DE19712195B4 - Verfahren und Vorrichtung zur Bereitstellung von Proben für den off-line Nachweis von Analyten nach der MALDI-Massenspektrometrie - Google Patents
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Abstract
Verfahren
zur Bereitstellung von Proben für
den off-line Nachweis von Analyten nach der MALDI-Massenspektrometrie,
bei der die nachzuweisenden Proben (5) entnommen sowie zur massenspektrometrischen
Untersuchung vorbehandelt auf einer Probenträgerplatte (13) eines MALDI-Spektrometers bereitgestellt
werden, wobei die Proben (5) in einer Vielzahl von Probengefäßen (2)
im definierten x-y-Raster einer an sich bekannten Multipipette (3)
angeordnet werden, aus denen sie mit den Pipettenspitzen (4) der
Multipipette (3) unter Rasterzuordnung jeweils einer Pipettenspitze
(4) zu exakt einem Probengefäß (2) entnommen
werden und wobei zumindest ein Teil der entnommenen und in im selben
x-y-Raster der Multipipette (3) angeordneten Mischgefäßen vorbehandelten Probenvolumina
(6) über
einen Pipettenadapter (7) mit fest zugeordneter Anpassung an das
Probenaufnahmeraster der Probenträgerplatte (13) des MALDI-Spektrometers
auf diese für
die massenspektrometrische Untersuchung und Auswertung abgegeben
wird, wobei jeweils genau ein Probenvolumen (6) über jeweils genau eine Pipettenspitze
(4) und jeweils genau einen Kanal des Pipettenadapters (7) in jeweils
genau ein zugeordnetes...
Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bereitstellung von Proben für den off-line Nachweis von Analyten nach der MALDI-Massenspektrometrie. Sie findet Anwendung auf dem Gebiet der Biochemie, Molekularbiologie, in der chemischen und biotechnologischen Industrie sowie in der Klinischen Chemie. Hauptsächlich wird sie zur Charakterisierung von Stoffmischungen nach spezieller Behandlung, insbesondere nach chromatographischer Trennung, über das Signal "präzise Masse" verwendet.
- "Matrix assisted laser desorption ion masspectrometrie" (MALDI-Spektrometrie) ist eine relativ neue Technik (Hillenkamp et all, 1988), die aber in den vergangenen Jahren eine sehr weite Verbreitung auf vielen Gebieten der Analytik gefunden hat. Die Vorzüge dieses Verfahrens gegenüber anderen massenspektrometrischen Techniken liegen darin, daß auch Moleküle mit großer Masse, wie Proteine, präzise bestimmbar sind und die Interpretation des Analysenergebnisses nicht oder nur minimal durch artifiziell auftretende Spaltprodukte und sekundäre Massengipfel beeinflußt wird. Außerdem ist diese robuste Technik nur wenig durch häufig in den Analyten vorkommenden Beimengungen wie Salze, Detergentien und andere Substanzen empfindlich zu stören.
- Die Präzision der Massenbestimmung, die mit geeigneten Eichverfahren durchgeführt weit unter 1 Promill liegt, erlaubt die Nutzung des Signals "Präzise Masse" als spezifischen Indikator zur Charakterisierung einer Substanz und wird zur Identifizierung von Molekülen genutzt. Durch die schnelle Entwicklung von chromatographischen Techniken in den letzten Jahren ist es heute durch Wahl geeigneter Trägermaterialien und Elutionsmittel möglich, nahezu jede Substanz aus einer Mischung von sehr vielen Verunreinigungen rein darzustellen. Dazu muß die einzelne zu charakterisierende Fraktion im chromatographischen Prozeß der Stofftrennung verfolgt werden. Das geschieht on-line, wenn die zu trennende Substanz geeignete physikalische Signale liefert, die kontinuierlich verfolgt werden können. Solche häufig verfolgten Signale sind Lichtabsorption, Fluoreszenz, Leitfähigkeit, Viskosität und andere. Können solche relativ unspezifischen Signale nicht verwendet werden, muß mit spezifischen Verfahren wie immunologischen Assays (RIA, EIA) oder unter Nutzung katalytischer Eigenschaften (Enzymbestimmung) off-line in den einzelnen Fraktionen, die nach der Stofftrennung in geeigneten Gefäßen mit Fraktionssammlern aufgefangen werden, der Analyt und seine Verunreinigung untersucht werden. Naturgemäß fallen bei diesem Vorgehen eine große Zahl zu analysierender Proben an, die untersucht werden müssen. Diese Zahl ist um so größer, je dichter besetzt und damit präziser der Trenngang