CN113521033A - 一种含蛋白质外壳的pha磁性纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种含蛋白质外壳的PHA磁性纳米颗粒及其制备方法和应用，该含蛋白质外壳的PHA磁性纳米颗粒的结构为核壳结构，内核为PHA磁性纳米颗粒，外壳为PHA表面结合蛋白，采用标签的融合蛋白；内核通过疏水性磁性成分与PHA类天然生物聚酯在有机溶剂溶液中分散形成油相，再加入到水相溶液中超声乳化形成乳化液，除去有机溶剂后得到；外壳是通过外源重组表达并纯化获取得到。本发明的具有蛋白质外壳的PHA磁性纳米颗粒能被细胞吞噬，实现细胞在磁场中固定和定向运动的能力，可应用于细胞监测、生物识别及临床治疗等领域。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种含蛋白质外壳的PHA磁性纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
磁性纳米颗粒（MNPs）是近年来发展迅速且极具应用价值的新型材料，通常由铁、钴、镍等磁性元素组成，因其特有的超顺磁性、生物相容性和靶向性等特性，在现代科学的众多领域如生物医药、磁流体、催化作用、核磁共振成像等应用广泛。由于磁性纳米颗粒能够在磁场下被操纵，可将细胞毒性药物（或者蛋白因子）附着到生物相容性MNPs载体，以胶体悬浮液形式静脉内注射，施加磁场梯度以引导至病理部位和治疗剂的释放，因此成为癌症治疗中最为有效的药物传递系统之一，特别是基于氧化铁纳米颗粒的治疗，是传统化疗、放疗或手术的重要替代方案。
低剂量的磁性纳米材料对不同细胞没有明显的细胞毒性，并且可以抑制肿瘤细胞的活性，但在长时间暴露或使用裸磁性纳米材料时有明显毒性。因此，需对颗粒进行表面涂层。磁性纳米材料经过表面修饰后，解决了颗粒团聚问题，并很大程度上改善了磁性纳米材料的生物相容性、稳定性及生物降解等特性，是目前该领域的研究热点。
磁性纳米颗粒外围通常由一层聚合物涂层作为保护层，目前主要的聚合物有聚乳酸（PLA）、聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)等。这些材料较传统疗法有明显优势，如可通过调节控制载体的药物释放速率，提高药物利用率等。但是有的材料在应用时仍存在诸多不足：如PLA的延展性和冲击性能较差，严重制约了PLA的应用；PLGA存在对亲水性药物包封率较低、靶向性传递效果不佳、对正常细胞毒副作用较强，PCL结晶度不高、降解速度不易控制、含有多个酯基和亲水性差等不足，导致其在临床应用中受到一定的限制。
聚羟基脂肪酸酯（PHA）是一种大量存在于微生物细胞，特别是细菌细胞中的一种高分子聚酯，作为细胞内的碳源和能源物质。PHA因其具有良好的生物相容性、生物可降解性、生物可再生性和材料多变性等优良性能，所以能在化工、农业、生物医学和塑料产业等领域有很大的研究前景。磁性纳米颗粒被PHA包被后改善了其生物相容性，并通过负载药物，可在外加磁场作用下定向移动从而靶向给药，为肿瘤治疗提供新思路。
RGD序列是三肽精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸组成，存在于多种细胞外基质中，RGD肽充当整联蛋白及其配体的识别位点，并能有效促进细胞对生物材料的粘附。近年来，RGD被应用于各种不同的多学科领域中，如药物输送，诊断，治疗学和组织工程学等。由于受体在人体各种组织中的特异性表达以及它们的表达与各种病理生理状况的紧密联系，这些受体成为用于多种疾病诊断和治疗以及各种器官再生的靶向候选物。基于此，各种形式的基于RGD的整合素配体已广泛用于生物医学研究中。
由于RGD肽对活化血小板表面上存在的活化整联蛋白GPIIb-IIIa（αIIbβ3）具有很高的亲和力，因此可以用作靶向配体来特异性递送抗血栓溶解药物。纤连蛋白以及其他ECM蛋白中存在的RGD序列可促进细胞分化和迁移，并被设计用于修饰肽材料。RGD序列已被应用于固定在聚合物表面上以生物活化表面。例如，在骨植入物中，它不仅增加了骨的生长，而且还减少了界面纤维组织。血液中的细胞外基质和粘附蛋白（包括纤维蛋白原，纤连蛋白和胶原蛋白）通常包含RGD序列。
