibida por la cámara de reacción;
un cierre adaptado para encajar en la cámara de reacción y para
aislar la cámara de reacción del entorno del operador; aislamiento
térmico para conservar el calor en la cámara de reacción; un
blindaje para aislar los componentes electrónicos de las sustancias
químicas presentes en la cámara de reacción; y circuitería de
control para recibir la entrada de al menos una sonda o
temporizador y regular por ello al menos una de la energía de
microondas de la fuente, transmitida a través de la guía de ondas,
y/o recibida en la cámara de reacción. El depósito es
preferiblemente transparente a la radiación de microondas y por lo
tanto no se consume energía para calentarlo.
Las características de los materiales usados
para el sellado al vacío son la capacidad de aislar herméticamente
la cámara de reacción o depósito del entorno, opcionalmente la
transparencia sustancial a la radiación de microondas, la
maleabilidad para asegurar un ajuste apretado que se conforma al
cierre, y la resistencia química a las soluciones del proceso.
Modificar una cámara de reacción o depósito con (i) un cierre y una
junta estanca/cierre hermético para reducir la evaporación y (ii)
un aislamiento térmico puede reducir a la mitad o a un tercio la
potencia requerida para operar el calentador o unidad de vacío.
Los módulos pueden ocupar el mismo espacio y/o
el espécimen de tejido puede permanecer estacionario. La energía de
microondas o térmica puede ser regulada y transmitida al mismo
espacio, o al espécimen estacionario de tejido en tiempos
diferentes en el proceso. Las soluciones y/o vapores químicos se
pueden introducir o sacar del mismo espacio, o ponerse o quitarse
del contacto con el espécimen de tejido estacionario. Se prefiere
minimizar los requisitos de espacio para el sistema usando dos
cámaras de reacción, y transportar las composiciones químicas
diferentes a una cámara de reacción por tubos o tuberías de cámaras
separadas de almacenamiento y/o desperdicio. Un controlador puede
recibir la entrada de la cámara de reacción y/o del tiempo de dicha
parte del ciclo de procesado, y por ello regular el transporte de
las diferentes composiciones químicas.
Transferir diferentes soluciones a y de la
cámara de reacción o transferir la cesta entre cámaras de reacción
conteniendo soluciones diferentes puede efectuar cambios en los
pasos de reacción. Mantener la cesta encima del interior de la
cámara de reacción durante aproximadamente 5 a 10 segundos permite
drenar de nuevo la solución excedente a través de uno o más
agujeros en la parte inferior y/o lados antes de transferir la
cesta. Así, la secuencia en que la cesta es transferida entre
cámaras de reacción, conteniendo cada una una composición
particular de sustancias químicas de procesado de tejido, y el
tiempo en que la cesta se incuba en cada cámara de reacción dictará
la serie de reacciones químicas necesarias para llevar a cabo el
proceso según la invención.
La tapa se puede quitar; la junta estanca se
puede unir a la tapa y mover con ella. Este proceso de quitar la
tapa y junta estanca se realiza tanto para la cámara de reacción que
contiene inicialmente los especímenes de tejido como para la cámara
de reacción siguiente a la que posteriormente se transferirán los
especímenes de tejido. Después, se quita la cesta, se deja que la
solución se drene de la cesta y las casetes que pueda haber en ella
de nuevo a la cámara de reacción durante aproximadamente 5 a 10
segundos, y transfiere la cesta a la cámara de reacción conteniendo
la solución química siguiente en el proceso. No hay que lavar los
tubos ni limpiar la cámara de reacción porque la cantidad de
solución que queda es mínima. Finalmente, se cambian las tapas y
juntas estancas. El tiempo total para dicha transferencia es
aproximadamente un minuto.
Se contemplan variaciones en los ejemplos
anteriores de los sistemas de procesado de tejido que no forman
parte de la presente invención. Son posibles varias configuraciones
del sistema de procesado de tejido, y se pueden conectar módulos
opcionales para formar una porción del sistema. La configuración
específica elegida puede ser dictada por el número medio de
especímenes que serán procesados a diario por el laboratorio
clínico, y/o la velocidad con que se deben preparar los informes de
histología o patología.
El sistema que no es parte de la presente
invención puede ser operado manualmente o automatizado. La operación
manual es especialmente adecuada para la búsqueda y el desarrollo
porque las variaciones en el proceso o aparato pueden ser conocidas
rápidamente, o en instalaciones que procesan un pequeño número de
especímenes. Para instrumentos automatizados, los especímenes de
tejido pueden ser transportados por un medio de transporte mecánico
(por ejemplo, brazo de robot, pista formada por correa y rodillo)
y/o se pueden transferir composiciones químicas por tubos
resistentes a la corrosión. Así, el procesado de tejido puede ser
automatizado transfiriendo especímenes entre módulos estacionarios
en una secuencia particular, llenando y vaciando módulos de
sustancias químicas diferentes de modo que los especímenes de
tejido estacionarios se incuben en una secuencia particular, o
cualquier combinación de los mismos. Los programas que controlan
los parámetros del procesado de tejido (por ejemplo, arranque y
parada del instrumento, carga y descarga de varios especímenes,
condiciones como el tiempo de reacción, el avance de los
especímenes a través del sistema) pueden ser supervisados en una
pantalla; los parámetros del procesado de tejido (por ejemplo,
espécimen en la cámara de reacción durante aproximadamente 15, 30 o
45 minutos) pueden ser preestablecidos o seleccionados por el
operador mediante un teclado.
