JP2004264278A - 試料調製およびｍａｌｄｉ−ｔｏｆターゲット上への溶離剤の直接スポッティングのための器械および方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析などによるさらなる分析の前に試料を脱塩・濃縮・付着させる、単一ウェルまたはマルチウェル試料調製器械および方法を提供すること。
【解決手段】本発明の一実施形態による器械は、複数のウェルを含んでおり、そのそれぞれが、個別の出口または排出開口部と流体連通し、場合によっては、固相抽出を実施できる装置が形成されるように、多孔質ポリマーマトリックス中に閉じ込められた複数の収着性粒子を好ましくは含む３次元膜構造を含んでいる。この器械は、ＭＡＬＤＩターゲット上に直接スポッティングできるように設計されているので、移動ステップがなくなる。また、本発明の器械を用いた試料の調製・付着・分析方法も開示する。
【選択図】図１

Description

マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ：ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）分析は、生化学、免疫学、遺伝学、および生物学における構造上の問題を解決する有用なツールである。試料が電離され、飛行時間（ＴＯＦ：ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ）分析装置を使用してイオンの質量が測定される。ＴＯＦ分析は、イオンの形成から始まり、イオンが一定の運動エネルギーまで加速されてドリフト領域に進入する。これらがその質量の平方根に比例した飛行時間後に検出器に到達する。異なる質量のイオンが異なる時間で検出器に到達するので、質量スペクトルが形成される。

質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）は、新薬の発見および開発、遺伝子型の特定、ならびにプロテオーム研究の分野で特に有力なツールになり得る。最新の研究の傾向は、自動化された取扱い機器またはロボティクスを使用して、よりいっそう多くの試料を分析することである。個々の試料の量は、ナノモル（ｎａｎｏ−ｍｏｌｅ）からアトモル（ａｔｔｏ−ｍｏｌｅ）までのレベルである。結果として、計装類がより高感度になっており、試料の取扱い構成を小型化し、高密度化し、使い捨て可能にする必要がある。

分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなど）の前の試料調製は、多くの場合、試料（例えばペプチド）を脱塩し、体積１〜２マイクロリットルまで濃縮するものである。このような体積は、時間が経つと数ナノリットルの体積に減少する可能性が高い。多くの場合、多数の試料を同時に調製、分析することが望ましい。同時分析のためのマルチウェルプレートが開発されており、通常これは、１枚のプレートにつき、９６、３８４、または１５３６個の反応ベッセルまたはウェルから成る。

Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているＺｉｐＴｉｐ（登録商標）装置など、ある種の試料調製装置は、ＭＡＬＤＩ分析前の試料調製に優れたツールである。それらは、手動で、あるいは自動化された機器によって試料をＭＡＬＤＩターゲット上にスポッティングするのに使用できる、単動式試料処理装置である。より具体的には、米国特許第６，０４８，４５７号および６，２００，４７４号に、ハウジングオリフィスの位置で粒子充填ポリマーシステムの転相によって形成される、試料調製のためのキャスト膜構造の形成が教示されている。ハウジング（可溶性のポリマー／粒子ラッカーを含んでいる）を沈殿槽（通常は水）内に浸すとポリマーが沈殿する。挿入によってラッカーの両側に小さい液圧が生じるので、沈殿して開放スポンジ様構造を形成しているポリマーに水が侵入する。ただし、構造の上のポリマーと水との界面には半透膜フィルムがあり、流れに対する大きな抵抗力が生じている。この障壁を浸食または切断して得られる構造は、きわめて透過性が高い。こうして得られる装置は、一般的な手持ち式１０マイクロリットル・ピペッター（例えば、Ｇｉｌｓｏｎ、Ｐｉｐｅｔｍａｎ）によって生み出される小さい差圧を受けて流れを生じるように設計されている。