发明内容
有鉴于此，本发明公开一种含蛋白质外壳的PHA磁性纳米颗粒及其制备方法，以应用于医疗领域。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明公开了一种含蛋白质外壳的PHA磁性纳米颗粒，其结构为核壳结构，可在磁场中固定和移动，粒径大小为50～600 nm，内核为PHA磁性纳米颗粒，外壳为PHA表面结合蛋白，采用标签的融合蛋白，所述融合蛋白是由RGD进行人工重组及微生物外源表达制备得到。
进一步，所述RGD的序列由三肽精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸组成，存在于多种细胞外基质中，RGD肽充当整联蛋白及其配体的识别位点，并能有效促进细胞对生物材料的粘附。
进一步，所述标签的融合蛋白还包括连接标签，所述连接标签是具有连接作用的蛋白质，分为PhaP、PhaR和PhaC。其中，PhaP是一种PHA表面结合蛋白，两亲性生物大分子，他的疏水端能够与体内以及体外颗粒相结合，具有稳定的物理性质及很好的抗逆性。它们具有调节功能，可以影响细胞内PHA积累并介导蛋白质折叠。PHA合成调节蛋白PhaR附着在细胞内PHA颗粒表面，两亲性生物大分子。纯化PhaR的乳化能力高于广泛使用的化学表面活性剂，包括SDS、Tween 20、油酸钠和液化洗涤剂（LD）。PhaR还表现出比生物表面活性剂和PHA颗粒相关的蛋白质PhaP更高的乳化能力。非纯化的PhaR，即原生包容体和细胞囊，也是一种优秀的表面活性剂，在95°C时，PhaR也高度稳定。 此外，PhaR是一种对革兰阳性和阴性细菌有效的杀菌剂。 因此，PhaR 被应用于食品、饮料、制药和化妆品行业等领域。，PHA合酶PhaC形成活性二聚体，将底物酰基辅酶A（CoA）中的酰基部分聚合成PHA聚合物。
进一步，所述标签的融合蛋白还包括荧光蛋白（红色荧光蛋白质，绿色荧光蛋白质，黄色荧光蛋白质等一种或者多种），用于观察及定位纳米颗粒的位置。
进一步，所述的PHA磁性纳米颗粒由疏水性磁性成分与PHA类天然生物聚酯在有机溶剂溶液中分散形成油相，再加入到水相溶液中超声乳化形成乳化液，除去有机溶剂后制备所得；其中，PHA类天然生物聚酯为聚-β-羟基丁酸（PHB）、聚羟基丁酸酯戊酸共聚酯（PHBV）、聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸（PHBHHx）、聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸-3-羟基己酸（PHBVHHx）、聚3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯（P34HB）等中的一种或几种的混合物；疏水性磁性成分为含氧化铁和/氧化钴和/氧化镍和/氧化锰等的磁性纳米颗粒。
本发明还公开了上述一种含蛋白质外壳的PHA磁性纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
将磁性成分分散于含PHA类天然生物聚酯的有机溶剂溶液中，低温超声搅拌形成油相；将油相加入稳定剂溶液中，低温超声搅拌形成乳化液；将乳化液进行机械搅拌，除去有机溶剂，得到镶嵌了磁性成分的PHA磁性纳米颗粒；
将PHA磁性纳米颗粒与蛋白液混合，常温或低温孵育，PBS清洗2次，即可得到经标签蛋白自组装修饰的PHA磁性纳米颗粒。
进一步地，油相中磁性成分的浓度为0.01%~0.5%；稳定剂溶液为十二烷基磺酸钠（SDS）、聚乙烯醇（PVA）、油酸钠（十八烯酸钠）等中的一种或多种，浓度为0.1%~30%；其有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷等中的一种或多种；油相和水相的体积比为1:10~1:30 (v/v)。
进一步地，PHA磁性纳米颗粒与蛋白液的质量比: 102:1~105:1。
本发明还公开了上述一种含蛋白质外壳的PHA磁性纳米颗粒蛋白疫苗、治疗用抗原、生物识别方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
