DE69827745T2

DE69827745T2 - Kovalente bindung von dna zu rna strängen katalysiert durch vaccinia topoisomerase

Info

Publication number: DE69827745T2
Application number: DE69827745T
Authority: DE
Inventors: Stewart Shuman; Joann Sekiguchi; Joseph Fernandez; Robert Marcil; James Hoeffler; John Comisky
Original assignee: Sloan Kettering Institute for Cancer Research; Invitrogen Corp
Current assignee: Life Technologies Corp; Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 1997-06-12
Filing date: 1998-06-12
Publication date: 2005-11-10
Anticipated expiration: 2018-06-13
Also published as: US6653106B1; US20040058417A1; US8192932B2; DE69827745D1; WO1998056943A9; AU8256598A; US20100317064A1; JP4447664B2; ATE283353T1; EP0920526A1; CA2263716A1; AU746657B2; JP2001507241A; EP0920526B1; CA2263716C; US20120322109A1; US7662556B2; WO1998056943A1; EP0920526A4

Description

Hintergrund der Erfindung
Vaccinia-Topoisomerase bindet Doppelstrang-DNA und erzeugt an der Sequenz 5'-CCCTT ein kovalentes DNA-(3'-Phosphotyrosyl)-Proteinaddukt. Das Enzym reagiert prompt mit einem 36-mer CCCTT-Strang (DNA-p-RNA), welcher nach 5' von der spaltbaren Bindung aus DNA und 3' davon aus RNA besteht. Ein 36-mer, welches 5' davon vom spaltbaren Phosphat aus RNA und nach 3' aus DNA besteht (RNA-p-DNA), ist jedoch ein schlechtes Substrat für die kovalente Erzeugung eines Adduktes. Vaccinia-Topoisomerase transferiert effizient covalent gebundene, CCCTT enthaltende DNA auf RNA-Akzeptoren mit einem 5'-OH-Terminus; die Topoisomerase kann deshalb dazu verwendet werde, das 5'-Ende von RNA in vitro zu markieren.
Die Religierung des kovalent gebundenen, CCCTT enthaltenden DNA-Stranges an einen DNA-Akzeptor mit einem 5'-OH-Terminus ist effizient und schnell (k_reI > 0.5 sec^–1), vorausgesetzt, dass die Akzeptor-DNA zur Basenpaarung mit dem ungespaltenen DNA-Strang des Topoisomerase-DNA-Donor-Komplexes fähig ist. Die Geschwindigkeit des Strang-Transfers zur DNA wird durch Basenfehlpaarungen am 5'-Nucleotid des Akzeptor-Stranges nicht nachweisbar beeinflusst. Nucleotiddeletionen und -insertionen am 5'-Ende des Akzeptors verlangsamen die Geschwindigkeit der Religierung; die beobachtete Hierarchie der Reaktionsgeschwindigkeiten ist: +1 Insertion > -1 Deletion > +2 Insertion » -2 Deletion. Diese Ergebnisse unterstreichen die Wichtigkeit eines richtig positionierten 5'-OH-Terminus in der Chemie von Transveresterungsreaktionen, werfen aber auch die Möglichkeit auf, dass die Topoisomerase Mutationen durch die Verschmelzung von DNA-Molekülen mit fehlgepaarten oder ungepaarten Enden erzeugt.
Vaccinia-Topoisomerase, ein 314 Aminosäuren langes, eukaryontisches Typ-1-Enzym, bindet und spaltet Doppelstrang-DNA an einer spezifischen Zielsequenz: 5' – (T/C) CCTT' (1 – 3). Die Spaltung ist eine Transveresterungsreaktion, in welcher der Tp'N-Phosphodiester durch das Tyr-274 des Enzyms angegriffen wird, was im Ergebnis ein DNA-(3'-Phosphotyrosyl)-Proteinaddukt erzeugt (4). Die kovalent gebundene Topoisomerase katalysiert eine Vielfalt von DNA-Strang-Transferreaktionen. Sie kann den CCCTT enthaltenden Strang über die selbe Bindung, welche ursprünglich gespalten wurde, religieren (wie dies während der Entspannung von Supercoil-DNA auftritt) oder sie kann den Strang an das 5'-Ende einer heterologen Akzeptor-DNA ligieren, wobei ein rekombinantes Molekül erzeugt wird (5 – 7).
Doppelstrang-DNA-Substrate, welche eine einzelne CCCTT-Zielstelle haben, wurden verwendet, um die Spaltungs- und Strangtransferschritte zu analysieren. Ein Spaltungs-Religierungs-Gleichgewichtszustand wird erreicht, wenn die Topoisomerase Transveresterungen zu DNA-Liganden, welche ≥ 18 Basenpaare Doppelstrang-DNA 3' zu der Spaltstelle enthalten, katalysiert (8 – 11). Die Reaktion ist im Gleichgewichtszustand, weil der distalen Abschnitt des spaltbaren Stranges, welcher einen 5'-OH-Terminus besitzt, aufgrund der Tatsache, dass er durch stabile Basenpaarung mit dem nicht-spaltbaren Strang verbunden ist, nahe am aktiven Zentrum positioniert bleibt. Etwa 20 % des CCCTT enthaltenden Stranges sind im Gleichgewichtszustand kovalent gebunden (11). Eine "Suizid"-Spaltung tritt auf, wenn das CCCTT enthaltende Substrat nicht mehr als 15 Basenpaare 3' zu der spaltbaren Bindung enthält, weil sich der kurze, austretende Strang vom Protein-DNA-Komplex abspaltet. Bei Enzym-Überschuß wird >90 % des Suizid-Substrates gespalten (11).
Das Suizid-Zwischenprodukt kann den gespaltenen CCCTT-Strang auf einen DNA-Akzeptor transferieren. Intramolekularer Strangtransfer tritt auf, wenn das 5'-OH-Ende des nicht-gespaltenen Stranges des Suizid-Zwischenproduktes die 3'-Phosphotyrosyl-Bindung angreift und das Tyr-274 als austretende Gruppe ausstößt.
Dies führt zur Erzeugung einer DNA-Schleife mit Haarnadelstruktur (5). Eine intermolekulare Religierung tritt auf, wenn dem Suizid-Zwischenprodukt ein exogener Akzeptorstrang, der einen 5'-OH-Terminus enthält und dessen Sequenz in der unmittelbaren Nähe des spaltbaren Phosphats komplementär zum Einzelstrangschwanz des nicht gespaltenen Stranges ist, zur Verfügung gestellt wird (5). In der Abwesenheit eines Akzeptorstranges kann die Topoisomerase den CCCTT-Strang auf Wasser, wobei ein Hydrolyseprodukt mit einem 3'-Phosphatterminus freigesetzt wird, oder auf Glycerin, wobei eine 3'-Phosphogylcerin-Derivat freigesetzt wird, transferieren (12). Obwohl Hydrolyse- und Glycerolysereaktionen viel langsamer als Religierungen an einen DNA-Akzeptorstrang sind, kann das Ausmaß der Strangtransfers auf Nucleophile, die nicht aus DNA bestehen, eine Größe von 15 – 40 % erreichen.
Die Spezifität von Vaccinia-Topoisomerase bei der Spaltung von DNA und ihre Vielseitigkeit beim Strangtransfer haben auf Topoisomerase basierende Strategien zur Synthese von Polynucleotiden, bei denen DNA-Oligonucleotide, welche CCCTT-Spaltstellen enthalten, als aktivierte Verbindungsstücke für die Verbindung mit anderen DNA-Molekülen mit kompatiblen Termini dienen, angeregt (13). Die vorliegende Untersuchung prüft die Fähigkeit der Vaccinia-Topoisomerase RNA enthaltende Polynucleotide zu spalten und wieder zu verbinden. Es wurde früher gezeigt, dass das Enzym nicht kovalent an CCCTT enthaltende Moleküle bindet, bei denen entweder der spaltbare Strang oder der komplementäre Strang vollständig aus RNA bestand (9). Um die Spezifität des Enzyms für Pentose-Zucker weiter zu untersuchen, haben wir synthetische, CCCTT enthaltende Substrate hergestellt, bei denen der spaltbare Strang aus DNA und RNA enthaltenden Hälften besteht. In dieser Weise zeigen wir, dass das Enzym indifferent gegenüber RNA stromabwärts vom spaltbaren Phosphat ist, aber es den kovalenten Komplex nicht bildet, wenn die Region 5' zu dem spaltbaren Phosphat in RNA-Form vorliegt. Es wird auch der Beitrag der Basenpaarung durch das 5'-Ende des Akzeptorstranges zur Geschwindigkeit der DNA-Strang-Transferreaktion untersucht.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur kovalenten Bindung eines DNA-Stranges an einen RNA-Strang bereit, welches (a) die Bildung eines Topoisomerase- DNA-Zwischenproduktes durch Inkubation eines DNA-Spaltungssubstrates, welches eine Topoisomerase-Spaltstelle umfasst, mit einer für diese Spaltstelle spezifischen Topoisomerase, wobei das Toposimomerase-DNA-Zwischenprodukt einen oder mehrere 5'-Einzelstrangschwänze hat, umfasst und welches (b) das Hinzufügen eines Akzeptor-RNA-Stranges, welcher komplementär zu dem 5'-Einzelstrangschwanz ist, zu dem Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt unter Bedingungen, welche eine Ligierung des 5'-Einzelstrangschwanzes des Topoisomerase-DNA-Zwischenproduktes an den RNA-Akzeptor-Strang und die Abspaltung der Topoisomerase erlauben, wodurch der DNA-Strang kovalent an den RNA-Strang gebunden wird, umfasst. Das DNA-Spaltungssubstrat kann durch Hybridisierung eines DNA-Stranges, welcher eine Topoisomerase-Spaltstelle besitzt, mit einem oder mehreren komplementären DNA-Strängen hergestellt werden, wodurch ein DNA-Spaltungssubstrat erzeugt wird, welches eine Topoisomerase-Spaltstelle und eine austretende Oligonucleotidgruppe, welche 3' zu der spaltbaren Bindung liegt, besitzt, oder es kann ein Plasmid-Vektor sein, der eine Topoisomerase-Spaltstelle umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein kovalentes Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt, welches einen 5'-Einzelstrangschwanz besitzt, bereit.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein DNA-RNA-Molekül bereit, welches kovalent durch Katalyse der Topoisomerase verbunden wurde.
Die vorliegende Erfindung stellt ein kovalent verbundenes DNA-RNA-Molekül bereit, welches ein markiertes 5'-Ende besitzt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Markierung des 5'-Endes eines RNA-Moleküls bereit, welches (a) die Erzeugung eines Topoisomerase-DNA-Zwischenproduktes durch Inkubation eines DNA-Spaltungssubstrates, welches eine Topoisomerase-Spaltstelle umfasst, mit einer für diese Spaltstelle spezifischen Topoisomerase, worin das Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt einen oder mehrere 5'-Einzelstrangschwänze hat, umfasst und welches (b) das Hinzufügen eines RNA-Moleküls mit einem 5'-Hydroxylterminus, welches zu dem 5'- Einzelstrangschwanz komplementär ist, zu dem Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt unter Bedingungen, welche eine Ligierung des kovalent gebundenen DNA-Stranges des Topoisomerase-DNA-Zwischenproduktes an das RNA-Molekül und die Abspaltung der Topoisomerase erlauben, umfasst, wodurch ein am 5'-Ende markiertes DNA-RNA-Ligierungsprodukt erzeugt wird. Das DNA-Spaltungssubstrat kann zum Beispiel durch Hybridisierung eines DNA-Stranges, welcher eine Topoisomerase-Spaltstelle besitzt, mit einem komplementären DNA-Strang hergestellt werden, wodurch ein DNA-Spaltungssubstrat erzeugt wird, welches eine Topoisomerase-Spaltstelle und eine austretende Oligonucleotidgruppe, welche 3' zu der spaltbaren Bindung liegt, besitzt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein am 5'-Ende markiertes RNA-Molekül bereit.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ebenfalls ein DNA-RNA-Molekül, welches in vitro durch die Verwendung einer Topoisomerase verbunden wurde, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Markierung des 5'-Endes einer Boten-RNA mit Cap-Struktur bereit, welches a) das Isolieren von mRNA aus Zellen oder einem Gewebe umfasst; welches b) das Entfernen einer RNA-Cap-Struktur von der isolierten mRNA, was eine mRNA ohne Cap-Struktur ergibt, umfasst; welches c) das Dephosphorylieren der RNA ohne Cap-Struktur umfasst, wodurch eine dephosphorylierte RNA ohne Cap-Struktur erzeugt wird; welches d) das Entwerfen eines DNA-Spaltungssubstrates für die Topoisomerase umfasst, welches eine Topoisomerase-Spaltstelle und einen komplementären Strang besitzt, wobei der komplementäre Strang eine gemischte oder zufällige Basenzusammensetzung stromabwärts von der Topoisomerase-Spaltstelle besitzt und das DNA-Spaltungssubstrat als ein DNA-(N)-Substrat bezeichnet wird; welches e) die Spaltung des DNA-(N)-Substrates mit einer Topoisomerase umfasst, wodurch ein kovalenter Topoisomerase-DNA-(N)M-Komplex erzeugt wird, welcher einen 5'-Schwanz von gemischter oder zufälliger Basenzusammensetzung auf einem ungespaltenen Strang enthält; und welches f) die Inkubation des kovalenten, gespaltenen Topoisomerase-DNA-(N)M-Komplexes mit der dephosphorylierten RNA ohne Cap-Struktur umfasst, welche in Schritt (c) erzeugt wurde, um ein 5' durch DNA markiertes DNA-RNA-Ligierungsprodukt zu erzeugen.
Wie hier verwendet, kann die Zahl der Basen (N) des DNA-Spaltungssubstrates, vorstehend als DNA-(N)-Substrat bezeichnet, ein bis vier Basen groß sein.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Isolierung und Clonierung einer mRNA mit Cap-Struktur nach Entfernung von RNA ohne Cap-Struktur bereit, welches a) die Isolierung von mRNA aus Zellen oder einem Gewebe umfasst; welches b) die Dephosphorylierung der mRNA umfasst; welches c) die Inkubation eines gespaltenen Topoisomerase-BioDNA-(N)-Komplexes mit der dephosphorylierten mRNA zur Erzeugung eines 5' durch BioDNA markierten DNA-RNA-Ligierungsproduktes umfasst; welches d) die Entfernung des an 5' durch BioDNA markierten DNA-RNA-Ligierungsproduktes und jeglicher nicht umgesetzter, gespaltener Topoisomerase-BioDNA-(N)-Komplexe durch Adsorption an Streptavidin und Gewinnung jeglichen nicht-adsobierten Materials umfasst, wobei das Material mit RNA, welche eine Cap-Struktur am 5'-Ende besitzt und resistent gegen Dephosphorylierung in Schritt (b) ist, wodurch es unfähig ist mit dem gespaltenen Topoisomerase-BioDNA-(N)-Komplex zu reagieren, angereichert ist; welches e) die Entfernung der 5'-Cap-Struktur von der angereicherten RNA, welche aus dem nicht-adsorbierten Material in Schritt (d) gewonnen wurde, umfasst; welches f) die Dephosphorylierung der RNA ohne Cap-Struktur umfasst, wodurch eine dephosphorylierte RNA ohne Cap-Struktur erzeugt wird; welches g) die Inkubation eines gespaltenen Topoisomerase-BioDNA-(N)-Komplexes mit der dephosphorylierten RNA ohne Cap-Struktur umfasst, um ein 5' durch BioDNA markiertes DNA-RNA-Ligierungsprodukt zu erzeugen; welches h) die Affinitätsreinigung des 5' durch DNA markierten DNA-RNA-Ligierungsproduktes umfasst; und welches i) die PCR-Amplifikation der dephosphorylierten RNA ohne Cap-Struktur aus dem DNA-RNA-Ligierungsprodukt unter Verwendung eines Sense-Primers, welcher 5' zu der Spaltstelle mit einem spaltbaren Strang des Topoisomerase-Spaltungssubstrates entspricht, und eines Antisense-Primers, welcher entweder zu einem 3'-Poly(A)-Schwanz oder zu einer internen RNA- Sequenz komplementär ist, umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Gewinnung von Gensequenzen mit voller Länge bereit, welches das Anbringen einer Markierung aus DNA an eine isolierte mRNA-Sequenz und die Verwendung der mit DNA markierten mRNA als Matrize für eine DNA-Synthese umfasst. Die DNA kann weiterhin in einen Expressionsvektor eingefügt und verwendet werden, um ein rekombinantes Protein zu exprimieren.
