JPH05505937A - 一本鎖ｄｎａの部位特異的切断 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 一本鎖ＤＮＡの部位特異的切断 ［発明の背景］ この発明は、全米健康協会の研究助成により行なわれた（承認番号０Ｍ２８０３ ９号）。米国政府はこの発明に権利を有する。

この発明は一本鎖デオキシリポ核酸（ＤＮＡ）の切断方法に関する。

ゾイグおよびシチ、２３１巻、サイエンス、４７０頁、１９８６年は、現在リボ ザイムと呼ばれる、ある種のリボ核酸（ＲＮＡ）分子は、−末鎖ＲＮＡ分子の切 断と結合を触媒することができることを述べている。この活性は、リボヌクレオ チドに特異的であるように見える。デオキシリボヌクレオチド類では反応は見ら れない。しかし、５つのデオキシリボシトシン残基（ｄＣ，）の鎖は５つのシト シン残基（Ｃ６）の鎖の切断の完全な阻害剤である。

シチ、２３６巻、サイエンス、１５３２頁、１９８７年は、混合オリゴヌクリオ チド（リボ−およびデオキシリボーヌクレオチドの両方を含む）の切断を記載し ているが、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの間の切断のみが 見られる。。切断は２つのデオキシリボヌクレオチド残基の間で見られない。

スギモトら、１７巻、ヌクレイツク・アシド・リサーチ、３５５．３６８頁、１ ９８９年は、環状ＲＮＡ分子が、１つ以上のデオキシヌクレオチドを含み得るジ ヌクレオチドの添加によって開かれる反応を記載している。ジヌクレオチドはＲ ＮＡ分子に添加され、環は単一フラグメントを形成するために開かれる。ＤＮＡ の切断は記載されていない。

［発明の要約コ この発明は、−末鎖ＤＮＡ分子を特異的に切断する方法を示す。この方法は、い かなるタンパク質からも独立したデオキシリボヌクレアーゼ活性をもつＲＮＡ分 子（すなわち、リボザイム）を提供すること、およびそのＲＮＡ分子を一本鎖Ｄ ＮＡ分子に接触させて一本鎖ＤＮＡ分子が切断されることを引き起こすことを含 む。この方法中、線状ＤＮＡ分子は２つ以上のＤＮＡフラグメントを形成するた めに切断され、環状ＤＮＡ分子は１つ以上のＤＮＡフラグメントを形成するため に切断される。これらのフラグメントは、自由分子としてリボザイムから遊離さ れる。

「特異的な切断」とは、ＲＮＡ分子が一本鎖ＤＮＡ分子の１つまたはほんの数個 の短いヌクレオチド配列で活性であることを意味する。このような配列は、３か ら８、一般に約４から６のデオキシヌクレオチドの長さをもつ。切断される特異 的配列は、例えばシチら、ＰＣＴ出願ＷＯ３８１０４３００号、ノ＼ゼロフおよ びゲルラッハ、３３４巻、ホーチャー５８５頁、１９８８年、ビーンおよびシチ 、４７巻　セル　２０７頁、１９８６年、およびノ１ゼロフら、ＰＣＴ出願ＷＯ ３９１０５８５２号などによって記載されている既知の方法である、ＲＮＡ分子 の活性部位の割合を変えることによって選択され得る。−末鎖ＤＮＡ分子は、少 なくとも４つ、好ましくは８つのデオキシヌクレオチドの近接配列をもつ分子を 含む。このような分子は、他のＤＮＡまたはＲＮＡ分子、またはそのハイブリツ ドに結合され得る。

好ましい具体例において、この方法は、１時間に少なくとも１％のＤＮＡ分子数 の切断をもたらすのに十分な濃度、最も好ましくは少なくとも１０％のこのよう なりＮＡ分子の切断をもたらすのに十分な濃度の反応培地中のＲＮＡ分子を提供 することを含む。反応培地は一般に例えば０．１μＭから１０μＭなどの望まし い濃度のＤＮＡ分子を含み、６．０から９．５のｐＨ１２０℃から７０℃の温度 に保たれる。ＲＮＡ分子は一般に０．１μＭから１００μＭの濃度で提供される 。

