CN104826139A - 一种rgd多肽靶向的超小四氧化三铁mri阳性纳米探针的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种RGD多肽靶向的超小四氧化三铁MRI阳性纳米探针的制备方法，包括：经一步溶剂热法合成得到表面柠檬酸钠稳定的超小Fe3O4纳米颗粒，然后将NH2-PEG-RGD修饰到纳米颗粒表面，得到RGD靶向的超小四氧化三铁MRI阳性分子探针。修饰了PEG-RGD的超小四氧化三铁纳米探针在小鼠体内具有长循环时间，并且在细胞水平和动物水平实现了对表面αvβ3整合素高表达癌细胞(U87MG细胞，人脑胶质瘤细胞)和皮下移植瘤的靶向T1加权增强MRI。本发明制备的Fe3O4纳米颗粒能够长时间稳定分散于水溶液中，不会出现团聚现象。本发明制备方法简单，成本低，具有产业化和商业化潜能。
Description
技术领域
本发明属于MRI纳米探针的制备领域，特别涉及一种RGD多肽靶向的超小四氧化三铁MRI阳性纳米探针的制备方法。
背景技术
癌症(cancer)，医学术语亦称恶性肿瘤，现在已直接或间接的影响许多人的生活，成为威胁人类健康的头号杀手。因此，早期的诊断和治疗成为治愈癌症的关键。在肿瘤的早期诊断方面，传统的影像技术只能了解肿瘤体积大小和解剖定位，而分子影像学技术可以获得更多的检测参数，如肿瘤生长动力学评估、恶变前的分子异常检测、肿瘤细胞标记物等，且活体分子成像可以实现在无损生物体微环境的状况下进行发病机制的研究，并帮助破译复杂的分子运动轨迹。目前应用于临床的分子影像学技术主要包括超声成像、核医学PET成像、CT成像和MRI等。作为MRI分子影像学的重要组成部分，造影剂的适当选择可以大大地提高成像诊断的灵敏性、特异性。而作为理想的且能应用于临床癌症早期靶向诊断的纳米材料体系，在生物安全性得以保障的同时，更要兼顾能同时携带靶向分子、成像试剂分子、制备方法简便、原材料价廉易得几个主要因素。目前应用于临床MRI的钆基小分子造影剂都存在不可克服的缺陷，如血液循环时间过短、无组织特应性，尤其是钆基造影剂一定浓度下还存在肾毒性。显而易见，金属或者金属氧化物纳米颗粒相对于金属离子螯合物要更加具有安全性，并且一定尺寸的纳米颗粒经表面修饰后不仅能延长血液循环时间，还能特异靶向肿瘤细胞或组织。至今已有大量文献报道利用磁性氧化铁纳米颗粒作为MRI阴性造影剂应用于癌症的诊断。然而，在人体血液中、钙离子富集区、金属离子沉积以及人体组织损伤部位在T2成像过程中也会出现信号减弱现象而得到负造影图像，这往往会干扰临床诊断。因此，临床医学界更期望开发具有信号增强作用的T1造影剂。已经有文献报道可以利用超小氧化铁纳米颗粒作为T1增强的MRI造影剂，但其合成方法一般为油相高温分解法，缺点是需要将颗粒从油相转入水相，而且很难在颗粒表面实施生物功能化(Sun et al.,J.Am.Chem.Soc.2008,7542–7543)。
检索国内外文献，尚没有发现关于用一步溶剂热法制备出超小四氧化三铁纳米颗粒经PEG-RGD环状多肽靶向修饰的MRI阳性造影剂及其体内肿瘤模型靶向MRI诊断的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种RGD多肽靶向的超小四氧化三铁MRI阳性纳米探针的制备方法。该方法工艺简单，反应条件温和，易于操作，成本较低，制备得到的Fe3O4纳米颗粒能够长时间稳定分散于水溶液中，不会出现团聚现象。
本发明的一种RGD多肽靶向的超小四氧化三铁MRI阳性纳米探针的制备方法，包括：
(1)将六水合氯化铁溶解在一缩二乙二醇DEG中，然后加入柠檬酸钠Na3Cit，在空气气氛下60～80℃搅拌，柠檬酸钠完全溶解后加入无水醋酸钠，搅拌至醋酸钠粉末完全溶解，将溶液转移至高压釜中，180～200℃反应3～4小时；自然冷却至室温，离心，弃上清液，用无水乙醇回溶，重复操作2～3次，将沉淀物烘干，得到超小四氧化三铁纳米颗粒；其中，六水合氯化铁、一缩二乙二醇、柠檬酸钠与无水醋酸钠的配比为1.081～1.09g：38～40mL：0.47～0.50g：1.312～1.33g；