Kurze Beschreibung der Figuren
1A–B. Topoisomerase-Spaltung von DNA-p-RNA- und RNA-p-DNA-Strängen. (A) Das 36-Bp-Substrat, welches in den Spaltungsreaktionen verwendet wird, ist dargestellt, wobei das ³²P-markierte, spaltbare Phosphat durch den ausgefüllten Kreis angezeigt wird. Die Abschnitte des oberen Stranges, welche das spaltbare Phosphat flankieren und entweder DNA oder RNA sind, sind eingeklammert; der untere Strang ist vollständig DNA. (B) Reaktionsgemische (20 μl), welche 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 pMol Substrat (entweder DNA-p-RNA oder RNA-p-DNA) und Topoisomerase, wie angegeben enthalten, wurden bei 37 °C für 10 min inkubiert. Die Erzeugung kovalenter Addukte (Prozentanteil des eingesetzten Markers, der auf die Topoisomerase transferiert wurde) wird als Funktion der Menge des zugesetzten Enzyms dargestellt.
2A–B. Kinetik der Spaltung von RNA enthaltenden 36-mer Substraten. Die Reaktionsgemische enthielten (pro 20 μl) 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 pMol radioaktiv markierten 36-mer-Substrat und 1 pMol Topoisomerase. Die Erzeugung kovalenter Addukte (Prozentanteil des eingesetzten Markers, der auf die Topoisomerase transferiert wurde) wird als Funktion der Dauer der Inkubation bei 37 °C dargestellt. (A) Spaltung von DNA-p-DNA und DNA-p-RNA; X-Achse in Sek. (B) Spaltung von RNA-p-DNA; X-Achse in min.
3A–B. Strangtransfer auf einen RNA-Akzeptor. (A) Es werden die Strukturen des kovalenten Topoisomerase-DNA-Komplexes (Suizid-Zwischenprodukt) und der 18-mer Akzeptorstränge (DNA oder RNA) gezeigt. (B) Religierungsreaktionen wurden unter Single-Turnover-Bedingungen, wie in Material und Methoden beschrieben, durchgeführt. Das Ausmaß der Religierung (ausgedrückt als Prozentanteil der eingesetzten, markierten DNA, die zum 30-mer Strangtransferprodukt umgesetzt wurde) wird als Funktion der Inkubationsdauer dargestellt.
4. Untersuchung der Strangtransfer-Reaktionsprodukte. Reaktionsgemische (20 μl), welche 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 pMol von 5' markiertem Suizid-DNA-Spaltungssubstrat und 2,5 pMol Topoisomerase enthielten, wurden bei 37 °C für 10 min inkubiert. Der Strangtransfer wurde dann durch Zugabe eines 50-fachen Überschusses der Akzeptor-DNA (18-mer D; Spuren 1 und 2) oder der Akzeptor-RNA (18-mer R; Spuren 5 und 6) gestartet, wobei gleichzeitig die Gemische auf 0,3 M NaCl eingestellt wurden. Die Religierungsreaktionen wurden nach einer Inkubationsdauer von 10 min durch Zugabe von SDS auf 0,2% gestoppt. Die Proben wurden mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Die Pellets wurden entweder in 12 μl 0,1 M NaOH, 1 mM EDTA (NaOH +) oder 12 μl 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (NaOH -) resuspendiert. Diese Proben wurden bei 37 °C für 16 h inkubiert. Das eingesetzte 18-mer DNA-Substrat enthaltende Kontrollproben, welche nicht der Topoisomerase ausgesetzt wurden, wurden parallel behandelt (Spuren 3 und 4). Die mit Alkali behandelten Proben wurden durch Zugabe von 1,2 μl 1 M HCl neutralisiert. Alle Proben wurden dann mit Ethanol präzipitiert, in Formamid resuspendiert, für 5 min auf 95 °C erhitzt und dann einer Elektrophorese in TBE durch ein 17%iges Polyacrylamidgel, welches 7 M Harnstoff enthielt, unterzogen. Eine Autoradiographie dieses Gels wird gezeigt. Die Positionen des 30-mer Religierungsproduktes und des eingesetzten 18-mer Stranges sind linksseitig angezeigt. Alkalische Hydrolyse des RNA-Strang-Transferreaktionsproduktes (Spur 6) ergab eine diskrete Spezies, die durch das Sternchen angezeigt wird.
5A–B Markierung von durch die T3-RNA-Polymerase transkibierter RNA an 5' durch DNA. (A) Die Strukturen des kovalenten Topoisomerase-DNA-Donorkomplexes und des RNA-Akzeptors werden gezeigt. Der 5'-Einzelstrangschwanz des Suizid-Zwischenproduktes ist komplementär zu den 18 Nucleotiden am 5'-Ende des T3-Transcriptes. Die Reaktionsgemische enthielten (pro 15 μl) 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,3 M NaCl und 0,1 pMol von mit ³²P-GMP markiertem T3-Tanskript. (B) Die Religierung wurde durch die Zugabe von zuvor erzeugtem Topoisomerase-DNA-Donor (im 10-fachen molaren Überschuß zum RNA-Akzeptor) gestartet. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C. Proben (15 μl) wurden zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen und sofort durch die Zugabe von SDS und EDTA gestoppt. Die Proben wurden auf 50 % Formamid eingestellt, für 5 min auf 95 °C erhitzt und einer Elektrophorese in TBE durch ein 12%iges Polyacrylamidgel, welches 7 M Harnstoff enthielt, unterzogen. Der Transfer des 12 Nucleotide langen DNA-Donorstranges auf das 5'-Ende des markierten 36-mer T3-Transcriptes ergab ein markiertes 48-mer Produkt. Umwandlung des eingesetzten 36-mer zum 48-mer wurde durch die Abtastung des Gels mit einem Phosphorabbildungsgerät.
6A–C. Kinetik der durch die Topoisomerase katalysierten Strangtransferreaktionen, welche DNA-Deletionen und -Insertionen ergeben. (A) Die Struktur des zuvor erzeugten Donor-Komplexes wird im oberen Teil der Figur gezeigt. Religierungsreaktionen wurden unter Single-Turnover-Bedingungen, wie in Material und Methoden beschrieben, durchgeführt. Alle DNA-Akzeptoren wurden in einem 50-fachen molaren Überschuss zu dem eingesetzten, CCCTT enthaltenden Substrat eingeschlossen. (B) Erzeugung von Deletionen. Die Strukturen des vollständig über Basenpaarung verbundenen 18-mer Akzeptor-DNA-Oligonucleotids (offene Kreise), eines 17-mer Oligonucleotids, welches, eine 1 Nucleotid weite Lücke offenlassend, durch Anelierung an den Donor-Komplex bindet (ausgefülltes Quadrat) und eines 16-mer Stranges der, eine 2 Nucleotide weite Lücke offenlassend, durch Anelierung bindet (Quadrat), werden gezeigt. (C) Erzeugung von Insertionen. Die Strukturen des vollständig über Basenpaarung verbundenen 18-mer Akzeptors (offene Kreise), eines 19-mer Oligonucleotids, welches 1 zusätzliches 5'-Nucleotid enthält (ausgefülltes Dreieck), und eines 20-mer Akzeptors, der 2 zusätzliche 5'-Nucleotide enthält (Dreieck), werden gezeigt. Das Ausmaß der Religierung wird als Funktion der Inkubationsdauer aufgezeichnet.
7. Untersuchung von DNA-Strangtransferprodukten mit Deletionen und Insertionen. Die Religierung mit Akzeptoren mit zurückgesetzten oder hervorstehenden 5'-Enden wurde, wie in der Beschreibung zu 6 beschrieben, durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden mittels einer Elektrophorese in TBE durch ein 17%iges Polyacrylamidgel, welches 7 M Harnstoff enthielt, untersucht. Eine Autoradiographie des Gels wird gezeigt. Die Akzeptor-Stränge waren wie folgt: kein Akzeptor (Spur 2); vollkommen gepaartes 18-mer (Spuren 3 und 8); 17-mer mit einer 1 Nucleotid weiten Lücke (Spur 4); 16-mer mit einer 2 Nucleotide weiten Lücke (Spur 5); 19-mer mit einer 1 Nucleotid großen Insertion (Spur 6); 20-mer mit einer 2 Nucleotide großen Insertion (Spur 7). Kontrollproben, welche den 5' markierten, spaltbaren 18-mer-Strang, aber nicht die Topoisomerase enthielten, wurden in den Spuren 1 und 9 untersucht.
8. Strangtransfer auf DNA-Akzeptoren, welche eine einzelne Basenfehlpaarung 5' enthalten. Religierungsreaktionen wurden unter Single-Turnover-Bedingungen, wie in Material und Methoden beschrieben, durchgeführt. Alle DNA-Akzeptoren wurden in einem 50-fachen molaren Überschuss zu dem eingesetzten CCCTT enthaltenden Substrat eingeschlossen. Die Strukturen des vollständig komplementären 18-mers und die drei Varianten des terminalen Nucleotids werden gezeigt.
9A–B. Kinetik der Erzeugung der intramolekularen Haarnadelstruktur. (A) Erzeugung einer Haarnadelstruktur ohne die Möglichkeit für eine Basenpaarung. DNA-Spaltungssubstrate wurden durch Anelierung des 5' durch ³²P markierten, 18-mer spaltbaren Stranges mit einem komplementären 30-mer Strang (ausgefüllter Kreis) oder mit einem komplementären 18-mer Strang (Kreis) hergestellt; die Strukturen der Substrate werden mit den durch Pfeile angezeigten Topoisomerase-Spaltstellen dargestellt. Reaktionsgemische, welche (pro 20 μl) 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,5 pMol DNA-Substrat und 1 pMol Topoisomerase enthielten, wurden bei 37 °C für 10 min inkubiert. Die Gemische wurden dann auf 0,3 M NaCl eingestellt. Proben (20 μl) wurden unmittelbar vor Zugabe des Salzes (Zeitpunkt null) und nach verschiedenen Zeitabschnitten nach Zugabe des Salzes entnommen; die Reaktionen wurden sofort durch Zugabe eines gleichen Volumens von Stopp-Lösung (1 % SDS, 95 % Formamid, 20 mM EDTA) gestoppt. Die Proben wurden durch Hitze denaturiert und einer Elektrophorese in TBE durch ein 17%iges Polyacrylamidgel, welches 7 M Harnstoff enthielt, unterzogen. Das Ausmaß des intramolekularen Strangtransfers (ausgedrückt als Prozentanteil des eingesetzten, markierten Substrates, welches zu einem Haarnadelstruktur-Produkt umgesetzt wurde) ist als Funktion der Zeit nach Zugabe von NaCl aufgezeichnet. (B) Erzeugung einer Haarnadelstruktur mit möglicher Basenpaarung. Die Struktur des 18-mer-/30-mer-Spaltungssubstrates wird gezeigt, wobei die Topoisomerase-Spaltstelle mit einem Pfeil angezeigt wird. Ein Reaktionsgemisch, welches (pro 20 μl) 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,5 pMol DNA-Substrat und 1 pMol Topoisomerase enthielt, wurde bei 37 °C für 2 min inkubiert. Die Gemische wurden dann auf 0,3 M NaCl eingestellt. Proben (20 μl) wurden unmittelbar vor Zugabe des Salzes (Zeitpunkt null) und nach verschiedenen Zeitabschnitten nach Zugabe des Salzes entnommen. Das Ausmaß des intramolekularen Strangtransfers ist als Funktion der Zeit nach Zugabe des NaCl aufgezeichnet.
10A–B. Affinitätsmarkierung von RNA unter Verwendung von Vaccinia-Topoisomerase. (A) Der Reaktionsweg des Strangtransfers ist in der Figur dargestellt. Das biotinylierte DNA-Substrat, welches eine einzelne Topoisomerase-Erkennungsstelle enthält, wird auf dem festen Dynabeads (Dynal) Streptavidinträger immobilisiert. Die Biotingruppe (angezeigt durch das schwarze Quadrat) wird am 5'-Ende des CCCTT enthaltenden Stranges mittels Standardverfahren für die automatisierte Oligonucleotidsynthese eingeführt. Die aufgereinigte Vaccinia-Topoisomerase wird, wie dargestellt, mit der an die Kügelchen gebundenen DNA unter Erzeugung eines kovalenten Enzym-Donor-DNA-Komplexes umgesetzt. Enzym, welches nicht an DNA gebunden ist, wird durch Waschen der Kügelchen mit Puffer entfernt. Die Strangtransferreaktion wird durch die Zugabe des [³²P]-CMP-markierten T7-Transcriptes, welches durch vorangehende Behandlung mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert wurde, gestartet. Der 5'-Einzelstrangschwanz des Donor-Komplexes ist komplementär zu den 12 Nucleotiden am 5'-Ende des T7-Transcriptes. Die Religierung des kovalent gebundenen, biotinylierten DNA-Stranges mit dem T7-Transcript wird als Umsetzung der 30-mer-RNA zu einem Produkt von 50 Nucleotiden Länge beobachtet. Das Gemisch wurde bei 37 °C für 15 min inkubiert. Die Kügelchen wurden dann durch Zentrifugation gewonnen, gewaschen und in 20 μl Puffer, welcher 0,8 % SDS und 80 % Formamid enthielt, resuspendiert. Die Proben wurden auf 95 °C für 5 min erhitzt, für 5 min zentrifugiert, dann wurden die Überstände einer Elektrophorese in TBE durch ein 12%iges Polyacrylamidgel, welches 7 M Harnstoff enthielt, unterzogen. (B) Eine Autoradiographie des Gels wird in der Figur gezeigt. Spur B (gebunden) – an die Dynabeads gebundenes Produkt der Strangtransferreaktion; Spur F (frei) -Überstand aus der Strangtransferreaktion. Die Positionen des eingesetzten 30-mer T7-Transcriptes und des 50-mer-Produktes werden auf der rechten Seite gezeigt.
11. Eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Verwendung von mit DNA markierter mRNA zur Gewinnung von Gensequenzen mit voller Länge. Kurzgefasst wird die mRNA voller Länge mit Cap-Struktur durch die Bindung an einen festen Träger, wie zum Beispiel durch die Verwendung biotinylierter mRNA mit Cap-Struktur, welche an ein magnetisches, mit Streptavidin konjugiertes Kügelchen gebunden ist, isoliert. Die Cap-Struktur der isolierten mRNA wird (durch Verwendung von saurer Tabak-Pyrophosphatase) entfernt und die mRNA (durch Verwendung von alkalischer Phosphatase) dephosphoryliert und dann mit einem DNA-Marker durch Anwendung der unten skizzierten Verfahren modifiziert. Die mit DNA markierte mRNA wird verwendet, um Erststrang-cDNA durch Verwendung von reverser Transcriptase zu erzeugen und durch Verwendung der PCR amplifiziert. Die amplifizierte cDNA wird dann in einen Plasmidvektor eingefügt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
In dieser Anmeldung werden durchwegs die folgenden Standardabkürzungen verwendet, um bestimmte Nucleotide darzustellen:

C: = Cytosin
A: = Adenosin
U: = Uracil
T: = Thymidin
G: = Guanosin

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur kovalenten Bindung eines DNA-Stranges an einen RNA-Strang bereit, welches (a) die Erzeugung eines Topoisomerase-DNA-Zwischenproduktes durch Inkubation eines DNA-Spaltungssubstrates, welches eine Topoisomerase-Spaltstelle umfasst, mit einer für diese Stelle spezifischen Topoisomerase, wobei das Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt einen oder mehrere 5'-Einzelstrangschwänze besitzt, umfasst; und welches (b) das Hinzufügen eines Akzeptor-RNA-Stranges, welcher komplementär zu dem 5'-Einzelstrangschwanz ist, zu dem Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt unter Bedingungen, welche eine Ligierung des kovalent gebundenen DNA-Stranges des Topoisomerase-DNA-Zwischenproduktes an den RNA-Akzeptor-Strang und die Abspaltung der Topoisomerase erlauben, wodurch der DNA-Strang kovalent an den RNA-Strang gebunden wird, umfasst. Das DNA-Spaltungssubstrat kann durch Hybridisierung eines DNA-Stranges, welcher eine Topoisomerase-Spaltstelle besitzt, mit einem oder mehreren komplementären DNA-Strängen hergestellt werden, wodurch ein DNA-Spaltungssubstrat gebildet wird, welches eine Topoisomerase-Spaltstelle und eine austretende Oligonucleotidgruppe, welche 3' zu der spaltbaren Bindung liegt, besitzt, oder es kann ein Plasmid-Vektor sein, der eine Topoisomerase-Spaltstelle umfasst.