ＲＮＡ分子は好ましくはＲＮＡ分子を切断して３′−ヒドロキシル基を残すもン （ランポウイッツ、５６巻　セル　３２３頁、１９８９年、ピープルら、４４巻 　セル　２１３頁、１９８６年、パン・デル・ベーンら、４４巻　セル　２２５ 頁、１９８６年、およびヤレルら、２６３巻　ジャーナル・オブ・）くイオロジ カル・ケミストリー、３４３２頁、１９８８年）、またはりボヌクレアーゼ　Ｐ （アルドマン、アトパンシーズ・イン・エンザイモロジー・アンド・リレーティ ラド・エリアズ・オブ・モルキュラー・バイオロン−１１，１９８９年）、また はその誘導体から選択されるＲＮＡ分子の活性部位を切断するデオキシリボヌク レアーゼを含む。さらに好ましくは、ＲＮＡ分子は、Ｌ−１９、Ｌ−２１、また はその誘導体である。さらに好ましくは、ＲＮＡ分子は、例えば、Ｔ、サーモフ ィラなどのテトラヒメナの介在配列（ＩＶＳ）の誘導体であり、ＲＮＡ分子はＬ −１９、Ｌ−２１、またはその誘導体である。

「誘導体」はデオキシリボヌクレアーゼ活性をもつ既知のりボザイムの活性部位 をもつＲＮＡ分子を意味する。この活性部位は、特異的に目的の一本鎖ＤＮＡ配 列を切断するために変えられ得る。このようなＲＮＡ分子は、デオキシヌクレア ーゼ活性に必要なりポザイムの重要な部分のみを含む必要がある。このようなり ボザイムは、どの番号の標準技法の使用によっても当技術の熟練者により容易に 作られ得る。

他の好ましい具体例において、接触段階はさらに、マグネシウムイオンを提供し 、グアノシン、グアノシン−リン酸、グアノシンニリン酸またはグアノシンニリ ン酸、または例えばグアノシンを含むジヌクレオチドなどの部分を含む別のグア ノシンを提供し、接触段階の前にＤＮＡ分子をグリオキシル酸またはグリオキサ ルなどの変性原で処理することを含む。この方法はさらに、ＲＮＡ分子のＤＮＡ 分子との反応を止めるために例えばＥＤＴＡなどのマグネシウムイオンのキレー ト剤を提供することを含む。

さらに他の好ましい具体例において、ＲＮＡ分子は、−末鎖ＤＮＡ分子上の切断 部位に相補的な一本鎖ＤＮＡの結合部位を含む。この方法は、各々が異なる結合 部位をもつ複数のＲＮＡ分子を提供する事を含む。この方法はさらに、ゲルマト リックス内の電気泳動による切断ＤＮＡフラグメントを分離することを含む。

この発明は一本鎖ＤＮＡ分子が特異的に切断され得る方法を提供する。このよう な方法は、それがＤＮＡ内の特異的切断部位またはヌクレオチド配列のマツピン グを可能にするので有用である。特異的ＤＮＡ部位の決定の従来の方法（よ、Ｉ Ｉ限エンドヌクレアーゼでの２本鎖ＤＮＡの消化を含む。このような制限エンド ヌクレアーゼは特異的配列で活性であるが、それらの特異性は容易に変更され得 ない。さらに、いかなる制限エンドヌクレアーゼも切断することが知られてし１ なし）多くのＤＮＡ配列がある。それと対照的に、リボザイムは目的の一本１１ １ＤＮＡ配列を切断するために容易に変更され、合成され得、したがって、確認 される部位における殆ど制限のないＤＮＡ分子を特性化するのに使用され得る。

