CN102680295B - 一种从he染色片提取残微核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从HE染色片提取残微核酸的方法，先用低浓度盐酸乙醇作脱色剂对HE染色片进行脱色，再用草酸溶液进行漂白，然后再富集靶细胞进行核酸提取。与现有技术相比，本发明的方法，能够有效祛除碱性染料苏木素和酸性染料伊红，有效的减少了核酸在提取和保存过程中的降解，并富集检测所需的靶细胞，从而可以利用穿刺组织、细胞涂片（包括痰和尿）、胃肠镜等全部常规HE染色片进行残微的核酸提取及其后续的分子病理检测，具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。

Description

一种从 HE 染色片提取残微核酸的方法

技术领域

本发明涉及核酸的提取方法，具体涉及一种从HE染色片提取残微核酸的方法。

背景技术

HE染色是常用的病理制片方法，广泛用于病理诊断和研究。HE染色片是采用两种生物染料即碱性染料苏木素和酸性染料伊红分别于细胞核和细胞质发生作用，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折光率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞图像，组织细胞内含有酸性物质和碱性物质，细胞的酸性物质与碱性染料的阳离子结合，而细胞核的碱性物质与酸性染料的阴离子结合，使其中酸性细胞核被碱性的苏木素染成蓝色，而碱性的胞浆被酸性染料伊红染成红色，其结果胞核呈蓝色，胞浆呈红色。一方面，经过HE染色的穿刺组织、细胞涂片（包括痰和尿）、胃肠镜等常规病理HE染色片的肿瘤细胞中含有碱性染料苏木素和酸性染料伊红，造成偏酸或偏碱的外界条件，从而对核酸链中的磷酸二酯键有破坏作用，同时生物染料酸根基团与核酸分子结合，阻抑了磁珠和柱子吸附核酸分子的过程，此外HE染色前细胞经过福尔马林一段时间的固定，使细胞DNA/RNA链被破坏氧化损耗断裂，这些因素直接影响从HE染色片提取的核酸的质量。另一方面，HE染色片在制作过程由于碱性水漂洗和弱酸染料的中和，及时中断了福尔马林的氧化破坏后，又被优质的核酸固定剂乙醇固定保护，之后组织细胞中的核酸被生物染料弱酸碱根长期均质化结合，在树脂和封片密闭环境中保护了残存的核酸物质，所以HE染色片细胞中残留尚未损耗断裂的微量核酸，在核酸序列完整性上优于保存在蜡块内的组织细胞。相反，蜡块组织保存的细胞持续的在残留的福尔马林环境中氧化破坏，福尔马林气体很难在密封的石蜡固体环境逸出，数月后就产生大量的核酸碎片，很难得到正常长度的核酸片段，使PCR产物出现二聚体导致特异性扩增失败。对后续满足核酸检测量的需要和检测准确性造成的重大不利影响；不能保证稳定性要求极高的临床检测顺利成功进行下去。