In einer Ausführungsform des vorangehend beschriebenen Verfahrens ist die Topoisomerase-Spaltstelle eine Sequenz, welche CCCTT umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Topoisomerase ein Vaccinia-Topoisomerase-Enzym. In einer weiteren Ausführungsform ist das Vaccinia-Topoisomerase-Enzym ein modifiziertes Vaccinia-Topoisomerase-Enzym. In einer anderen Ausführungsform ist der DNA-Strang, welcher eine Topoisomerase-Spaltstelle besitzt, radioaktiv markiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die radioaktive Markierung ³²P oder ein Radiohalogen. Mittel zur radioaktiven Markierung von Nucleotiden sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt (siehe Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3. Ausgabe, Wiley (1995); US-Patent 5,746,997, veröffentlicht am 05.05.98). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der DNA-Strang, welcher eine Topoisomerase-Spaltstelle besitzt, mit einer Biotin-Einheit oder einer anderen Affinitätsreinigungsmarkierung wie zum Beispiel einer Chitin-Bindungsdomäne, einer Glutathion-S-Transferaseeinheit oder ähnlichem markiert. Verfahren zum Anfügen von Affinitätsmarkierungen an Nucleotide sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt (siehe Carniaci et al., Genomics 37 (1996), 327-336; Ausubel et al., vorstehend). In einer Ausführungsform werden das an Topoisomerase gebundene DNA-Zwischenprodukt und der Akzeptor-RNA-Strang in vitro ligiert.
Die vorliegende Erfindung stellt ein kovalentes Topoisomerase-DNA- Zwischenprodukt-Molekül bereit, welches einen 5'-Einzelstrangschwanz besitzt. In einer Ausführungsform des kovalenten Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt-Moleküls umfasst der 5'-Einzelstrangschwanz eine spezifische Sequenz. In einer anderen Ausführungsform wird das kovalente Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt-Molekül, welches einen 5'-Einzelstrangschwanz besitzt, durch das oben beschriebene Verfahren zur kovalenten Bindung eines DNA-Stranges an einen RNA-Strang erzeugt. In einer weiteren Ausführungsform des kovalenten Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt-Moleküls, welches einen 5'-Einzelstrangschwanz besitzt, welcher durch das oben beschriebene Verfahren erzeugt worden ist, umfasst der 5'-Einzelstrangschwanz eine spezifische Sequenz. In einer weiteren Ausführungsform des kovalenten Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt-Moleküls welches einen 5'-Einzelstrangschwanz besitzt und welches durch Schritt (a) des oben beschriebenen Verfahrens erzeugt worden ist, ist der DNA-Strang radioaktiv markiert. In einer bevorzugten Ausführungsform des kovalenten Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt-Moleküls ist die radioaktive Markierung ³²P oder ein Radiohalogen. In einer anderen Ausführungsform des kovalenten Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt-Moleküls, welches einen 5'-Einzelstrangschwanz besitzt und welches durch Schritt (a) des oben beschriebenen Verfahrens erzeugt worden ist, ist der DNA-Strang affinitätsmarkiert. In einer bevorzugten Ausführungsform des kovalenten Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt-Moleküls, ist die Affinitätsmarkierung eine Biotin-Einheit, eine Chitin-Bindungsdomäne, eine Glutathion-S-Transferaseeinheit oder Ähnliches.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein DNA-RNA-Molekül bereit, welches kovalent durch Katalyse der Topoisomerase verbunden ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ein DNA-RNA-Molekül bereit, welches kovalent durch das oben beschriebene Verfahren zur kovalenten Bindung eines DNA-Stranges an einen RNA-Strang verbunden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform hat das kovalent verbundene DNA-RNA-Molekül eine Markierung am 5'-Ende. In einer weiteren Ausführungsform ist die Markierung am 5'-Ende ³²P oder ein Radiohalogen. In einer anderen Ausführungsform ist die Markierung am 5'-Ende eine Biotin-Einheit, eine Chitin-Bindungsdomäne, eine Glutathion-S-Transferaseeinheit oder Ähnliches.
Die vorliegende Erfindung stellt ein kovalent verbundenes DNA-RNA-Molekül bereit, welches ein markiertes 5'-Ende besitzt. In einer bevorzugten Ausführungsform des kovalent verbundenen DNA-RNA-Moleküls ist die Markierung am 5'-Ende ³²P oder ein Radiohalogen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des kovalent verbundenen DNA-RNA-Moleküls ist die Markierung am 5'-Ende eine Biotin-Einheit, eine Chitin-Bindungsdomäne, eine Glutathion-S-Transferaseeinheit oder Ähnliches.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Markierung des 5'-Endes eines RNA-Moleküls bereit, welches (a) die Erzeugung eines Topoisomerase-DNA-Zwischenproduktes durch Inkubation eines DNA-Spaltungssubstrates, welches eine Topoisomerase-Spaltstelle umfasst, mit einer Topoisomerase, die für diese Spaltstelle spezifisch ist, umfasst, wobei das Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt einen oder mehrere 5'-Einzelstrangschwänze hat; und welches (b) das Hinzufügen eines RNA-Moleküls mit 5'-Hydroxylterminus, welches komplementär zu dem 5'-Einzelstrangschwanz ist, zum Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt unter Bedingungen, die eine Ligierung des 5'-Einzelstrangschwanzes des Topoisomerase-DNA-Zwischenproduktes an das RNA-Molekül und die Abspaltung der Topoisomerase erlauben, umfasst, wodurch ein DNA-RNA-Ligierungsprodukt mit markiertem 5'-Ende erzeugt wird. Das DNA-Spaltungssubstrat kann zum Beispiel durch Hybridisierung eines DNA-Stranges, welcher eine Topoisomerase-Spaltstelle besitzt, an einen komplementären DNA-Strang erzeugt werden, wodurch ein DNA-Spaltungssubstrat erzeugt wird, welches eine Topoisomerase-Spaltstelle und eine austretende Oligonucleotidgruppe, welche 3' zu einer spaltbaren Bindung liegt, besitzt.
Das RNA-Molekül kann das Produkt einer in vitro-Synthese sein oder kann aus Zellen oder Geweben isoliert worden sein. Verfahren zur Synthese von RNA in vitro sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt (siehe zum Beispiel, Ausubel et al., vorstehend). Verfahren zur Isolierung von RNA aus Zellen und/oder Geweben sind ebenfalls auf dem Fachgebiet wohl bekannt (siehe Ausubel et al., vorstehend). Zellen und Gewebe, geeignet zur Verwendung bei der Gewinnung von RNA, welche bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung von Nutzen ist, schließen sowohl tierische als auch pflanzliche Zellen ein. Besonders bevorzugte Zellen schließen Säugerzellen (wie zum Beispiel Nagerzellen, Primatenzellen und Ähnliches) und Insketenzellen ein. RNA kann auch aus prokaryontischen Zellen wie zum Beispiel Bakterien isoliert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens wird das RNA-Molekül nach Synthese oder Isolierung dephosphoryliert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Dephosphorylierung durch Behandlung des RNA-Moleküls mit alkalischer Phosphatase erreicht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Topoisomerase ein Vaccinia-Topoisomerase-Enzym. In einer weiteren Ausführungsform ist das Vaccinia-Topoisomerase-Enzym ein modifiziertes Vaccinia-Topoisomerase-Enzym. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Spaltstelle CCCTT. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin vor dem Schritt (a) das Einführen einer Biotin-Einheit oder einer anderen Affinitätsreinigungs-Einheit in das DNA-Spaltungssubstrat. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin vor dem Schritt (a) die Immobilisierung des DNA-Spaltungssubstrates mit Affnitätsreinigungsmarkierung auf einem festen Träger. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der feste Träger ein Sepharose-Harz oder es sind magnetische Kügelchen, welche eine Affinitätsreinigungssubstanz, wie zum Beispiel Avidin, Streptavidin, Chitin, Glutathion und Ähnliches an sich gebunden haben. Verfahren zur Herstellung solcher Substanzen sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin die Reinigung eines biotinylierten DNA-RNA-Ligierungsproduktes mit markiertem 5'-Ende durch Trennung des festen Trägers, an den das biotinylierte DNA-RNA-Ligierungsprodukt mit markiertem 5'-Ende immobilisiert ist, von einer Flüssigphase welche unmodifizierte RNA umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das 5'-Ende des DNA-Spaltungssubstrates affinitätsmarkiert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Affinitätsmarkierung eine Biotin-Einheit. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin die Immobilisierung des biotinylierten DNA-Spaltungssubstrates mit affinitätsmarkiertem 5'-Ende auf einem festen Träger. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der feste Träger mit Streptavidin modifiziert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin die Reinigung des biotinylierten DNA-RNA-Ligierungsproduktes mit affinitätsmarkiertem 5'-Ende durch Trennung des mit Streptavidin modifizierten festen Trägers, an welchen das DNA-RNA-Ligierungsprodukt mit affinitätsmarkiertem 5'-Ende immobilisiert ist, von einer Flüssigphase, die unmodifizierte RNA umfasst.
Wie hier verwendet, wird unmodifizierte RNA als RNA-Strang oder -Stränge definiert, welche nicht kovalent an einen DNA-Strang gebunden wurden.
Die vorliegende Erfindung stellt ein RNA-Molekül mit markiertem 5'-Ende bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform des RNA-Moleküls mit markiertem 5'-Ende ist die Markierung eine DNA-Sequenz. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des RNA-Moleküls mit markiertem 5'-Ende umfasst es weiterhin eine Markierung des 5'-Endes. In einer Ausführungsform ist die Markierung des 5'-Endes ³²P oder ein Radiohalogen. In einer anderen Ausführungsform ist die Markierung des 5'-Endes eine Biotin-Einheit oder eine andere Affinitätsreinigungseinheit.
In einer Ausführungsform wird das RNA-Molekül mit markiertem 5'-Ende durch das oben beschriebene Verfahren zur Markierung des 5'-Endes eines RNA-Moleküls erzeugt. In einer Ausführungsform umfasst das RNA-Molekül mit markiertem 5'-Ende weiterhin eine Markierung des 5'-Endes. In einer weiteren Ausführungsform ist die Markierung des 5'-Endes ³²P. In einer anderen Ausführungsform ist die Markierung des 5'-Endes eine Biotin-Einheit.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung weiterhin ein DNA-RNA-Molekül bereit, welches in vitro durch Verwendung einer Topoisomerase verbunden wurde.
Wie hier verwendet, kann die Zahl von Nucleotiden (N) des DNA-Spaltungssubstrates, welches voranstehend als DNA-(N)-Substrat bezeichnet wurde, zwischen 1 bis 4 Nucleotiden groß sein.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Markierung des 5'-Endes einer Messenger-RNA mit Cap-Struktur bereit, welches a) die Isolierung von mRNA aus Zellen oder einem Gewebe umfasst; welches b) das Entfernen einer RNA-Cap-Struktur von der isolierten mRNA umfasst, was eine RNA ohne Cap-Struktur ergibt; welches c) die Dephosphorylierung der RNA ohne Cap-Struktur umfasst, wobei eine dephosphorylierte RNA ohne Cap-Struktur erzeugt wird; welches d) das Entwerfen eines DNA-Spaltungssubstrates für die Topoisomerase umfasst, welches eine Topoisomerase-Spaltstelle und einen komplementären Strang besitzt, wobei der komplementäre Strang eine gemischte oder zufällige Basenzusammensetzung stromabwärts von der Topoisomerase-Spaltstelle hat und das DNA-Spaltungssubstrat als ein DNA-(N)-Substrat bezeichnet wird; welches e) die Spaltung des DNA-(N)-Substrates mit einer Topoisomerase umfasst, wodurch ein kovalenter Topoisomerase-DNA-(N)-Komplex erzeugt wird, der einen 5'-Schwanz mit einer gemischten oder zufälligen Basenzusammensetzung auf einem nichtgespaltenen Strang besitzt; welches f) die Inkubation des gespaltenen, kovalenten Topoisomerase-DNA-(N)-Komplexes mit der dephosphorylierten RNA ohne Cap-Struktur, die in Schritt (c) erzeugt wurde, zur Erzeugung eines 5'-DNA markierten DNA-RNA-Ligierungsproduktes umfasst.
In einer Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens erfolgt die Entfernung der RNA-Cap-Struktur entweder als enzymatische Behandlung der mRNA mit einer Pyrophosphatase oder als chemische Entfernung der Cap-Struktur durch Periodatoxidation und Beta-Eliminierung. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Pyrophosphatase eine saure Tabak-Pyrophosphatase. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Topoisomerase-Spaltstelle CCCTT. In noch einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform hat das DNA-(N)-Spaltungssubstrat eine Biotin-Einheit stromaufwärts von der Spaltstelle und wird als BioDNA-(N) bezeichnet. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin die Affinitätsreinigung des biotinylierten, 5'-DNA markierten DNA-RNA-Ligierungsproduktes durch die Bindung der Biotin-Einheit an das Streptavidin vor dem Schritt (e).
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein an 5' markiertes DNA-RNA-Ligierungsprodukt bereit, welches durch das Verfahren zur Markierung des 5'-Endes einer Messenger-RNA mit Cap-Struktur erzeugt wurde. In einer Ausführungsform umfasst das an 5' markierte DNA-RNA-Ligierungsprodukt weiterhin eine Markierung des 5'-Endes. In einer weiteren Ausführungsform des am 5'-Ende markierten DNA-RNA-Ligierungsproduktes ist die Markierung ³²P. In einer weiteren Ausführungsform des am 5'-Ende markierten DNA-RNA-Ligierungsproduktes ist die Markierung eine Bitotin-Einheit.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Isolierung und Clonierung einer mRNA mit Cap-Struktur nach Entfernung von RNA ohne Cap-Struktur bereit, welches a) die Isolierung von mRNA aus Zellen oder einem Gewebe umfasst; welches b) die Dephosphorylierung der mRNA umfasst; welches c) die Inkubation eines gespaltenen Topoisomerase-BioDNA-(N)-Komplexes mit der dephosphorylierten mRNA zur Erzeugung eines 5'-BioDNA markierten DNA-RNA-Ligierungsproduktes umfasst; welches d) die Entfernung des 5'-BioDNA markierten DNA-RNA-Ligierungsproduktes und jeglicher nicht umgesetzter, gespaltener Topoisomerase-BioDNA-(N)-Komplexe durch Adsorption an Streptavidin und Gewinnung jeglichen nicht adsorbierten Materials umfasst, wobei das Material mit RNA, welche ein 5'-Ende mit Cap-Struktur besitzt und resistent gegen die Dephosphorylierung in Schritt (b) ist und damit unfähig ist, mit dem gespaltenen Topoisomerase-BioDNA-(N)-Komplex zu reagieren, angereichert ist; welches e) die Entfernung der Cap-Struktur am 5'-Ende der angereicherten RNA, welche aus dem nicht adsorbierten Material in Schritt (d) gewonnen wurde, umfasst; welches f) die Dephosphorylierung der RNA ohne Cap-Struktur umfasst, wodurch eine dephosphorylierte RNA ohne Cap-Struktur erzeugt wird; welches g) die Inkubation eines gespaltenen Topoisomerase-BioDNA-(N)-Komplexes mit der dephosphorylierten RNA ohne Cap-Struktur, um ein 5'-BioDNA markiertes DNA-RNA-Ligierungsprodukt zu erzeugen, umfasst; welches h) die Affinitätsreinigung des 5'-DNA markierten DNA-RNA-Ligierungsproduktes umfasst; und welches i) die Amplifikation der dephosphorylierten RNA ohne Cap-Struktur des DNA-RNA-Ligierungsproduktes mittels PCR durch Verwendung eines Sense-Primers, welcher einem spaltbaren Strang des Topoisomerase-Spaltungssubstrates 5' zu der Spaltstelle entspricht, und eines Antisense-Primers, welcher entweder zu einem 3'-Poly(A)-Schwanz oder zu einer internen RNA-Sequenz komplementär ist, umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform des oben beschriebenen Verfahrens erfolgt die Affinitätsreinigung in Schritt (h) durch die Bindung des 5'-BioDNA markierten DNA-RNA-Ligierungsproduktes an Streptavidin. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Entfernung der RNA-Cap-Struktur entweder als enzymatische Behandlung der mRNA mit einer Pyrophosphtatase oder als chemische Entfernung der Cap-Struktur durch Periodatoxidation und Beta-Eliminierung. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Pyrophosphatase Tobacco-Acid-Pyrophosphatase.
