CN102614532A - 一种多功能肿瘤成像剂、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一种多功能肿瘤成像剂、制备方法及应用，属于肿瘤成像剂领域。它具备肿瘤靶向性、磁共振成像和抗肿瘤的特性。以Fe3O4为核，通过微乳液方法制备了包裹荧光染料异硫氰酸罗丹明B和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、二氧化硅为壳的纳米颗粒。SiO2的表面修饰了肿瘤靶向肽RGD及甲氧基聚乙二醇，最终得到了一种肿瘤靶向性多功能的纳米复合成像剂。具有肿瘤靶向肽诱导的肿瘤细胞主动靶向性，可以用于肿瘤细胞与正常细胞的磁共振成像鉴别剂，可运用于临床磁共振成像监测治疗用药，实现肿瘤治疗过程的时时监测，而目前临床运用的抗肿瘤药物仅具有肿瘤抑制性能，无法实现药物治疗过程的实时监测。
Description
技术领域
本发明涉及一种多功能肿瘤成像剂及其制备技术，属于肿瘤成像剂领域，特指靶向性肿瘤成像剂及其制备方法和应用。
背景技术
由于肿瘤细胞的过度增殖和对正常组织的侵犯、转移，癌症成为威胁人类健康的严重疾病。然而目前在临床肿瘤诊断和治疗中广泛应用的药物多为非选择性药物，体内分布广泛，常规治疗剂量即可对正常组织器官产生显著的毒副作用，导致患者不能耐受，故提高药物的肿瘤选择性，减少其在非靶向部位的聚集是提高抗肿瘤药物疗效的关键。靶向性药物能最大限度地进入到靶区，并在靶区浓集，直接作用于病变组织、器官和细胞，延长药物与靶部位的作用时间，使到达需药部位的药量增加，从而减少用药量、药物的毒副作用，达到高效低毒的治疗效果。生物靶向纳米药物和磁性靶向纳米药物（Cho H S, Dong Z Y, Pauletti G M, Zhang J M, Xu H, Gu H C, Wang L M, Ewing R C, Huth C, Wang F, Shi D L. Fluorescent, superparamagnetic nanospheres for drug storage, targeting, and imaging: a multifunctional nanocarrier system for cancer diagnosis and treatment, ACS Nano, 2010, 4(9):5398-5404）是目前靶向纳米药物研究的两大热点，其中具有核壳结构的纳米颗粒（Gao J H, Liang G L, Cheung J S. Multifunctional yolk-shell nanoparticles: a potential MRI contrast and anticancer agent, J. Am. Chem. Soc., 2008, 130:11828-11833）引起了人们的关注，二氧化硅具备良好的生物安全性，表面的硅羟基易于修饰，可与各种生物分子通过多种方式偶联且不会对生理活动造成危害。使得二氧化硅包覆的纳米颗粒(Jiang S, Gnanasammandhan M K, Zhang Y. Optical imaging-guided cancer therapy with fluorescent nanoparticles, J. R. Soc. Interface, 2010, 7:3-18)在核壳结构的纳米粒子中脱颖而出。
发明内容
本发明报道了一种新型多功能的纳米复合成像剂，它具备肿瘤靶向性、磁共振成像和抗肿瘤的特性。以粒径20 nm磁性纳米四氧化三铁（Fe3O4）为核，通过微乳液方法制备了包裹荧光染料异硫氰酸罗丹明B（RBITC）和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、二氧化硅为壳的纳米颗粒（RBITC-Fe3O4SiO2， 其中表示核壳结构）。接着在SiO2的表面修饰了肿瘤靶向肽精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸 (RGD)及甲氧基聚乙二醇（PEG），获得肿瘤靶向纳米多孔药物载体（RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD)； 最后将顺磁性抗肿瘤配合物二氯N-（2-丙酸乙酯基）-N，N-二（2-吡啶甲基）胺合锰（简写为LMnCl）吸附到多孔药物载体中最终得到了一种肿瘤靶向性多功能的纳米复合成像剂（LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD）。