(2)分别将Mal-PEG-NH2和巯基化的RGD溶解于DMSO中，然后将溶解于DMSO中的巯基化的RGD逐滴加入到Mal-PEG-NH2的DMSO溶液中，持续搅拌反应60～72小时，反应结束后透析，真空冷冻干燥，得到RGD-PEG-NH2；其中，Mal-PEG-NH2与RGD的摩尔比为1.5～2：1～1.5；
(3)将步骤(1)中的超小四氧化三铁纳米颗粒分散在DMSO中，超声，分别将EDC和NHS的DMSO溶液加入到超小四氧化三铁纳米颗粒的DMSO的分散液中，搅拌反应2～3小时，将反应结束后的溶液逐滴加入到步骤(2)中RGD-PEG-NH2的DMSO溶液中反应60～72小时，得到Fe3O4-PEG-RGD，透析，然后真空冷冻干燥，即得Fe3O4-PEG-RGD；其中，超小四氧化三铁纳米颗粒、EDC与NHS的质量比为160～168：134～144：65～70。
所述步骤(1)中搅拌的时间为1～2小时。
所述步骤(1)中离心为8500rpm离心15分钟。
所述步骤(1)中烘干温度为60℃。
所述步骤(2)中所采用的PEG为一端氨基另一端为马来酰亚胺基团，分子量为2000。
所述步骤(2)中透析时用截留分子量为2000的透析袋透析3天，每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次。
所述步骤(3)中透析时用截留分子量为8000～14000的透析袋透析3天，每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次。
柠檬酸钠是一种小分子羧酸盐，拥有三个羧基，被广泛地应用于纳米材料合成过程中的晶体生长抑制剂和稳定剂，不仅能提供影响纳米颗粒胶体稳定性的电荷排斥力，还使得纳米颗粒表面带上负电荷的羧基官能团，为纳米颗粒的表面多功能修饰提供了可行性。本发明选取的靶向分子环状RGD多肽，具有分子量小、无毒、无免疫原性、生物相容性好等多种优势。并且，前期的研究成果显示经一步水热法合成得到的氧化铁经PEG修饰后在体内可以保持长的血液循环时间(Li et al.,Biomaterials 34(2013)8382-8392)。正是基于氧化铁纳米颗粒选材廉价、安全性高、易于制备以及前期在纳米颗粒表面修饰的基础上，本发明采用了类似的方法(一步溶剂热法)合成出具有良好胶体稳定性的超小Fe3O4纳米颗粒。随后，Fe3O4纳米颗粒表面的NH2-PEG-RGD修饰不仅增加了纳米颗粒的水溶性和生物相容性，同时也提高了Fe3O4纳米颗粒对肿瘤细胞或肿瘤部位的靶向性，从而获得T1增强的MRI纳米探针，用于表面αvβ3整合素高表达癌细胞和肿瘤的特异性MRI诊断。
本发明先利用一步溶剂热法合成柠檬酸钠稳定的Fe3O4磁性纳米颗粒，然后将NH2-PEG-RGD修饰在纳米颗粒的表面。
本发明操作简便易行，原材料成本低。制备的纳米颗粒具有良好的水溶性、胶体稳定性和生物相容性。与没有RGD修饰的对照材料相比，修饰RGD的Fe3O4纳米颗粒对肿瘤细胞或肿瘤部位具有更好的靶向性。该方法制备的RGD靶向超小Fe3O4纳米颗粒在MRI分子影像诊断领域有着潜在的应用。
本发明使用核磁共振波谱(1H NMR)、红外(FTIR)、热重分析(TGA)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-OES)、Zeta电势、水合粒径等方法表征制备的磁性纳米颗粒，并通过MRI成像仪测定纳米颗粒的T1成像性能和r1弛豫率，然后通过溶血实验、MTT法和相差显微镜观察法评价纳米颗粒的血液相容性和细胞毒性，再利用普鲁士蓝染色法和电感耦合等离子体原子发射光谱法验证U87MG细胞对纳米颗粒的吞噬能力和修饰RGD后的靶向能力，体外和体内MRI实验检测RGD修饰的纳米材料对肿瘤细胞的靶向诊断效果。具体测试结果如下：
(1)核磁共振分析(1H NMR)的测试结果
通过分析RGD-PEG-NH2在氘代水中的氢谱(如图1)可知，RGD-PEG-NH2在6-10ppm出现的谱峰证明RGD已经成功连接到PEG上，并通过积分峰面积计算可知，每一个PEG上连接了0.47个RGD分子。
(2)红外光谱(FT-IR)测试结果