verfolgt werden soll. Die oben aufgeführten Vorteile der MALDI-MS machen es wünschenswert, die Bestimmung der Massenverteilung in einer Vielzahl von Proben, die während der Trennung erhalten werden, relativ spezifisch zur Bestimmung des/der Analyte(n) zu nutzen, um den gesuchten Analyten hinsichtlich seiner Verunreinigung zu charakterisieren und den Trenngang zu optimieren. Gegenwärtig müssen für ein solches Vorgehen viele einzelne Proben manuell aus den einzelnen Gefäßen der Fraktionssammlung entnommen werden, in Zwischenschritten mit geeigneten Verfahren vorbehandelt werden, um die Substanzen zu entfernen, welche die MALDI-Prozedur stören können, und dann mit Matrixlösung behandelt werden. Danach muß die Analyt-Matrix-Mischung einzeln auf die Probenträgerplatte des entsprechenden MALDI-Spektrometers getropft werden und nach der Massenbestimmung eine Zuordnung der gefundenen einzelnen Massen zu den Fraktionen des Fraktionssammlers erfolgen. Infolge der Vielzahl der erforderlichen Proben sowie der Arbeitsschritte zu deren Vorbehandlung und massenspektrometrischer Auswertung ist der manuelle und zeitliche Arbeitsaufwand hoch und steigt mit zunehmender Probenanzahl drastisch an.
- Hinzu kommt, daß bei Durchführung einer Pluralität prinzipiell ähnlich gelagerter monotoner Arbeitsgänge zur Probenbehandlung – psychologisch bedingt – die Gefahr von Unachtsamkeiten und Behandlungsfehlern im Umgang mit den Proben gegeben ist, wodurch das Analysenergebnis schnell beeinträchtigt werden kann.
- Aus der
EP 0 206 945 A2 ist eine Adaptervorrichtung bekannt, mit welcher Rastermaß und Rasterzuordnung einer Pipettiervorrichtung in gewissen Grenzen verändert werden können. Hierbei sind für jedes Aufnahmegefäß insbesondere mehrere Adapter-Einfüllöffnungen vorgesehen, welche jeweils über mechanisch bewegte Leitungen zu den Aufnahmegefäßen geführt werden und über diesen enden. - Durch die Lageänderung dieser Leitungen (gesteuert per Gewindespindel mit Schub/Zugelement) kann sowohl eine möglichst exakt justierbare geometrisch paßfähige Einfüllung erreicht als auch möglicherweise die Zuordnung der Adapter-Einfüllöffnungen zu den jeweiligen Aufnahmegefäßen geändert werden. Indem jedem Aufnahmegefäß jeweils mehrere Adapter-Einfüllöffnungen zugeordnet sind, können die Aufnahmegefäße zumindest in vorgegebenen Rasterabweichungen mit unterschiedlichem geometrischem Maß pipettiert werden, wobei einer solchen Rasteranpassung in Bezug auf die Größenordnung konstruktiv bedingte Grenzen gesetzt sind, welche in der Praxis durch die Unterschiede der Rastermaße sogenannter Liquidhandlingtechnik für an sich bekannte und hochgerasterte Mikrotiterplatten zum Rastermaß der MALDI-Massenspektrometrie überschritten werden. Darüber hinaus erscheint, speziell bei höheren Rastermaßen, die Probenabgabe aus den über den Probenaufnahmegefäßen endenden Leitungen nicht flüssigkeitsdicht und wenig zuverlässig, so daß die Gefahr von Fraktionsvermischungen und Probenverfälschungen nicht auszuschließen ist. Aus der
US 5,508,200 A ist eine spezielle Vorrichtung zur steuerbaren Zuführung multipler Proben bekannt, bei der eine Anzahl von umgekehrt angeordneten Reagenzvorratsbehältern kreisförmig positioniert sind, deren Reagenzien mittels einer Druckleitung sowie über jeweils probenspeziell steuerbare seitlich angebrachte Ventile nach unten zu wiederum kreisförmig angebrachten Anschlußleitungen bereitgestellt werden können. Den konstruktiven Abmessungen dieser Anschlußleitungen entsprechend, welche geringer als die Abmessungen der besagten Reagenzvorratsbehälter sind, können die besagten Anschlußleitungen auch in weitaus engerer Gruppierung, d. h. mit kleinerem Kreisdurchmesser, plaziert werden. - Diese (durch die jeweils probenspezifisch betätigbaren Ventile) gesteuerte Zuführung der einzelnen Reagenzien aus den genannten Vorratsbehältern kann in der Gesamtheit und gemeinsam für alle diese Zuführungen noch mit einer zusätzlichen Vermischung mit einem Reagenz aus einem unter Druck stehenden Vorratsbehälter kombiniert werden. Die zusätzliche Vermischung wird durch ein Hauptventil gesteuert.