一种多功能肿瘤成像剂，其结构式为LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD，其中LMnCl为二氯N-（2-丙酸乙酯基）-N，N-二（2-吡啶甲基）胺合锰，RBITC为异硫氰酸罗丹明B，RGD为精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸三肽，PEG为甲氧基聚乙二醇, 其中表示核壳结构。
上述一种多功能肿瘤成像剂的制备方法，按照下述步骤进行：
（1）将Fe3O4和四甲氧基硅烷（TEOS）以质量比1：1～1：6，混合并超声分散于三氯甲烷，其中Fe3O4与三氯甲烷质量比1：1～1：10，再加入Fe3O4的量 0.1～1.0 倍的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）水溶液，接着加入水和1～5 M的NaOH溶液；其中水与TEOS的质量比例1：1～1：10，其中NaOH与TEOS的质量比例1：2～1：10，温度控制在30～70 oC制成溶液A；将TEOS和 RBITC按照质量比4：1～ 1：1，混合后制成溶液B；将溶液B加入溶液A中，再加入乙酸乙酯，其中乙酸乙酯用量为反应液体积的5%～40%，反应1～30 min后加入氨丙基三乙氧基硅烷（APS），其中APS：Fe3O4质量比为10：1～1：1，搅拌反应1～5 h，磁性分离，固体用乙醇和水各洗2次得荧光染料异硫氰酸罗丹明B（RBITC）和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、二氧化硅为壳的纳米颗粒（RBITC-Fe3O4SiO2， 其中表示核壳结构）。
（2）将精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸三肽(RGD)、1,3-二环己基碳二亚胺（DCC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）混合，其中RGD：DCC：NHS质量比为1：5：2～1：1：4，加入一定量的DMF至固体刚好溶解，其中质量比DMF：NHS为2：1～8：1，溶液在常温下搅拌反应10～36 h；再加入上述干燥后的固体RBITC-Fe3O4SiO2，继续搅拌反应10～36 h；结束反应，磁性分离得表面修饰RGD的荧光染料异硫氰酸罗丹明B（RBITC）和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、二氧化硅为壳的纳米颗粒（RBITC-Fe3O4SiO2-RGD）。
（3）称取甲氧基聚乙二醇酸溶于DMF制成饱和溶液中，其中甲氧基聚乙二醇酸：RBITC-Fe3O4SiO2-RGD的质量比为4:1～1:2，再依次加入DCC和NHS，其中质量比DCC:NHS: 甲氧基聚乙二醇酸为3:3:1～3:2:4，让其在常温下搅拌反应10～36 h；再将RBITC-Fe3O4SiO2-RGD加入其中，常温搅拌反应10～36 h后加入一定量的乙醇超声分散5分钟，其中与RBITC-Fe3O4SiO2-RGD的质量比为1：1～6：1；然后加入顺磁性抗肿瘤配合物二氯N-（2-丙酸乙酯基）-N，N-二（2-吡啶甲基）胺合锰（简写为LMnCl），其中质量比LMnCl: RBITC-Fe3O4SiO2 -RGD 为1：2～4：1，混和溶液在40～80 oC下搅拌反应1～6 h；磁性分离，真空干燥得产物：一种肿瘤靶向性多功能的纳米复合成像剂（LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD）。
其中步骤（1）Fe3O4为粒径20 nm磁性纳米Fe3O4中，磁性纳米Fe3O4和四甲氧基硅烷（TEOS）质量比为1：2；Fe3O4与三氯甲烷质量比为1：2；再加入Fe3O4的量0.5倍的CTAB水溶液，水与TEOS的质量比例为1：4.5； NaOH溶液为2 M，其中NaOH与TEOS的质量比例为1：5，温度控制在70 oC；TEOS和 RBITC的质量比为2：1；其中乙酸乙酯用量为反应液体积的20%，反应10 min；其中氨丙基三乙氧基硅烷（APS）：Fe3O4质量比为5：1，搅拌反应3 h。