通过PHA与表面结合蛋白PhaP，PhaR，PhaC绑定，能有效促进磁性成分在水中的分散性，提升单纯的磁性成分的生物相容性；PhaP，PhaR，PhaC与生物材料的结合，可是使多种功能蛋白可以不受本身亲疏水性的影响而粘附在材料上。
本发明的含蛋白质外壳的PHA磁性纳米颗粒在小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3、小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1和人骨髓间充质干细胞hBMSC无细胞毒性；
本发明的含蛋白质外壳的PHA磁性纳米颗粒的表面蛋白含量高，因其尺寸呈纳米级容易进入血液和细胞，若携带癌症杀伤因子，具有高效的治疗癌症的作用且效率较高；
本发明的含蛋白质外壳的PHA磁性纳米颗粒可用于科研开发蛋白疫苗、治疗用抗原以及临床治疗，对防控2019新型冠状病毒流行具有重要意义并且在细胞粘附、促干细胞分化、抗菌等领域有着广大前景，实现上述功能蛋白在磁场中固定和定向运动的能力，也可应用于食品监测、生物识别及临床治疗等领域。
附图说明
图1为本发明实施例含蛋白质外壳的PHA磁性纳米颗粒的结构图；
图2为本发明中与PHA结合的标签蛋白介导的PHA磁性纳米颗粒的界面修饰方法的示意图；
图3为本发明实施例1的PHA磁性纳米颗粒的TEM图；
图4为本发明实施例1的Fe3O4@PHBVHHx-NP绑定PhaP-RGD的SDS-PAGE图；
图5为本发明实施例7中与不同的磁性纳米颗粒共培养7天的小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的细胞活性变化；
图6为本发明实施例7中与不同的磁性纳米颗粒共培养7天的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1的细胞活性变化；
图7为本发明实施例7中与不同的磁性纳米颗粒共培养7天的人骨髓间充质干细胞hBMSC的细胞活性变化；
图8为细胞及其吞噬的磁性纳米颗粒的激光共聚焦显微镜图；
图9为吞噬磁性纳米颗粒的细胞在星形磁场中生长1天后的细胞形态。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
请参阅图1：本发明实施例的一种含蛋白质外壳的PHA磁性纳米颗粒，其粒径大小为50～600 nm，可在磁场中固定和移动，为核壳结构，内核为通过疏水性磁性成分与PHA类天然生物聚酯在有机溶剂溶液中分散形成油相，再加入到水相溶液中超声搅拌形成乳化液，除去有机溶剂后得到的PHA磁性纳米颗粒，外壳为通过外源重组表达并纯化获取得到PHA表面结合蛋白为标签的融合蛋白。
本发明实施例中所述纳米颗粒为纳米级的不规则颗粒、球体或椭球。
本发明实施例中所述的PHA磁性纳米颗粒由疏水性磁性成分与PHA类天然生物聚酯在有机溶剂溶液中分散形成油相，再加入到水相溶液中超声乳化形成乳化液，除去有机溶剂后制备所得；其中，PHA类天然生物聚酯为聚-β-羟基丁酸（PHB）、聚羟基丁酸酯戊酸共聚酯（PHBV）、聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸（PHBHHx）、聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸-3-羟基己酸（PHBVHHx）、聚3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯（P34HB）中的一种或几种的混合物；疏水性磁性成分为含氧化铁和/氧化钴和/氧化镍和/氧化锰的磁性纳米颗粒。
本发明实施例中所述融合蛋白RGD序列是三肽精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸组成，存在于多种细胞外基质中，RGD肽充当整联蛋白及其配体的识别位点，并能有效促进细胞对生物材料的粘附。