通过对得到的图谱(如图2)进行解析，曲线a、b、c中3436cm-1处的峰为吸附的水分子上OH的伸缩振动峰，图2a在2922cm-1和2841cm-1处的特征吸收峰和图2b在2916cm-1与2842cm-1处的峰归属于柠檬酸钠上亚甲基的伸缩振动。同时在1396-1642cm-1(C＝O的伸缩振动)和1064cm-1(C-O-C的伸缩振动)处的峰，均在Fe3O4、Fe3O4-PEG、Fe3O4-PEG-RGD样品上得到体现。而466-601cm-1上出现的特征吸收峰为Fe3O4上Fe-O的伸缩振动(图2a，b，c)。红外光谱图结果表明合成得到的超小四氧化三铁表面柠檬酸钠的存在，以及靶向分子RGD和PEG的存在。
(3)纳米颗粒Zeta电势及水合粒径测试结果
本发明制备得到的Fe3O4纳米颗粒表面有大量的柠檬酸钠存在而具有较高的负电荷，较高的负电荷使得纳米颗粒之间产生相互的排斥作用而具有很好的胶体稳定性。所示：合成得到的柠檬酸钠稳定的Fe3O4表面电势和水合粒径分别为-39.7mV和14.6nm。而经过修饰NH2-PEG-RGD和mPEG-NH2之后，实验组材料Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒的表面电势和水合粒径分别为-10.1mV和212.5nm，而对照组材料Fe3O4-PEG纳米颗粒的表面电势和水合粒径分别为-8.8mV和168.7nm。从实验结果得出，超小四氧化三铁纳米颗粒在修饰NH2-PEG-RGD和mPEG-NH2之后表面电势在升高，并向中性电势靠近。
(4)热重分析(TGA)测试结果
通过对样品Fe3O4，Fe3O4-PEG和Fe3O4-PEG-RGD进行热重分析得出，Fe3O4的失重量为65.6％(图3a)，Fe3O4-PEG和Fe3O4-PEG-RGD的失重分别是58.9％(图3b)和55.3％(图3c)，由此定量分析出PEG和RGD连接到Fe3O4纳米颗粒比例分别为6.7％和3.6％。
(5)透射电子显微镜(TEM)测试结果
通过TEM观察本发明制备的Fe3O4-PEG(图4a)纳米颗粒和Fe3O4-PEG-RGD(图4b)纳米颗粒的形态和粒径。TEM测试结果显示制备得到的Fe3O4-PEG和Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒呈球形或者近似球形状，经过统计分析后得到Fe3O4-PEG平均直径为2.72±0.17nm，Fe3O4-PEG-RGD的平均直径为2.71±0.2nm，两者的平均直径并没有明显的区别。
(6)r1弛豫率测量结果
r1弛豫率反映Fe3O4纳米粒子作为MRI造影剂的效率，为单位摩尔浓度铁的纵向弛豫时间，可通过不同浓度下的T1弛豫时间的倒数拟合计算得到。图5为本发明制备的Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照组材料Fe3O4-PEG的T1弛豫时间倒数与Fe浓度的线性拟合图，可以看出这两种Fe3O4纳米材料的弛豫时间倒数随着铁浓度的增加(在0.1-1.6mM浓度范围内)具有很好的线性关系。并且通过计算可得本发明制备的Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照材料Fe3O4-PEG的r1弛豫率分别为1.37mM-1s-1和1.15mM-1s-1。因此，本发明所制备的Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照材料Fe3O4-PEG纳米颗粒均可作为MRI分子影像学诊断中的优良T1信号增强造影剂。
(7)T1加权MR成像测量结果
图6是本发明制备得到的Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒(6a)和对照材料Fe3O4-PEG纳米颗粒(6b)的T1加权MR成像性能测试，从图中可以看出随着铁浓度(0.05-0.8mM)的提高，MRI信号逐渐增强，并且呈良好的梯度关系。结果说明制备得到的两组材料都具有良好的MRI信号增强造影剂应用潜质。
(8)血液相容性