この方法は一本鎖ＤＮＡの切断に限られるが、二本鎖ＤＮＡは、最初番：変性さ れ一本鎖ＤＮＡを形成する場合、この方法中で使用され得る。この方法はヒトま たは他の組織のゲノムマツピングをするのにインビトロで非常に有用である。さ らに、リポザイムは一本鎖ＤＮＡを切断するのにインビボで使用され得る。例え ば、−末鎖ＤＮＡの切断の高い活性をもつりポザイムは、−末鎖ＤＮＡウィルス を切断するのに使用され得、したがってそれらの感染力およびそれらが起こす病 気の徴候を低下させる。

この発明の他の特徴および利点は、好ましい具体例の下記の記載および請求項か ら明かになろう。

［好ましい具体例の記述］ 図面は最初に簡単に記載される。

図 図１は、この発明のりポザイムのデオキシリボヌクレアーゼ反応を図表にしたも のである。

図２および３は、リボザイムのデオキシリボヌクレアーゼ活性を示すポリアクリ ルアミドの写真である（図２においてレーンは下記の、左方から出発するレーン １−８を指す）。また、 図４はりポザイムと一本鎖ＤＮＡ基質との反応の時間経過の図示である。

リポザイム 前記で論じたように、デオキシリボヌクレアーゼ活性をもつりボザイムがこの発 明において使用され得る。一般に、有用なりボザイムは、ＲＮＡ分子を切断して 、２’　、３’環状ホスフアートではな（３°−ヒドロキシル基、または３゛ホ スフアートを残すものである。これらのりポザイムは単離され得、シチら、ＰＣ Ｔ（前記）、ランポウイッツ（前記）、およびパン・デル・ベーン（前記）によ って記載されたように、誘導体を提供するために変更され得る。天然に発生する りボザイムの誘導体の広範囲な群のいずれもが、この発明において有用であり、 その全てが当技術の通常の熟練者によって容易に分離され得る。例えば、シチら 、ＰＣＴ、前記、テトラヒメナ・サーモフィラのりポザイムは、その活性部位が 様々なＲＮＡ配列のＲＮＡ分子を切断するのに有効であるように容易に分離され 得る。同様に、このリボザイムは、様々なりＮＡ配列をもつＤＮＡ分子を切断す るよう変更され得る。このような変更は中心部位の突然変異誘発、または同等の 方法により行なわれ得る（例えばマーフイおよびシチ、プロシージャー・オブ・ ナシ這ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、ＵＳＡ、１９９０年参照）。一般 に、活性部位は、切断される塩基配列に相補的な塩基配列をもつように作られる 。つまり、４つの塩基のうち少なくとも３つが塩基対を形成するよう配置される 。例えば、ＡはＴまたはＵに相補的であり、塩基対合し、ＧはＣまたＵに相補的 であり、塩基対合する（Ａ、Ｔ、Ｕ、ＣおよびＧはそれぞれアデニン、チミン、 ウラシル、シトシン、およびグアニンの標準記号である）。さらに、リポザイム の様々な割合の欠失または付加、または他の手段による突然変異は、それらのデ オキシリボヌクレアーゼ活性を保つか好ましくは増大している、より小さいかま たはより大きいりボザイムを作るのに使用され得る。このような変更は当技術の 通常の技術の範囲内にあり、いかなる不当な実験作業もそれらのりボザイムのう ちのどれが活性であるかを決定するのに必要でない。このようなりポザイムは単 に、例えば下記のように、それらがこの発明で有用であるために十分なデオキシ リボヌクレアーゼ活性をもつかどうかを決定するために、ＤＮＡ切断プロトコー ル中で作られ、試験される必要がある。