目前，常用的核酸提取方法包括：磁珠法、溶胞法、自动提取法、硅藻玻璃粉吸附法和低温酶解法等。在中国专利申请97125650.0中，公开了一种从石蜡包埋组织中提取核酸进行基因扩增的方法，采用二甲苯脱蜡法或水浴脱蜡法，再提取核酸DNA进行基因PCR扩增。在中国专利申请03113637.0中，公开了一种核酸自动提取机，可以完成血液、精液和其它体液样品定量吸取、转移，试剂自动定量添加、振荡，一次性吸液器的装卸，样品控温加热，离心试管合盖，按需自动分离等一系列提取核酸工序的自动化操作。在中国专利申请89104591.0中，公开了一种核酸提取新工艺，是用低温酶解法的高效率提取核酸的新方法。在中国专利申请94110993.3中，公开了一种脱氧核糖核酸（DNA）提取工艺，提出了一种从鱼的性腺体如鱼的精巢中提取DNA的生产工艺。在中国专利申请94106094.2中，公开了一种核糖核酸(RNA)的提取方法，从新鲜海产品中摘取内脏，低温保存后置入碱性缓冲液中，再向上清中加入聚乙二醇沉淀、溶解后加入有机酸，析出变性蛋白，上清再沉淀、洗涤、干燥，即可得到RNA。在中国专利申请98110654.4中，公开了一种核酸快速抽提方法，采用乙醇、焦碳酸二乙酯混合溶液，与一定比例的待测标本混合，经反应、浓缩、离心后，即可得到用于PCR或RT－PCR的核酸溶液。在中国专利申请200810200588.X中，公开了一种应用纳米磁珠纯化核酸的试剂盒，可以从人血浆或血清或尿液中纯化出病毒及革兰氏阴性菌的核酸，可以快速、灵敏的大规模纯化核酸。上述这些技术和工艺均是针对新鲜组织细胞，血液或石蜡组织等检材，没有涉及这些检材后续的HE染色片上的靶细胞残微核酸提取和纯化，因此针对以HE染色片为原材料进行残微核酸的提取还处于空白阶段。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种从HE染色片提取残微核酸的方法，通过利用化学上同离子竞争效应解除核酸分子的弱酸根染料基团的结合，可以针对HE切片中残存的长片段核酸进行有效提取和纯化，获得高质量的核酸。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种染色细胞核酸提纯技术，简称染色核酸提纯（tained nucleus-TN），是从HE染色片提取残微核酸的方法：先用低浓度盐酸乙醇作脱色剂对HE染色片进行脱色，然后用草酸水溶液漂白，再富集靶细胞，最后对富集的靶细胞进行核酸提取即可。具体步骤包括：

（1）将HE染色片浸入二甲苯30min及以上，轻滑掉盖玻片并取出，继续浸泡HE染色片8~12h，更换入新二甲苯，充分祛除中性树胶，得细胞片；更换入新二甲苯，浸泡15~20min；

（2）取出细胞片用无水乙醇浸泡10~20min，充分祛除二甲苯；更换入新无水乙醇，浸泡15min，然后依次进行95%乙醇浸泡10min；80%乙醇浸泡5min；70%乙醇浸泡2min；自来水洗2min；

（3）用1%盐酸酒精苏木素脱色细胞片30min以上；

（4）2%草酸水溶液浸泡细胞片3～10min；自来水稍洗，蒸馏水洗30min，富集细胞片上的靶细胞，并立即转到离心管内；

（5）提取靶细胞核酸即可。

操作全过程中，禁止细胞片裸露在空气中。

所述的HE染色片为：从手术病理石蜡包埋组织、穿刺组织、胃肠镜活检以及细胞涂片中通过正常病理步骤切片、染色得到的HE染色片。

所述的核酸包括DNA、RNA和miRNA。

步骤（5）中，采用常规方法或采用常规试剂盒进行核酸提取。

近年来，随着核酸提取技术方法及试剂盒质量的进步，对残微核酸的提取纯化有了极大地进步，但还不能满足HE染色片提取核酸的需求。本发明通过创造，仅以微量的1张HE染色片上的靶细胞为材料，先从HE染色片上祛除碱性染料苏木素和酸性染料伊红染料，富集靶细胞，然后再从富集的靶细胞中提取核酸，能够获得临床迫切需要的，难于在病人身上再次捡取的核酸等，成为解决提取病人肿瘤细胞中的DNA/RNA这一困难的新途径。

有益效果：与现有技术相比，本发明染色核酸提纯技术的从HE染色片提取残微核酸的方法，先对穿刺组织、细胞涂片（包括痰和尿）、胃肠镜的常规HE染色片进行脱色，然后再进行核酸的提取，能够有效祛除碱性染料苏木素和酸性染料伊红，有效的减少了核酸在提取和保存过程中的降解，从而可以利用各种病理切片穿刺组织、细胞涂片（包括痰和尿）、胃肠镜等常规HE染色片进行残微的核酸的提取及其后续的分子病理检测，为保存优质核酸，利用核酸找到经济环保的新材料和新资源，具有很好的实用性，能够产生很好的经济效益和社会效应。