El transporte inducido puede agarrar, por
ejemplo, el espécimen con un mecanismo en forma de pinza o retener
el espécimen con un dispositivo en forma de gancho. El brazo puede
ser articulado para realizar un movimiento parecido al humano; o
puede estar montado en una cremallera de coordenadas fijas con
movimiento lineal o bidimensional, y opcionalmente otra dimensión
de movimiento obtenida variando la altura del brazo sobre el
sistema. La pista de transporte puede ser de material elástico o
pegajoso para fijar el espécimen en la pista por rozamiento, o
puede haber una serie regular de abombamientos o paredes para
atrapar el espécimen entremedio. La pista se puede formar como una
correa continua o puede ser una serie de correas que transporten el
espécimen de tejido, poniéndose la correa en movimiento con un
mecanismo de rodillo o piñón. La casete o el soporte puede estar
adaptado para transporte al tener un vástago (con o sin un pomo) a
agarrar o un bucle a coger con el brazo, o por encaje dentro de una
ranura o indentación en la pista. Igualmente, la casete o soporte
puede estar organizado en un soporte o cesta para procesar gran
número de especímenes, estando adaptado el soporte o la cesta para
transporte por el medio de transporte de inducido o pista.
Se puede usar motores eléctricos y controladores
para transportar un espécimen de tejido por la orden en tiempo real
del operador o la selección de un programa almacenado. Un simple
mecanismo de controlar el tiempo que pasa el espécimen de tejido en
cada módulo sería mover la muestra de tejido o su soporte a una
velocidad constante y regular la longitud del recorrido a través de
cada módulo para acomodar el tiempo de incubación previsto.
El tubo flexible o tubo fijo, así como otros
componentes de los tubos, se deberán hacer de materiales resistentes
a sustancias químicas para evitar la corrosión (por ejemplo,
vidrio, acero inoxidable, polietileno, politetrafluoroetileno,
cloruro de polivinilo). Se puede usar controladores y
bombas/válvulas para transportar composiciones químicas desde la
cámara de almacenamiento a la cámara de reacción, desde la cámara de
reacción a la cámara de almacenamiento si la composición puede ser
reutilizada, y desde la cámara de reacción a la cámara de
desperdicios si la composición se ha de sacar del sistema; para
llenar la cámara de almacenamiento; y para lavar la cámara de
desperdicios por la orden en tiempo real del operador o la
selección de un programa almacenado. Un depósito calentado y
componentes de tubos calentados pueden ser necesarios para mantener
la composición química a la temperatura de reacción o para asegurar
que la composición química (por ejemplo, la solución de cera) se
mantenga en un estado fluido transportable. Pueden ser necesarias
juntas estancas al vapor y/o enfriamiento para aislar los vapores
corrosivos de los componentes mecánicos y eléctricos del
sistema.
Se entiende que los ejemplos siguientes son
ilustrativos de la presente invención, pero no limitan o restringen
de ninguna forma la puesta en práctica de la invención.
El procesado de tejido con una serie de
soluciones no acuosas se describe en la Patente de Estados Unidos
6.207.408. En particular, se utilizó una serie de cuatro soluciones
para procesar satisfactoriamente tejido para examen histológico en
WO-A-01/44783 y la Solicitud de
Estados Unidos publicada 2001/0051365. Morales y colaboradores
(Arc. Pathol. Lab. Med. 126:583-590, 2002; Am. J.
Clin. Pathol. 121:528-536, 2004) describen la
experiencia obtenido usando la invención anterior. Aquí, hemos
modificado el programa usado en un procesador de tejido rápido con
una serie de cuatro soluciones en módulos separados para determinar
la contribución de cada solución a la microtomía e histología
exitosas. Usando estas modificaciones, se seleccionaron soluciones
diferentes en los cuatro módulos del sistema y los resultados se
resumen en la tabla 1. La necesidad de cada solución se conoció con
varios tejidos fijados con formalina de aproximadamente 1,5 mm de
grosor.