- Ein Verfahren und eine Vorrichtung zur massenspektrometrischen Untersuchung multipler Proben an sich offenbart die
US 5,498,545 A . Die zu analysierenden Proben werden in einem y-x-Raster bereitgestellt. Wie diese Probenträger durch Pipettiervorgänge möglichst effizient und zuverlässig befüllt werden können, geht aus der Patentschrift nicht hervor. - Aufgabe der Erfindung ist es, den manuellen und zeitlichen Aufwand zur Handhabung (Entnahme, Vorbehandlung, Masseanalyse, Auswertung), insbesondere einer Vielzahl, von Proben für massenspektrometrische Untersuchungen nach dem MALDI-Verfahren zu verringern. Darüber hinaus soll die Gefahr der Beeinträchtigung des Analysenergebnisses infolge von Fehlhandhabungen im Umgang mit den Proben weitgehend ausgeschlossen und eine möglichst universelle massenspektrometrische Auswertbarkeit der Analyte ermöglicht werden.
- Erfindungsgemäß werden die zu untersuchenden Proben des Analyts nicht mehr manuell zur MS-Untersuchung nach dem MALDI-Verfahren vorbereitet und gehandhabt, sondern sie werden im x-y-Raster der Pipettenspitzen einer an sich bekannten Multipipette bereitgestellt. Es ist somit möglich, gleichzeitig eine Vielzahl von Proben, beispielsweise im Raster 96 (8×12), zu entnehmen sowie für die MS-Untersuchung (mit entsprechender Vorbehandlung) vorzubereiten. Von der Multipipette werden die Proben über einen Pipettenadapter an den Probenträger des MALDI-Spektrometers abgegeben, wobei mittels geeigneter und schwimmend gelagerter Dichtelemente sowie mit diesen in Verbindung stehender Leitungen das Probenrastermaß der Multipipette an das Probenaufnahmeraster der MS-Probenträgerplatte umgesetzt wird, d. h. je genau eine im Raster der Multipipette bereitgestellte Probe des Probenbereichs gelangt in genau ein über eine feste Zuordnung korrespondierendes Aufnahmegefäß der besagten MS-Probenträgerplatte. Diese feste Zuordnung wird für den gesamten Pipettenadapter durch das (Multipipetten-)Raster der Dichtelemente und die mit diesen in Verbindung stehenden Leitungen realisiert. Auf diese Art und Weise ermöglicht die Erfindung nicht nur eine Vorbehandlung und Vorbereitung der Proben durch die Multipipette in dem bewährten x-y-Raster der Pipettenspitzen (welches bei der Probenvorbehandlung und -Mischung eine gute Zugänglichkeit und Probenhandhabung gestattet), sondern sie gestattet (mit dem an sich bekannten Raster der Multipipette) auch unmittelbar die multiple Probenbeschickung des Massenspektrometers in dem spezifischen Probenaufnahmeraster des Spektrometers, ohne daß manuelle und damit verbundene zeitliche Arbeitsaufwände zur Handhabung der Proben erforderlich werden. Außerdem läuft der essentielle Prozeß der gemeinsamen Kristallisation von Matrix und Probe für alle Proben eines Analyseansatzes unter standardisierten Bedingungen ab. Dadurch erhöht sich die Vergleichbarkeit der erhaltenen Signale. Außerdem wird damit auch die Grundlage dafür geschaffen, diesen Prozeß programmtechnisch ablaufen zu lassen, die Probenhandhabung automatisch steuern zu können und die Analyse und Darstellung der Ergebnisse mit geeigneten Auswerteprogrammen vorzunehmen. Mit der Automatisierung des Prozeßablaufes werden gleichzeitig subjektive Fehler, wie sie vom Grundsatz bei der Durchführung einer Pluralität ähnlich gelagerter manueller Arbeitsgänge gegeben wären, vermieden.