本发明实施例中所述融合蛋白还包括连接标签，连接标签是具有连接作用的蛋白质。本发明实施例中所用连接标签为PhaP、PhaR及PhaC中的任一种。PhaP是一种天然生物高分子PHA（聚羟基脂肪酸酯）表面的结合蛋白，具有良好的生物相容性，无毒无害。PhaP蛋白有两种蛋白构象，是由四个单体组成的双亲性蛋白，可通过其疏水区结合位点与较疏水的高分子材料结合，如PHA（聚羟基脂肪酸酯），PLA（聚乳酸），PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物），PCL（聚己内酯）等；也可以粘附在疏水的油珠表面作表面活性剂。利用连接标签PhaP，可将重组的融合蛋白粘附在PHA磁性纳米颗粒表面。 PhaR和PhaC同PhaP作用方式相同。
本发明实施例中所述融合表面蛋白还包括荧光蛋白，用于观察及定位纳米颗粒。本发明实施例中所述荧光蛋白包括红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白中的任一种。
下面结合实施例，更进一步阐述本发明。
实施例1
多种Fe3O4@PHA磁性纳米颗粒的获取。
将0.089g乙酰丙酮铁、2.5 mL的油胺和2.5 mL石蜡油（有机溶剂）加入三口瓶中，在搅拌下通入氮气15 min，在110℃下反应1 h，再升温到200℃下反应2 h；冷却至室温，加入30 mL无水乙醇，离心分离并自然风干得到疏水性磁性成分Fe3O4；再将获取的疏水性磁性成分Fe3O4分别分散于10 mL分别含有3g 的PHA（PHBVHHx、P34HB和PHBHHx）的有机溶剂溶液（二氯甲烷或三氯甲烷）中，低温超声搅拌2 min，形成油相；将油相加入1 L的1% PVA溶液中，低温超声搅拌10 min，形成乳化液；将乳化液进行机械搅拌，除去有机溶剂，得到三种Fe3O4@PHA磁性纳米颗粒：Fe3O4@PHBVHHx-NP、Fe3O4@P34HB-NP和Fe3O4@PHBHHx-NP。
经TEM观察，三种Fe3O4@PHA磁性纳米颗粒均为纳米级球形结构，Fe3O4镶嵌在PHA材料内部（图2）。经马尔文粒径仪检测，Fe3O4@PHBVHHx-NP的粒径为59~600 nm；Fe3O4@P34HB-NP的粒径为61~600 nm；以及 Fe3O4@PHBHHx-NP的粒径为40~600 nm。经热重分析仪测定，其Fe3O4的质量比分别为：Fe3O4@PHBVHHx-NP的1%~99%；Fe3O4@P34HB-NP的1%~98%；Fe3O4@PHBHHx-NP的1%~99%。
实施例2
多种CoFe2O4@PHA磁性纳米颗粒的获取。
将0.059g乙酰丙酮铁、0 .021g乙酰丙酮钴、2.5 mL的油胺和2.5 mL石蜡油（有机溶剂）加入三口瓶中，在搅拌下通入氮气15 min，在110℃下反应1 h，再升温到200℃下反应2 h；冷却至室温，加入30 mL无水乙醇，离心分离并自然风干得到疏水性磁性成分CoFe2O4；再将疏水性磁性成分CoFe2O4分别分散于10 mL分别含有3g 的PHA（PHBVHHx、P34HB和PHBHHx）的有机溶剂溶液（二氯甲烷或三氯甲烷）中，低温超声搅拌2 min，形成油相；将油相加入1 L的1% PVA溶液中，低温超声搅拌10 min，形成乳化液；将乳化液进行机械搅拌，除去有机溶剂，得到三种CoFe2O4@PHA磁性纳米颗粒：CoFe2O4@PHBVHHx-NP、CoFe2O4@P34HB-NP和CoFe2O4@PHBHHx-NP。
经TEM观察，三种CoFe2O4@PHA磁性纳米颗粒均为纳米级球形结构，CoFe2O4镶嵌在PHA材料内部。经马尔文粒径仪检测，CoFe2O4@PHBVHHx-NP的粒径为61~600 nm；CoFe2O4@P34HB-NP的粒径为58~600 nm；以及 CoFe2O4@PHBHHx-NP的粒径为66~600 nm。经热重分析仪测定，其CoFe2O4的质量比分别为：CoFe2O4@PHBVHHx-NP的1%~97%；CoFe2O4@P34HB-NP的1%~99%；CoFe2O4@PHBHHx-NP的1%~97%。
实施例3
多种NiFe2O4@PHA磁性纳米颗粒的获取