In einer Ausführungsform des Verfahrens zur kovalenten Bindung eines DNA-Stranges an einen RNA-Strang hat der 5'-Einzelstrangschwanz eine spezifisch entworfene Sequenz.
Ein weiterer Aspekt der vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur gezielten Ligierung eines interessierenden RNA-Stranges in einem Gemisch von RNA-Strängen bereit, welches das oben beschriebene Verfahren zur kovalenten Bindung eines DNA-Stranges an einen RNA-Strang umfasst. In einer Ausführungsform des Verfahrens zur gezielten Ligierung eines interessierenden RNA-Stranges in einem Gemisch von RNA-Strängen, welches das Verfahren zur kovalenten Bindung eines DNA-Stranges an einen RNA-Strang umfasst, liefert der 5'-Einzelstrangschwanz die Spezifität des kovalent gebundenen DNA-RNA-Ligierungsproduktes.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Gewinnung einer Gensequenz voller Länge bereit gestellt, welches (a) die Isolierung von mRNA voller Länge, (b) das Anfügen einer DNA-Markierungssequenz an die isolierte mRNA und (c) die Synthetisierung von cDNA durch Verwendung der markierten mRNA als Matrize umfasst.
Um sicher zu stellen, dass nur mRNA voller Länge in diesem Aspekt der Erfindung verwendet wird (wodurch die Erzeugung einer Gensequenz voller Länge sicher gestellt wird), ist es im Allgemeinen bevorzugt, dass nur mRNA mit Cap-Struktur isoliert wird. Eukaryontische primäre Transcripte werden am Anfangsnucleotid, oder 5'-Nucleotid, des primären Transcriptes durch die Anfügung einer 5' methylierten Cap-Struktur modifiziert (Shatkin, Cell 9 (1976), 645), was dazu dienen kann, die mRNA vor enzymatischem Abbau zu schützen. Nur Transcripte voller Länge werden so modifiziert. Die Cap-Struktur kann zum Beispiel durch Anfügung einer Affinitätsreinigungsmarkierung, wie zum Beispiel Biotin, Chitin-Bindungsdomänen und Ähnliches modifiziert werden (Carnici et al., vorstehend). Die affinitätsmarkierte mRNA mit Cap-Struktur kann dann von abgebauter mRNA oder RNAs mit Poly(A)-Schwänzen, welche keine codierende mRNAs voller Länge sind, isoliert werden.
Die affinitätsmarkierte mRNA kann von unmarkierter RNA durch Verwendung einer Affinitätsreinigung, zum Beispiel dadurch, dass die markierte RNA mit einem Affinitätsreinigungsmaterial wie zum Beispiel ein mit Streptavidin, Avidin, Chitin, Gluthation und Ähnlichem komplexierter fester Träger in Kontakt gebracht wird, abgetrennt werden. Statt dessen kann unmodifizierte mRNA mit Cap-Struktur von RNA-Spezies, welchen eine Cap-Struktur fehlt, auch dadurch abgetrennt werden, dass die mRNA mit Cap-Struktur mit einem festen Träger in Kontakt gebracht wird, der zum Beispiel mit Phenylboronsäure komplexiert ist (siehe Theus und Liarakos, Biotechniques 9(5) (1990), 610 – 612). Geeignete feste Träger schließen verschiedene Säulenchromatographiegele, wie zum Beispiel Sepharose, Agarose und Ähnliches und magnetische Kügelchen ein.
Jeder Typ eukaryontischer Zellen kann als Quelle für mRNA zur Verwendung bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens dienen, was sowohl tierische Zellen als auch pflanzliche Zellen einschließt. Geeignete tierische Zellen schließen Säugerzellen (Nagetier-, nicht humane Primaten-, Primaten-, Ziegen-, Schaf-, Rinder-Zellen und Ähnliches) und Insektenzellen (Nachtfalter-, Drosophila-Zellen und Ähnliches) ein. Verfahren zur Gewinnung von mRNA aus verschiedenen Zelltypen sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt (siehe zum Beispiel Ausubel et al., vorstehend).
Bevorzugt wird nach der Isolierung die Cap-Struktur der isolierten mRNA entfernt und die isolierte mRNA dephosphoryliert. Verfahren zur Entfernung der Cap-Struktur von RNAs sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt und schließen sowohl enzymatische Verfahren (wie zum Beispiel durch Verwendung einer Pyrophosphatase wie zum Beispiel Tabak-Pyrophosphatase) und chemische Verfahren (wie zum Beispiel Periodatoxidation und Beta-Eliminierung) ein. Genauso sind Verfahren zur Dephosphorylierung von RNA, zum Beispiel durch Verwendung von alkalischer Phosphatase, auf dem Fachgebiet wohl bekannt.
Eine DNA-Markierungssequenz kann an die isolierte mRNA voller Länge durch Verwendung der oben beschriebenen Verfahren angefügt werden. Eine bevorzugte DNA-Markierungssequenz wird in 11 sowohl als ein Doppelstrang-DNA-Spaltungssubstrat als auch als ein kovalentes Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt gezeigt. Der komplementäre Strang des Topoisomerase-DNA-Zwischenproduktes schließt einen 3'-Überhang von 1 bis 4 Nucleotiden ein, welche jedes Gemisch von Adenin, Guanin, Cytosin oder Thymin (in der Figur bezeichnet als N) sein können. Diese Nucleotide werden Basenpaarungen mit den ersten 1 bis 4 Basen des 5'-Endes des isolierten mRNA-Moleküls ausbilden, was es der kovalent gebundenen Topoisomerase erlaubt, die Transveresterungsreaktion, welche die DNA-Markierung an das Ende der RNA-Sequenz bindet, zu katalysieren. Die DNA-Markierungssequenz umfasst eine Topoisomerase-Erkennungsstelle, bevorzugt CCCTT, und kann zudem eine Erkennungsschnittstelle für eine ortsspezifische Restriktionsendonuclease wie zum Beispiel EcoRI umfassen, was nützlich für das anschließende Einfügen eines cDNA-Moleküls in einen Expressionsvektor ist.
Das DNA-RNA-Molekül wird als Matrize für die Synthese und Amplifikation der cDNA-Sequenzen voller Länge, bevorzugt unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR), einer auf dem Fachgebiet wohl bekannten Technik (siehe Ausubel et al., supra), verwendet. Geeignete Primer schließen die gesamte oder einen Teil der 5'-Markierungssquenz des DNA-RNA-Moleküls und einen für das Gen spezifischen 3'-Primer oder einen Oligo-dT-Primer ein.
Die amplifizierten Genprodukte werden als Nächstes von den anderen Bestandteilen des Reaktionsgemisches der Amplifikation isoliert. Diese Reinigung kann durch Verwendung einer Vielfalt von Verfahrensweisen wie zum Beispiel Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und Ähnliches bewerkstelligt werden. Ein bevorzugtes Reinigungsverfahren verwendet eine Gelelektrophorese mit niedrig abschmelzender Agarose. Das Reaktionsgemisch wird aufgetrennt und durch geeignete Mittel wie zum Beispiel eine Ethidiumbromidfärbung sichtbar gemacht. DNA-Banden, welche Amplifikationsprodukte richtiger Größe darstellen, werden aus dem Rest des Gels herausgeschnitten und in angemessene, entsprechende Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gelegt. Diese Stücke werden anschließen geschmolzen und die darin enthaltene DNA als Insertionen für die Clonierung verwendet.
Die gereinigten, amplifizierten Gensequenzen werden als Nächstes in einen Expressionsvektor eingefügt. Eine Vielzahl von Expressionsvektoren ist zur Verwendung, sowohl für die prokaryontische als auch die eukaryontische Expession, bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung geeignet. Im Allgemeinen wird der Expressionsvektor eines oder mehrere der folgenden Merkmale haben: Eine Promotor-Enhancer-Sequenz, eine Selektionsmarkersequenz, einen Replikationsursprung, eine Markierungssequenz für die Affinitätsreinigung, eine Sequenz mit einem induzierbaren Element, eine Epitopmarkierungssequenz und Ähnliches.
Promotor-Enhancer-Sequenzen sind DNA-Sequenzen, an welche die RNA-Polymerase bindet und die Transkription initiiert. Der Promotor bestimmt die Polarität des Transcriptes durch die Festlegung des Stranges, der transkribiert werden wird. Bakterielle Promotoren bestehen aus Konsensussequenzen, -35- und -10-Nucleotide relativ zum Startpunkt der Transkription, welche von einem spezifischen sigma-Faktor und der RNA-Polymerase gebunden werden. Eukaryontische Promotoren sind komplexer. Die meisten Promotoren, welche in Expressionsvektoren verwendet werden, werden durch RNA-Polymerase II transkribiert. Allgemeine Transcriptionsfaktoren (GFTs) binden als erstes spezifische Sequenzen nahe dem Startpunkt und rekrutieren dann die Bindung der RNA-Polymerase II. Zusätzlich zu diesen minimalen Promotorelementen, werden kleine Sequenzelemente spezifisch durch modulare DNA-bindende-/Transaktivierende Proteine (zum Beispiel AP-1, SP-1), welche die Aktivität eines gegebenen Promotors regulieren, erkannt. Virale Promotoren dienen der gleichen Funktion wie bakterielle oder eukaryontische Promotoren und stellen entweder eine spezifische RNA-Polymerase in trans bereit (T7-Bakteriophage) oder rekrutieren zelluläre Faktoren und RNA-Polymerasen (SV40, RSV, CMV). Virale Promotoren werden bevorzugt, da sie im Allgemeinen besonders starke Promotoren sind.
Promotoren können weiterhin entweder konstitutiv oder, stärker bevorzugt, regulierbar sein (zum Beispiel induzierbar oder dereprimierbar). Induzierbare Elemente sind DNA-Sequenzelemente, welche in Verbindung mit Promotoren wirken und entweder Repressoren (zum Beispiel das lacO/LAC lq – Repressorsystem in E. coli) oder Induktoren (zum Beispiel galI/GAL4 – Induktorsysteme in Hefe) binden. In beiden Fällen ist die Transcription faktisch "abgeschaltet", bis der Promotor dereprimiert oder induziert wird, wobei an diesem Punkt die Transcription "angeschaltet" wird.
Beispiele für konstitutive Promotoren schließen den int-Promotor des λ-Bakteriophagen, den bla-Promotor der β-Lactamase-Gensequenz aus pBR322, den CAT-Promotor der Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gensequenz aus pPR325 und Ähnliches ein. Beispiele für induzierbare, prokaryontische Promotoren schließen den rechten und linken Hauptpromotor des Bakteriophagen (P_L und P_R), die trp-, reca-, lacZ-, Lacl-, AraC- und gal-Promotoren von E. coli, den α-Amylase- (Ulmanen Ett at., J. Bacteriol. 162 (1985), 176 – 182) und die sigma-28-spezifischen Promotoren von B. subtilis (Gilman et al., Gene Sequence 32 (1984), 11 – 20), die Promotoren der Bakteriophagen von Bacillus (Gryczan, in: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press Inc., NY (1982)), Streptomyces-Promotoren (Ward et al., Mol. Gen. Genet. 203 (1986), 468 – 478) und Ännliches ein. Beispielhafte prokaryontische Promotoren werden in Übersichtsartikeln von Glick (J. Ind. Microtiot. 1 (1987), 277-282); Cenatiempo (Biochimie 68 (1986), 505 – 516); und Gottesman (Ann. Rev. Genet. 18 (1984), 415 – 442) dargestellt.
Bevorzugte eukaryontische Promotoren schließen zum Beispiel den Promotor der Methallothionein-I-Gensequenz aus der Maus (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 273 – 288), den TK-Promotor des Herpesvirus (McKnight, Cell 31 (1982), 355 – 365), den frühen Promotor von SV40 (Benoist et al., Nature (London) 290 (1981), 304 – 310), den Promotor der gal1-Gensequenz der Hefe (Johnston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79 (1982), 6971 – 6975; Silver et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. (USA) 81 (1984), 5951 – 5955), den CMV-Promotor, den EF-1-Promotor, auf Ecdyson reagierende Promotor(en) und Ähnliches ein.
Selektionsmarkersequenzen sind wertvolle Elemente in Expressionsvektoren, da sie Wege bereitstellen um nur die Zellen für das Wachstum zu selektionieren, welche einen Vektor enthalten. Solche Marker sind von zweierlei Art: Wirkstoffresistenz und Auxotrophie. Ein Wirkstoffresistenzmarker ermöglicht es Zellen einen exogen zugesetzten Wirkstoff, der andernfalls die Zelle töten würde, zu entgiften. Auxotrophiemarker erlauben es Zellen einen essentiellen Baustein (für gewöhnlich eine Aminosäure) zu synthetisieren, während sie in einem Medium gezüchtet werden, dem dieser essentielle Baustein fehlt.
Gebräuchliche, selektionierbare Markergensequenzen schließen solche für die Resistenz gegen Antibiotika wie zum Beispiel Ampicillin, Tetrazyklin, Kanamycin, Bleomycin, Streptomycin, Hygromycin, Neomycin, Zeocin^TM und Ähnliches ein. Selektionierbare Auxotrophie-Gensequenzen schließen zum Beispiel hisD ein, welches das Wachstum in Histidin freiem Medium in der Anwesenheit von Histidinol erlaubt.
Eine bevorzugte selektionierbare Markersequenz zur Verwendung in Hefeexpressionssystemen ist URA3. Labor-Hefestämme, welche Mutationen in dem Gen tragen, welches die Orotidin-5'-Phosphat-Decarboxylase codiert, welches ein essentielles Enzym für die Uracil-Biosynthese ist, sind nicht fähig in der Abwesenheit von exogenem Uracil zu wachsen. Eine Kopie des Wildtyp-Gens (ura4+ in S. pombe und URA3 in S. cerevisiae) wird diesen Defekt in trans komplementieren.
Ein weiteres in einem Expressionsvektor nützliches Element ist eine Replikationsursprungssequenz. Replikationsursprünge sind einzigartige DNA-Abschnitte, welche mehrfache, kurze und wiederholte Sequenzen enthalten, die von multimeren, den Ursprung bindenden Proteinen erkannt werden und die eine Schlüsslerolle beim Zusammenbau der DNA-Replikationsenzyme an der Stelle des Ursprungs haben. Geeignete Replikationsursprünge zur Nutzung in Expressionsvektoren, die hier verwendet werden, schließen den oriC aus E, coli, 2μ und ARS (beide nützlich in Hefesystemen), sf1, SV40 (nützlich in Säugersystemen) und Ähnliches ein.
Zusätzliche Elemente, welche in einen Expressionsvektor eingeschlossen werden können, der in Übereinstimmung mit der vorliegende Erfindung verwendet wird, sind Sequenzen; die Affinitätsreinigungsmarkierungen oder Epitopmarkierungen codieren. Affinitätsreinigungsmarkierungen sind im Allgemeinen Peptidsequenzen, welche mit einem Bindungspartner interagieren können, der an einem festen Träger immobilisiert ist. Synthetische DNA-Sequenzen, die multiple, konsekutive, einmalige Aminosäuren codieren, wie zum Beispiel Histidin, können, wenn sie mit dem exprimierten Protein verbunden werden, für Einschrittreinigungen des rekombinanten Proteins durch hochaffine Bindung an eine Harzsäule wie zum Beispiel Nickel-Sepharose genutzt werden. Eine Erkennungsstelle für eine Endopeptidase kann zwischen die Polyaminosäure-Markierung und das Protein des Interesses eingebaut werden, um die anschließende Entfernung des Leader-Peptids durch Spaltung mit Enterokinase und anderen Proteasen zu erlauben. Sequenzen, die Peptide wie zum Beispiel die Chitin-Bindungsdomäne (welche an Chitin bindet), die Gluthation-S-Transferase (welche an Gluthation bindet), Biotin (welches an Avidin und Streptavidin bindet) und Ähnliches codieren, können auch zur Reinigung des Proteins des Interesses genutzt werden. Die Affinitätsreinigungsmarkierung kann vom Protein des Interesses durch Verfahren abgetrennt werden, die auf dem Fachgebiet wohl bekannt sind und die Verwendung von Inteinen (sich selbst spleißende Proteinelemente, Chong et al., Gene 192 (1997), 271 – 281) einschließen.