\newpage
En una modificación del procesado de tejido
descrito en el ejemplo 4 de
WO-A-01/44783 y la Solicitud de
Estados Unidos publicada 2001/0051365, se procesaron especímenes en
un procesador de tejido bajo control variable. El proceso inicial
utilizó cuatro módulos (es decir, dos unidades de microondas y dos
unidades de vacío con cuatro soluciones diferentes cada una) y
tiempos de incubación de 15 minutos por módulo. Programar el
procesador de tejido para ampliar los tiempos de incubación y
saltar módulos usando las soluciones I y III demostró que tanto el
proceso de cuatro soluciones/una hora como el proceso de dos
soluciones/dos horas producían excelentes resultados (+++). Para
ser considerada excelente, la microtomía de bloques de tejido tenía
que producir cintas aceptables de secciones en serie que podrían
flotar en un baño de agua sin "explotar" y después colocar en
un portaobjetos de vidrio para tinción histológica sin
"fisurarse" sistemáticamente y uniformemente a través de
varios tipos de tejido. Este manejo característico de las secciones
de tejido después del corte con un microtomo era esencial para
proporcionar diagnósticos patológicos eficientes y fiables basados
en la morfología observada en secciones tintadas. La ausencia o
tinción pobre de porciones de la sección impediría dar una opinión
acerca de la morfología del tejido en dicha sección y por ello
reduciría la confianza en las conclusiones del diagnóstico. Por lo
tanto, los procedimientos e instrumentos que se usan en un
laboratorio clínico de patología requieren la validación de que
puedan ser realizados sistemática y eficientemente, se pueden
procesar varios tipos de tejido y se puedan aplicar diferentes
criterios de diagnóstico a tejidos procesados usando un protocolo
estandarizado, y se procesarán fiablemente especímenes preciosos.
Ambos procesos producen excelentes resultados. Pero la presente
invención tiene la ventaja de requerir solamente dos composiciones
químicas diferentes y la mitad de componentes del sistema requerido
para el procesado de tejido usando una serie de soluciones no
acuosas. El tiempo de procesado más largo es un compromiso aceptable
y puede ser mitigado mediante la utilización de especímenes de
tejido más finos y/o el preprocesado de los especímenes.
Durante la microtomía, los especímenes de tejido
pobremente procesados no forman una cinta de secciones en serie, la
sección explota cuando se introduce en un baño de agua, y hay
fisuras (es decir, ausencia de porciones) en la sección. Los
resultados "bueno" y "excelente" del procesado de tejido
no tienen tales defectos porque la microtomía produce secciones con
morfología conservada (por ejemplo, estructura celular y
organización del tejido) durante el análisis posterior (por
ejemplo, tinción histológica, unión de antígeno por anticuerpo,
hibridización in situ). Pero los resultados buenos (++) son
variables: (a) incoherentes con secciones del mismo tipo de tejido
o (b) coherentes con algunos tipos de tejidos, pero insatisfactorios
con otros tipos de tejidos. Tales resultados variables no son
aceptables a efectos
de diagnóstico porque es preferible usar el mismo protocolo para todos los especímenes procesados en el laboratorio.
de diagnóstico porque es preferible usar el mismo protocolo para todos los especímenes procesados en el laboratorio.
La eliminación de la solución II no produjo
excelentes resultados ni siquiera cuando el tiempo de incubación
para la solución I se amplió a 45 minutos. La microtomía mostró que
las secciones de parafina que flotaban en un baño de agua se
extenderían inaceptablemente en la superficie y "explotarían"
antes de la colocación en portaobjetos de vidrio. Sin embargo, la
histología demostró que había menos "fisuras" después de
tinción hematoxilina-eosina de secciones
desparafinadas cuando la incubación en la solución I se amplió de 30
minutos a 45 minutos.
Por lo tanto, las investigaciones restantes se
realizaron con la solución II y sin la solución I. La incubación en
la solución II era 45 minutos o 60 minutos. El procesado con 15
minutos en las soluciones III y IV no produjo secciones con
características de manejo aceptables. Las secciones en serie no
produjeron cintas aceptables, aunque la histología era adecuada. El
uso de solución III solamente era desastroso (cf. Solamente la
solución III durante 45 minutos a solamente la solución IV durante
45 minutos) porque los bloques no se podían seccionar. La
combinación de las soluciones II y IV solamente produjo al menos
buenos resultados con respecto a la microtomía e histología. Pero
se prefieren tiempos de incubación de 60 minutos en lugar de 45
minutos porque el primero podría procesar especímenes tanto frescos
como fijados con formalina mientras que el último no procesaba
aceptablemente tejido fresco.
El tiempo de incubación más corto también dio
resultados incoherentes con "fisuras" en tejidos
linforreticulares (por ejemplo, bazo) y morfología inaceptable con
tejidos grasos (por ejemplo, mama). Se han procesado
satisfactoriamente diversos tipos de tejidos con el tiempo de
incubación más largo (véase más adelante).
Se procesaron especímenes de tejido frescos,
fijados con formalina y tratados con UM-FIX de
aproximadamente 1,0 mm a aproximadamente 2,0 mm (preferiblemente
aproximadamente 1,5 mm) en la dimensión más fina. La vejiga, mama,
carcinoma del pulmón, cérvix (epitelio escamoso), riñón, hígado,
ovario, bazo, amígdala, y útero (endometrio y miometrio) dieron
uniformemente excelentes resultados para microtomía e histología
(tinción hematoxilina-eosina de secciones
desparafinadas).
La mezcla no acuosa se compone de:
aproximadamente 25% acetona
aproximadamente 55% isopropanol
aproximadamente 20% aceite mineral
ácido acético glacial añadido a una
concentración de aproximadamente 0,5% volumen total
DMSO añadido a una concentración de
aproximadamente 1% volumen total.