一般に、この発明で有用なりボザイムは、下記の条件下で少なくとも１時間に１ ％、好ましくは１０％以上のＤＮＡ分子数が切断されるのに十分な反応培地中の 濃度で提供され得るものである。ＤＮＡの濃度に対するリボザイムの濃度の比率 はりボザイムおよびＤＮＡのよって変わり得、一般に１：１０’から１０００＝ １、好ましくは１：１０および１０００　：　１の望ましい比率であり得る。Ｄ ＮＡに対するリポザイムの比率が高くなればなるほど反応は速く進む。しかし、 高い比率はりボザイムのムダ使いであり、使用される必要はない。使用されるリ ボザイムは、−末鎖ＤＮＡ基質がリボザイムから遊離される１、２またはそれ以 上のフラグメントに切断するように作られることが大切である。リポザイムは、 別のＤＮＡ分子を再循環し切断することができるようにこの方法によって変えら れないことも重要である。

インビボでの使用のために、インビボの優勢な状況下でより高いデオキシリボヌ クレアーゼ活性をもつりポザイムをもつことが望ましい。この目的のために、３ ７℃で１時間に少なくとも１０％のＤＮＡ分子数を切断する活性をもつりボザイ ムが望ましい。

テトラヒメナ・サーモマイラ中に天然に発生するＲＮＡの合成変形の変更が記載 されているが、この例は、当技術の通常の熟練者が、この発明で有用なりボザイ ムを提供するために容易に他のグループＩまたはグループＩＩのリポザイム、ま たはりボヌクレアーゼＰを変えることができるのでこの発明を制限するものでは ない。

一本鎖ＤＮＡの切断のためのインビトロでのりボザイムの使用の実施例を下記に 挙げる。これらの実施例はこの発明を説明するためにのみ提供されるものであっ て、発明の範囲を限定するものではなく、当技術の熟練者は、この発明が下記に 請求されるように広範囲に実施され得ることを認めるであろう。

図１では、出願者は、リボザイムによる一本鎖ＤＮＡの切断の一般モデルを提案 している。このモデルは出願者のこの反応についての現在の理解を説明するため のものであって、発明の範囲を限定するためのものではない。この実施例は具体 的には、テトラヒメナ・サーモフィラリポザイムにおけるＲＮＡの合成ＲＮＡ変 形のデオキシリボヌクレアーゼ活性に関する。この合成変形はりボザイムである 。図１において、Ｌ−２１ＳｃａＩリポザイム（ゾイグら、２７巻、バイオケミ ストリー、８９２４頁、１９８８年）とＤＮＡ基質１８（デオキシ−〇ＣＣＬ’ ＣＵλ５）とのデオキシリボヌクレアーゼ反応が示されている。全段階は入れ替 え可能である。オリゴヌクレオチド基質１８の前のグアノシン（Ｇ）の結合が簡 単に示されている。２つの結合部位（基質およびＧ結合部位）は、どの添加の順 序も起こり得るように全く独立している。リボザイム（斜線部、ＧＧＧＡＧＧ− ５゛）の配列５′は、５′工クソン結合部位１２と呼ばれるが、塩基の対合によ る基質の認識に関与している。

図１に関してさらに、リボザイム１０は基質結合部位１２およびグアノシン結合 部位１４をもつことが提案されている。グアノシン残基（Ｇ）は部位１４と結合 している。つぎにリボザイムの活性部位１２は基質と相互作用して２０に示され ているような構造を形成する。構造２０におけるリボザイム１０は基質１８の切 断を起こして、付着したグアノシン残基（Ｇ　ｄ　Ａｓ）をもつデオキシＡ５鎖 および、リボザイム１０を再生するための残部の基質（ｄＣＣＣＵＣＵ、、）を 遊離する。このように、リポザイム１０は、各基質の切断とそれに続く切断の結 果起るフラグメントの遊離を起こすどの番号の基質にも作用することができるの で触媒として作用する。