将0.059g乙酰丙酮铁、0 .021g乙酰丙酮镍、2.5 mL的油胺和2.5 mL石蜡油（有机溶剂）加入三口瓶中，在搅拌下通入氮气15 min，在110℃下反应1 h，再升温到200℃下反应2 h；冷却至室温，加入30 mL无水乙醇，离心分离并自然风干得到疏水性磁性成分NiFe2O4；再将疏水性磁性成分NiFe2O4分别分散于10 mL分别含有3g 的PHA（PHBVHHx、P34HB和PHBHHx）的有机溶剂溶液（二氯甲烷或三氯甲烷）中，低温超声搅拌2 min，形成油相；将油相加入1 L的1% PVA溶液中，低温超声搅拌10 min，形成乳化液；将乳化液进行机械搅拌，除去有机溶剂，得到三种NiFe2O4@PHA磁性纳米颗粒：NiFe2O4@PHBVHHx-NP、NiFe2O4@P34HB-NP和NiFe2O4@PHBHHx-NP。
经TEM观察，三种NiFe2O4@PHA磁性纳米颗粒均为纳米级球形结构，NiFe2O4镶嵌在PHA材料内部。经马尔文粒径仪检测，NiFe2O4@PHBVHHx-NP的粒径为64~600 nm；NiFe2O4@P34HB-NP的粒径为62~600 nm；以及 NiFe2O4@PHBHHx-NP的粒径为55~600 nm。经热重分析仪测定，其NiFe2O4的质量比分别为：NiFe2O4@PHBVHHx-NP的1%~97%；NiFe2O4@P34HB-NP的1%~97%；NiFe2O4@PHBHHx-NP的1%~98%。
实施例4
多种MnFe2O4@PHA磁性纳米颗粒的获取。
将0.059g乙酰丙酮铁、0 .021g乙酰丙酮锰、2.5 mL的油胺和2.5 mL石蜡油（有机溶剂）加入三口瓶中，在搅拌下通入氮气15 min，在110℃下反应1 h，再升温到200℃下反应2 h；冷却至室温，加入30 mL无水乙醇，离心分离并自然风干得到疏水性磁性成分MnFe2O4；再将疏水性磁性成分MnFe2O4分别分散于10 mL分别含有3g 的PHA（PHBVHHx、P34HB和PHBHHx）的有机溶剂溶液（二氯甲烷或三氯甲烷）中，低温超声搅拌2 min，形成油相；将油相加入1 L的1% PVA溶液中，低温超声搅拌10 min，形成乳化液；将乳化液进行机械搅拌，除去有机溶剂，得到三种MnFe2O4@PHA磁性纳米颗粒：MnFe2O4@PHBVHHx-NP、MnFe2O4@P34HB-NP和MnFe2O4@PHBHHx-NP。
经TEM观察，三种MnFe2O4@PHA磁性纳米颗粒均为纳米级球形结构，MnFe2O4镶嵌在PHA材料内部。经马尔文粒径仪检测，MnFe2O4@PHBVHHx-NP的粒径为61~600 nm；MnFe2O4@P34HB-NP的粒径为65~600 nm；以及 MnFe2O4@PHBHHx-NP的粒径为50~600 nm。经热重分析仪测定，其MnFe2O4的质量比分别为：MnFe2O4@PHBVHHx-NP的1%~97%；MnFe2O4@P34HB-NP的1%~98%；MnFe2O4@PHBHHx-NP的1%~97%。
实施例5
RGD修饰的PHA磁性纳米颗粒的制备与检测
将实施例1~实施例4中所制备的PHA磁性纳米颗粒分别与PhaP-RGD、PhaR-RGD和PhaC-RGD蛋白液混合，常温孵育2 h，PBS清洗2次，得到经RGD自组装修饰的PHA磁性纳米颗粒（RGD-PHA-MNP）。
经TEM观察，RGD-PHA-MNP均为纳米级球形结构；经马尔文粒径仪检测，RGD-PHA-MNP的粒径分布为50~660nm；经热重分析仪测定，RGD-PHA-MNP中PHA磁性纳米颗粒中磁性成分的质量比均与PhaP-RGD、PhaR-RGD和PhaC-RGD自组装修饰前相比不变。
实施例6
PhaP介导的RGD修饰的PHA磁性纳米颗粒的蛋白质成分鉴定
将实施例1中所制备的0.01g的Fe3O4@PHBVHHx-NP与1 ml的富含1% PhaP-RGD的蛋白液混合，常温孵育2 h，PBS清洗2次，得到经PhaP-RGD自组装修饰的Fe3O4@PHBVHHx-NP（Fe3O4@PHBVHHx@PhaP-RGD-NP）。利用单一的Fe3O4纳米颗粒作为对照组，将0.01g的Fe3O4纳米颗粒与富含1 ml的富含1% PhaP-RGD的蛋白液混合，常温孵育2 h，PBS清洗2次。
利用SDS-PAGE检测，Fe3O4@PHBVHHx@PhaP-RGD-NP所在泳道存在大量PhaP-RGD，说明其表面均绑定PhaP-RGD蛋白，而对照组单一的Fe3O4纳米颗粒表面不绑定任何PhaP-RGD蛋白。
实施例7
PHA磁性纳米颗粒的细胞毒性鉴定