\vskip1.000000\baselineskip
Los tres componentes principales se mezclaron a
un volumen de 3,8 l, y después se añadieron el ácido acético y
DMSO. Los especímenes se incubaron durante aproximadamente 60
minutos en esta mezcla no acuosa a aproximadamente 62ºC; el
intercambio químico se promovió agitando la mezcla no acuosa (por
ejemplo, aireación). Tanto el espécimen como la mezcla no acuosa se
calentaron con energía de microondas durante la incubación.
Después del endurecimiento del espécimen de
tejido por sustancias químicas en la mezcla no acuosa y/o
irradiación de microondas, el espécimen de tejido se impregnó
durante 60 minutos en parafina fundida, que estaba desgasificada y
deshidratada, a aproximadamente 65ºC y una presión reducida de
aproximadamente 640 mm de Hg. La impregnación se promovió agitando
la solución de cera con ciclos PN. Después de un tiempo de procesado
total de aproximadamente dos horas, el espécimen de tejido se
preparó para microtomía y análisis posterior, o almacenamiento.
Para especímenes de tejido más gruesos (por
ejemplo, rodaja de aproximadamente 2,5 mm de grosor), es posible
que los tiempos de incubación con mezcla no acuosa y solución de
cera tengan que prolongarse a aproximadamente 90 minutos o 120
minutos para cada solución.
\vskip1.000000\baselineskip
Se procesaron especímenes de tejido frescos,
fijados con formalina y tratados con UM-FIX de
aproximadamente 1,0 mm a aproximadamente 2,0 mm (preferiblemente
aproximadamente 1,5 mm) en la dimensión más fina. Se obtuvieron
resultados uniformemente excelentes para microtomía e histología
(tinción hematoxilina-eosina de secciones
desparafinadas) con tejidos humanos (por ejemplo, adenoide, mama,
riñón, lipoma, hígado, placenta, piel, bazo, y útero) en las
condiciones siguientes (es decir, dos reacciones cada una durante
aproximadamente 30 minutos).
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla no acuosa se compone de:
aproximadamente 50% acetona
aproximadamente 30% isopropanol
aproximadamente 20% aceite mineral
ácido acético glacial añadido a una
concentración de aproximadamente 0,5% volumen total
DMSO añadido a una concentración de
aproximadamente 1% volumen total.
\vskip1.000000\baselineskip
Los tres componentes principales se mezclaron en
un volumen de 3,8 l, y después se añadieron el ácido acético y
DMSO. Los especímenes se incubaron durante aproximadamente 30
minutos en esta mezcla no acuosa a aproximadamente 62ºC; el
intercambio químico se promovió agitando la mezcla no acuosa (por
ejemplo, aireación). Tanto el espécimen como la mezcla no acuosa se
calentaron con energía de microondas durante la incubación.
Después del endurecimiento del espécimen de
tejido con sustancias químicas en la mezcla no acuosa y/o
irradiación de microondas, el espécimen de tejido se impregnó
durante 30 minutos en parafina fundida, que estaba desgasificada y
deshidratada, a aproximadamente 65ºC y una presión reducida de
aproximadamente 640 mm de Hg. La impregnación se promovió agitando
la solución de cera con ciclos P/V. Después de un tiempo de
procesado total de aproximadamente dos horas, el espécimen de
tejido se preparó para microtomía y análisis posterior, o
almacenamiento.
Para especímenes de biopsia más pequeños
obtenidos con un trocar (por ejemplo, un cilindro de aproximadamente
2 mm a aproximadamente 3 mm en diámetro), es posible que los
tiempos de incubación con mezcla no acuosa y solución de cera se
tengan que acortar a aproximadamente 15 minutos para cada
solución.
En otras realizaciones se procesaron apéndice,
intestino, mama, trompa de Falopio, riñón, hígado, pulmón,
parótida, placenta, próstata, tiroides y útero para microtomía e
histología cuando cada tiempo de reacción se acortó a
aproximadamente 20 minutos. En otras realizaciones se procesaron
adenoma, apéndice, mama, cérvix, vesícula biliar, riñón, hígado,
pulmón, ovario, piel, bazo, tiroides, amígdala, y cuerpo uterino
(así como hígado fresco de ratón) para microtomía e histología
cuando cada tiempo de reacción se acortó a aproximadamente 15
minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
El procesado de tejido puede ser realizado
usando una realización de la invención (representada en la figura
1A) de la siguiente manera. Se une una botella de una mezcla no
acuosa (3,8 l) y se añaden pelets de parafina (3 l). La mezcla no
acuosa se precalienta y la parafina sólida, que había sido
desgasificada y deshidratada cuando estaba en forma líquida, se
funde antes de la carga de muestras. Se aspira vacío y se eleva la
presión de aire para transferir soluciones y, si es necesario,
llevar a cabo la agitación de soluciones dentro de la retorta por
burbujeo (bomba BP) o ciclo P/V (bomba AP). Una conexión (por
ejemplo, tubos flexibles) y un orificio donde la conexión une
diferentes componentes del sistema puede ser usada para transferir
solución entre un primer depósito y la retorta de microondas usando
una bomba LP y válvulas de solenoide. Solamente la impregnación en
la retorta al vacío requiere una reducción de la presión con una
bomba de aire porque el procesado de tejido en la retorta de
microondas (por ejemplo, endurecimiento e impregnación inicial) se
realiza a presión atmosférica con agitación mecánica usando una
bomba de burbujeo.