ハイスループットの試料処理では、質量スペクトルの分解能および感度を向上させるために、望ましくない塩および生化学物質の除去など、試料の取扱いおよび調製にマルチウェルプレートを使用することが望ましい。ただし、溶出溶媒の気化（ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）が問題になることがある。タンパク質およびペプチドは、適切なＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを得るために体積をできる限り小さくする必要がある。遠心分離による溶出体積の回収は、可能であるが困難である。これは、マルチウェルプレートを遠心分離機に移動する際、ならびに特に遠心分離の際に、各ウェル内の体積が急速な気化によって変化することがあるからである。また、従来のように真空法によって回収された溶離剤（ｅｌｕａｎｔ）も、陰圧下で急速に気化する傾向にあるので、再懸濁させる必要がある。さらに、試料を例えばピペットから回収プレートに移動するたびに、あるいは再懸濁させるたびに、これらの装置の境界面との接着によって試料が失われる。試料の量が通常フェムトモル（ｆｅｍｔｏｍｏｌｅ）程度であるので、試料の損失を許容することができない。さらに、プレートを手で遠心分離機に設置し取り出さなければならないので、遠心分離も自動化に適していない。

高感度および強いＭＡＬＤＩ信号を実現するのに重要なことは、結合ペプチドをできる限り高濃度に溶出させることである。これは、使用する溶出体積を最小限に抑え、取扱いステップを削減することによって達成することができる。

自動化に容易に適応可能な並列試料調製に、マイクロタイタープレート構成を使用することがきわめて望ましい。

したがって、本発明の目的は、試料調製装置からＭＡＬＤＩターゲット上に少量の溶離剤を直接スポッティングする装置および方法を提供することである。

本発明の他の目的は、比較的高濃度の試料の溶離剤をＭＡＬＤＩターゲット上に直接スポッティングする装置および方法を提供することである。

前述および他の目的については、以下の説明から明らかになろう。

従来技術の問題は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析などによるさらなる分析の前に試料を脱塩・濃縮・付着させる、単一ウェルまたはマルチウェル試料調製器械および方法を提供する本発明によって克服される。より具体的には、本発明の一実施形態による器械は、複数のウェルを含んでおり、そのそれぞれが、個別の出口または排出開口部と流体連通し、場合によっては、固相抽出を実施できる装置が形成されるように、多孔質ポリマーマトリックス中に閉じ込められた複数の収着性粒子を好ましくは含む３次元膜構造を含んでいる。この器械は、ＭＡＬＤＩターゲット上に直接スポッティングできるように設計されているので、移動ステップがなくなる。

また本発明は、本発明の器械を用いた試料の調製・付着・分析方法も対象としている。

本発明の試料調製装置に適している基板材料には、特に制限するものではないが、プラスチック（ポリエチレンやポリプロピレンなど）、ガラス、ステンレス鋼などの金属が含まれる。基板材料は、この手順で使用する装置の動作または化学物質に干渉しないものにすべきである。ポリオレフィンと、特にポリプロピレンとが、好ましい材料である。

本明細書で使用する用語「膜」には、所望の用途に適した孔隙率（ｐｏｒｏｓｉｔｙ）を有し、粒子を含む／含まない、透過性／半透性の３次元構造が含まれる。本明細書で使用する用語「複合構造」には充填膜が含まれる。