Epitopmarkierungen sind kurze Peptidsequenzen, welche durch Epitop-spezifische Antikörper erkannt werden. Ein Fusionsprotein, welches ein rekombinantes Protein und eine Epitopmarkierung umfasst, kann unkompliziert und einfach durch Verwendung eines Antikörpers, der an ein Chromatographieharz gebunden ist, gereinigt werden. Die Anwesenheit einer Epitopmarkierung erlaubt weiterhin den Nachweis des rekombinanten Proteins in anschließenden Tests, wie zum Beispiel Western-Blots, ohne einen für das rekombinante Protein selbst spezifischen Antikörper herstellen zu müssen. Beispiele für verbreitet verwendete Eptiopmarkierungen schließen V5, Gluthation-S-Transferase (GST), Hämagglutinin (HA), das Peptid Phe-His-His-Thr-Thr, die Chitin-Bindungsdomäne und Ähnliches ein.
Ein weiteres nützliches Element in einem Expressionsvektor ist eine multiple Clonierungsstelle oder ein Polylinker. Synthetische DNA, welche eine Folge von Erkennungsstellen für Restritkionsendonukleasen codiert, wird in einen Plasmidvektor stromabwärts von dem Promotorelement eingefügt. Diese Stellen werden für die günstige Clonierung von DNA in den Vektor an einer spezifischen Position entworfen.
Die vorerwähnten Elemente können kombiniert werden, um einen Expressionsvektor herzustellen, der für die Herstellung der erfindungsgemäßen Genbanken nützlich ist. Geeignete prokaryontische Vektoren schließen Plasmide wie zum Beispiel jene, die zur Replikation in E. coli fähig sind (zum Beispiel pBR322, ColEI, pSC101, PACYC 184, itVX, pRSET, pBAD (Invitrogen, Carlsbad, CA) und Ähnliches), ein. Solche Plasmide werden durch Sambrock offenbart (vergleiche "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", zweite Ausgabe, herausgegeben durch Sambrook, Fritsch und Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). Bacillus-Plasmide schließen pC194, pC221, pT127 und Ähnliches ein und werden durch Gryczan offenbart (In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), 307 – 329). Geeignete Streptomyces-Plasmide schließen pIJ101 (Kendall et al., J. Bacteriol. 169 (1987), 4177 – 4183) und Streptomyces-Bakteriophagen wie zum Beispiel ϕC31 (Chater et al., in: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Ungarn (1986), 45-54) ein. Pseudomonas-Plasmide werden in Übersichtsartikeln durch John et al. (Rev. Infect. Dis. 8 (1986), 693 – 704) und Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33 (1978), 729 – 742) dargestellt.
Geeignete eukaryontische Plasmide schließen zum Beispiel BPV, Vaccinia, SV40, 2-micron-Circle, pcDNA3.1, pcDNA3.1/GS, pYES2/GS, pMT, pIND, pIND (SP1), pVgRXR (Invitrogen) und Ähnliches oder deren Abkömmlinge ein. Solche Plasmide sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt (Botstein et al., Miami Wntr. Symp. 19 (1982), 265 – 274; Broach, in: "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance", Cold Spring Harbor Laboratory (1981), Cold Spring Harbor, NY, 445 – 470; Broach, Cell 28 (1982), 203-204; Dilon et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10 (1980), 39 – 48; Maniatis, in: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Band 3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY (1980), 563 – 608) Sobald Plasmide, welche die Gensequenz-Insertion in der richtigen Orientierung enthalten, identifiziert worden sind, wird die Plasmid-DNA zur Verwendung in der Transformation von Wirtszellen für die Expression hergestellt. Verfahren zur Herstellung von Plasmid-DNA und Transformation von Zellen sind dem Fachmann wohl bekannt. Solche Verfahren sind zum Beispiel in Ausubel et al., vorstehend, beschrieben.
Prokaryontische Wirte sind im Allgemeinen sehr effizient und geeignet zur Herstellung von rekombinanten Proteinen und sind deshalb ein Typ eines bevorzugten Expressionssystems. Prokaryonten werden am häufigsten durch verschiedene Stämme von E. coli vertreten. Es können jedoch auch andere Organismen einschließlich anderer bakterieller Stämme verwendet werden.
Anerkannte prokaryontische Wirte schließen Bakterien wie zum Beispiel E. coli und solche von Gattungen wie zum Beispiel Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia und ähnliche ein. Unter solchen Bedingungen wird das Polypeptid jedoch nicht glycosyliert werden. Der hier zur Verwendung ausgewählte prokaryontische Wirt muss mit dem Replikon und den Kontrollsequenzen im Expressionsplasmid kompatibel sein.
Geeignete Wirte können oft eukaryontische Zellen einschließen. Bevorzugte eukaryontische Wirte schließen zum Beispiel Hefen, Pilze, Insektenzellen und Säugerzellen entweder in vivo oder in Zellkultur ein. Säugerzellen, welche als Wirte nützlich sein können, schließen HeLa-Zellen, Zellen fibroblastischen Ursprungs, wie zum Beispiel VERO, 3T3 oder CHOK1, HEK 293-Zellen oder Zellen lymphoiden Ursprungs (wie zum Beispiel 32D-Zelten) und ihre Abkömmlinge ein. Bevorzugte Säuger-Wirtszellen schließen nicht adhärente Zellen wie zum Beispiel CHO, 32D und Ähnliches ein. Bevorzugte Hefe-Wirtszellen schließen S. Pombe, Pichia pastoris, S. cerevisiae (wie zum Beispiel IVNSc1) und ähnliche ein.
Zudem stehen Pflanzenzellen ebenfalls als Wirte zur Verfügung und es stehen mit Pflanzenzellen kompatible Kontrollsequenzen zur Verfügung, wie zum Beispiel 35S und 19S des Blumenkohl-Mosaik-Virus, Nopalinsynthasepromotor und – polyadynelierungssignalsequenzen und Ähnliches. En weiterer bevorzugter Wirt ist die Insektenzelle, zum Beispiel die Drosophilalarven. Bei Verwendung von Insektenzellen als Wirt kann der Drosophila-Alkoholdehydrogenase-Promotor verwendet werden (Rubin, Science 240 (1988), 1453 -1459). Als Alternative können Baculovirus Vektoren hergestellt werden, um große Menge von Peptiden in Insektenzellen zu exprimieren, welche von einer gewünschten Gensequenz codiert werden (Jasny, Science 238 (1987), 1653; Miller et al., in: Genetic Engineering (1986), Setlow, J.K. et al., Herausgeber, Plenum, Band 8, Seiten 277 – 297). Die vorliegende Erfindung bietet ebenfalls die gereinigten, isolierten oder angereicherten Versionen der exprimierten Genprodukte, an welche durch die voranstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wurden.
Diese Erfindung wird aus den folgenden Experimentellen Details besser verständlich. Der Durchschnittsfachman wird jedoch schnell erkennen, dass die spezifischen, erörterten Verfahren und Ergebnisse die Erfindung lediglich veranschaulichen, welche vollständiger in den daran anschließenden Ansprüchen beschrieben wird.
Experimentelle Details
VERFAHREN UND MATERIALIEN
Herstellung von Tandem-RNA-p-DNA und -DNA-p-RNA-Olgionucleotiden
CCCTT enthaltende 36-mer-Oligonucleotide, welche eine einzelne, interne Markierung durch ³²P am spaltbaren Phosphat enthalten, wurden durch Ligierung von 2 18-mer-Strängen (synthetische RNA- oder DNA-Oligonucleotide), welche an einen komplementären 36-mer-DNA-Strang hybridisiert wurden, hergestellt. Die Sequenz des proximalen CCCTT enthaltenden 18-mer-Stranges war 5'-CATATCCGTGTCGCCCTT als DNA oder 5'-CAUAUCCGUGUCCCUU als RNA. Die Sequenz des distalen 18-mer Stranges war 5'-ATTCCGATAGTGACTACA als DNA oder 5'-AUUCCGAUAGUGACUACA als RNA. Der distale 18-mer-Strang wurde in der Anwesenheit von [γ³²p]-ATP und T4-Polynucleotidkinase 5' markiert und dann über ein Gel aufgereinigt. Die Sequenz des 36-mer-Stranges war 5'-TGTAGTCACTATCGGAATAAGGGCGACACGGATATG. Die Stränge wurden in 0,2 M NaCl durch Erhitzen auf 65 °C für 2 min, gefolgt von langsamem Abkühlen auf Raumtemperatur, aneliert. Das molare Verhältnis des 5' markierten, distalen 18-mers zum proximalen 18-mer und dem 36-mer-Strang im Hybridisierungsgemisch war 1 : 4 : 4. Das in einem Strang einfach gespaltene Produkt der Anelierungsreaktion wurde in vitro mit gereinigter, rekombinanter Vacciniavirus-DNA-Ligase verbunden (14, 15). Die Ligierungsreaktionsgemische (400 μl) enthielten 50 mM Tris HCl (pH 8.0), 5 mM DTT, 10 mM MnCl₂, 1 mM ATP, 10 pMol von 5' mit ³²P markiertem Substrat mit einer Spaltung eines Stranges und 160 pMol Ligase. Nach einer Inkubation für 4 h bei 22 °C wurden die Reaktionen durch die Zugabe von EDTA zu einer Endkonzentration von 25 mM gestoppt. Die Proben wurden dann mit Phenol-Choroform extrahiert und markierte Nucleinsäure wurde aus der wässrigen Phase durch Ethanolpräzipitation gewonnen. Die 36-mer-Doppelstrangprodukte wurden in TE-Puffer aufgelöst (10 mM Tris HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Die Ligierung des markierten, distalen 18-mer Stranges an den unmarkierten CCCTT enthaltenden 18-mer-Strang zur Erzeugung eines intern markierten 36-mer Produktes wurde durch Elektrophorese der Reaktionsprodukte durch ein 17%iges denaturierendes Polyacrylamidgel bestätigt. Das Ausmaß der Ligierung [36-mer/(36-mer + 18-mer)] war wie folgt:
DNA-p-DNA (88 %); DNA-p-RNA (67 %); RNA-p-DNA (66 %).
Kovalente Bindung von Topoisomerase an intern markierte 36-mer-Doppelstränge
Rekombinante Vaccinia-Topoisomerase wurde in Bakterien exprimiert und durch Phosphocellulose und SP5PW-Säulenchromatographie, wie beschrieben, gereinigt (16, 17). Reaktionsgemische für Untersuchungen der kovalenten Erzeugung von Addukten enthielten (pro 20 μl) 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 pMol 36-mer-Doppelstrang und 1 pMol Topoisomerase. Die Raktionen wurden durch Zugabe von Topoisomerase gestartet und durch Zugabe von SDS bis zu einer Endkonzentration von 1 % gestoppt. Die Proben wurden mittels SDS-PAGE untersucht. Kovalente Erzeugung von Komplexen wurde durch den Transfer von radioaktiv markierten Polynucleotiden auf das Topoisomerase-Polypeptid gezeigt (3). Das Ausmaß der Erzeugung von Addukten wurde durch das Abtasten des Gels unter Verwendung eines FUJIX BAS1000-Phosphorabbildungsgerät quantifiziert und wurde als Prozentanteil des eingesetzten, 5' durch ³²P markierten 36-mer-Substrates, welches kovalent auf das Protein transferiert wurde, ausgedrückt.
DNA-Strangtransfer auf einen RNA-Akzeptor
Ein CCCTT enthaltendes 18-mer-DNA-Oligonucleotid (5'-CGTGTCGC-CCTTATTCCC) wurde in der Anwesenheit von [γ³²P]-ATP und T4-Polynucleotidkinase am 5'-Ende markiert, dann mittels eines Gels gereinigt und an einen komplementären 30-mer-Strang hybridisiert, um das 18-mer/30-mer Suizid-Spaltungssubstrat zu erzeugen. Kovalente Topoisomerase-DNA-Komplexe wurden in einem Reaktionsgemisch, welches (pro 20 μl) 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,5 pMol 18-mer/30-mer-DNA und 2,5 pMol Topoisomerase enthielt, erzeugt. Das Gemisch wurde für 5 min bei 37 °C inkubiert. Die Strangtransferreaktion wurde durch Zugabe eines 18-mer-Akzeptorstranges 5'-ATTCCGATAGTGACTACA (entweder DNA oder RNA) bis zu einer Konzentration von 25 pMol/20 μl (das heißt, ein 50-facher molarer Überschuß gegenüber dem eingesetzten DNA-Substrat) gestartet, während gleichzeitig das Reaktionsgemisch auf 0,3 M NaCl eingestellt wurde. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von SDS und Fromamid zu jeweils 0,2 % bzw. 50 % gestoppt. Die Proben wurden durch Hitze denaturiert und dann einer Elektrophorese in TBE (90 mM Tris-Borat, 2,5 mM EDTA) durch ein 17%iges Polyacrylamid, welches 7 M Harnstoff enthielt, unterzogen. Das Ausmaß des Strangtransfers (ausgedrückt als Prozentanteil der eingesetzten, markierten DNA, welche zu einem 30-mer-Strangtransferprodukt umgesetzt wurde) wurde durch Abtasten des nassen Gels mittels eines Phosphorabbildungsgerät quantifiziert.
Herstellung einer mit ³²-P markierten 36-mer-RNA
Ein 36 Nucleotide langes Run-Off-Transcript wurde in vitro durch T3-RNA-Polymerase von dem Plasmid pBluescirpt II-SK(-) als Matrize, welches durch Spaltung mit der Endonuclease EagI linearisiert wurde, synthetisiert. Ein Transcriptionsreaktionsgemisch (100 μl), welches 40 mM Tris HCl (pH 8,0), 6 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP, 0,5 mM CTP, 0,5 mM UTP, 6,25 μM [α³²P] GTP, 5 μg Matrizen-DNA und 100 Einheiten T3-RNA-Polymerase (Promega) enthielt, wurde für 90 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Einstellen des Gemisches auf 0,1 % SDS, 10 mM EDTA und 0,5 M Ammoniumacetat gestoppt. Die Proben wurden mit Phenol-Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Das Pellet wurde in Formamid resuspendiert und dann einer Elektrophorese in TBE durch ein 12%iges Polyacrylamidgel, welches 7 M Harnstoff enthielt, unterzogen. Die radioaktiv markierte 36-mer-RNA wurde durch Autoradiographie des nassen Gels lokalisiert und aus einem ausgeschnittenen Stück des Gels durch Einlegen in 0,4 ml eines Puffers, welcher 1 M Ammoniumacetat, 0,2 % SDS und 20 mM EDTA enthielt, für 16 h bei 4°C eluiert. Das Eluat wurde durch Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Die RNA wurde in TE resuspendiert. Die Dephosphorylierung des 5'-Endes der RNA wurde in einem Reaktionsgemisch (30 μl), welches 10 mM Tris-HCl (pH 7,9), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 10 pMol 36-mer-RNA und 30 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (New England Biolabs) enthielt, durchgeführt. Nach einer Inkubation für 1 h bei 37 °C wurde das Gemisch mit Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Das mit Phosphatase behandelte 36-mer-Transcript wurde erneut durch eine Elektrophorese, wie oben beschrieben, gereinigt.
Affinitätsmarkierung von RNA durch Verwendung von Vaccinia-Topoisomerase
Der Reaktionsweg des Strangtransfers ist in 10a dargestellt. Das biotinylierte DNA-Substrat, welches eine einzelne Topoisomerase-Erkennungsstelle besitzt, wird auf dem festen Dynabeads (Dynal) Träger mit Streptavidin immobilisiert. Die Biotingruppe (angedeutet durch das schwarze Quadrat) wird am 5'-Ende des CCCTT enthaltenden Stranges mittels Standardverfahren für die automatisierte Oligonucleotidsynthese eingeführt. Die aufgereinigte Vaccinia-Topoisomerase wird mit der an die Kügelchen gebundenen DNA unter Erzeugung eines kovalenten Enzym – Donor-DNA – Komplexes, wie dargestellt, umgesetzt. Enzym, welches nicht an DNA gebunden ist, wird durch Waschen der Kügelchen mit Puffer entfernt. Die Strangtransferreaktion wird durch die Zugabe des [³²P]-CMP-markierten T7-Transcriptes, welches durch vorangehende Behandlung mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert wurde, gestartet. Der 5'-Einzelstrangschwanz des Donor-Komplexes ist komplementär zu den 12 Nucleotiden am 5'-Ende des T7-Transcriptes. Die Religierung des kovalent gebundenen, biotinylierten DNA-Stranges mit dem T7-Transcript wird als Umsetzung der 30-mer RNA zu einem Produkt von 50 Nucleotiden Länge beobachtet.