Las soluciones y las retortas se calientan a
temperaturas operativas apropiadas. Por ejemplo, la mezcla no
acuosa se pretrata a aproximadamente 55ºC con un calentador
eléctrico en el depósito del primer módulo (primer depósito 1)
antes de transferirla a la retorta de microondas 2. La mezcla no
acuosa se transfiere típicamente de nuevo al primer depósito 1
antes de abrir la retorta de microondas 2 de modo que los
especímenes de tejido se coloquen en una cámara de reacción al
vacío. Igualmente se funde parafina sólida en el depósito del
segundo módulo (segundo depósito 4) del que la solución de cera es
transferida típicamente a la retorta al vacío 3 al inicio de la
operación diaria y devuelta al segundo depósito 4 al final del día.
La temperatura de la solución se mantiene a aproximadamente 62ºC en
la retorta de microondas 2 y a aproximadamente 65ºC en la retorta al
vacío 3. Los tubos entre (i) el primer depósito 1 y la retorta de
microondas 2 o (ii) el segundo depósito 4 y la retorta al vacío 3
proporcionan comunicación bidireccional de fluido. Los dos depósitos
1 y 4 para soluciones no acuosas y de cera están separados. La
presencia o ausencia de solución y/o cesta en una retorta 2 o 3
puede ser determinada con un sensor de nivel para detectar el
volumen o desplazamiento de la solución.
Se carga una cesta perforada conteniendo
especímenes de tejido en casetes. Una estación de carga es opcional
de modo que la cesta se pueda colocar en una cámara de reacción de
la estación de carga (si la hay) que contiene mezcla no acuosa, en
un medio de transporte que transfiere una cesta a la retorta de
microondas 2 (y posteriormente a la retorta al vacío 3), o
directamente en la cámara de reacción de la retorta de microondas 2.
El medio de transporte es preferiblemente un brazo de robot con un
gancho que se une de forma reversible a la cesta; una cubeta con un
revestimiento absorbente sustituible está unida al brazo de robot y
bascula debajo de la cesta para coger las gotas de mezcla no acuosa
o solución de cera. Una tapa está unida a cada cámara de reacción
por una bisagra; cada tapa forma una junta estanca con la cámara de
reacción usando una junta estanca de caucho, y se abre/cierra con
una cadena movida con un motor eléctrico M. Finalmente, cuando la
impregnación del tejido ha terminado, la cesta cargada es
transferida desde la retorta al vacío 3. Una estación de descarga es
opcional y una cámara de reacción de la estación de descarga (si la
hay) está vacía de modo que la parafina fundida excedente puede
drenar de la cesta. El tiempo requerido para transferir la cesta
entre estaciones es menos de aproximadamente 10 segundos. Las
casetes de tejido se pueden descargar entonces de la cesta.
El proceso descrito en el ejemplo 2 o 3 puede
ser usado en este sistema. Se transfiere una mezcla no acuosa entre
la retorta de microondas 2 y el depósito calentado 1. La cesta es
transferida a una cámara de reacción vacía de la retorta de
microondas 2, la tapa de la cámara de reacción se cierra, la mezcla
no acuosa es transferida a la retorta de microondas 2 desde el
primer depósito calentado 1 para contactar los especímenes de
tejido, la mezcla no acuosa es devuelta al primer depósito
calentado 1 cuando termina la incubación (es decir, los especímenes
de tejido están adecuadamente endurecidos), la tapa se abre y la
cesta se transfiere a la retorta al vacío 3 conteniendo solución de
cera, y los especímenes de tejido se incuban en ella hasta que
termina la impregnación.
La cámara de reacción conteniendo un agente de
impregnación se calienta usando una fuente de calentamiento
radiante. Alternativamente, un calentador mantiene la temperatura
del agua que circula en tubos en contacto con el agente de
impregnación para mantenerla en un estado fundido. Por ejemplo, una
bobina de tubos puede estar situada dentro de la cámara de
reacción; esta bobina de calentamiento transferiría entonces calor
al contenido. Preferiblemente la bobina de calentamiento se elimina
envolviendo la pared exterior de la cámara de reacción con cable
eléctrico que conduce calor a través de las paredes al contenido de
la cámara de reacción. La agitación en la retorta al vacío puede
ser realizada por ciclos P/V de presión nominal 0,35 Kg/cm^{2} y
500 mm Hg de vacío.