其中步骤（2）中将精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸 (RGD)、1,3-二环己基碳二亚胺（DCC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）以质量比1：1.5：1.5混合，加入NHS质量 4倍的DMF至固体刚好溶解，溶液在常温下搅拌反应24 h后。
其中步骤（3）中甲氧基聚乙二醇酸的分子量2000；称取RBITC-Fe3O4SiO2-RGD 两倍质量的甲氧基聚乙二醇酸溶于DMF制成饱和溶液，其中DCC:NHS: 甲氧基聚乙二醇酸质量比为3:3:2；让其在常温下搅拌反应24 h；再将RBITC-Fe3O4SiO2-RGD加入其中，继续常温搅拌反应24 h后加入RBITC-Fe3O4SiO2-RGD质量3倍的乙醇超声分散5分钟；然后加入RBITC-Fe3O4SiO2-RGD质量两倍的顺磁性抗肿瘤配合物二氯N-（2-丙酸乙酯基）-N，N-二（2-吡啶甲基）胺合锰（简写为LMnCl），混和溶液在80oC下搅拌反应4 h。
上述一种多功能肿瘤成像剂的应用，具有肿瘤靶向肽诱导的肿瘤细胞主动靶向性，可以用于肿瘤细胞与正常细胞的磁共振成像鉴别剂。
本发明的优点：上述所说的一种多功能肿瘤成像剂的应用，具有肿瘤靶向肽诱导的肿瘤细胞主动靶向性，可以用于肿瘤细胞与正常细胞的磁共振成像鉴别剂，能借助磁共振成像技术或荧光成像技术区别肿瘤细胞与正常细胞，而传统的磁共振成像剂仅具有成像功能，不能区别肿瘤细胞和正常细胞；此外这种多功能肿瘤成像剂，还具有抗肿瘤活性，可运用于临床磁共振成像监测治疗用药，实现肿瘤治疗过程的时时监测， 而目前临床运用的抗肿瘤药物仅具有肿瘤抑制性能，无法实现药物治疗过程的实时监测。
附图说明
图1：LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD引起的HeLa细胞形状的变化(A: 1μg/ml, B: 10μg/ml; C: 30μg/ml)。纳米颗粒对肿瘤生长的抑制活性（实验1）。30 μg/ml的LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD处理HeLa细胞时，几乎所有细胞全部皱缩、变圆，即所有细胞全部死亡，说明其对肿瘤细胞的抑制活性较好。
图2：LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD的MRI图(WRL-68细胞) (a: 空白; b: 10μg/ml; c: 30μg/ml; d: 50μg/ml)。WRL-68细胞为正常地肝细胞，附图2较弱的磁共振信号表示 L3MnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD纳米颗粒在正常细胞里的吸收较少。
图3：LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD的MRI图(HepG-2细胞) (a: 空白; b: 10μg/ml; c: 30μg/ml; d: 50μg/ml)。HepG-2细胞为肝癌细胞，附图3较强的信号表示肝癌细胞对L3MnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD纳米颗粒吸收较强，即制备的纳米颗粒具有肿瘤选择性吸收和磁共振成像的特性。
经生物活性测试，LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD同时具有动物体外磁共振成像，抗肿瘤以及肿瘤靶向性的特征，能特定地杀死HeLa细胞，30μg/ml 能够引起细胞显著死亡；此外 这种纳米复合物对肝肿瘤细胞HepG-2聚集度显著高于正常肝细胞WRL-68 （见图2与图3，实验1与2），说明具有较好的肿瘤细胞靶向性，从而有望作为一种诊断、治疗癌症的多功能靶向纳米药物或用于肿瘤磁共振成像、荧光成像剂。
具体实施方式
试剂和原料
实验中所用试剂均为分析纯，除特别注明外，未经进一步处理。元素分析用Carlo-Erba-1106型元素分析仪测定， 红外光谱用Fr-IR 169(固体用KBr压片)。