Ｔ、サーモフィラのＬ−２１５ｃａＩ 図２では、リボザイムＬ−２１ＳｃａＩによって触媒されたＤＮＡオリゴヌクレ オチド基質のデオキシヌクレオチド切断反応の結果が示されている。リボザイム は標準的方法（ゾイグら、２７巻、バイオケミストリー、８９２４頁、１９８８ 年）によって形成された。基質、デオキシＣＣＣＵ　ＣＵ　Ａ　ｓは約２ナノモ ルの濃度であり、５゛末端で３２Ｐを標識した。これはアプライド・バイオサイ エンシズ・ＤＮＡ合成器で合成した。この基質に２ナノモルの濃度で１ミクロモ ルのし一２１８ｃａｌリボザイム（前掲）を８００ミクロモルのＧ、５０ミリモ ルのＭＥＳ（緩衝液）、ｐＨ７，０、および１０ミリモルのＭｇＣ１、の存在下 で、５０℃で１５時間、インキュベートした（レーン４）。同じ反応をＧなしで （レーン５）、Ｇの代わりに８００ミクロモルのＡＴＰ　（レーン５）、ＭｇＣ ｌ２なしで（レーン７）、およびリボザイムなしで（レーン８）行なった。レー ン２（ま基質のみを示し、レーン３は推定生成物、デオキシ”Ｐ−ＣＣＣＵＣＵ を示す。レーン１は、１ミリモルのトリス、ｐＨ７，５，２ミリモルの塩化亜鉛 、０．１ミリモルのＥＤＴＡ、および１ミクロリツトルにつき０．　１ミクログ ラムのｔＲＮＡ中の１ミクロリツトルにつき０．２単位のＰＩヌクレアーゼによ る、３７℃で６０分間の基質の消化による生成物を示す。

リポザイム反応を、５０℃で１０分間のりポザイム、緩衝液、およびＭｇＣｌ２ のブレインキュベーションの後、ＤＮＡ基質の添加により始めた。反応を０℃で ＥＤＴＡおよび尿素で終了させ、ゾイグら（前掲）により記載された、２０％の 変性ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動にかけた。

ＤＮＡ基質をこのリポザイムと類似のＲＮＡ基質と同じ位置で特異的に切断した 。単一標識生成物をこのＤＮＡ基質から作る。この生成物はデオキシ５２ｐ−Ｃ ＣＣＵＣＵ　（レーン３）およびＤＮＡ基質のＰＩヌクレアーゼ消化からの適当 な生成物（レーン１）と共に移動する。Ｍｇ”；ｉ必要である。ＡＴＰ　（アデ ノシントリホスファート）はＧと置換できず（レーン６）、ＧＴＰ（グアノシン トリホスファート）はＧと置換できず（図示なし）、それの各々もまた、ＲＮＡ 基質との反応の性質である。少量の生成物がＧの添加なしに形成される（レーン ５および６、より長い照射線量で見られる）。これはＧなしにおこるＲＮＡ基質 の遅（１加水分解と類似している。デオキシ−”Ｐ−ＣＣＣＵＣＵＡと同様の実 験もまた、リポザイムの存在によるＵとＡの間の特異的な切断を生む。