Otras condiciones (por ejemplo, tiempos y
temperaturas de cada incubación) son como los descritos en los
ejemplos 2-3. El sistema puede estar encerrado en
un armario para contener los humos que pueda haber y expulsarlos
(control de humo). Un sistema de encimera puede usar un medio de
transporte mecánico para transferir especímenes de tejido o se
pueden transferir manualmente. Alternativamente, una puerta con una
ventana de vidrio a la altura del torso permite al operador acceder
al sistema cuando no hay movimiento de la cesta, cargar o descargar
una cesta del sistema, y observar el movimiento de la cesta. Para
seguridad, se prefiere que la puerta se bloquee cuando el brazo o
la tapa en una retorta se estén moviendo. Otra puerta a la altura de
la rodilla permite al operador (i) unir una botella de la mezcla no
acuosa a un orificio que conduce al primer depósito 1 que está
conectado a la retorta de microondas 2 y (ii) fundir parafina en el
segundo depósito 4 que está conectado a la retorta al vacío 3.
En una realización alternativa (figura 1B), se
puede usar una sola retorta 5 con funciones de microondas y vacío
combinadas en la misma posición. Una mezcla no acuosa de un primer
depósito 6 y una solución de cera de un segundo depósito 7 son
transferidas sucesivamente a la retorta de microondas/de vacío 5
para no tener que transferir especímenes de tejido entre dos
retortas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se fijaron especímenes de tejido en formalina o
UM-FIX, y posteriormente se procesaron durante 30
minutos en cada una de las dos reacciones. Se cortaron secciones de
parafina en un microtomo a un grosor de 3 micras, colocaron en un
baño de agua, y flotaron sobre un portaobjetos de vidrio. La
parafina se fundió colocando el portaobjetos en un horno a 58ºC
durante 30 minutos, o preferiblemente en un horno a 37ºC durante
aproximadamente 18 horas o durante la noche, y posteriormente se
desceró en un baño de xileno durante 10 minutos. Los portaobjetos
se rehidrataron en soluciones de etanol decrecientes durante un
minuto cada uno (dos baños de alcohol absoluto, dos baños de 95%
alcohol, y un baño de 90% alcohol), y posteriormente se lavaron por
inmersión en agua del grifo durante 2 minutos.
La peroxidasa endógena se bloqueó con una
solución de 6% peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}) y metanol, o
35 ml de 6% H_{2}O_{2} con 140 ml de metanol, se incubó durante
15 minutos. Los portaobjetos se lavaron por inmersión en agua del
grifo durante 2 minutos y salina fosfato tamponada (PBS) durante 2
minutos, secándose posteriormente.
Se transfirieron los portaobjetos a una cámara
de humedad y se añadió suero de caballo normal (NHS) al bloque
durante 10 minutos. El suero de caballo normal excedente se decantó
del portaobjetos, y se incubó anticuerpo específico primario
durante 30 minutos en la sección de tejido en una cámara de humedad
a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron con PBS con un
movimiento de adelante-atrás usando una botella
escurridora, se sumergieron en un baño PBS durante 2 minutos, y el
PBS excedente se secó de cada portaobjetos. Se añadió solución de
unión (también conocida como anticuerpo secundario o anticonejo o
anti-ratón biotinilado) a cada sección de tejido e
incubó durante 25 minutos en una cámara de humedad a temperatura
ambiente. Tales anticuerpos secundarios de conejo, rata y ratón
(por ejemplo, anti-IgM, anti-IgG) se
pueden obtener de Dako (Carpinteria, CA) y usar en una dilución de
aproximadamente 1:600. Los portaobjetos se lavaron con PBS usando
una botella escurridora, se sumergieron en un baño PBS durante 2
minutos, y el PBS excedente se secó de cada portaobjetos.
Se desarrolló una señal según las instrucciones
del fabricante (Vector Laboratories). Se añadió solución de
complejo de avidina-biotina (ABC) a la sección de
tejido e incubó durante 25 minutos en la cámara de humedad. Los
portaobjetos se lavaron con PBS en una botella escurridora y
sumergieron en una cremallera en un baño PBS durante 2 minutos. La
cremallera se sumergió en un baño de diaminobenzidina (DAB)
cromógeno durante 6 minutos, posteriormente se sumergió en
corriente agua para lavarla suavemente durante 4 minutos. Las
secciones de tejido se contratiñeron con hematoxilina (el tiempo de
tinción dependerá de la edad de la hematoxilina) desde
aproximadamente 15 segundos a 90 segundos a temperatura ambiente.
Los portaobjetos se lavaron en agua corriente durante 3 minutos
para quitar la contratinción excedente, se deshidrataron en baños de
alcohol (aproximadamente 10 segundos en cada uno) de 85% alcohol a
alcohol absoluto, limpiaron en xileno, y cubrieron. Los resultados
se exponen en la tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se colocan dos secciones de tejido de seis
micras en un tubo de microfuga de 1,5 ml, se añaden 800 \mul de
xileno y se mezclan mediante remolino, se añaden 400 \mul de
etanol absoluto y se mezclan mediante remolino, se centrifuga el
tubo durante 5 minutos en un microfuga, y se decanta el
supernadante. Al pelet se añaden 800 \mul de etanol absoluto y se
mezclan mediante remolino.
Se decanta el supernadante después de
centrifugación, entonces se añaden 100 \mul de un detergente y
solución proteinasa K (1% NP40 o Triton X-100, 2,4
\mul de 2,5 mg/ml proteinasa K) al pelet e incuba a 55ºC durante
una hora.