抗肿瘤试验试剂如下：（1） RPMI 1640培养基（RPMI 1640+10%小牛血清+HEPES 3.5g/l +NaHCO3 2.2g/l +青霉素 0.13g/l +链霉素 0.15g/l）。（2）高糖DMEM培养基 （DMEM +10%小牛血清+HEPES 3.5g/l +NaHCO3 2.2g/l +青霉素 0.13g/l +链霉素 0.15g/l）。（3）MTT（美国Amresco公司产品）
纳米颗粒对水质子弛豫速率增强的能力影响其在体内磁共振成像的效果，弛豫效率用R 1 表示，R 1 值越大，其弛豫能力越强，活体成像效果也越好。弛豫效率用下式计算:
R 1 =[(1/t1)obsd-(1/t1)d]/[M] (1)
式中(1/t1)obsd与(1/t1)d分别为在造影剂存在下观察到水质子的纵向弛豫速率和纯水中质子的弛豫速率。[M]为造影剂的浓度，计算得LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD的纵向弛豫效率R 1 分别为11.99 mmol- 1·L ·s- 1。数据表明所合成是纳米颗粒对水质子的弛豫速率起良好的加速作用。附图2为LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD的WRL-68细胞的MRI图，附图3 为LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD 作用HepG-2细胞的MRI图，从图可以看出，两者都有一定的磁共振成像效果。比较附图2 和附图2可知， LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD纳米颗粒能特定地靶向于肿瘤细胞，而对正常细胞的吸收较弱。以上结果表明，LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD能作为肿瘤靶向性磁共振成像剂，从而有望用于肿瘤的诊断和治疗。
实施例1（最价制备条件举例）： 将粒径20 nm磁性纳米Fe3O4 (40 mg)和四甲氧基硅烷（TEOS ）(80mg)以质量1：2混合并超声分散于80 mg三氯甲烷（Fe3O4与三氯甲烷质量比1：2），再加入0.5M 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）水溶液0.8ml，接着加入水2ml和2 M的NaOH溶液0.4 g （其中NaOH与TEOS的质量比例1：5），温度控制在最佳70 oC获得溶液A；将另一份TEOS (120mg)和异硫氰酸罗丹明B（RBITC） (60mg) 以质量比2：1混合后制成溶液B；将溶液B加入溶液A中，再加入反应液体积的20%乙酸乙酯，反应10 min后加入APS (200mg) （APS：Fe3O4质量比5：1），搅拌反应3 h，磁性分离，固体用乙醇和水各洗2次得包裹荧光染料异硫氰酸罗丹明B（RBITC）和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、二氧化硅为壳的纳米颗粒（RBITC-Fe3O4SiO2， 其中表示核壳结构）。
将22 mg RGD、(33mg) 1,3-二环己基碳二亚胺（DCC）和(33mg)N-羟基丁二酰亚胺（NHS）的N，N-二甲基甲酰胺混合（其中RGD：DCC：NHS质量比为1：1.5：1.5），加入20 ml DMF至固体刚好溶解，溶液在常温下搅拌反应24 h。再加入上述干燥后的固体RBITC-Fe3O4SiO2，继续搅拌反应24 h。结束反应，磁性分离得表面修饰RGD的荧光染料异硫氰酸罗丹明B（RBITC）和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、二氧化硅为壳的纳米颗粒RBITC-Fe3O4SiO2-RGD (69.1 mg)。