図３では、３゛末端で標識されたＤＮＡ基質を使って、グアノシン・コファクタ ーが３゛−生成物フラグメントに共有的に添加されたことを示した。デオキシ− ＣＣＣＵＣＵＡ、ｓ！Ｐ−３’　ｄＡ　Ｃ２ｆ−）モル、末端転移酵素ノ存在下 テテオキシーＣＣＣＵ　ＣＵ　Ａ　ｓと［α−”　Ｐ〕３’　ｄＡＴＰとの反応 によって作られた）に４時間、４ｕＭ　Ｌ−２１Ｓｃａｌリボザイム、５０ｍＭ のＭＥＳ、ｐＨ７．０、および１０または１００ｍＭのＭ　ｇ　Ｃ１２をインキ ュベートした。１アリコートをＥＤＴＡおよび尿素で終了させ（図３で“−”と 示されている）、他を３７℃で１時間０．０５Ｕ／μｍのリボヌクレアーゼＴＩ で処理した（図３で“＋“と示されている）。レーン３および４は１ｍＭのＧお よび１０ｍＭのＭｇＣ＋、の反応を示す。レーン５および６は１μＭのＧおよび １００ｍＭのＭｇＣ１，の反応を示す。レーン１１および１２は１ｍ、ＭのＧＴ Ｐおよび１００ｍＭのＭｇＣ１，の反応を示す（反応は、ＭｇＣｌ２の濃度が高 いほど速い）。レーン７および８はリボザイムなしで１ｍＭのＧＴＰおよび１０ ０ｍＭＣＱＭｇＣ１□をインキュベージコンしたものである。レーン１およびレ ーン１０は基質のみを示し、レーン２および９はデオキシ−Ａｓ”Ｐ３°　ｄＡ （Ｍ）を示す。デオキシ−ＣＣＣＵＣＵＡｓｐ”Ｐ−３’　ｄＡとＧＴＰの反応 からの生成物（レーン１１）は、Ｇとの反応からの生成物（レーン３および５、 条件は前記と同様、グアノシンコファクターなし、ＭｇＣ１，なし、またはりポ ザイムなしにはいかなる生成物も見られない）よりもポリアクリルアミドゲル中 で速く移動した。ＧＴＰおよびＧとのりポザイムの反応（レーン４．６および１ ２）からの生成物は、リボヌクレアーゼＴ１による処理の後共に移動したが、こ れは３′−ホスホリル基をもつ（リポ）−グアノシン残基にならって切断する。

ＴＩ処理により形成された新規生成物は、図１で概要を述べた機構から予測され るように、□。ｄＡ５”　Ｐ３’　ｄＡ、□（レーン２および９）と共に移動し た。

ＤＮＡエンドヌクレアーゼ反応は触媒作用的である。例えば、２５μＭのＤＮＡ 基賀（デオキシＣＣＣＵ　ＣＵ　Ａ　ｓ　）と微量（約１ｎＭ）の５°末端標識 基質の反応混合物を０．５５μＭのりポザイムおよび８００μＭのＧに２０時間 インキュベートした。欅！！ＤＮＡの５％を生成物に転換したが、これは２回以 上の繰返しに相当する。

図４には、デオキシ”Ｐ　ＣＣＣＵＣＵＡｓ　（２ｎＭ）と１．１マイクロモル のりボザイム、８００マイクロモルの０１５０ミリモルのＭＥＳ、ｐＨ７、およ び１０ミリモルのＭｇＣ１，，５０℃からの生成物の形成の時間経過が示されて いる。反応を終了させ、生成物を変性ゲル電気泳動によって分離し、ＡＭＢ　Ｉ 　Ｓ放射分析スキャナーで定量した。グラフかられかるように、これらの条件下 で、はぼ１％の生成物を３０−５０分毎に放出する。

ＤＮＡ基質は、対応するＲＮＡ基質よりもリボザイムとの低い親和力およびより 緩慢な反応度合をもつ。内部誘導配列の延長は、結合を促進し、ＤＮＡエンドヌ クレアーゼ反応の割合を増すことができる。

使用 前記で論じたように、この発明の方法は、−重鎖ＤＮＡ分子中の特異的ＤＮＡ配 列の位置を決定するのに有用である。この分析は、制限エンドヌクレアーゼタン パク質および２本鎖ＤＮＡを使用する制限エンドヌクレアーゼマツピングと類似 している。一般に、２本鎖ＤＮＡ分子は変性され、変性から生まれる一本鎖ＤＮ Ａ分子は、適当な条件下（例えば前記のような）でリポザイムと接触させて、ゲ ルマトリックス中で分離され得る１、２個またはそれ以上の一末鎖ＤＮＡフラグ メントを生成する。生成したフラグメントの大きさは、一本ＭＤＮＡ分子中の特 異的ＤＮＡ部位の位置を反映する。