ここで図１を参照すると、３８４個などの複数のウェルを有する試料調製装置の単一ウェル１２が示されている。ウェル１２は、垂直に延びる流体不透過性の側壁１４と、傾斜した底部分１３とによって画定される。ウェル１２の中央および上方部分は、直径が一様で、ほぼ円筒形断面であることが好ましいが、他の構造も企図され、本発明の範囲内にある。ウェル１２の下方部分は、中心に向かって内側に傾斜している底部分１３に向け、流体の流れの方向である下方向にテーパになって、円錐台形状をしていることが好ましい。底部分１３は、スパウト（ｓｐｏｕｔ）１５を有しており、これがウェル内で中心に配置されていることが好ましい。図１の詳細Ａから最もよくわかるように、スパウト１５は、ボアであり、これが円筒形でウェル１２の中心長手軸と軸方向に心合わせされていることが好ましい。ボアの寸法が、その中に含まれている膜構造の寸法を決定し、１つにはそれが、膜構造を通過する流れによって形成される液滴の特性を決定する。適切なボア径には、約０．２〜約２ｍｍ、より好ましくは約０．４〜約０．８ｍｍが含まれるが、直径０．５ｍｍが好ましい。適切なボア深度には、約０．２〜約２ｍｍが含まれるが、１ｍｍが好ましい。スパウト１５の少なくとも一部分が吸着性膜構造２５を含むことが好ましい。適切な吸着性膜構造は、結合剤によって１つに接着されたクロマトグラフィ用ビーズで構成されたものなどの場所打ち（ｃａｓｔ−ｉｎ−ｐｌａｃｅ）ポリマー結合粒子充填吸着性膜構造であり、米国特許第６，０４８，４５７号および６，２００，４７４号に開示されている。なおこれらの開示を参照によりここに援用する。このような好ましい構造の１つが、多孔質ポリマーマトリックス中に閉じ込められた複数の収着性粒子を含む、アスペクト比（平均厚さに対する平均直径）が約１０未満、好ましくは約５未満の３次元構造である。構造２５は、スパウト１５の底部と同一境界内にすることができ、スパウト１５の本体内に延びて、好ましくはスパウト１５の深さのほぼ全体を通って延びる。

本発明による装置には、電荷、サイズ、親和性、および／または疎水性の異なる検体を分留するために、様々な官能基を有する樹脂材料を含む複数の膜構造を組み込むことができ、あるいは様々な個々の機能性膜を含んでいる複数の装置を組み合わせて使用して同様の結果を達成することもできる。同様に、１つまたは複数の膜を適当なハウジング内でキャスト成型することができ、キャスティングの前または後に機能性を加えることもできる。

膜構造２５を排出口１５の遠位端に配置し、その体積を約３００ナノリットルにすることが好ましい。排出口の内径を約０．５ミリメートルなど、小さくすることが好ましく、これによって膜構造が比較的小さいものになり、その結果必要な溶出体積が小さくなる。構造２５がスパウト１５の開放底端部と同一境界にある好ましい実施形態では、デッドスペースが小さくまたは存在しないので試料の希釈が最小限に抑えられる。

溶出体積を最小限に抑え、試料をターゲット基板上に効率的に付着（すなわち「スポット」）させるには、スパウト１５をターゲットに非常に近接させて保持しなければならない。装置を基板上で支持し、スパウト１５の出口とターゲット表面５０との間の適当な隙間または距離「ｘ」を維持するために、装置には各スパウト１５を部分的または完全に囲む成形スタンドオフカラーまたはスカート３０が形成されている。この隙間が、溶離剤が膜構造２５からターゲット表面５０に移動するときに形成される液体の滴５１の直径よりも小さいことが好ましい。したがって、図２Ｂに示すように滴がスパウト１５から形成されると、滴は、スパウト１５を離れる前にターゲット表面５０に触れる（図２Ｃ）。これが起こると、ターゲット表面上の表面張力による接着性が増大（例えば、表面積の差異やターゲット表面の相対的疎水性に起因）して、滴をスパウトから「引き離す」。スパウト出口とターゲット表面５０との間の最大の寸法オフセットは、１つには、溶出体積ならびに溶出溶液の性質によって決まる。１マイクロリットルの溶出の場合に適当な隙間「ｘ」は、約３．８〜約０．５１ｍｍ（約０．１５〜約０．０２０インチ）（約０．５ｍｍ）で、最大隙間が約０．８９ｍｍ（約０．０３５インチ）である。２マイクロリットルの溶出の場合に適当な隙間は、約０．５１〜約０．７６ｍｍ（約０．０２０〜約０．０３０インチ）で、最大約１．３ｍｍ（約０．０５インチ）である。隙間が最大限度を超えると、溶離剤を最小体積（または合理的な量）で効率的に移動させることができない。隙間が小さすぎる場合、移動は起こるが、滴が完全には移動しないのでスポットが大きく不規則になる傾向にあり、滴が隙間を埋め、構造内に空気が流れると発泡することがある。最小限の隙間とは、スパウトを通過する空気の流れによって溶出液滴が妨げられないように、形成された溶出液滴がターゲット表面５０に接触し、スパウト出口から出て隙間を離れるようなものである。有効に移動した後、ターゲット表面上のスポット５２は、図２Ｄに描かれているように陰圧下で急速乾燥される。