称取甲氧基聚乙二醇酸（分子量2000）(138.2 mg)溶于DMF制成饱和溶液中（其中甲氧基聚乙二醇酸：RBITC-Fe3O4SiO2-RGD质量比2：1中，再依次加入207.3 mg 的DCC和207.3 mg NHS (质量比DCC:NHS: 甲氧基聚乙二醇酸为3:3:2），让其在常温下搅拌反应24 h。再将RBITC-Fe3O4SiO2-RGD(69.1 mg)加入其中，常温搅拌反应24 h后加入18ml乙醇超声分散5分钟；然后加入138.4 mg顺磁性抗肿瘤配合物二氯N-（2-丙酸乙酯基）-N，N-二（2-吡啶甲基）胺合锰（简写为LMnCl） ( 质量比LMnCl: RBITC-Fe3O4SiO2 -RGD 约为2：1)，混和溶液在80 oC下搅拌反应4 h。磁性分离，真空干燥得产物LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD (132 mg)。
IR（KBr, cm-1）3440, 1608, 1428, 1065, 562. UV (H2O, nm), 555, 260. Mn 12.68%. 粒径（TEM）, 20-30 nm。 油脂分布系数1.2。测得纳米颗粒的t1迟豫时间分别为83.410 ms，纵向弛豫效率R 1 为11.99 mmol- 1·L ·s- 1。 经生物活性测试，LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD同时具有动物体外磁共振成像，抗肿瘤配合物的输送以及肿瘤靶向性的特征，能特定地杀死HeLa细胞，30μg/ml 能够引起细胞显著死亡。
实施例2：将粒径20 nm磁性纳米Fe3O4 (40 mg)和TEOS (40mg)以质量1：1混合并超声分散于40 mg三氯甲烷（Fe3O4与三氯甲烷质量比1：1），再加入0.5M十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）水溶液0.12ml，接着加入水0.3 ml和2 M的NaOH溶液0.1 g（其中NaOH与TEOS的质量比例1：1），温度控制在最佳70 oC制得溶液A；将另一份TEOS(20mg)和 RBITC(20mg)以质量比1：1混合后制成溶液B；将溶液B加入溶液A中，再加入反应液体积的5%乙酸乙酯，反应10 min后加入APS (400mg) （APS：Fe3O4质量比10：1），搅拌反应3 h，磁性分离，固体用乙醇和水各洗2次得包裹荧光染料异硫氰酸罗丹明B（RBITC）和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、二氧化硅为壳的纳米颗粒（RBITC-Fe3O4SiO2，其中表示核壳结构）。
将15 mg RGD、(15 mg) 1,3-二环己基碳二亚胺（DCC）和(60 mg)N-羟基丁二酰亚胺（NHS）的N，N-二甲基甲酰胺混合（其中RGD：DCC：NHS质量比为1：1：4），加入10 ml DMF至固体刚好溶解，溶液在常温下搅拌反应10 h。再加入上述干燥后的固体RBITC-Fe3O4SiO2，继续搅拌反应10 h。结束反应，磁性分离得表面修饰RGD的荧光染料异硫氰酸罗丹明B（RBITC）和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、二氧化硅为壳的纳米颗粒RBITC-Fe3O4SiO2-RGD (27.6 mg)。
称取甲氧基聚乙二醇酸（分子量2000）(70.6 mg)溶于DMF制成饱和溶液中（其中甲氧基聚乙二醇酸：RBITC-Fe3O4SiO2-RGD质量比4：1中，再依次加入211.8 mg 的DCC和NHS (质量比DCC:NHS: 甲氧基聚乙二醇酸为3:3:1），让其在常温下搅拌反应10 h。再将RBITC-Fe3O4SiO2-RGD (27.6 mg)加入其中，常温搅拌反应10 h后加入9.5 ml乙醇超声分散；然后加入13.8 mg顺磁性抗肿瘤配合物二氯N-（2-丙酸乙酯基）-N，N-二（2-吡啶甲基）胺合锰（简写为LMnCl） ( 质量比LMnCl: RBITC-Fe3O4SiO2 -RGD 约为1：2)，混和溶液在80 oC下搅拌反应1 h。磁性分离，真空干燥得产物LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD (49 mg)。