附图说明

图1是胃镜HE标本提取的DNA电泳图；

图2是PCR扩增产物电泳图；

图3是RNA的Q-PCR的扩增曲线图；

图4是miRNA的Q-PCR的扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

以下实施例所使用的材料为：从各种手术病理石蜡包埋组织（FFPE）、穿刺组织、胃肠镜活检以及各种细胞涂片（包括宫颈，胸腹水，痰和尿等各种手工或仪器离心制片或印片后获取的细胞涂片）中通过正常病理步骤切片、染色得到的HE染色片。

实施例1 HE染色片的脱色方法

将HE染色片浸入二甲苯30min，轻滑掉盖玻片，如盖玻片不能自动滑落可适当延长时间；取出盖玻片，继续浸泡HE染色片8~12h，充分祛除中性树胶；更换入新二甲苯，浸泡15min；取出细胞片用无水乙醇浸泡10~20min，充分祛除二甲苯；更换入新无水乙醇，浸泡15min，然后依次进行95%乙醇浸泡10 min；80%乙醇浸泡5 min；70%乙醇浸泡2 min；自来水稍洗2min；1%盐酸酒精苏木素脱色，镜下控制至细胞片几近无色，约需10min，如仍有颜色或原片染色较深可适当延长脱色时间；2%草酸水溶液浸泡细胞片3min～5min，如仍有颜色或原片染色较深可适当延长时间；自来水稍洗，蒸馏水洗30min，将靶细胞（含有肿瘤组织的细胞）刮下立即转到离心管内，全过程组织细胞禁止裸露在空气中。

HE染色片的脱色方法有很多种试剂可供选择，酸性高锰酸钾氧化加草酸漂白是一种被广泛采用较优良的脱色方法。但因为高锰酸钾的强氧化作用，与细胞之间的作用比较剧烈，在其作用下，非常容易导致细胞的部分或完全脱落，从而使载玻片上的肿瘤细胞的数量减少，影响后续DNA/RNA的提取的得率。选用低浓度盐酸乙醇作脱色剂，作用比较温和，涂片可以褪色干净并保持细胞完整，从而保证了核酸提取的量。采用1%盐酸酒精作为脱色剂，其原理类似于常规HE染色中的分化作用。盐酸可使留在细胞上的金属根（即苏木精染液中的媒染剂通常是钾明矾）与细胞分离，并阻止苏木精染料色素根与媒染剂中的铝化合形成蓝紫色沉淀色素。草酸具有漂白作用，而且酸能破坏苏木精的醌型结构，使色素与组织解离。从而达到脱色漂白作用。

实施例2

选择2008~2011年20例HE染色片（胃镜标本，江苏省中医院病理科提供），每例一张，20片试验样用实施例1的脱色工艺进行脱色，富集获得靶细胞，然后利用OMEGA bio-tek公司的E.Z.N.A.^TMTissue DNA Kit试剂盒从富集的靶细胞中提取DNA，利用QIAGEN RNeasy® FFPE Kit试剂盒从富集的肿瘤组织中提取RNA，另20片对照样为未经实施例1的脱色步骤而直接用对应的提取试剂盒进行DNA/RNA提取，结果如图1和表1所示，经脱色后提取的DNA电泳条带比未经脱色的组织提取的DNA电泳条带的完整程度较好，图中，上排为对照样（未经过脱色步骤）的DNA，下排为试验样（经过脱色步骤）的DNA，从左到右各泳道分别为DNA Ladder、空白对照、DNA。具体数值如表1所示，对试验样和对照样提出的DNA浓度进行T值检验，t=4.900，t>t0.05(39)，P＜0.05，说明两组浓度存在统计学差异，试验样提出的DNA的质量好于对照样。