図示した実施形態では、カラー３０が環状で、ウェルの底部とターゲット表面５０とによって閉ざされた体積を都合よく画定しており、その結果真空がスパウト１５まで及んでいる。この目的で、カラー３０内に１つまたは複数の通気孔５４が形成されている。隙間を形成し、確実にスパウトに陰圧を与えられるようにするために、支柱または他の構造を使用できることが当業者には理解されよう。

適当な基板またはターゲットは、従来ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析で使用されたものである。それらは、ほぼ平面状で導電性であり、ＭＡＬＤＩ計器の電離室に適合するように寸法設定されている。ステンレス鋼などの金属が一般的である。

本発明は、その方法態様では、前述した気化の問題をプロセスの解決策として利用し、従来の方法を使用するときにこれまで必要であった移動ステップをなくす。この目的で、ピペット操作などのいずれかの適切な手段によって、試料がマルチウェルプレートの１つまたは複数のウェル内に導かれる。関心のある分子は、各ウェル内に存在する膜構造２５によって捕捉される。場合によっては洗浄ステップが実行される。図２Ａ〜２Ｃおよび図５に示すように、プレートは、真空マニホールド６０（シーリングガスケット６１で密封されている）上で、平面状のＭＡＬＤＩターゲット基板を覆って位置決めされており、ＭＡＬＤＩターゲット基盤が例えばスパウト出口の下方に適切に位置決めされている。関心のある分子を膜構造から溶出させるには、各ウェルに真空（好ましくは約１７ｋＰａ（約５インチＨｇ））を適用して好ましくは約１４〜４１ｋＰａ（約２〜６ｐｓｉ）の圧力差を生じさせ、溶出溶媒（約１〜２マイクロリットル）を各ウェル内に導く。真空度が高すぎると、溶出液の発泡または霧散を引き起こしやすくなり、ターゲット表面上のスポッティングが不十分なものになる。アセトニトリル／マトリックス混合物、好ましくは５０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ混合物など、適切な溶出溶媒を使用することができ、真空が適用される。溶出体積がスパウト１５から出て、スパウトの下方に位置決めされたターゲットに接触し、ターゲット上で急速に気化すると、ＭＡＬＤＩなどによる分析にすぐに使用できる試料の結晶が都合のよい配列（ウェル１２の配列に一致）で残る。移動ステップがないので、損失が最小限に抑えられ、試料処理時間が短縮される。結晶形成は、優れたものであり、ＭＡＬＤＩ信号感度が高められている。

未知のタンパク質を同定する一方法は、それをウシトリプシンで消化して一連の固有のペプチドを生成することである。質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）によって決定されたこれらのペプチドの集合的な質量は、データベースで検索できるフィンガープリントを表す。データベースとの一致性の質は、いくつかの複合採点システムによって評価することができる。ただし、単純な一採点手段は、質量スペクトルによって同定できるタンパク質配列の量である。このパラメータは、当該分野では通常、％配列被覆率または％被覆率と呼ばれている。ほとんどの場合、５０ｐｐｍの質量単位に精確な高性能ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳシステムを用いると、タンパク質をその配列のわずか約１２％程度で同定することができる。