实施例3：将粒径20 nm磁性纳米Fe3O4 (60 mg)和TEOS (240mg)以质量比1：6混合并超声分散于600 mg三氯甲烷（Fe3O4与三氯甲烷质量比1：10）中，再加入0.5M十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）水溶液 1.2 ml，接着加入水240 ml和2 M的NaOH溶液2.4 g（其中NaOH与TEOS的质量比例1：10），温度控制在最佳30 oC制得溶液A；将另一份TEOS (120 mg)和 RBITC (120 mg)以质量比1：1混合后制成溶液B；将溶液B加入溶液A中，再加入反应液体积的40%乙酸乙酯，反应30 min后加入APS (60mg) （APS：Fe3O4质量比1：1），搅拌反应3 h，磁性分离，固体用乙醇和水各洗2次得包裹荧光染料异硫氰酸罗丹明B（RBITC）和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、二氧化硅为壳的纳米颗粒（RBITC-Fe3O4SiO2，其中表示核壳结构）。
将15 mg RGD、15 mg 1,3-二环己基碳二亚胺（DCC）和15 mgN-羟基丁二酰亚胺（NHS）的N，N-二甲基甲酰胺混合（其中RGD：DCC：NHS质量比为1：1：1），加入36 ml DMF至固体刚好溶解，溶液在常温下搅拌反应10 h。再加入上述干燥后的固体RBITC-Fe3O4SiO2，继续搅拌反应36 h。结束反应，磁性分离得表面修饰RGD的荧光染料异硫氰酸罗丹明B（RBITC）和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、二氧化硅为壳的纳米颗粒RBITC-Fe3O4SiO2-RGD(46.8 mg)。
称取甲氧基聚乙二醇酸（分子量2000）(23.4 mg) 溶于DMF制成饱和溶液中（其中甲氧基聚乙二醇酸：RBITC-Fe3O4SiO2-RGD质量比1：2中，再依次分别加入34.2 mg 的DCC和22.8 mg 的NHS (质量比DCC:NHS: 甲氧基聚乙二醇酸为3:2:4），让其在常温下搅拌反应36 h。再将RBITC-Fe3O4SiO2-RGD (46.8 mg)加入其中，常温搅拌反应36 h后加入30 ml乙醇超声分散5分钟；然后加入107.2 mg顺磁性抗肿瘤配合物二氯N-（2-丙酸乙酯基）-N，N-二（2-吡啶甲基）胺合锰（简写为LMnCl） ( 质量比LMnCl: RBITC-Fe3O4SiO2 -RGD 约为4：1)，混和溶液在80 oC下搅拌反应1 h。磁性分离，真空干燥得产物LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD (68 mg)。
实施例4：将粒径20 nm磁性纳米Fe3O4 (60 mg)和TEOS (60 mg)以质量比1：1混合并超声分散于240 mg三氯甲烷（Fe3O4与三氯甲烷质量比1：4）中，再加入 0.5M十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）水溶液 1.4 ml，接着加入水240 ml和2 M的NaOH溶液6 mg （其中NaOH与TEOS的质量比例1：10），温度控制在最佳30 oC制的溶液A；将另一份TEOS (120 mg)和 RBITC (120 mg)以质量比1：1混合后制成溶液B；将溶液B加入溶液A中，再加入反应液体积的30%乙酸乙酯，反应30 min后加入APS (90mg) （APS：Fe3O4质量比1.5：1），搅拌反应3 h，磁性分离，固体用乙醇和水各洗2次得包裹荧光染料异硫氰酸罗丹明B（RBITC）和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、二氧化硅为壳的纳米颗粒（RBITC-Fe3O4SiO2，其中表示核壳结构）。
将44 mg RGD、(44 mg) 1,3-二环己基碳二亚胺（DCC）和(44 mg)N-羟基丁二酰亚胺（NHS）的N，N-二甲基甲酰胺混合（其中RGD：DCC：NHS质量比为1：1：1），加入42 ml DMF至固体刚好溶解，溶液在常温下搅拌反应20 h。再加入上述干燥后的固体RBITC-Fe3O4SiO2，继续搅拌反应20 h。结束反应，磁性分离得表面修饰RGD的荧光染料异硫氰酸罗丹明B（RBITC）和多孔磁性纳米四氧化三铁为核、二氧化硅为壳的纳米颗粒RBITC-Fe3O4SiO2-RGD (56.8 mg)。