表1 核酸质量测定结果

为检测提取的DNA的质量，采用不同的引物，以提取的DNA为模板，进行三个基因的PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，结果如图2所示，发现试验样所提取的DNA的PCR产物较对照样中提取的DNA的PCR产物的特异性更强。图2中，左边三条带为试验样DNA的K-ras-2，C-kit-9，EGFR-18 PCR产物，右边三条带为对照样DNA的K-ras-2，C-kit-9，EGFR-18 PCR产物。其中，PCR的引物为：K-ras-2-U：aggcctgctgaatttgactg，K-ras-2-L：catgattttggtcagagaaacc；C-kit-9-U：tgattggaaacgtaatcgtag，C-kit-9-L：aacaaaacaaaggaagccact；EGFR-18-U：aggtgacccaagactctgtg，EGFR-18-L：tcccctcctgaggatgagag。20uL PCR体系为：QIAGEN HotStarTaq®DNA polymerase Kit 10×扩增缓冲液2uL，dNTP 2U，上下游引物各10pmol，模板DNA 0.1～2ug，Taq DNA聚合酶 2.5u，Mg²⁺1.5mmol/L，加双蒸水至20ul。PCR条件：95℃10min；95℃40s，60℃1min，72℃45s，30个循环；72℃45min；4℃保温。

为检测提取的RNA的质量，对提取的RNA进行Q-PCR检测，结果如图3所示，可以看出，由试验样提出的RNA的ACTB基因扩增曲线的重复性和Ct值均好于对照样中提出的RNA的扩增曲线。其中，RNA逆转录反应条件：QIAGEN QuantiTect® Rever Transcription Kit gDNA 1uL，RNA 100~1000uL，加DEPC水至7uL，RT-buffer 2uL，primer 0.5uL，RT-Taq 0.5uL。RT条件：42℃2min；42℃30min，90℃5min。ABI Power SYBR®Green PCR master mix 3 uL，(β-actin-U：tggggcacaaagtttccc，β-actin-L：aaattgccctgtagccaaataa)0.5uL，cDNA 100-1000 uL/L，加双蒸水至5uL，Q-PCR条件：95℃10min，95℃30s，60℃1min 45个循环。

实施例3

以穿刺样本常规处理后的1张HE染色片，（江苏省中医院病理科提供2009年常规穿刺病理HE染色片）为材料，进行脱色，步骤如下：

将1张穿刺HE样本浸入二甲苯30min，轻滑掉盖玻片；取出盖玻片，继续浸泡HE染色片8~12h，充分祛除中性树胶；更换入新二甲苯，浸泡15min；取出用无水乙醇浸泡10~20min，充分祛除二甲苯；更换入新无水乙醇，浸泡15min，然后依次进行95%乙醇浸泡10 min；80%乙醇浸泡5 min；70%乙醇浸泡2 min；自来水稍洗2min；1%盐酸酒精苏木素脱色，约需10min；2%草酸水溶液浸20min；自来水稍洗，蒸馏水洗30min，将靶细胞刮下富集并立即转到离心管内，全过程组织细胞禁止裸露在空气中。

利用OMEGA bio-tek公司的E.Z.N.A.^TMTissue DNA Kit试剂盒从富集的穿刺靶细胞（肿瘤组织）中提取DNA，具体方法参照试剂盒。利用QIAGEN RNeasy® FFPE Kit试剂盒从富集的靶细胞（肿瘤组织）中提取RNA，具体方法参照试剂盒。试验样为先进行脱色再提取核酸，1张对照样为未经脱色步骤处理，其他方法相同。

通过紫外分光光度计检测，试验样的DNA的浓度为30.46ug/mL，纯度A₂₆₀/A₂₈₀为1.99；对照样的DNA浓度为13.75ug/mL，纯度A₂₆₀/A₂₈₀为2.54。试验样的RNA的浓度为23.13ug/mL，纯度A₂₆₀/A₂₈₀为1.86；对照样的RNA浓度为8.93ug/mL，纯度A₂₆₀/A₂₈₀为3.50。

实施例4

以1张细胞涂片样本（常规处理后的HE染色片，江苏省中医院病理科提供2011年常规细胞涂片1张HE染色片）为材料，进行脱色，步骤如下：

将细胞涂片浸入二甲苯浸泡HE染色片8~12h，充分祛除中性树胶；更换入新二甲苯，浸泡15min；取出细胞片用无水乙醇浸泡10~20min，充分祛除二甲苯；更换入新无水乙醇，浸泡15min，然后依次进行95%乙醇浸泡10 min；80%乙醇浸泡5 min；70%乙醇浸泡2 min；自来水稍洗2min；1%盐酸酒精苏木素脱色，约需15min；2%草酸水溶液浸泡细胞片3min～5min，如仍有颜色或原片染色较深可适当延长时间；自来水稍洗，蒸馏水洗30min，将靶细胞刮下富集并立即转到离心管内，全过程靶细胞禁止裸露在空气中。