- Die schnelle Handhabung sehr vieler Proben ermöglicht auch ohne großen Aufwand die Durchführung mannigfaltiger und unterschiedlicher oder Mehrfachanalysen, die bei manueller Probenhandhabung aus Zeit- und Aufwandsgründen praktisch nicht oder kaum realisierbar wären, jedoch zur weiteren Objektivierung des Analysenergebnisses führen. Trotz der sehr effizienten Vorbereitung der Proben mit den Vorteilen der an sich bekannten Liquidhandlingtechnik, können die Proben mit der Erfindung zuverlässig zur massenspektrometrischen Analyse bereitgestellt werden, indem die Pipettenspitzen der Liquidhandlingtechnik in die schwimmend gelagerten Dichtelemente eingreifen.
- Die Erfindung soll nachstehend anhand von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispielen zum MALDI-massenspektrometrischen Nachweis von Analyten näher erläutert werden.
- Es zeigen:
-
1 : Prinzipanordnung einer Mikrotiterplatte und einer Multipipette im bekannten 96-Raster zur Aufnahme (und Vorbehandlung) von Proben -
2 : Prinzipanordnung zur Pipettenadaptierung des Multipipettenrasters gemäß1 an das 10×10-Raster einer Probenträgerplatte des MALDI-Spektrometers -
3 : Aufbringen der vorbereiteten Analyten aus der Multipipette über einen Pipettenadapter gemäß2 auf die Probenträgerplatte des MALDI-Spektrometers -
4 : Effektivität der Salzabtrennung durch Acetonfällung von BSA als Probenvorbereitung -
5 : Effektivität der Salzabtrennung durch Acetonfällung von Immunglobulinen als Probenvorbereitung -
6 : Effektivität der Tritonabtrennung durch Acetonfällung von BSA als Probenvorbereitung -
7 : Spektrenqualität als Funktion der BSA-Menge - Ausführungsbeispiel 1:
- Anhand der
1 –3 sollen die Handhabung der Proben zur Entnahme, Vorbehandlung und Bereitstellung für die MALDI-Massenanalyse sowie die dazu verwendete Vorrichtung erläutert werden. - In einem ersten Schritt wird aus einer in
1 gezeigten Mikrotiterplatte1 , die im 8×12-Raster angeordnete Probenaufnahmegefäße2 besitzt, mit dem Kopf einer automatischen Multipipette3 , die seinerseits im gleichen 8×12-Raster angeordnete Pipettenspitzen4 für die Hantierung von Volumina trägt, aus den mit Proben5 gefüllten (dunkel dargestellten) Probenaufnahmegefäßen2 simultan eine Pluralität von mit MALDI-MS nachzuweisenden Probenvolumina6 in die Pipettenspitzen4 (in2 und3 ebenfalls dunkel dargestellt) aufgenommen. In einem zweiten Schritt wird zumindest ein Teil dieser Volumina in eine nicht in der Zeichnung dargestellte Misch- und Probenvorbehandlungskammer, die eine wie in1 gezeigte herkömmliche Mikrotiterplatte1 sein kann und die im gleichen Rastermaß angeordnete Einzelgefäße (Probenaufnahmegefäße2 ) trägt, abgegeben. In dieser Misch- und Probenvorbereitungskammer erfolgt im einfachsten Fall die Zugabe von geeigneter Matrixlösung und die Mischung von Probe und Matrix mit an sich bekannten Multipipetten3 und (aus Übersichtsgründen nicht in der Zeichnung dargestellten) Mikrotiterplatten-Schüttlern. - Müssen störende Salze oder andere Begleitstoffe, wie Detergentien, entfernt werden, kann in dieser Misch- und Probenvorbereitungskammer eine Probenvorbehandlung (siehe Ausführungssbeispiele 2–4) durchgeführt werden.