図３は、ウシトリプシンで消化したβ−ガラクトシダーゼ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））試料（５０、１００、２００ｆｍｏｌ）を異なる３つの手段によってＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳターゲットに移動し分析して得られた配列被覆率を示している。「真空式間接」法では、真空マニホールド（１７ｋＰａ（５インチＨｇ））を使用して、試料を体積１５マイクロリットルでプレートから脱離させて（５０％のアセトニトリルを含むＭＡＬＤＩマトリックス、例えばα−シアノ−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸）、９６ウェル「Ｖ」底ポリプロピレンマイクロタイタープレート内に到達させた。１５マイクロリットルは、スパウトから重力によって落下させることのできる十分大きな液滴を形成するのに必要である。（この量よりも少ない体積は、通常、表面張力によってスパウト上で保持される。）回収された体積（通常は１０マイクロリットル以下）から、ピペットによって２マイクロリットルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳターゲットに移動し、乾燥させた。この方法は、２００ｆｍｏｌの試料の場合には許容可能な配列被覆率を提供する。ただし、それより低い濃度のペプチドでは、％被覆率は、事実上存在しない。「間接的」移動の感度は、使用する溶離剤の体積をさらに少なくする（約２マイクロリットル）ことによって向上させることができる。少ない体積を効率的に膜に通過させるには、遠心力（約１５００×ｇ、１５秒間）を使用しなければならず、その後、回収された体積全体をターゲット上にスポッティングする。許容可能な％被覆率は、わずか５０ｆｍｏｌ程度のタンパク質で得ることができる。この方法の性能は良好なものであるが、遠心分離が必要であるので自動化には適しておらず、ハイスループット分析に完全には有用でない。

真空を使用した試料調製装置からＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳターゲットへの直接移動（またはスポッティング）は、１）取扱いステップがなくなり、２）必要な体積が最小限で、３）十分に自動化可能であるという理由から好ましい。図３からわかるように、この方法（真空式直接法）では、「遠心分離式間接」法に匹敵する％被覆率の結果が得られる。

（β−ガラクトシダーゼ・トリプシンペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトル比較）
５０ｆｍｏｌのβ−ガラクトシダーゼ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））の３つの試料をトリプシンで消化し、スパウト内の膜に結合させ、異なる方法によって溶出させた。図４Ａは、真空（１７ｋＰａ（５インチＨｇ））を用いて５０％のアセトニトリルを含むＭＡＬＤＩマトリックス１５マイクロリットルで膜をマイクロタイタープレートウェル内に溶出させてから、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳターゲット上にスポッティング（２マイクロリットル）して得られたスペクトルである。図４Ｂは、遠心分離（１５００×ｇ、１５秒間）を用いて５０％のアセトニトリルを含むＭＡＬＤＩマトリックス２マイクロリットルで膜を溶出させてからスポッティング（２マイクロリットル）して得られた。図４Ｃは、本発明により、真空（１７ｋＰａ（５インチＨｇ））によってＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳターゲット上に直接溶出／スポッティング（２マイクロリットル）したウェルのスペクトルである。遠心分離を使用した場合には被覆率が２０％、間接的真空法の場合には被覆率が事実上ゼロであるのに比べて、図４Ｃでは被覆率２３％が示されている。

複合構造が拡大された詳細Ａで示されている、マルチウェル装置の単一ウェルの斜視図である。 本発明による溶出・移動プロセスの４つのステップを示す図である。 本発明による溶出・移動プロセスの４つのステップを示す図である。 本発明による溶出・移動プロセスの４つのステップを示す図である。 本発明による溶出・移動プロセスの４つのステップを示す図である。 様々な溶出技術の％配列被覆率を比較するグラフである。 従来技術により真空を用いてマイクロタイタープレート内に溶出させたβ−ガラクトシダーゼ試料のスペクトルである。 従来技術により遠心分離を用いて溶出させたβ−ガラクトシダーゼ試料のスペクトルである。 本発明によりＭＡＬＤＩターゲット上に直接溶出させたβ−ガラクトシダーゼ試料のスペクトルである。 本発明により、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦターゲット基板を覆って位置決めされ、真空マニホールドに結合された、ウェルの断面図である。