La proteinasa K se inactiva por incubación a
95ºC durante 10 minutos. El supernadante conteniendo ADN se recoge
después de la centrifugación en un microfuga durante 5 minutos. Este
material está preparado para PCR. Se precipitaría y/o extraerían
más si se planificase hibridación de Southern. Se precisarían más
secciones para obtener suficiente ADN para análisis de
restricción.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cortaron diez secciones (7 \mum cada una)
de un bloque de tejido procesado usando cuchillas desechables. Se
colocaron en tubos Falcon de 50 ml, desparafinizaron con 20 ml de
xileno, y el tejido restante se lavó posteriormente dos veces con
alcohol absoluto durante 30 minutos. Se suspendió el tejido en 0,5
gm/ml en una solución conteniendo 4M de tiocianato de guanidinio,
25 mM Na citrato pH 7,0, 0,5% N-laurilsarcosina, y
0,1 M de 2-mercaptoetanol. La solución se mezcló
mediante remolino y se cortó ADN por el paso a través de una aguja
de jeringa de calibre 18 a 22.
La solución conteniendo ARN se colocó con
cuidado en capas sobre 2,8 ml de 5,7 M CsCI en varios tubos
centrífugos de 5 ml (Sorvall), y se sedimentó ARN por
centrifugación en un rotor SW55Ti a 35.000 rpm y 18ºC durante 14
horas en una ultracentrífuga Beckman L8-53. La
fracción superior se quitó con cuidado dejando un pelet de ARN en
la parte inferior del tubo. El pelet se resuspendió con agua sin
ribonucleasa, y el tubo Eppendorf se giró a 14.000 rpm durante 10
minutos. Se guardó el supernadante conteniendo ARN y se midió la
absorbancia ultravioleta (UV): se estima que un coeficiente de
extinción de 1 OD_{280}/cm es el equivalente de aproximadamente
40 \mug/ml ARN y la relación OD_{260}/OD_{280} deberá ser
entre aproximadamente 1,8 y aproximadamente 2,0.
Se colocaron fragmentos de hígado de dos ratones
en UM-FIX durante aproximadamente dos horas y
posteriormente se procesaron según el ejemplo 3. El tejido se
procesó durante 15 minutos o 30 minutos en cada una de dos
reacciones. Las bandas 18S y 28S rARN se separaron por
electroforesis de gel desnaturalizante (figura 2). El ARN extraído
de hígado fresco de ratón se usó como el control positivo (carril
C). Se extrajo ARN de tejido de hígado procesado de dos ratones
(carriles 1 y 2 del primer ratón; carriles 3 y 4 del segundo ratón).
Los carriles 1 y 3 se procesaron durante 15 minutos en cada
reacción; los carriles 2 y 4 se procesaron durante 30 minutos en
cada reacción. Las bandas 18S y 28S rARN estaban en la relación
esperada y no se observó degradación.
Al indicar un rango numérico, se deberá entender
que también se describen todos los valores dentro del rango (por
ejemplo, uno a diez también incluye cada valor entero entre uno y
diez así como todos los rangos intermedios tal como dos a diez, uno
a cinco, y tres a ocho). El término "aproximadamente" se puede
referir al incertidumbre estadística asociada con una medición o la
variabilidad de una cantidad numérica que los expertos en la técnica
entenderán que no afecta a la operación de la invención o su
patentabilidad.
Todas las modificaciones y sustituciones que
caigan dentro del significado de las reivindicaciones y el rango de
sus equivalentes legales quedan incluidos dentro de su alcance. Una
reivindicación usando la transición "incluyendo" permite la
inclusión de otros elementos dentro del alcance de la
reivindicación; la invención también se describe por
reivindicaciones que utilizan la expresión de transición ``que
consta esencialmente de (es decir, permite la inclusión de otros
elementos dentro del alcance de la reivindicación si no afectan
materialmente a la operación de la invención) y la transición "que
consta" (es decir, permite solamente los elementos enumerados en
la reivindicación distintos de impurezas o actividades
inconsecuentes que de ordinario están asociados con la invención)
en lugar del término "incluyendo". Cualquiera de estas tres
transiciones puede ser usada para reivindicar la invención.
Se deberá entender que un elemento descrito en
esta memoria descriptiva no se deberá interpretar como limitación
de la invención reivindicada a no ser que se indique explícitamente
en las reivindicaciones. Así, las reivindicaciones concedidas son
la base para determinar el alcance de protección legal en lugar de
una limitación de la memoria descriptiva expuesta en las
reivindicaciones. En contraposición, la técnica anterior se excluye
explícitamente de la invención en la medida en que realizaciones
específicas anticiparían la invención reivindicada o destruirían la
novedad.
Además, no se ha previsto ninguna relación
particular entre limitaciones de una reivindicación a no ser que
tal relación se exponga explícitamente en la reivindicación (por
ejemplo, la disposición de componentes en una reivindicación de
producto o el orden de pasos en una reivindicación de método no es
una limitación de la reivindicación a no ser que así se indique
explícitamente). Todas las posibles combinaciones y permutaciones
de elementos individuales aquí descritos se han de considerar
aspectos de la invención. Igualmente, las generalizaciones de la
descripción de la invención se consideran parte de la invención.