对比考察实施例1中所制备的0.01g的Fe3O4@PHBVHHx-NP、Fe3O4@P34HB-NP和Fe3O4@PHBHHx-NP，及实施例5中经PhaP-RGD自组装修饰的Fe3O4@PHBVHHx@PhaP-RGD-NP、Fe3O4@P34HB@PhaP-RGD-NP和Fe3O4@PHBHHx@PhaP-RGD-NP的细胞毒性。
将上述PHA磁性纳米颗粒分散在无菌的PBS，分别加入105小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3、小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1和人骨髓间充质干细胞hBMSC。利用单一的Fe3O4纳米颗粒作为对照组。
共培养7天后，利用CCK-8试剂盒检测细胞活性。结果显示，除对照组（单一的Fe3O4纳米颗粒）外，所有实验组细胞均为正常生长，其生物相容性远优于单一的Fe3O4纳米颗粒。
实施例8
PHA磁性纳米颗粒的细胞吞噬行为
考察实施例1中所制备的0.01g的Fe3O4@PHBVHHx-NP的细胞吞噬行为。
将上述PHA磁性纳米颗粒分散在无菌的PBS，分别加入105人骨髓间充质干细胞hBMSC。共培养1天后，利用DAPI和AlexaFluor® 488 Phalloidin分别对细胞的细胞核和细胞骨架进行染色，利用激光共聚焦显微镜进行原位观察。如图8所示，Fe3O4@PHBVHHx-NP能被细胞吞噬，并位于细胞内部。
实施例9
PHA磁性纳米颗粒辅助细胞在磁场中固定和移动。
考察实施例1中所制备的0.01g的Fe3O4@PHBVHHx-NP的辅助细胞在磁场中固定和移动。
将上述PHA磁性纳米颗粒分散在无菌的PBS，分别加入105人骨髓间充质干细胞hBMSC。共培养1天后，胰酶消化重悬细胞，再利用五角星型磁体制造五角星型磁场。待静态培养1天后，移除五角星型磁场。利用DAPI和AlexaFluor® 488 Phalloidin分别对细胞的细胞核和细胞骨架进行染色，利用激光共聚焦显微镜进行原位观察。如图9所示，所形成的细胞群落形态为五角星型，成功实现细胞在磁场中固定和移动。
本发明实施例对比考察实施例1中所制备的0.01g的Fe3O4@PHBVHHx-NP、Fe3O4@P34HB-NP和Fe3O4@PHBHHx-NP，及实施例5中经PhaP-RGD自组装修饰的Fe3O4@PHBVHHx@PhaP-RGD-NP、Fe3O4@P34HB@PhaP-RGD-NP和Fe3O4@PHBHHx@PhaP-RGD-NP的细胞毒性。
本发明实施例将上述PHA磁性纳米颗粒分散在无菌的PBS，加入105小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3，利用单一的Fe3O4纳米颗粒作为对照组。
请参阅图6：本发明与不同的磁性纳米颗粒共培养7天的小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1的细胞活性变化。
本发明实施例将上述PHA磁性纳米颗粒分散在无菌的PBS，加入105小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1，利用单一的Fe3O4纳米颗粒作为对照组。
请参阅图7：本发明与不同的磁性纳米颗粒共培养7天的人骨髓间充质干细胞hBMSC的细胞活性变化。
本发明实施例将上述PHA磁性纳米颗粒分散在无菌的PBS，加入105人骨髓间充质干细胞hBMSC，利用单一的Fe3O4纳米颗粒作为对照组。
本发明实施例共培养7天后，利用CCK-8试剂盒检测细胞活性。
本发明实施例结果显示，除对照组（单一的Fe3O4纳米颗粒）外，所有实验组细胞均为正常生长，其生物相容性远优于单一的Fe3O4纳米颗粒。
请参阅图8：本发明 PHA磁性纳米颗粒的细胞吞噬行为
本发明考察实施例1中所制备的0.01g的Fe3O4@PHBVHHx-NP的细胞吞噬行为。
将上述PHA磁性纳米颗粒分散在无菌的PBS，分别加入105人骨髓间充质干细胞hBMSC。
共培养1天后，利用DAPI和AlexaFluor® 488 Phalloidin分别对细胞的细胞核和细胞骨架进行染色，利用激光共聚焦显微镜进行原位观察。