利用OMEGA bio-tek公司的E.Z.N.A.^TMTissue DNA Kit试剂盒从富集的靶细胞（穿刺肿瘤组织）中提取DNA。利用QIAGEN RNeasy® FFPE Kit试剂盒从富集的靶细胞（穿刺肿瘤组织）中提取RNA。试验样为先进行脱色再提取核酸，对照样为未经脱色步骤处理，其他方法相同。

通过紫外分光光度计检测，试验样DNA的浓度为50.06ug/mL，纯度A₂₆₀/A₂₈₀为1.92；对照样DNA浓度为27.55ug/mL，纯度A₂₆₀/A₂₈₀为2.33。试验样RNA的浓度为46.71ug/mL，纯度A₂₆₀/A₂₈₀为1.94；对照样RNA浓度为26.33ug/mL，纯度A₂₆₀/A₂₈₀为2.46。

实施例5

以1张常规胃镜样本（常规处理后的HE染色片，江苏省中医院病理科提供2008年常规胃镜样本HE染色片）为材料，进行脱色，步骤如下：

将胃镜样本HE染色片浸入二甲苯30min，轻滑掉盖玻片；取出盖玻片，继续浸泡HE染色片8~12h，充分祛除中性树胶；更换入新二甲苯，浸泡15min；取出用无水乙醇浸泡10~20min，充分祛除二甲苯；更换入新无水乙醇，浸泡15min，然后依次进行95%乙醇浸泡10 min；80%乙醇浸泡5 min；70%乙醇浸泡2 min；自来水稍洗2min；1%盐酸酒精苏木素脱色，约需10min；2%草酸水溶液浸30min；自来水稍洗，蒸馏水洗30min，将靶细胞刮下富集并立即转到离心管内，全过程组织细胞禁止裸露在空气中。

利用OMEGA bio-tek公司的E.Z.N.A.^TMTissue DNA Kit试剂盒从富集的靶细胞（肿瘤组织）中提取DNA。利用QIAGEN RNeasy® FFPE Kit试剂盒从富集的靶细胞（肿瘤组织）中提取RNA。试验样为先进行脱色再提取核酸，对照样为未经脱色步骤处理，其他方法相同。

通过紫外分光光度计检测，试验样DNA的浓度为75.26ug/mL，纯度A₂₆₀/A₂₈₀为1.80；对照样DNA浓度为33.75ug/mL，纯度A₂₆₀/A₂₈₀为2.67。试验样RNA的浓度为39.84ug/mL，纯度A₂₆₀/A₂₈₀为2.04；对照样RNA浓度为17.47ug/mL，纯度A₂₆₀/A₂₈₀为2.39。

实施例6

TaqMan® MicroRNA Assay has-U6；TaqMan® Universal PCR Master Mix均购自Ambion公司 ；石蜡标本提取用Ambion RecoverALLTM Total Nucleic试剂盒。

将胃镜样本浸入二甲苯30min，轻滑掉盖玻片；取出盖玻片，继续浸泡HE染色片8~12h，充分祛除中性树胶；更换入新二甲苯，浸泡15min；取出用无水乙醇浸泡10~20min，充分祛除二甲苯；更换入新无水乙醇，浸泡15min，然后依次进行95%乙醇浸泡10 min；80%乙醇浸泡5 min；70%乙醇浸泡2 min；自来水稍洗2min；1%盐酸酒精苏木素脱色，约需10min；2%草酸水溶液浸30min；自来水稍洗，蒸馏水洗30min，将靶细胞刮下富集并立即转到离心管内，全过程组织细胞禁止裸露在空气中。