称取甲氧基聚乙二醇酸（分子量2000）(113.6 mg) 溶于DMF制成饱和溶液中（其中甲氧基聚乙二醇酸：RBITC-Fe3O4SiO2-RGD质量比1：2中，再依次分别加入169.8 mg 的DCC和169.8 mg 的NHS (质量比DCC:NHS: 甲氧基聚乙二醇酸为3:3:2），让其在常温下搅拌反应20 h。再将RBITC-Fe3O4SiO2-RGD (56.8 mg)加入其中，常温搅拌反应20 h后加入38ml乙醇超声分散5分钟；然后加入85.2 mg顺磁性抗肿瘤配合物二氯N-（2-丙酸乙酯基）-N，N-二（2-吡啶甲基）胺合锰（简写为LMnCl）( 质量比LMnCl: RBITC-Fe3O4SiO2 -RGD 约为1.5：1)，混和溶液在80 oC下搅拌反应1.5 h。磁性分离，真空干燥得产物LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD (86 mg)。
实验1：抗肿瘤活性测定及细胞增殖形态学观察
以实施例1得到的配合物为受试化合物
将HeLa细胞在含10%热灭活的胎牛血清（FCS）的RPMI1640培养液中，于CO2培养箱（37 oC，5%CO2、饱和湿度）内连续培养。取对数生长期细胞，消化、计数，以2×104/ml的密度接种于96孔培养板中，每孔100 μl。培养 24 h后，分别用浓度为1 μg/ml，10 μg/ml和30 μg/ml的LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD作用HeLa细胞。用TS100 Nikon 倒置相差显微镜观察细胞的生长情况。从附图1的细胞形态学观察，可以看出 30 μg/ml LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD的能显著诱导肿瘤细胞的凋亡。
分别用浓度为1 μg/ml，10 μg/ml和30 μg/ml的LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD作用HeLa细胞（见图1）。实验结果显示LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD都能引起细胞的皱缩和诱导细胞不同程度的分裂。用30 μg/ml的LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD处理HeLa细胞时，几乎所有细胞全部皱缩、变圆，即所有细胞全部死亡，说明其对肿瘤细胞的抑制活性较好。
.实验2：细胞磁共振成像：
将WRL-68细胞和HepG2细胞在含10%热灭活的胎牛血清（FCS）的RPMI1640培养液中，于CO2培养箱（37 oC，5%CO2、饱和湿度）内连续培养。取对数生长期的WRL-68细胞和HepG2细胞，消化、计数，以2×104/ml的密度接种到96孔培养板中，每孔100 μl。培养24 h后，分别用不同浓度的LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD的溶液处理肿瘤细胞，连续培养4 h后，于室温在NMI20磁共振成像仪（0.53 T）上进行T1加权成像测试，见图2和图3。设置参数为重复采样次数（NS）为8, 反转恢复序列循环采样次数（T1IRCount）为300，每次增加的步长（AddD1）为2000， 90 °脉宽（P90）为4.5，180 °脉宽（P180）为9。测得纳米颗粒的t1迟豫时间分别为83.410 ms。
Claims (6)
1.一种多功能肿瘤成像剂，其结构式为LMnCl-RBITC-Fe3O4SiO2-PEG-RGD，其中LMnCl为二氯N-（2-丙酸乙酯基）-N，N-二（2-吡啶甲基）胺合锰，RBITC为异硫氰酸罗丹明B，RGD为精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸三肽，PEG为甲氧基聚乙二醇，其中表示核壳结构。
2.权利要求1所述的一种多功能肿瘤成像剂的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：