- In einem dritten Schritt wird in Analogie zum ersten Schritt in die (auch als Igelspitzen bezeichneten) Pipettenspitzen
4 die in2 und3 dunkel dargestellten Probenvolumina6 der so vorbehandelten Proben5 aufgenommen. - Danach wird in einem vierten Schritt ein Pipettenadapter
7 an die Pipettenspitzen4 der Multipipette3 form- bzw. kraftschlüssig angedockt (3 ). Der Pipettenadapter7 besteht aus einer Halteplatte8 für schwimmend gelagerte Dichtelemente9 , sowie aus Leitungen10 , die jeweils mit ihrem oberen Ende mit dem korrespondierenden Dichtelement9 verbunden sind und mit ihren anderen Enden11 durch eine Fixierplatte12 so aufgenommen werden, daß die Enden11 in einem neuen zu einer Probenträgerplatte13 eines MALDI-Massenspektrometers paßfähigen Rastermaß angeordnet sind. Die Dichtelemente9 sind „schwimmend" gelagert, d.h. sowohl horizontal als auch vertikal in gewissen Grenzen beweglich angeordnet, so daß sie sich bei der Aufnahme der Pipettenspitzen4 selbst für den Formschluß zentrieren. - In einem fünften Schritt werden zumindest Teile der in den Pipettenspitzen
4 befindlichen Probenvolumina6 der Probe-Matrix-Mischung über die angedockten Dichtelemente9 und die Leitungen10 des Pipettenadapters7 auf die Proben tragende Bereiche der Probenträgerplatte13 abgegeben und nach an sich bekannter Kristallisation der MALDI-Massenspektrometrie zugeführt. - Ausführungsbeispiel 2:
- Zur Vorbereitung der Proben für die MALDI-Massenspektrometrie wird eine Salzabtrennung durch Acetonfällung von BSA durchgeführt.
- In die Mikrotiterplatte
1 im 8×12 Raster (vgl.1 ) wird eine BSA-Lösung so pipettiert, daß durch Mischung mit verschieden konzentrierten NaCl-lösungen jeweils 200 μl Lösung mit cBSA = 2 g/l (mBSA = 400 μg) und cNaCl = 0; 0,005; 0,1; 0,5; 1, 1,5; 2 M entstehen. Mit der Multipipette3 im 8×12 Raster ihrer Pipettenspitzen4 werden zu den Proben jeweils 200 μl Aceton oder 400 μl Aceton gegeben. Daraus ergeben sich Aceton endkonzentationen von 50 bzw. 66 %. Die Mikrotiterplatte1 wird auf Grund der hohen Flüchtigkeit von Aceton mit einer Folie abgeklebt und 10 min. bei 4000 g und 4 °C zentrifugiert. Es werden nun der Überstand mit der Multipipette3 abgenommen, zum Niederschlag jeweils 400 μl 96 %iges Aceton pipettiert und nochmals 10 min. bei 4000 g und 4 °C zentrifugiert. Nach erneuter Abnahme des Überstandes mit der Multipipette, wird die verbleibende Flüssigkeit abgedampft. Das Albumin wird nun in 330 μl H2O zu einer Konzentration von 20 pmol/μl gelöst. Hiervon werden 200 μl zur Bestimmung der Proteinkonzentration abgenommen. Die acetonhaltigen Überstände werden zur NaCl-Konzentrationsbestimmung gesammelt. - Mit der Multipipette
3 werden 50 μl in eine Mikrotiterplatte1 pipettiert, in dessen Mischgefäßen sich bereits 50 μl der Matrixlösung (20 g/l Sinapinsäure in 66 % Acetonitril/H2O) für das MALDI-MS befanden. Nach 5-minütiger Mischung werden hiervon jeweils 50 μl von der Multipipette3 angesaugt. Nun wird der Pipettenadapter7 so am Pipettenigel (Pipettenspitzen4 ) befestigt, daß die Dichtelemente9 dicht mit den Pipettenspitzen4 abschließen. Unter dem Pipettenadapter7 ist die Probenträgerplatte13 positioniert, so daß das Raster der Enden11 von den Leitungen10 mit dem Probenaufnahmeraster (10×10) der Probenträgerplatte13 korrespondiert. - Zunächst wird der Pipettenadapter
7 als in sich dichtes System durch Ausstoß von 30 μl der Probevolumina6 aus den Pipettenspitzen4 gefüllt. Dann werden die Probenträgerplatte13 des MALDI-MS unter dem Pipettenadapter7 positioniert sowie ein Probenvolumen6 von 2 μl im Probenaufnahmeraster von 10×10 an die Probenträgerplatte13 abgegeben. - Nach einer Trocknungszeit von 10 min. werden die Proben mittels MALDI-MS analysiert.