Experimentelle Details: Das DNA-Substrat wurde durch Anelierung des biotinylierten 25-mer-Stranges, welcher die Topoisomerase-Erkennungsstelle enthielt, an einen komplementären, phosphorylierten 24-mer-Strang (der im 4-fachem molaren Überschuss vorlag) erzeugt. Die Stränge wurden in der Anwesenheit von 0,2 M NaCl durch Erhitzen auf 65 °C für 10 min, gefolgt von langsamer Abkühlung auf Raumtemperatur, aneliert. Der biotinylierte Doppelstrang wurde auf Streptavidin-Kügelchen durch Inkubation von 10 pMol der DNA mit 10 μg Dynabeads in 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 M NaCl für 10 min bei 22 °C immobilisiert. Die Kügelchen wurden durch Zentrifugation zurückgewonnen. Die Kügelchen wurden zweimal mit 1 ml 50 mM Tris-HCI (pH 8,0) gewaschen. Die gewaschenen Beads wurden in 20 μl 50 mM Tris-HCI (pH 8,0) resuspendiert. Ein 5-facher molarer Überschuss von Topoisomerase (50 pMol) wurde dem an die Kügelchen gebundenen DNA-Substrat hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei 37 °C für min inkubiert. Die Kügelchen wurden durch Zentrifugation gewonnen, zweimal mit 1 ml 50 mM Tris-HCI gewaschen, dann in 18 μl 50 mM Tris-HCI, 0,3 M NaCl resuspendiert. Der Strangtransfer wurde durch die Zugabe von 1 pmol durch [³²P]-CMP markierten T7-Tanskriptes gestartet. Das Gemisch wurde bei 37 °C für 15 min inkubiert. Die Kügelchen wurden dann durch Zentrifugation zurückgewonnen, gewaschen und in 20 μl Puffer, welcher 0,8 % SDS und 80 % Formamid enthielt, resuspendiert. Die Proben wurden auf 95 °C für 5 min erhitzt, für 5 min zentrifugiert und dann wurden die Überstände einer Elektrophorese in TBE durch ein 12%iges Polyacrylamidgel, welches 7 M Harnstoff enthielt, unterzogen. Eine Autoradiographie des Gels wird in 10B gezeigt. Spur B (gebunden) – Produkt der Strangtransferreaktion, gebunden an die Dynabeads; Spur F (frei) – Überstand aus der Strangtransferreaktion. Die Positionen des eingesetzten 30-mer-T7-Transcriptes und des 50-mer-Produktes werden rechtsseitig gezeigt.
RNA-Substrat: Das 30 Nucleotide lange Run-Off-Transcript wurde in vitro durch T7-RNA-Polymerase von dem Plasmid pBluescirpt II-SK(-) als Matrize, welches durch die Spaltung mit der Endonuclease XhoI linearisiert wurde, synthetisiert. Das Transcript wurde mit [α³²P]-CTP unter gleichartigen Reaktionsbedingungen, wie für die Herstellung des T3-RNA-Transcriptes beschrieben, synthetisiert. Die 30-mer-RNA wurde durch ein Gel gereinigt und anschließend, wie beschrieben, dephosphoryliert.
Ergebnisse
Kovalente Bindung von Topoisomerase an ein Doppelstrangsubstrat, welches RNA 3' zu dem spaltbaren Phosphat enthält
Vaccinia-Topoisomerase bindet nicht kovalent an CCCTT enthaltende RNA-Doppelstränge, noch erzeugt sie kovalente Komplexe mit RNA-DNA-Hybriddoppelsträngen, in welchen einer der beiden Stränge RNA ist (9). Kontrollexperimente zeigten, dass das Ausbleiben der Erzeugung eines kovalenten Adduktes mit einem CCCUU enthaltenden RNA-Strang nicht durch die Ersetzung der Thymin-Basen durch Uracil in der CCCTT-Sequenz bedingt wurde (9). Um besser zu verstehen, warum Vaccinia-Topoisomerase keine kovalenten Komplexe mit reinen RNA-Strängen erzeugt, stellten wir 36-Bp-Doppelstrangsubstrate her, in welchen der spaltbare Strang ein Tandem-RNA-DNA- oder -DNA-RNA-Kopolymer und der nichtgespaltene Strang reine DNA war (1). Diese Doppelstränge waren ausschließlich mit ³²P am spaltbaren Phosphodiester markiert. Die Substratmoleküle wurden durch Anelierung zweier 18-mer-Oligonucleotide (von denen eines 5' mit ³²P markiert wurde) an einen komplementären 36-mer-DNA-Strang hergestellt, um einen in einem Strang einfach gespaltenen Doppelstrang zu erzeugen. Der 5' markierte 18-mer-Strang wurde dann in einer durch Vaccinia-Virus-DNA-Ligase katalysierten Reaktion an den unmarkierten CCCTT-Strang (oder CCCUU-Strang) gebunden. Die 36-mer-Doppelstrangprodukte wurden isoliert und dann als Substrate für die Vaccinia-DNA-Topoisomerase verwendet. Wir werden uns auf diese Substrate als DNA-p-DNA, DNA-p-RNA und RNA-p-DNA, mit der Bezeichnung des markierten Phosphats als p, beziehen.
Transveresterungen durch die Topoisomerase an der CCCTT-Stelle werden eine kovalente Bindung eines 3' mit ³²P markierten 18-mer Oligonucleotides an das Enzym ergeben. Das Ausmaß der Erzeugung kovalenter Komplexe mit dem DNA-p-RNA-Substrat in 10 min war proportional zu der eingesetzten Topoisomerase; 80 – 85 % des 36-mer Stranges wurden bei Sättigung mit dem Enzym auf die Topoisomerase transferiert (1). Der gleiche Spiegel von Topoisomerase band kovalent weniger als 1 % des 36-mer-RNA-p-DNA-Stranges. Daraus folgt, dass die Topoisomerase eine RNA-Substitution stromabwärts vom spaltbaren Phosphat toleriert, aber an der Erzeugung kovalenter Addukte gehindert wurde, wenn die CCCTT-Sequenz in Form einer RNA vorlag.
Die Kinetik der kovalenten Bindungsreaktion bei sättigenden Spiegeln von Topoisomerase wurde bestimmt (2). Eine reine 36-mer-DNA (DNA-p-DNA) wurde in 2 min zu einem Endpunkt von 21 % gebunden (2A). Die offensichtliche Spaltungs-Religierungs-Gleichgewichtskonstante (K_cI – kovalenter Komplex/nicht-kovalenter Komplex) war 0,26, was mit den Werten von 0,2 bis 0,25 übereinstimmt, die früher über die Spaltung eines am 5'-Ende markierten, CCCTT enthaltenden DNA-Substrates im Gleichgewichtszustand berichtet wurde (10, 11). Das DNA-p-RNA-36-mer wurde in 5 min zu einem Endpunkt von 80 % gebunden (2A und andere, nicht gezeigte Ergebnisse). Die offensichtliche Gleichgewichtskonstante für DNA-p-RNA (K_cI = 4) war signifikant höher als diejenige, welche für den reinen DNA-Liganden beobachtet wurde.
Das RNA-p-DNA-36-mer wurde, wenn auch sehr langsam, auf die Topoisomerase transferiert. Nach 4 h waren 4 % des CCCUU enthaltenden RNA-Stranges kovalent an das Enzym gebunden (2B). Ein Endpunkt wurde in diesem Experiment nicht erreicht. Durch Vergleich der initialen Geschwindigkeit der Erzeugung kovalenter Addukte mit RNA-p-DNA (0,04 % des eingesetzten Substrates wurde pro min gespalten) mit der Menge von Addukt, die mit DNA-p-DNA zum frühesten Zeitpunkt (12 % in 10 Sek.) erzeugt wurde, wird jedoch geschätzt, dass die Substitution des CCCTT-Abschnittes des Substrates mit RNA die Geschwindigkeit der Erzeugung kovalenter Komplexe um etwa 3 Größenordungen verlangsamt hat.
DNA-Strangtransfer auf einen RNA-Akzeptor
Erneute Bindung des gespaltenen Stranges geschieht durch Angriff eines Polynucleotids mit 5'-Hydroxylterminus an der 3'-Phosphodiesterbindung zwischen Tyr-274 und der CCCTT-Stelle. Dieser Transveresterungsschritt kann unabhängig von der Strangspaltung durch Untersuchung der Fähigkeit eines vorher erzeugten Topoisomerase-DNA-Komplexes einen kovalent gebundenen Strang an einen heterologen Akzeptorstrang zu religieren studiert werden (5, 11). Um einen kovalenten Topoisomerase-DNA-Donorkomplex zu erzeugen, wurde das Enzym zunächst mit einem Suizid-Substrat inkubiert, welches aus einem 5' durch ³²P markierten spaltbaren 18-mer-Strang (CGTGTCGCCCTTATTCCC), der an einen 30-mer-Strang hybridisiert wurde, bestand. Die Spaltung dieser DNA durch Topoisomerase wird von der Abspaltung der 6 Nucleotide langen, austretenden Gruppe, ATTCCC, begleitet. Ohne einen gleich verfügbaren Akzeptor für die Religierung ist das Enzym im Wesentlichen auf der DNA als Suizid-Zwischenprodukt gefangen (3). In einer 5-minütigen Reaktion mit Enzymüberschuss wird > 90 % des 5' durch ³²P markierten Stranges kovalent an das Protein gebunden. Die Strangtransferreaktion wurde durch Zugabe eines 50-fachen molaren Überschusses eines 18-mer-Akzeptorstranges (entweder DNA oder RNA), komplementär zu dem 5'-Einzelstrangschwanz des kovalenten Donorkomplexes (3), gestartet, während gleichzeitig die Ionenstärke auf 0,3 M NaCl erhöht wurde. Zugabe von NaCl während der Religierungsphase fördert die Abspaltung der Topoisomerase nach dem Strangschluss und verhindert die erneute Spaltung des Strangtransferproduktes. Ligierung des kovalent gebundenen 12-mers CGTGTCGCCCTT an das 18-mer ergibt ein mit ³²P markiertes 30-mer (4, Spur 1). Das Suizid-Zwischenprodukt transferierte 94 % des eingesetzten, CCCTT enthaltenden Stranges auf den 18-mer DNA-Strang (3). Das Ausmaß der Religierung zum frühesten Zeitpunkt (5 Sek.) war 90 % des Endpunktwertes. Aus diesem Datenpunkt wurde eine Geschwindigkeitskonstante der Religierung (k_reI) von > 0,5 s^–1 errechnet. Ein k_reI-Wert von ~ 1,3 s^–1 wurde früher bestimmt (aus experimentellen Werten für k_cI und K_eq bei 37 °C) (18).
Topoisomerase ligierte prompt die kovalent gebundene 12-mer-DNA an einen 18-mer-RNA-Akzeptor, um ein 30-mer-Produkt zu erzeugen (4, Spur 5). 89 % des eingesetzten CCCTT-Stranges wurde auf RNA transferiert, wobei 40 % des Endpunktwertes in 5 Sek. erreicht wurden. Dieser Datenpunkt wurde verwendet, um die Geschwindigkeitskonstante von 0,1 s^–1 für einen Single-Turnover-Strangtransfer auf RNA zu schätzen. Somit war die Religierung mit DNA etwa 10-mal schneller als die Religierung mit RNA. Die verlangsamte Geschwindigkeit der RNA-Religierung ist wahrscheinlich für die beobachtete Zunahme der Spaltungs-Religierungs-Gleichgewichtskonstante (K_eq = k_cI/k_reI) mit dem DNA-p-RNA-36-mer verantwortlich.
Untersuchung des Strangtransferreaktionsproduktes
Das vorhergesagte Produkt des Strangtransfers auf RNA ist ein 30-mer-Tandem-DNA-RNA-Strang (5' – CGTGTCGCCCTTAUUCCGAUAGUGACUACA), welcher ausschließlich mit ³²P am 5'-Ende markiert ist. Die Struktur dieses Moleküls wurde durch Untersuchung der Empfindlichkeit dieses Produktes gegenüber der Behandlung mit NaOH bestätigt. Das markierte 30-mer-RNA-Ligierungsprodukt wurde fast quantitativ in eine diskrete Spezies umgewandelt, welche schneller als der eingesetzte, CCCTT enthaltende 18-mer-DNA-Strang wanderte (4, Spur 6). Die Beweglichkeit dieses Produktes war mit einer Kettenlänge von 13 Nucleotiden vereinbar. Das erwartete mit ³²P markierte Produkt der alkalischen Hydrolyse des RNA-Strang-Transferproduktes ist ein 13-mer (5' -CGTGTCGCCCTTAp). Kontrollreaktionen zeigten, dass weder der mit ³²P markierte Strang des Suizid-Substrates noch das 30-mer-Produkt des Strangtransfers auf DNA empfindlich gegenüber Alkali war (4, Spuren 4 und 2). Es wird geschlussfolgert, dass die Topoisomerase verwendet werden kann, um in vitro RNA an DNA zu ligieren.
Markierung eines RNA-Transcriptes, welches durch die T3-Polymerase in vitro synthetisiert wurde, mit einem DNA-Liganden
Praktische Anwendungen von durch Topoisomerase vermitteltem Strangtransfer auf RNA schließen die 5'-Markierung von RNA-Transcripten ein. RNA-Polymerasen aus Bakteriophagen wurden verbreitet zur Synthese von RNA in vitro von Plasmid-DNA-Matrizen, welche Phasen-Promotoren enthielten, verwendet. Um zu prüfen, ob solche Transkripte Substrate für durch Topoisomerase katalysierte Ligierungen wären, konstruierten wir ein CCCTT enthaltendes Suizid-Spaltungssubstrat, das, wenn es durch die Topoisomerase gespalten wird, einen 5'-Einzelstrangschwanz, komplementär zu der vorhergesagten 5'-Sequenz jeder RNA, enthalten würde, die von der T3-RNA-Polymerase von einem pBluescript-Vektor transkribiert wird (5). Ein 36 Nucleotide langes T3-Transcript wurde in einer Transkriptionsreaktion synthetisiert, die [α³²P]-GTP enthielt. Die RNA wurde mit alkalischer Phosphatase behandelt um den 5'-Terminus zu dephosphorylieren. Das kovalente Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt wurde mit einem unmarkierten Suizid-Substrat erzeugt. Inkubation des radioaktiv markierten T3-Transkriptes mit dem Suizid-Zwischenprodukt ergab eine Umwandlung der 36-mer-RNA in eine neue Spezies, welche während einer Polyacrylamidgelelektrophorese langsamer wanderte (nicht gezeigt). Die offensichtliche Größe dieses Produktes (48 Nucleotide) zeigte die Ligierung an den 12-mer-CCCTT-DNA-Strang an. Die Kinetik der DNA-Ligierung an das T3-Transcript wird in 5 gezeigt. Die Reaktion war im Wesentlichen innerhalb 1 min beendet; an ihrem Endpunkt waren 29 % der eingesetzten RNA an DNA gebunden. Kein DNA-RNA-Ligierungsprodukt wurde in Reaktionen erzeugt, welche T3-Transkript enthielten, das nicht mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war (nicht gezeigt).
Erzeugung von Insertionen und Deletionen – eine Untersuchung der Kinetik
Die Akzeptor-Polynucleotide, die in den oben beschriebenen Experimenten verwendet wurden, waren in der Lage perfekt mit dem 5'-Einzelstrangschwanz des Topoisomerase-DNA-Donorkomplexes zu hybridisieren. Es wurde früher gezeigt, dass die Vaccinia-Virus-Topoisomerase fähig ist den CCCTT-Strang an ein Akzeptor- Oligonucleotid zu binden, welches derart hybridisiert, dass eine 1 Nucleotid lange Lücke zwischen dem kovalent gebundenen 3'-Ende des Donors und dem 5'-Terminus des Akzeptors gelassen wird. Die Religierung über diese Lücke erzeugt eine Deletion von einer Base im Produkt im Vergleich zum eingesetzten spaltbaren Strang (5). Das Enzym katalysiert auch den Strangtransfer an ein Akzeptor-Oligonucleotid, welches, wenn es hybridisiert wird, ein zusätzliches Nucleotid zwischen das 3'-Ende des Donors und das vorletzte eine Basenpaarung aufweisende Nucleotid des Akzeptors einführt. Die Religierung wird in diesem Fall eine 1 Base lange Insertion erzeugen (5). Die Erzeugung von Deletionen und Insertionen in vitro wurde ebenfalls für die Typ-I-Topoisomerase der Säuger dokumentiert (19). Es gibt jedoch keinen Bericht über die Auswirkungen von Lücken und Insertionen im Akzeptorstrang auf die Geschwindigkeit der Verbindung von Strängen durch diese Enzyme.