总RNA提取：将按石蜡组织试剂盒说明书方法操作。

RT反应：以RT-PCR反应扩增基因，采用15uL反应体系：dNTP mix(100mM total)0.15uL，Multiscribe RT enzyme(50U/uL)1.00uL，10×RT Buffer 1.5uL，RNase Inhibitor(20U/uL)0.19uL，Nuclease free water 4.16uL，3uL引物(由Lifetech定制通用引物)，5uL（20-80ng/uL）RNA。在操作时注意轻轻混匀（不要涡旋振荡），短暂离心，冰上放置。（引物冰上溶解，短暂离心后再使用）。RT-PCR反应条件：16℃30min，42℃30s，85℃5min，4℃保存。

实时PCR：总反应体系为20uL：TaqMan MicroRNA Assay(20×)1.00uL，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10.00uL，石蜡组织 Product from RT reaction (Minimum1︰15Dilution)4.5uL，Nuclease-free water4.5uL。扩增条件：95℃10min；95℃15s、60℃1min，50个循环。两组及内参各miRNA实验均设三个复孔，在384板上样定量检测。结果如图4所示，可以看出，由试验样提出的miRNA的U6基因扩增曲线的重复性和Ct值均好于对照样中提出的miRNA的扩增曲线。

通过以上实施例可见，HE染色片先经过脱色后再进行核酸提取，所得到核酸的质量和纯度均明显好于未经脱色而直接提取核酸的HE染色片，随后的PCR实验及其qPCR实验所得各种结果也显示出经脱色后的切片组织中明显好于未脱色的HE染色片，因此，本发明的方法能够有效祛除碱性染料苏木素和酸性染料伊红，为之后的靶细胞的核酸的提取恢复相对适当的理化环境，减少了核酸在提取和保存过程中的降解，有效的利用各种病理切片，穿刺组织、细胞涂片（包括痰和尿）、胃肠镜的常规HE染色片进行靶细胞的核酸的提取，顺利完成后续的分子病理检测，不仅针对HE切片常规诊断后进行治疗性二次利用，而且减少社会单位蜡块储存和患者切白片的经济负担，为长期保存优质核酸，利用核酸找到经济环保的新材料和新资源。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省中医院 南京紫霄科技有限公司 赖仁胜

<120> 一种从HE染色片提取残微核酸的方法

<130> 100

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> K-ras-2-U序列

<400> 1

aggcctgctg aatttgactg 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> K-ras-2-L序列

<400> 2

catgattttg gtcagagaaa cc 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C-kit-9-U序列

<400> 3

tgattggaaa cgtaatcgta g 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> C-kit-9-L序列

<400> 4

aacaaaacaa aggaagccac t 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> EGFR-18-U序列

<400> 5

aggtgaccca agactctgtg 20

<210> 6

Claims (3)

1.一种从HE染色片提取残微核酸的方法，其特征在于：先用低浓度盐酸乙醇作脱色剂对HE染色片进行脱色，然后用草酸水溶液漂白，再富集靶细胞，最后对富集的靶细胞进行核酸提取即可；具体步骤包括：

(1)将HE染色片浸入二甲苯30min及以上，轻滑掉盖玻片并取出，继续浸泡HE染色片8～12h，更换入新二甲苯，充分祛除中性树胶，得细胞片；更换入新二甲苯，浸泡15～20min；

(2)取出细胞片用无水乙醇浸泡10～20min，充分祛除二甲苯；更换入新无水乙醇，浸泡15min，然后依次进行95％乙醇浸泡10min；80％乙醇浸泡5min；70％乙醇浸泡2min；自来水洗2min；

(3)用1％盐酸酒精苏木素脱色细胞片30min以上；

(4)2％草酸水溶液浸泡细胞片3～10min；自来水稍洗，蒸馏水洗30min，富集细胞片上的靶细胞，并立即转到离心管内；

(5)提取靶细胞核酸即可；

操作全过程中，禁止细胞片裸露在空气中；

所述的HE染色片为：从手术病理石蜡包埋组织、穿刺组织、胃肠镜活检以及细胞涂片中通过正常病理步骤切片、染色得到的HE染色片。

2.根据权利要求1所述的从HE染色片提取残微核酸的方法，其特征在于：所述的核酸包括DNA、RNA和miRNA。

3.根据权利要求1所述的从HE染色片提取残微核酸的方法，其特征在于：步骤(5)中，采用常规方法或采用常规试剂盒进行核酸提取。