- Die Analyse im Massenspektrometer ergab Massenspektren in der selben Qualität, wie sie vom BSA aus salzfreier Lösung ohne vorherige Fällungsprozedur gewonnen werden.
- Die Proteinausbeute wird durch die Extinktionmessung bei 280 nm bestimmt und mittels Messung der elektrischen Leitfähigkeit ist es möglich, die Salzkonzentration im Überstand zu ermitteln.
- Die Effektivität der Salzabtrennung durch Acetonfällung von BSA als Probenvorbereitung ist in
4 dargestellt. Die Kürzel WF und Ac stehen dabei für die Begriffe Wiederfindung bzw. Aceton. Es wird deutlich, daß eine 50 % Acetonlösung nur ausreichend ist, wenn die NaCl-Konzentration im Bereich von 0,1 bis 0,5 M liegt. Dagegen kann man BSA durch 66 % Acetonlösung bis zu einer 1,5 M Salzlösung quantitaiv ausfällen. In diesen Konzentrationsbereichen bleibt das gesamte Salz in Lösung. Erst bei einer 2 molaren NaCl-Lösung wurde das Löslichkeitsprodukt durch 50 % (ca. 10 % des NaCl fiel aus) bzw. 66 % Aceton (ca. 15 % fiel aus) überschritten. Albumin schlägt in salzfreier Lösung nicht durch Aceton nieder. - Ausführungsbeispiel 3:
- In gleicher Weise, wie im Ausführungsbeispiel 2 anhand der Salzabtrennung durch Acetonfällung von BSA beschrieben, wird zur Vorbereitung der Proben für die MALDI-Massenspektrometrie eine Salzabtrennung durch Acetonfällung von Gamma-Globulinlösung durchgeführt.
-
5 zeigt die Ergebnisse dieser Acetonfällung. - Das Immunglobulin zeigte bereits bei nur 50 % Aceton auch noch bis 2 M NaCl-Lösung einen Niederschlag von ca. 80 %. Bei 66 % Aceton fällt aber deutlich mehr Protein in den Niederschlag (zwischen cNaCl = 0,005 bis 2 M ca. 85–100 %).
- Auch hier bleibt im ganzen untersuchten Konzentrationsbereich das gesamte Salz im Überstand; und auch die Analyse im Massenspektrometer ergab Massenspektren in der selben Qualität, wie sie vom Immunglobulin aus salzfreier Lösung ohne vorherige Fällungsprozedur gewonnen werden.
- Ausführungsbeispiel 4:
- Zur Vorbereitung der Proben für die MALDI-Massenspektrometrie wird eine Tritonabtrennung durch Acetonfällung von BSA durchgeführt.
- Dazu wird in der Mikrotiterplatte
1 eine BSA-Lösung (mit 0,1 M NaCl) mit Tritonlösungen so gemischt, daß in 100 μl jeweils 500 μg BSA enthalten sind und Tritonkonzentrationen von jeweils cTrX 100 = 0,05; 0,1; und 0,5 % vorliegen. Diese Gemische werden, wie im Ausführungsbeispiel 2 beschrieben, mit Aceton behandelt. Anschließend werden der Niederschlag für die MALDI-MS-Analyse gelöst und mit Matrixlösung gemischt sowie 2 μl dieses Gemisches mittels der Multipipette3 und des Pipettenadapters7 (3 ) im Probenraster von 10×10 auf die Probenträgerplatte13 des Massenspektrometers gebracht. - Die quantitative Proteinbestimmung im Niederschlag erfolgt auf Grund der Tritonbeimischung mittels an sich bekannter Flurammethode.
6 zeigt die Ergebnisse dieser Acetonfällung. Die Kürzel WF und Ac stehen dabei wiederum für die Begriffe Wiederfindung bzw. Aceton. - Es zeigt sich deutlich, daß 50 %iges Aceton nicht ausreicht, um Rinderserumalbumin vollständig zu fällen. Dabei geht die Ausbeute von 78 % bei 0,05 % Triton bis auf 69 % bei 0,5 % Triton zurück. Dagegen reichen 2/3 Aceton aus, um mehr als 95 % des Albumins zu gewinnen.