Die Kinetik des Strangtransfers durch das kovalente Vaccinia-Topoisomerase-Zwischenprodukt auf Akzeptor-Oligonucleotide, welche Basenpaarungen mit dem Donorkomplex bilden, um entweder einen vollständig durch Basenpaarung verbundenen 3'-Doppelstrangabschnitt oder 3'-Doppelstrangabschnitte mit einer 1 Nucleotid langen Lücke oder einer 2 Nucleotide langen Lücke zu erzeugen, wurde untersucht. 84 % des eingesetzten DNA-Substrates wurden in 10 Sek., dem frühesten untersuchten Zeitpunkt, an den vollständig gepaarten Akzeptor ligiert (6A). Die Größe des Strangtransferproduktes war, wie erwartet, 30 Nucleotide (7, Spur 3). In der Abwesenheit des zugesetzten Akzeptorstranges wurde kein 30-mer-Produkt erzeugt (7, Spur 2).
Die Religierung über eine 1 Nucleotid lange Lücke war, obwohl langsam, in hohem Maße effizient. 85 % des eingesetzten Substrates wurden über eine 1 Nucleotid lange Lücke verbunden, um das erwartete 29 Nucleotide lange Produkt zu ergeben (6A und 7, Spur 4). Die Ergebnisse für die Kinetik in 6 passen gut zu einer einfachen Exponentialfunktion mit einer offensichtlichen Geschwindigkeitskonstante von 0,005 s^–1. Somit war der Single-Turnover-Strangschluß durch die Topoisomerase über eine 1 Nucleotid lange Lücke um 2 Größenordnungen langsamer als die Geschwindigkeit der Verbindung über eine vollständig gepaarte Spaltung. Vaccinia-Topoisomerase katalysierte den Strangtransfer über eine Lücke von 2 Nucleotiden um das erwartete 28 Nucleotide lange Produkt zu erzeugen (7, Spur 5), diese Reaktion war aber schwach ( 6A). Lineare Akkumulation des Produktes mit der 2 Nucleotide langen Lücke wurde nach einer Inkubation über 2 h beobachtet, wobei zu diesem Zeitpunkt nur 10 % der eingesetzten DNA verbunden worden waren. Auf der initialen Geschwindigkeit basierend, wurde geschätzt, dass die Religierung über die 2 Nucleotide lange Lücke 2 Größenordnungen langsamer als die Verbindung über eine 1 Nucleotid lange Lücke war (und damit 4 Größenordnungen langsamer als die Verbindung über die Spaltung eines Stranges).
Gleichartige Experimente wurden unter Verwendung von DNA-Akzeptoren durchgeführt, welche entweder 1 oder 2 zusätzliche Nucleotide an ihren 5'-Enden enthielten (6C). Die Religierung an diese Akzeptoren ergab jeweils markierte Strangtransferprodukte von 31 und 32 Nucleotiden Länge (7, Spur 6 und 7). 90 % der eingesetzten DNA wurde religiert um das Produkt mit der Insertion von 1 Nucleotid Länge zu erzeugen (6C). Eine Geschwindigkeitskonstante von 0,04 s^–1 für die Religierung mit einer 1 Nucleotid langen Insertion wurde berechnet. Ein gleichartiger Endpunkt wurde bei der Erzeugung eines Produktes mit einer 2 Nucleotide langen Insertion erreicht, aber die Strangtransfergeschwindigkeit war erheblich langsamer (6C). Die beobachtete Geschwindigkeitskonstante für eine Insertion von 2 Nucleotiden Länge war 0,0001 s^–1, das heißt, 3 Größenordnungen kleiner als k_reI bei einer Spaltung eines Stranges.
Effekt einer 5'-Basenfehlpaarung des Akzeptors auf den Strangtransfer
Strangtransfer durch die Topoisomerase auf einen Satz von 18-mer-Akzeptoren, welche fähig waren Basenpaarungen mit dem 5'-Schwanz des Donorkomplexes von der Position -2 bis -18 (relativ zu dem spaltbaren +1 T:A-Basenpaar des CCCTT-Elementes) zu bilden, welche aber eine Basenfehlpaarung an der Position -1, unmittelbar 3' zu der spaltbaren Bindung haben, wurde untersucht. Der Kontrollakzeptor, welcher ein normales -1 A:T-Basenpaar besitzt, wurde in 10 Sek. vollständig umgesetzt; 89 % des Endpunktes wurden in 5 Sek. erreicht (8). DNAs, welche T:T-, C:T- oder G:T-Fehlpaarungen an der Position -1 enthielten, unterstützten das gleiche Ausmaß an Strangtransfer; 77 % des Endpunktes wurden in jedem Fall in 5 Sek. erreicht (8). Somit hatte in den Nachweisgrenzen dieses Experiments eine Fehlpaarung an der Position -1 geringfügige Wirkung auf die Strangtransferreaktion. Es gibt klare und aufschlussreiche Unterschiede zwischen den Auswirkungen von Basenfehlpaarungen gegenüber der Deletion eines einzelnen Nucleotids auf die Geschwindigkeit des Schrittes der Verbindung der Stränge.
Kinetik der intramolekularen Erzeugung von Haarnadelstrukturen
In der Abwesenheit eines exogenen Akzeptor-Oligonucleotids kann der 5'-OH-Terminus des nicht spaltbaren Stranges des kovalenten 12-mer/30-mer-Komplexes zurückklappen und als das Nucleophil durch Angriff der DNA-(3-Phosphotyrosyl-) Bindung wirken (5). Das Reaktionsprodukt ist ein Molekül mit Haarnadelstruktur, welches einen 12 Bp langen Stamm und eine 18 Nucleotide lange Schleife enthält. Die Kinetik dieser Reaktion wurden unter Single-Turnover-Bedingungen untersucht. Im Experiment, das in 9A gezeigt wird, wurden in drei Stunden 65 % des eingesetzten CCCTT-Stranges zu einem Produkt mit Haarnadelstruktur umgewandelt. Die beobachtete Geschwindigkeitskonstante war 5,7 × 10^–4 s^–1. Gleichzeitig wurde die Geschwindigkeit der Erzeugung einer Haarnadelstruktur durch den kovalenten Komplex mit einem 18 Bp langen Spaltungssubstrat untersucht ( 9A). In diesem Fall ergab der Angriff des 5'-OH des nicht spaltbaren Stranges ein Molekül mit Haarnadelstruktur, welches einen 12 Bp langen Stamm und eine 6 Nucleotide lange Schleife enthielt. 69 % des eingesetzten CCCTT-Stranges wurden in 10 h zu einem Produkt mit Haarnadelstruktur umgewandelt. Die beobachtete Geschwindigkeitskonstante war 8,2 × 10^–5 s^–1. Somit war der 18 Nucleotide lange 5'-Schwanz ~ 7 mal effektiver als der 6-mer-5'-Schwanz als angreifendes Nucleophil im Strangtransfer in cis. Beachte, dass die Erzeugung von Haarnadelstrukturen durch diese kovalenten Komplexe ohne jegliche Möglichkeit für eine Basenpaarung durch die Einzelstrangschwänze eintritt.
Um den Beitrag der Basenpaarung für die Geschwindigkeit der Religierung zu untersuchen, wurden die letzte und vorletzte 5'-Base des unteren Stranges des 18-mer/30-mer Substrates nach 5' -AT geändert (9B). Jetzt sind die 3 Basen am 5'- Terminus des unteren Stranges (5'- ATT) identisch mit den Basen am 5'-Terminus des austretenden Stranges (5'- ATTCCC); daher ist der Einzelstrangschwanz mit sich selbst komplemenär und fähig 3 Basenpaare benachbart zu dem spaltbaren Phosphat zu erzeugen. Bei dieser DNA geschah die intramolekulare Bildung einer Haarnadelstruktur extrem schnell; die Reaktion war in 10 – 20 Sek. vollständig ( 9B) Die beobachtete Geschwindigkeitskonstante der Religierung war 0,2 s^–1. Durch Vergleich dieses Wertes mit der Geschwindigkeitskonstante der Religierung des nicht komplementären 18-mer/30-mer-Substrates (9A) wurde die Vermutung angestellt, dass 3 Basenpaare die Reaktion ~ 350-fach beschleunigen.
Kinetik der Single-Turnover-Spaltung eines CCCTT enthaltenden Moleküls mit Haarnadelstruktur
Das 42 Nucleotide lange, 5' mit ³²P markierte Produkt mit Haarnadelstruktur wurde durch ein Gel gereinigt und als Substrat für die kovalente Erzeugung von Addukten durch die Vaccinia-Topoisomerase getestet. 55 % der eingesetzten Radioaktivität wurde bei 37 °C für 15 Sek. auf das Topoisomerasepolypeptid transferiert; ein Endpunkt mit einem Transfer von 90 % wurde in 60 Sek. erreicht (Ergebnisse werden nicht gezeigt). Die offensichtliche Geschwindigkeitskonstante für die Spaltung der Haarnadelstruktur war 0,06 s^–1. Somit spaltete die Topoisomerase schnell und effizient ein CCCTT enthaltendes Molekül, in welchem es keine standardmäßig gepaarten Basen stromabwärts des spaltbaren Phosphates gab. Die Geschwindigkeitskonstante der Spaltung der Haarnadelstruktur ist etwa ein fünftel der k_cI für das 18-mer/30-mer Suizid-Substrat, welches 5 gepaarte Basen Doppelstrang-DNA 3' zu der CCCTT-Stelle enthält.
DISKUSSION
Vaccinia-Topoisomerase katalysiert ein mannigfaltiges Repertoire von Strangtransferreaktionen. Die Religierung von kovalent gebundener DNA an ein Akzeptor-DNA-Oligonucleotid mit vollständiger Basenpaarung stellt ein Modell für den Schritt des Strangschlusses der DNA-Relaxationsreaktion bereit. Hier wird die Kinetik des Strangtransfers auf alternative Nucleinsäureakzeptoren untersucht. Die Ergebnisse bieten neue Einsichten bezüglich der Parameter, welche die Geschwindigkeit der Transveresterung beeinflussen, beleuchten das Potential der Topoisomerase Mutationen in vivo zu erzeugen und schlagen praktische Anwendungen für die Vaccinia-Topoisomerase als RNA-modifizierendes Enzym vor.
Die Zuckerspezifität für die kovalente Erzeugung von Addukten liegt in dem CCCTT-Element
Vaccinia-Topoisomerase ist offensichtlich unfähig kovalent an CCCUU-enthaltende RNA-Stränge zu binden. Dies ist der Fall, wenn der CCCUU-Strang Teil eines RNA-RNA- oder auch eines RNA-DNA-Doppelstranges ist (9). Es wurde nun gezeigt, dass die Zuckerspezifität des Enzyms auf eine strikte Anforderung, dass sich DNA auf der 5'-Seite des spaltbaren Phosphats befindet, zurückzuführen ist, das heißt, dass die CCCTT-Stelle DNA sein muss. Außerdem muss das CCCTT-Element ein DNA-DNA-Doppelstrang sein, weil frühere Experimente gezeigt haben, dass ein CCCTT-Strang nicht gespalten wird, wenn er mit einem komplementären RNA-Strang aneliert (9). Die Ergebnisse für die RNA-DNA-Hybride sind aufschlussreich, weil sie nahe legen, dass die CCCTT-Stelle eine Helixkonformation der B-Form annehmen muss, um gespalten zu werden. RNA- und DNA-Polynucleotidketten nehmen verschiedene Konformationen in einem RNA-DNA-Hybrid an, wobei der RNA-Strang die Helixkonformation der A-Form behält (wie sie in dsRNA vorgefunden wird), während der DNA-Strang eine Konformation annimmt, die weder genau A noch B ist, aber stattdessen mit ihren Eigenschaften zwischen diesen zwei Formen liegt (20, 21). Vaccinia-Topoisomerase stellt Kontakte mit den Nucleotidbasen der CCCTT-Stelle in der großen Furche her (9, 22). Sie stellt ebenfalls Kontakte mit den spezifischen Phosphaten der CCCTT-Stelle her (23). Die Annahme einer Konformation durch die CCCTT-Stelle, die nicht die B-Konformation ist, kann diese Kontakte schwächen oder ausschließen. Die Erkenntnis, dass die Vaccinia-Topoisomerase relativ unempfindlich gegenüber der Zusammensetzung von Nucleotidzuckern stromabwärts von dem spaltbaren Phosphat ist, impliziert, dass die Konformation der Helix in diesem Abschnitt des Liganden nicht wichtig für die Erkennung der Stelle oder die Reaktionschemie ist. Die Topoisomerase spaltet DNA-p-RNA-Stränge, in denen der austretende Strang RNA ist. Tatsächlich ist das Ausmaß der Spaltung im Gleichgewichtszustand signifikant höher als jenes, welches mit einem DNA-p-DNA-Strang erreicht wird.
Strangtransfer auf RNA
Die Steigerung in der Spaltungs-Religierungs-Gleichgewichtskonstante K_eq (= k_cI/k_reI) für das DNA-p-RNA-Substrat kann durch das Ergebnis erklärt werden, dass die Geschwindigkeit einer Single-Turnover-RNA-Religierung k_reI(RNA)etwa ein zehntel von k_reI(DNA) ist. Nichtsdestoweniger ist das Ausmaß der Relgierung mit RNA ziemlich hoch, das heißt, ~ 90 % des eingesetzten CCCTT-Stranges werden in einer Reaktion über 2 min mit einem 18-mer-RNA-Akzeptorstrang religiert. Es wird gezeigt, dass ein CCCTT-enthaltender DNA-Strang schnell durch eine Topoisomerase mit einem in vitro durch eine RNA-Polymerase aus Bakteriophagen synthetisierten Transcript verbunden werden kann; ~ 30 % der RNA werden in einer Reaktion über 2 – 5 min auf den DNA-Strang transferiert. Diese Eigenschaft kann ausgenutzt werden, um eine jegliche RNA, für welche die RNA-Sequenz am 5'-Terminus bekannt ist, das heißt, durch Entwurf eines Suizid-DNA-Spaltungssubstrates für die Vaccinia Topoisomerase, in welchem der nicht spaltbare Strang komplementär zur 5'-Sequenz des geplanten RNA-Akzeptors ist, 5' zu markieren. Einige praktische Anwendungen schließen (i) die Markierung des 5'-Endes von RNA mit ³²P und (ii) die Affinitätsmarkierung des 5'-Endes von RNA, zum Beispiel durch Verwendung eines biotinylierten Topoisomerase-Spaltungssubstrates, ein. Ein potentieller Vorteil der durch Topoismomerase vermittelten Verbindung von RNA-Strängen (verglichen mit der standardmäßigen T4-RNA-Ligasereaktion) ist, dass die Ligierung durch Topoisomerase durch den Forscher zielgerichtet auf interessierende RNAs in einem komplexen Gemisch von RNA-Molekülen erfolgen kann.
Rasterverschiebungs- und Missensemutagenese
Es wurde früher berichtet, dass Vaccinia-Topoisomerase an komplementäre DNA-Akzeptoren, welche zurückgesetzte Enden oder zusätzliche Nucleotide enthalten, religieren kann, wodurch das Äquivalent einer Rasterverschiebungsmutation erzeugt wird (5). Gleichartige Reaktionen wurden durch Henningfeld und Hecht (19) für die zelluläre Typ-I-Topoisomerase beschrieben. Eine Schlüsselfrage ist, ob diese aberranten Religierungsreaktionen stark genug sind, um die Topoisomerase in vivo als potentielles Mutagen anzusehen. Die Untersuchung der Kinetik legt nahe, dass sie dies sind und stellt den ersten Hinweis bereit, welches Spektrum von Rasterverschiebungsreaktionen am wahrscheinlichsten auftreten wird (nur die intrinsischen Eigenschaften der Topoisomerase berücksichtigend). Für das Vaccinia-Enzym ist die Hierarchie von Rasterverschiebungen erzeugenden Religierungsreaktionen wie folgt: +1 Insertion > -1 Deletion> +2 Insertion » -2 Deletion.