Las realizaciones descritas se deberán
considerar solamente como ilustrativas, no restrictivas, porque el
alcance de la protección legal de la invención se indicará por las
reivindicaciones anexas más bien que por esta memoria
descriptiva.
Claims (29)
1. Un método de procesado de tejido de uno o más
especímenes de tejido para uso en microtomía o histología,
incluyendo el método:
- (a)
- impregnar inicialmente un espécimen de tejido en una sola mezcla no acuosa que se calienta, teniendo dicha mezcla no acuosa funciones de (i) fijación, (ii) deshidratación y (iii) aclarado e incluyendo al menos una cetona, al menos un alcohol, y aceite mineral; y después
- (b)
- impregnar a la cera sustancialmente el espécimen de tejido con una sola solución de cera que se calienta y también está a presión inferior a la presión atmosférica;
caracterizado porque el método usa
solamente las dos composiciones químicas diferentes.
2. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 1, donde el espécimen de tejido tiene un grosor de
aproximadamente 3 mm o menos.
3. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 1 o 2, donde los especímenes de tejido son procesados
manualmente.
4. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 1 o 2, donde los especímenes de tejido son procesados
mecánicamente.
5. El método de procesado de tejido de alguna de
las reivindicaciones precedentes, donde el espécimen de tejido es
procesado sin usar un aldehído.
6. El método de procesado de tejido de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el espécimen de
tejido es procesado sin usar un xileno.
7. El método de procesado de tejido de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el espécimen de
tejido no ha sido fijado antes del procesado.
8. El método de procesado de tejido de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el espécimen de
tejido ha sido fijado en formaldehído antes del procesado.
9. El método de procesado de tejido de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el espécimen de
tejido ha sido conservado en metanol y polietilen glicol (PEG)
antes del procesado.
10. El método de procesado de tejido de alguna
de las reivindicaciones precedentes, donde el espécimen de tejido
es procesado en una retorta de microondas para (a).
11. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 10, donde el espécimen de tejido se endurece
sustancialmente por la mezcla no acuosa, radiación de la unidad de
microondas, o ambos.
12. El método de procesado de tejido de alguna
de las reivindicaciones precedentes, incluyendo además agitación
para promover el intercambio químico entre la mezcla no acuosa y el
espécimen de tejido.
13. El método de procesado de tejido de alguna
de las reivindicaciones precedentes, donde la mezcla no acuosa está
a más de aproximadamente 55ºC y/o menos de aproximadamente 75ºC.
14. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 1, donde la mezcla no acuosa se compone de cetona y
alcohol en una relación en volumen de 1:1 a 10:1.
15. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 1, donde al menos una cetona es más de
aproximadamente 40% (v/v) y menos de aproximadamente 65% (v/v) de
la mezcla no acuosa.
16. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 1, donde al menos un alcohol es más de
aproximadamente 15% (v/v) y menos de aproximadamente 35% (v/v) de
la mezcla no acuosa.
17. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 1, donde el aceite mineral es más de aproximadamente
15% (v/v) y menos de aproximadamente 25% (v/v) de la mezcla no
acuosa.
18. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 1, donde la mezcla no acuosa se compone además de un
surfactante.
19. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 1, donde la mezcla no acuosa se compone de acetona,
alcohol isopropílico, y aceite mineral.
20. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 1, donde la mezcla no acuosa se compone además de
dimetil sulfóxido (DMSO).
21. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 1, donde la mezcla no acuosa se compone de
aproximadamente 15% (v/v) a aproximadamente 35% (v/v) de acetona,
aproximadamente 45% (v/v) a aproximadamente 65% (v/v) de alcohol
isopropílico, y aproximadamente 10%, (v/v) a aproximadamente 25%
(v/v) de aceite mineral.
22. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 1, donde la mezcla no acuosa se compone de
aproximadamente 40% a aproximadamente 60% (v/v) de acetona,
aproximadamente 25% a aproximadamente 35% (v/v) de isopropanol, y
aproximadamente 10% (v/v) a aproximadamente 25% (v/v) de aceite
mineral.
23. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 1, donde el espécimen de tejido se endurece
sustancialmente después de incubarse en la mezcla no acuosa durante
aproximadamente 45 minutos o menos.
24. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 1, donde el espécimen de tejido es procesado en una
retorta al vacío para (b).
25. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 24, donde el espécimen de tejido se impregna
sustancialmente a una presión superior a aproximadamente 104 torr
y/o inferior a aproximadamente 760 torr.
26. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 1, donde la solución de cera está a más de
aproximadamente 55ºC y/o menos de aproximadamente 85ºC.
27. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 1, donde la solución de cera ha sido desgasificada y
deshidratada.
28. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 1, donde la solución de cera se hace de parafina que
es sólida por debajo de aproximadamente 30ºC.
29. El método de procesado de tejido de la
reivindicación 1, donde el espécimen de tejido se puede seccionar
después de incubarse en la solución de cera durante aproximadamente
45 minutos o menos, y después se enfría.
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