- Charakteristische Tritonspektren wurden nach der Fällung bei keiner der verwendeten Tritonkonzentrationen im Massenspektrum des Rinderserumalbumins gefunden. Dieser Befund spricht für eine ausreichende Triton abtrennung aus der zu analysierenden Probe. Die Analyse im Massenspektrometer ergab Massenspektren in der selben Qualität, wie sie vom BSA aus salzfreier Lösung ohne vorherige Fällungsprozedur gewonnen werden.
- Ausführungsbeispiel 5:
- Zur Ermittlung des kleinsten hantierbaren Einsatzes für die Acetonfällung wird eine BSA-Lösung (2 g/l BSA, 0,15 M NaCl) so auf Blottfoliestücke (a = 20 mm2) pipettiert, daß auf einem Foliestück jeweils 0,5; 1; 3; 6; 10; oder 15 μg BSA aufgetropft werden. Als Blottfolie kommen Nitrocellulose und PVDF zur Anwendung. Die Folien mit dem eingetrocknetem Albumin werden in einem verschließbaren Glasgefäß (in der Zeichnung nicht dargestellt) durch 400 μl 85 %iges Aceton aufgelöst und dabei das Protein ausgefällt. Nach einer 10 minütigen Zentrifugation mit 5800 g bei 4 °C wurde der Überstand mittels Pipette dekandiert. Danach werden der Niederschlag nochmals mit 200 μl 96%igem Aceton versetzt, erneut zentrifugiert und der Überstand wieder dekandiert. Der Niederschlag wird zur Trockne gebracht. Mittels einer Matrixlösung aus 10 g/l Sinapinsäure in 66 % Acetonitril/H2O wird der Niederschlag auf 5 pmol/μl (0,3 μg/μl) aufgelöst. Jeweils 2 μl (beim Einsatz von lediglich 0,5 μg wird alles pipettiert) diese Gemisches werden auf die Probenpositionen der MALDI-MS-Probenträgerplatte
13 aufgebracht. Nach einer Trocknungszeit von 10 min. werden die Proben im MS analysiert. Ein Wert für die Qualität des erhaltenen Spektrums wurde durch das Verhältnis aus der Peakhöhe zur Amplitude des Grundrauschens ermittelt. Wie7 zeigt, ist die relative Peakhöhe im untersuchten Intervall eindeutig von der einsetzten Proteinmenge abhängig. Dabei wurde ein auswertbares Proteinsignal schon bei nur 1 μg (16 pmol) Einsatz erzielt. Allerdings kann man von guten Signalen erst bei einem Einsatz von 3 μg bei Nitrocellulosefolie und 6 μg bei PVDF-Folie sprechen. -
- 1
- Mikrotiterplatte
- 2
- Probenaufnahmegefäß
- 3
- Multipipette
- 4
- Pipettenspitze
- 5
- Probe
- 6
- Probevolumen
- 7
- Pipettenadapter
- 8
- Halteplatte
- 9
- Dichtelement
- 10
- Leitung
- 11
- Ende
- 12
- Fixierplatte
- 13
- Probenträgerplatte
Claims (9)
- Verfahren zur Bereitstellung von Proben für den off-line Nachweis von Analyten nach der MALDI-Massenspektrometrie, bei der die nachzuweisenden Proben (
5 ) entnommen sowie zur massenspektrometrischen Untersuchung vorbehandelt auf einer Probenträgerplatte (13 ) eines MALDI-Spektrometers bereitgestellt werden, wobei die Proben (5 ) in einer Vielzahl von Probengefäßen (2 ) im definierten x-y-Raster einer an sich bekannten Multipipette (3 ) angeordnet werden, aus denen sie mit den Pipettenspitzen (4 ) der Multipipette (3 ) unter Rasterzuordnung jeweils einer Pipettenspitze (4 ) zu exakt einem Probengefäß (2 ) entnommen werden und wobei zumindest ein Teil der entnommenen und in im selben x-y-Raster der Multipipette (3 ) angeordneten Mischgefäßen vorbehandelten Probenvolumina (6 ) über einen Pipettenadapter (7 ) mit fest zugeordneter Anpassung an das Probenaufnahmeraster der Probenträgerplatte (13 ) des MALDI-Spektrometers auf diese für die massenspektrometrische Untersuchung und Auswertung abgegeben wird, wobei jeweils genau ein Probenvolumen (6 ) über jeweils genau eine Pipettenspitze (4 ) und jeweils genau einen Kanal des Pipettenadapters (7 ) in jeweils genau ein zugeordnetes Aufnahmegefäß der Probenträgerplatte (13 ) gefüllt wird, wobei der Pipettenadapter (7 ) an seiner der Multipipette (3 ) zugewandten Seite eine Anzahl von im x-y-Raster der Pipettenspitzen (4 ) der Multipipette (3 ) in einer Halteplatte (8 ) schwimmend gelagerten und mit den Pipettenspitzen (4 ) jeweils lagekorrespondierenden Dichtelementen (9 ) aufweist, die jeweils der Aufnahme einer Pipettenspitze (4 ) dienen. - Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Probenvorbehandlung eine Mischung der Proben (
5 ) mit geeigneten Matrixlösungen durchgeführt wird. - Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenvorbehandlung eine Fällung mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Aceton, darstellt.
- Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Probenvorbehandlung eine Extraktion mit organischen Lösungsmitteln durchgeführt wird.
- Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Handhabung der Proben (
5 ) (Entnahme, Vorbehandlung und Massenanalyse) sowie die Auswertung der Analysenergebnisse programm-technisch gesteuert werden. - Vorrichtung zur Bereitstellung von Proben für den off-line Nachweis von Analyten nach der MALDI-Massenspektrometrie, mit welcher die nachzuweisenden Proben (
6 ) aus Probengefäßen (2 ) durch Pipetten entnommen und nach Probenvorbehandlung in Mischgefäßen auf eine Probenträgerplatte (13 ) eines MALDI-Spektrometers zur massenspektrometrischen Analyse abgegeben werden, wobei die Vorrichtung einen zwischen einer zur Aufnahme und Abgabe von Proben an sich bekannten Multipipette (3 ), deren Pipettenspitzen (4 ) in einem definierten und zu den Probengefäßen (2 ), wie auch zu den Mischgefäßen, identischen x-y-Raster angeordnet sind, sowie einer Probenträgerplatte (13 ) des MALDI-Spektrometers vorgesehenen Pipettenadapter (7 ) mit fester Rasterzuordnung des x-y-Rasters der Pipettenspitzen (4 ) zum Probenaufnahmeraster der Probenträgerplatte (13 ) umfasst, wobei der Pipettenadapter (7 ) an seiner der Multipipette (3 ) mit den Pipettenspitzen (4 ) zugewandten Seite eine Anzahl von im x-y-Raster der Pipettenspitzen (4 ) in einer Halteplatte (8 ) schwimmend gelagerten und mit den Pipettenspitzen (4 ) jeweils lagekorrespondierenden Dichtelementen (9 ) für die kraft- oder formschlüssige Aufnahme je einer Pipettenspitze (4 ) besitzt, wobei jedes Dichtelement (9 ) mit jeweils genau einer Leitung (10 ) zur Abgabe genau einer nachzuweisenden Probe (6 ) an jeweils genau ein einziges Aufnahmegefäß der Probenträgerplatte (13 ) des MALDI-Spektrometers in Verbindung steht, wobei die Enden (11 ) aller Leitungen (10 ) in dem zum Probenaufnahmeraster der Probenträgerplatte (13 ) identischen Raster angeordnet sind. - Vorrichtung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die in dem zum Probenaufnahmeraster der Probenträgerplatte (
13 ) identischen Raster angeordneten Enden (11 ) der Leitungen (10 ) durch eine Platte (12 ) aufgenommen werden. - Vorrichtung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das x-y-Raster der Pipettenspitzen (
4 ) dem 96 (8×12) bzw. n×96 Raster an sich bekannter Mikrotiterplatten (1 ) entspricht. - Vorrichtung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Enden (
11 ) der Leitungen (10 ) zur jeweiligen Ankopplung an die korrespondierenden Probenaufnahmegefäße der Probenträgerplatte (13 ) in ihrem Endbereich jeweils konisch ausgebildet sind.
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