本发明实施例Fe3O4@PHBVHHx-NP能被细胞吞噬，并位于细胞内部。
请参阅图9：本发明 PHA磁性纳米颗粒辅助细胞在磁场中固定和移动。
本发明考察实施例1中所制备的0.01g的Fe3O4@PHBVHHx-NP的辅助细胞在磁场中固定和移动。
将上述PHA磁性纳米颗粒分散在无菌的PBS，分别加入105人骨髓间充质干细胞hBMSC。
本发明实施例共培养1天后，胰酶消化重悬细胞，再利用五角星型磁体制造五角星型磁场。待静态培养1天后，移除五角星型磁场。
本发明实施例利用DAPI和AlexaFluor® 488 Phalloidin分别对细胞的细胞核和细胞骨架进行染色，利用激光共聚焦显微镜进行原位观察。
本发明实施例所形成的细胞群落形态为五角星型，成功实现细胞在磁场中固定和移动。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种含蛋白质外壳的PHA磁性纳米颗粒，其特征在于：所述含蛋白质外壳的PHA磁性纳米颗粒的结构为核壳结构，可在磁场中固定和移动，粒径大小为50～600 nm，内核为PHA磁性纳米颗粒，外壳为PHA表面结合蛋白，采用标签的融合蛋白，所述融合蛋白是由RGD进行人工重组及微生物外源表达制备得到。
2.如权利要求1所述的PHA磁性纳米颗粒，其特征在于，所述的PHA磁性纳米颗粒由疏水性磁性成分与PHA类天然生物聚酯在有机溶剂溶液中分散形成油相，再加入到水相溶液中超声乳化形成乳化液，除去有机溶剂后制备所得；其中，PHA类天然生物聚酯为聚-β-羟基丁酸（PHB）、聚羟基丁酸酯戊酸共聚酯（PHBV）、聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸（PHBHHx）、聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸-3-羟基己酸（PHBVHHx）、聚3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯（P34HB）中的一种或几种的混合物；疏水性磁性成分为含氧化铁和/氧化钴和/氧化镍和/氧化锰的磁性纳米颗粒。
3.如权利要求1所述的PHA磁性纳米颗粒，其特征在于，所述的标签的融合蛋白的成分含有（1）能与PHA结合的标签蛋白：PhaP，PhaR，PhaC等一种或多种；（2）含有RGB序列的具有细胞粘附功能性蛋白或短肽；（3）荧光蛋白质。
4.如权利要求1-3任一项所述的PHA磁性纳米颗粒的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
将磁性成分分散于含PHA类天然生物聚酯的有机溶剂溶液中，低温超声搅拌形成油相；将油相加入稳定剂溶液中，低温超声搅拌形成乳化液；将乳化液进行机械搅拌，除去有机溶剂，得到镶嵌了磁性成分的PHA磁性纳米颗粒；
将PHA磁性纳米颗粒与蛋白液混合，常温或低温孵育，PBS清洗2次，即可得到经标签蛋白自组装修饰的PHA磁性纳米颗粒。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：油相中磁性成分的浓度为0.01%~0.5%；稳定剂溶液为十二烷基磺酸钠（SDS）、聚乙烯醇（PVA）、油酸钠（十八烯酸钠）中的一种或多种，浓度为0.1%~30%；其有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷中的一种或多种；油相和水相的体积比为1:10~1:30 (v/v)。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：PHA磁性纳米颗粒与蛋白液的质量比:102:1~105:1。
7.如权利要求1-3任一项所述的PHA磁性纳米颗粒的应用，其特征在于：可用于制备蛋白疫苗。
8.如权利要求1-3任一项所述的PHA磁性纳米颗粒的应用，其特征在于：可用于制备治疗用抗原。
9.如权利要求1-3任一项所述的PHA磁性纳米颗粒的应用，其特征在于：可用于生物识别。
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