Die langsamste dieser von der Topoisomerase katalysierten Reaktionen ist der Strangschluss über eine 2 Nucleotide weite Lücke (initiale Geschwindigkeit = 0,002 % der eingesetzten DNA religiert/Sek.). In dieser Situation wird das angreifende Nucleophil an seiner Position in einer gewissen Entfernung vom DNA-Protein-Phosphodiester durch Basenpaarung mit dem nicht spaltbaren Strang festgehalten. Bewegung des 5'-Hydroxyls um ein Basenpaar näher an den Phosphodiester erhöht die Reaktionsgeschwindigkeit um einen Faktor von 100. Zusätzliche, ungepaarte Nucleotide scheinen ein viel geringeres Hindernis für die Verbindung von Strängen zur Bildung von 1 oder 2 Nucleotide langen Insertionen darzustellen. Das aktive Zentrum der Topoisomerase kann fähig sein, extrahelicale Nucleotide aufzunehmen; statt dessen könnten diese Nucleotide auch an dem durch die Topoisomerase erzeugten Spalt eines Stranges in die DNA-Helix interkalieren.
Es gibt zwei mögliche Wege für die Topoisomerase Minus-Rasterverschiebungen in vivo zu erzeugen, die sich durch die Art der Erzeugung des Akzeptorstranges unterscheiden: (i) das 5'-Ende des austretenden Stranges kann durch eine Nuclease beschnitten werden, wonach eine Ligierung über die entstehende Lücke stattfinden könnte; oder (ii) ein homologer DNA-Einzelstrang greift das kovalente Zwischenprodukt an. Der zweite Weg benötigt vermutlich eine Helicase um den eintretenden Strang zu erzeugen (und vielleicht auch um den austretenden Strang zu verdrängen). Im Fall von Plus-Rasterverschiebungen würde der Topoisomerase nur der letztere Weg zur Verfügung stehen, d.h. da keine Mechanismen existieren, um Nucleotide an den 5'-Terminus des ursprünglich austretenden Stranges anzufügen.
Unabhängig davon welcher Weg beschritten wird, ist es vernünftig anzunehmen, dass die am schnellsten katalysierten, mutagenen Strangverbindungsreaktionen diejenigen sind, welche am wahrscheinlichsten ihre Spuren in vivo hinterlassen. Wenn die Religierungsreaktion langsam ist, wie bei der -2-Rasterverschiebung, dann hat die Zelle eine bessere Möglichkeit die mutagene Läsion zu reparieren, zum Beispiel durch Entfernung der kovalent gebundenen Topoisomerase. Dies könnte zur Folge haben: (i) das Ausschneiden eines Stück des DNA-Stranges, an den die Topoisomerase gebunden ist; oder (ii) die Hydrolyse des Topoisomerase-DNA-Adduktes. Ein Enzym, welches die letztere Reaktion katalysiert, wurde kürzlich von Yang et al. (24) entdeckt.
Die Einführung einer Basenfehpaarung an der Position -1, die das spaltbare Phosphat unmittelbar flankiert, hat fast keine Auswirkung auf die Geschwindigkeit der Religierung. Das Ergebnis steht im krassen Gegensatz zum 10^–2-Geschwindigkeitseffekt einer 1 Nucleotid langen Lücke. Es wird gefolgert, dass die -1-Basenfehpaarungen die Nähe des 5'-Hydroxyl-Nucleophils des terminalen Nucleotids zum spaltbaren Phosphat im aktiven Zentrum des Enzyms nicht signifikant verändern. Die Ergebnisse weisen klar darauf hin, dass die Topoisomerase die Fähigkeit hat, Missense-Mutationen in vitro zu erzeugen. Der Weg des Eintretens des Einzelstranges, welcher oben in die Rasterverschiebungsmutagenese eingeschlossen wurde, könnte im Prinzip für die Topoisomerase die Möglichkeit bereitstellen Missense-Mutationen in vivo zu erzeugen. Die Kinetik der Religierung in vitro legt nahe, dass durch Topoisomerase erzeugte Missense-Mutationen gegenüber Rasterverschiebungen überwiegen würden.
Der Beitrag der Basen-Komplementarität zur Kinetik
Untersuchung der Kinetik der intramolekularen Erzeugung von Haarnadelstrukturen durch die Vaccinia-Topoisomerase liefert die erste quantitative Auswertung der Rolle der Basen-Komplementarität beim Strangschluss. Die Geschwindigkeitskonstante für den Angriff auf die DNA- (3'-Phosphotyrosyl)-Bindung durch einen nicht paarenden, 18 Nucleotide langen Einzelstrang, welcher in cis an den kovalenten Komplex gebunden ist, war 5,7 × 10^–4 s^–1. Die alleinige Veränderung der terminalen Basen des Einzelstrangschwanzes, um eine Basenpaarung an den -1-, -2- und -3- Positionen zu erlauben, erhöhte die Geschwindigkeitskonstante für die Erzeugung einer Haarnadelstruktur um das 350-fache. Die Geschwindigkeit der Religierung in cis mit drei potentiellen Basenpaaren war annähernd gleich der Geschwindigkeit der Religierung an einen nicht kovalent gebundenen Akzeptorstrang, welcher 18 Basenpaare 3' von der spaltbaren Bindung erzeugt. Die Fähigkeit des kovalent gebundenen Enzyms DNA-Stränge mit nur drei komplementären Nucleotiden aufzunehmen und schnell zu verbinden verleiht dem Vorschlag Glaubwürdigkeit, dass Vaccinia-Topoisomerase die Erzeugung von Rekombinationszwischenprodukten in vivo (25), entweder durch Eintreten eines Stranges oder durch reziproken Strangtransfer zwischen zwei Topoisomerase-DNA-Komplexen, katalysiert.
Erzeugung von Gensequenzen
Die Verwendung von durch DNA markierter RNA zur Clonierung von Gensequenzen wurde unter Verwendung von 96 Basen langen RNA-Testfragmenten bekannter Sequenz (GGG AGA CCC AAG CTC GCC CGG TTC TTT TTG TCA AGA CCG ACC TGT CCG GTG CCC TGA ATG AAC TGC AGG ACG AGG CAG CGC GGC TAT CGT GGC TGG) untersucht. Diese Test-RNA wurde unter Verwendung eines T7-Invitrotranscriptions-Kits von Ambion Co. unter Verwendung der vom Hersteller bereitgestellten Protokolle synthetisiert.
Ein Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt wurde wie folgt erzeugt:
25 μl mit Streptavidin konjugierte Dynabeads (Dynal) wurden zweimal mit 25 l 2 × B&W-Puffer (10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCl) in einem Effendorfgefäß gewaschen, dann in 50 μl 1 × B&W-Puffer resuspendiert. 1, 5 μg eines biotinylierten Oligos (TOPOB1) und 0,75 μg von zwei anelierenden Oligos (TOPOP2, TOPOP3) wurden den Kügelchen hinzugefügt und dann auf 70 °C für 5 Minuten erhitzt, dann für 2 Minuten auf Eis gekühlt. Die Beads wurden dann zweimal jeweils mit 25 μl NEB #1-Puffer (New England Biolabs – 10 mM Bis-Tris-Propan-HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT pH 7,0 bei 25 °C) gewaschen um jegliche nicht anelierte angelagerte Oligonucleotide zu entfernen. Die Oligonucleotide wurden von Dalton Biochemicals (Kanada) synthetisiert und hatten folgende Sequenzen:
TOPOB1 – 5' B-GTTTTGGCTCCCATATACGACTCGCCCTTNTTCCGATAGTG
TOPOP2 – 5'-NAAGGGCGAGTC
TOPOP3 – 5'-CACTATCGGAA.
Das 5'-Ende von TOPOB1 wurde durch Verwendung eines biotinylierten Guanin-Nucleotids während dieser Runde der automatisierten Synthese biotinyliert.
Nach dem Anelierungs-Schritt wurde das DNA-Substrat unter Verwendung der Vaccinia-Topoisomerase, im Wesentlichen wie vorher beschrieben, modifiziert. Annähernd 2,5 g Vaccinia-Topoisomerase 1 wurden den Kügelchen in 25 μl 1 × NEB#1-Puffer hinzugefügt. Dieses Gemisch wurde für 5 Minuten bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad befestigt, dann dreimal mit 25 μl 1 × NEB#1-Puffer gewaschen. Annähernd 100 – 200 ng der 96-mer-RNA wurden den gewaschenen, mit Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt gebundenen Kügelchen in 10 μl 0,5 M NaCl (Endkonzentration 0,3 M) hinzugefügt und das Gefäß für 5 Minuten bei Raumtemperatur rotiert.
Die mit DNA markierter RNA gebundenen Kügelchen wurden als nächstes zweimal mit 1 × RT-Puffer (cDNA Cycle Kit, Invitrogen, Carlsbad, CA, Kat. Nr.: L1310-01) gewaschen, der RT96 geprimt (Synthese des ersten Stranges) und eine PCR unter Verwendung des cDNA Cycle Kit entsprechend den Anweisungen des Herstellers und der Primer PCR96 und PCR53 durchgeführt.
RT96 – 5'-CCACGATAGCCGCGCT
PCR96 – CGTCCTGCAGTTCATTCAG
PCR53 – GGCTCCCATATACGACTC
Die Reaktionszyklen waren wie folgt: 2 Minuten bei 94 °C, dann 25 – 35 Zyklen (10 Sek./Zyklus) 94 °C, 55 °C und 72 °C, gefolgt von 5 Minuten bei 72 °C. Die als Ergebnis amplifizierte cDNA wurde unter Verwendung eines TOPO^TMTA Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, Kat. Nr.: K4500-01), verwendet entsprechend den Anweisungen des Herstellers, in einen Plasmid-Vektor eingefügt.

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Claims

Verfahren zur kovalenten Bindung eines DNA-Stranges an einen RNA-Strang, umfassend: (a) Herstellen eines Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukts durch Inkubation eines DNA-Spaltungssubstrats, das eine Topoisomerase-Spaltstelle umfasst, mit einer für diese Stelle spezifischen Topoisomerase, wobei das Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt ein oder mehr 5'-Einzelstrangschwänze besitzt; und (b) Zugeben eines RNA-Akzeptorstranges, der zu dem 5'-Einzelstrangschwanz komplementär ist, zu dem Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt unter Bedingungen, die eine Ligierung des kovalent gebundenen DNA-Stranges des Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukts an den RNA-Akzeptorstrang erlauben, und Abspalten der Topoisomerase, wodurch der DNA-Strang kovalent an den RNA-Strang gebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das DNA-Spaltungssubstrat durch die Hybridisierung eines DNA-Stranges, der eine Topoisomerase-Spaltstelle besitzt, an einen komplementären DNA-Strang hergestellt wird, wodurch ein DNA-Spaltungssubstrat mit einer Topoisomerase-Spaltstelle und einer austretenden Oligonucleotidgruppe, die 3' zu einer spaltbaren Bindung liegt, gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das DNA-Spaltungssubstrat ein Plasmidvektor ist, der eine Topoisomerase-Spaltstelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Topoisomerase-Spaltstelle eine Sequenz darstellt, die CCCTT umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Topoisomerase ein Vaccinia- Topoisomerase-Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der DNA-Strang, der eine Topoisomerase-Spaltstelle umfasst, radioaktiv markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die radioaktive Markierung ³²P oder ein Radiohalogen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der DNA-Strang mit einer Topoisomerase-Spaltstelle mit einer Biotin-Einheit markiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Topoisomerase-gebundene DNA-Zwischenprodukt und der RNA-Akzeptorstrang in vitro ligiert werden.
Verfahren zum Markieren eines 5'-Endes eines RNA-Moleküls, umfassend: (a) Herstellen eines Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukts durch Inkubation eines DNA-Spaltungssubstrats, das eine Topoisomerase-Spaltstelle umfasst, mit einer für diese Stelle spezifischen Topoisomerase, wobei das Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukt ein oder mehr 5'-Einzelstrangschwänze besitzt; und (b) Zugeben eines RNA-Moleküls mit einem 5'-Hydroxylterminus, das zu dem 5'-Einzelstrangschwanz komplementär ist, zu dem Topoisomerase-Zwischenprodukt unter Bedingungen, die eine Ligierung des kovalent gebundenen DNA-Stranges des Topoisomerase-DNA-Zwischenprodukts an das RNA-Molekül erlauben, und Abspalten der Topoisomerase, wodurch ein am 5'-Ende markiertes DNA-RNA-Ligierungsprodukt entsteht.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das RNA-Molekül mit dem 5'-Hydroxylterminus das Produkt einer in-vitro-Synthese oder Isolierung von Zellen oder Geweben ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das RNA-Molekül nach der Synthese oder Isolierung dephosphoryliert wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Dephosphorylierung durch eine Behandlung des RNA-Moleküls mit alkalischer Phosphatase erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das DNA-Spaltungssubstrat durch Hybridisieren eines DNA-Stranges, der eine Topoisomerase-Spaltstelle besitzt, mit einem komplementären DNA-Strang hergestellt wird, wodurch ein DNA-Spaltungssubstrat mit einer Topoisomerase-Spaltstelle und einer austretenden Oligonucleotidgruppe, die 3' zu einer spaltbaren Bindung liegt, gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Topoisomerase ein Vaccinia-Topoisomerase-Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Spaltstelle die Sequenz CCCTT umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die DNA eine Markierung am 5'-Ende umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Markierung am 5'-Ende eine Biotin-Einheit, eine Chitin-Bindungsdomäne oder eine Glutathion-S-Transferaseeinheit ist.
Verfahren nach Anspruch 17, weiterhin umfassend das Immobilisieren der am 5'-Ende markierten DNA auf einem festen Träger vor Zugabe des RNA-Moleküls mit dem 5'-Hydroxylterminus.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der feste Träger Streptavidin, Avidin, Chitin oder Glutathion umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19, weiterhin umfassend das Reinigen eines biotinylierten DNA-RNA-Ligierungsproduktes mit markiertem 5'-Ende durch Abtrennen des festen Trägers, an dem das DNA-RNA-Ligierungsprodukt mit markiertem 5'-Ende immobilisiert ist, von einer flüssigen Phase, die unmodifizierte RNA umfasst.
Verfahren zum Isolieren eines mRNA-Polynucleotids mit voller Länge, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Inkontaktbringen einer RNA-Probe mit einem Mittel, das die 5'-Cap-Struktur der mRNA entfernt, unter Bedingungen, die die Entfernung der Cap-Struktur durch das Mittel erlauben; (b) Inkontaktbringen der Probe aus Schritt (a) mit einem Dephosphorylierungsmittel unter Bedingungen, die die Dephosphorylierung der mRNA ohne Cap-Struktur durch das Mittel erlauben; (c) Inkontaktbringen der Probe aus Schritt (b) mit einem DNA-Topoisomerasekomplex, wobei der DNA-Anteil eine Affinitätsmarkierung besitzt, unter Bedingungen, die die Ligierung der DNA mit der RNA durch die Topoisomerase erlauben; und (d) Affinitätsreinigen des DNA-mRNA-Ligierungsprodukts aus Schritt (c), wodurch das mRNA-Polynucleotid mit voller Länge isoliert wird.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die DNA aus Schritt (c) weiterhin eine bekannte Sequenz umfasst, die zum Verbinden mit einem Oligonucleotidprimer geeignet ist, wobei der Primer zur Verwendung in einer durch Polymerasekettenreaktion katalysierten Amplifikation von DNA geeignet ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei cDNA von dem DNA-mRNA-Ligierungsprodukt durch ein durch Polymerasekettenreaktion katalysiertes Verfahren synthetisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei in der Polymerasekettenreaktion ein Sense-Primer, der zu einem Teil der DNA-Sequenz des DNA-mRNA-Ligierungsprodukts komplementär ist, und ein Antisense-Primer, der entweder zu einem 3'-Poly(A)-Schwanz oder einer zur mRNA-Sequenz der Ligierungsproduktes internen Sequenz komplementär ist, verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Mittel aus Schritt (a) eine Pyrophosphatase ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Mittel über Periodatoxidation und Beta-Eliminierung wirkt.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Mittel aus Schritt (b) alkalische Phosphatase ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die DNA aus Schritt (c) weiterhin eine Erkennungsschnittstelle für eine ortsspezifische Restriktionsendonuclease umfasst.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Topoisomerase eine Vaccinia-DNA-Topoisomerase ist.
Verfahren nach Anspruch 24, weiterhin umfassend das Einfügen der synthetisierten cDNA in einen Expressionsvektor.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die DNA aus Schritt (c) einen linearisierten Expressionsvektor umfasst.