ＤＮＡのそれぞれのアリコートを、様々な切断部位の位置が決定できるように様 々なりポザイムで処理し得る。いくつかの実験においては、ＤＮＡを２またはそ れ以上のりポザイムと接触させることが有用であり得る。またはＤＮＡを１つの りボザイムと接触させ得、第一のりボザイムを除去した後に第二のりポザイムと 接触させ得る。

この発明の方法は、細胞内または細胞の周囲の培地で、−重鎖ＤＮＡをインビボ 条件下で活性なりボザイムと接触させることによって、インビボで使用し得る。

別法として、インビボで目的のりボザイムを生成するためにＤＮＡ分子の発現を 起こす方法でのＤＮＡ分子の細胞への形質転換により、リボザイムをインビボで 合成し得る。次にそのリポザイムは細胞内の一本鎖ＤＮＡを切断するために活性 であり得る。

他の具体例は下記の請求項中にある。

日Ｇ、２ ＦＩＧ、３ 生成物５− 要約書 一本鎖ＤＮＡ分子を特異的に切断する方法。この方法はタンパク質から独立した デオキシリボヌクレアーゼ活性を有するＲＮＡ分子を提供し、このＲＮＡ分子を 一本鎖ＤＮＡ分子と接触させ、一本ＤＮＡ分子に切断を生じさせることを含む国 際調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）タンパク質から独立したデオキシリボヌクレアーゼ活性をもつＲＮＡ 分子を提供すること、および （ｂ）前記ＲＮＡ分子を前記一本鎖ＤＮＡ分子に接触させてこの一本鎖ＤＮＡ分 子が切断されるようにする段階を含む、一本鎖ＤＮＡ分子を特異的に切断する方 法。
2. ２．さらに、１時間にＤＮＡ分子数の少なくとも１％の切断を引き起こすのに十 分な濃度の反応培地中の前記ＲＮＡ分子を提供することを含む、請求項１記載の 方法。
3. ３．さらに、１時間にＤＮＡ分子数の少なくとも１０％の切断を引き起こすのに 十分な濃度の反応培地中の前記ＲＮＡ分子を提供することを含む、請求項１記載 の方法。
4. ４．さらに、３′−ヒドロキシル基を残すようにＲＮＡ分子を切断するものから 前記ＲＮＡ分子を選択することを含む請求項１記載の方法。
5. ５．前記ＤＮＡ分子が、グループＩまたはグループＩＩイントロン、リボヌクレ アーゼＰ、またはその誘導体から選ばれる、ＲＮＡ分子の活性部位を切断するデ オキシリボヌクレアーゼを含むものである、請求項４記載の方法。
6. ６．前記ＲＮＡ分子がテトラヒメナの介在配列の誘導体である、請求項４記載の 方法。
7. ７．ＲＮＡ分子がＬ−１９、Ｌ−２１、またはその誘導体である、請求項５記載 の方法。
8. ８．前記の接触段階がさらにＭｇ２＋イオンを含む、請求項１記載の方法。
9. ９．前記の接触段階がさらにグアノシンまたはグアノシントリホスファートをを 含む請求項１記載の方法。
10. １０．さらに、前記のＲＮＡ分子の前記のＤＮＡ分子との反応を止めるために前 記Ｍｇ２＋イオンのキレート剤を有する段階を含む請求項８記載の方法。
11. １１．前記のキレート剤がエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）である、請 求項１０記載の方法。
12. １２．前記のＲＮＡ分子が一本鎖ＤＮＡの結合部位を含み、その結合部位が、前 記の一本鎖ＤＮＡ分子上の切断部位に近接したヌクレオチドに相補的である、請 求項１記載の方法。
13. １３．さらに、一本鎖ＤＮＡの様々な結合部位をもつ多数のＲＮＡ分子を提供す ることを含む請求項１２記載の方法。
14. １４．さらに、２つ以上のＤＮＡフラグメントをゲル内の電気泳動により分離す ることを含む請求項１２記載の方法。