（1）将Fe3O4和四甲氧基硅烷（TEOS）以质量比1：1～1：6，混合并超声分散于三氯甲烷，其中Fe3O4与三氯甲烷质量比1：1～1：10，再加入Fe3O4的量 0.1～1.0 倍的十六烷基三甲氧基溴化銨（CTAB）水溶液，接着加入水和1～5 M的NaOH溶液；，其中水与TEOS的质量比例1：1～1：10，其中NaOH与TEOS的质量比例1：2～1：10，温度控制在30～70 oC制成溶液A；将TEOS和 异硫氰酸罗丹明B(RBITC)按照质量比4：1～ 1：1，混合后制成溶液B；将溶液B加入溶液A中，再加入乙酸乙酯，其中乙酸乙酯用量为反应液体积的5%～40%，，反应1～30 min，后加入氨丙基三乙氧基硅烷（APS），其中APS：Fe3O4质量比为10：1～1：1，搅拌反应1～5 h，磁性分离，固体用乙醇和水各洗2次得RBITC-Fe3O4SiO2；
（2）将精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸三肽( (RGD)、1,3-二环己基碳二亚胺（DCC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）混合，其中RGD：DCC：NHS质量比为1：5：2～1：1：4，加入一定量的DMF至固体刚好溶解，其中质量比DMF：NHS为2：1～8：1，溶液在常温下搅拌反应10～36 h；再加入上述干燥后的固体RBITC-Fe3O4SiO2，继续搅拌反应10～36 h；结束反应，磁性分离得固体RBITC-Fe3O4SiO2-RGD；
（3）称取甲氧基聚乙二醇酸溶于DMF制成饱和溶液中，其中甲氧基聚乙二醇酸：RBITC-Fe3O4SiO2-RGD的质量比为4:1～1:2，再依次加入DCC和NHS，其中质量比DCC:NHS: 甲氧基聚乙二醇酸为3:3:1～3:2:4，让其在常温下搅拌反应10～36 h；再将RBITC-Fe3O4SiO2-RGD加入其中，常温搅拌反应10～36 h后加入一定量的乙醇超声分散5分钟，其中与RBITC-Fe3O4SiO2-RGD的质量比为1：1～6：1；然后加入顺磁性抗肿瘤配合物二氯N-（2-丙酸乙酯基）-N，N-二（2-吡啶甲基）胺合锰, 其中质量比LMnCl: RBITC-Fe3O4SiO2 -RGD 为1：2～4：1，混和溶液在40～80 oC下搅拌反应1～6 h；磁性分离，真空干燥得产物一种肿瘤靶向性多功能的纳米复合成像剂。
3.根据权利要求2所述的一种多功能肿瘤成像剂的制备方法，其特征在于其中步骤（1）Fe3O4为粒径20 nm磁性纳米Fe3O4，磁性纳米Fe3O4和TEOS质量比为1：2；Fe3O4与三氯甲烷质量比为1：2；再加入Fe3O4的量0.5倍的CTAB水溶液，水与TEOS的质量比例为1：4.5； NaOH溶液为2 M，其中NaOH与TEOS的质量比例为1：5，温度控制在70 oC；TEOS和 RBITC的质量比为2：1；其中乙酸乙酯用量为反应液体积的20%，反应10 min；其中APS：Fe3O4质量比为5：1，搅拌反应3 h。
4.根据权利要求2所述的一种多功能肿瘤成像剂的制备方法，其特征在于其中步骤（2）中将RGD、1,3-二环己基碳二亚胺（DCC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）以质量比1：1.5：1.5混合，加入NHS质量 4倍的DMF至固体刚好溶解，溶液在常温下搅拌反应24 h后。
5.根据权利要求2所述的一种多功能肿瘤成像剂的制备方法，其特征在于其中步骤（3）中甲氧基聚乙二醇酸的分子量2000；称取RBITC-Fe3O4SiO2-RGD 两倍质量的甲氧基聚乙二醇酸溶于DMF制成饱和溶液，其中DCC:NHS: 甲氧基聚乙二醇酸质量比为3:3:2；让其在常温下搅拌反应24 h；再将RBITC-Fe3O4SiO2-RGD加入其中，继续常温搅拌反应24 h后加入RBITC-Fe3O4SiO2-RGD质量3倍的乙醇超声分散5分钟；然后加入RBITC-Fe3O4SiO2-RGD质量两倍的顺磁性抗肿瘤配合物二氯N-（2-丙酸乙酯基）-N，N-二（2-吡啶甲基）胺合锰，混和溶液在80oC下搅拌反应4 h。
6.权利要求1所述的一种多功能肿瘤成像剂的应用，具有肿瘤靶向肽诱导的肿瘤细胞主动靶向性，可以用于肿瘤细胞与正常细胞的磁共振成像鉴别剂。
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