符号の説明

１２ ウェル
１３ 底部分
１４ 側壁
１５ スパウト、排出口
２５ 膜構造
３０ カラー、スカート
５０ ターゲット表面
５１ 滴
５２ スポット
５４ 通気孔
６０ 真空マニホールド
６１ シーリングガスケット

Claims (14)

1. 少なくとも１つのウェルを提供するステップであって、前記少なくとも１つのウェルが、関心のある分子に結合する膜構造を含み、前記少なくとも１つのウェルが、出口を有するスパウトを備えているステップと、
   試料を前記少なくとも１つのウェル内に導き、前記少なくとも１つのウェル内で前記関心のある分子を前記膜構造に結合させるステップと、
   前記スパウト出口の下方に基板を位置決めするステップと、
   前記関心のある分子を前記膜構造から前記基板上に溶出させるステップと、
   ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって前記基板上で前記試料を分析するステップとを含む、試料の調製、移動および分析方法。
2. 前記溶出を実施するために前記少なくとも１つのウェルを真空に曝露するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
3. 前記膜構造が多孔質マトリックス中に閉じ込められた複数の収着性粒子を含む請求項１に記載の方法。
4. 複数のウェルを提供するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
5. 前記出口と前記基板との間に隙間、すなわち構造のない部分が形成されるように、前記基板が前記少なくとも１つのウェルの下方に所定の距離をあけて位置決めされている請求項１に記載の方法。
6. 前記溶出によって前記スパウト出口上に滴が形成され、前記各滴が直径を有しており、前記所定の距離が前記直径よりも小さい請求項５に記載の方法。
7. 前記所定の距離が約０．３８〜約０．７６ｍｍ（約０．０１５〜約０．０３０インチ）である請求項５に記載の方法。
8. 関心のある分子を含んでいる試料のさらなる分析のための試料調製方法であって、
   複数のウェルを提供するステップであって、各ウェルが、入口と、底表面と、前記底表面内の排出口と、前記排出口内に位置決めされた膜構造とを有するステップと、
   前記試料を前記ウェルの少なくとも１つの中に導くステップと、
   前記関心のある分子を前記膜構造内に捕捉するステップと、
   前記複数のウェルを、試料提示表面を覆って位置決めするステップと、
   前記少なくとも１つのウェルに真空を適用することによって、前記捕捉された関心のある分子を前記膜構造から前記試料提示表面上に溶出させるステップと、
   ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって前記試料提示表面上で前記関心のある分子を分析するステップとを含む方法。
9. 前記複数のウェルが、前記排出口と前記試料提示表面との間の隙間を画定する所定の距離をあけて前記試料提示表面を覆って位置決めされる請求項８に記載の方法。
10. 前記溶出ステップによって前記排出口上に滴が形成され、前記滴が直径を有しており、前記排出口と前記表面との間に前記直径よりも小さい隙間が形成されるように前記排出口が前記試料提示表面を覆って位置決めされていて、前記滴が前記表面に接触し、前記排出口から前記表面に移動する請求項８に記載の方法。
11. 関心のある分子を有する試料を分析のために調製、提示する、試料の調製および提示の組合せであって、
    少なくとも１つのウェルを備える試料調製装置であって、前記少なくとも１つのウェルが、前記関心のある分子に結合する膜構造を含み、前記少なくとも１つのウェルが、出口を有するスパウトを備えている試料調製装置と、
    前記結合された関心のある分子を前記膜構造から溶出させる真空マニホールドと、
    前記溶出された関心のある分子を受け取って提示する、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析のための試料提示基板とを含む組合せ。
12. 前記試料調製装置が複数のウェルを備え、そのそれぞれが前記関心のある分子に結合する膜構造を含んでいる請求項１１に記載の組合せ。
13. 前記複数のウェルが整列して配置されている請求項１２に記載の組合せ。
14. 前記試料提示表面がほぼ平面状である請求項１１に記載の組合せ。