由于造影剂的给药途径多数情况下是经由静脉注射方式进入体内的。因此，造影剂势必会与血液直接接触。而造影剂的介入会不会产生溶血或者其他不良症状便成为科研工作者不得不考虑的重要因素之一。本发明通过溶血试验评估了制备得到的Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照材料Fe3O4-PEG纳米颗粒的血液相容性。图7中显示了Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG在不同铁浓度(10、20、40、60、80μg/mL)下经过1个小时孵育之后离心观察溶血结果，结果显示阳性对照组(水)完全溶血，阴性对照组(PBS)、实验组以及对照组并未出现溶血现象。此外，通过测量上层清液中血红蛋白的吸光值来定量分析纳米材料的溶血性能。如图7中柱状图所示，即使在铁浓度达到80μg/mL时，Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照材料Fe3O4-PEG纳米颗粒的溶血率均小于5％，说明制备得到的纳米材料具有良好的血液相容性，具有安全用于生物体内MR成像的潜质。
(9)MTT细胞活力和相差显微镜测试结果
通过MTT比色法测定U87MG细胞的活力来检测本发明制备得到的Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照材料Fe3O4-PEG纳米颗粒的细胞毒性(如图8)。U87MG细胞分别与Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照材料Fe3O4-PEG纳米颗粒(铁浓度为5、10、25、50和100μg/mL)在37℃下共培养24小时。然后，经MTT处理后在570nm处测量吸光值，以缓冲液PBS组的吸收值为基准，不同浓度的材料处理后的吸收值与之相比计算得到U87MG细胞的存活率。实验结果显示Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照材料Fe3O4-PEG纳米颗粒在给定浓度5到100μg/mL范围内对U87MG细胞的存活率没有显著性差异，细胞存活率均在80％以上(如图8)。这说明Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照材料Fe3O4-PEG纳米颗粒具有良好的细胞相容性。同时，通过相差显微镜观察材料是否会对U87MG细胞的形貌产生影响，如图9所示U87MG细胞经过PBS缓冲液((a)、(l))、Fe3O4-PEG(b-f，分别对应铁浓度为5、10、25、50和100μg/mL)和实验组材料Fe3O4-PEG-RGD(g-k，分别对应铁浓度为5、10、25、50和100μg/mL)处理24小时后的相差显微镜细胞形貌图。不同浓度的Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照材料Fe3O4-PEG纳米颗粒(铁浓度分别为5、10、25、50和100μg/mL)处理24小时后的细胞形态和PBS处理的细胞相比，没有明显的变化，说明了合成的材料不会对细胞产生影响，进一步证明材料在给定浓度范围内具有细胞相容性。
(10)普鲁士蓝染色检测结果
通过普鲁士蓝染色检测U87MG细胞对本发明制备的Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照材料Fe3O4-PEG纳米颗粒在不同浓度下的吞噬情况如图10，U87MG细胞经过PBS缓冲液(a，f)、Fe3O4-PEG(b和c，Fe浓度分别在50和100μg/mL)和Fe3O4-PEG-RGD(d，e，Fe浓度分别在50和100μg/mL)纳米颗粒处理4小时后经普鲁士蓝染色后的结果。U87MG细胞分别与Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照组材料Fe3O4-PEG纳米颗粒(Fe浓度为50和100μg/mL)在37℃下共培养4小时，并且以PBS处理的细胞作为对照组。然后通过普鲁士蓝染色法检测细胞对两种纳米颗粒的吞噬。在图10中，随着Fe浓度的提高，Fe3O4-PEG-RGD处理后细胞经染色后明显呈现蓝色，而Fe3O4-PEG处理后细胞经染色后蓝色程度增加不明显。值得注意的是对比两种材料在相同铁浓度下处理细胞后的染色图片可以看出，Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒组蓝色明显要比对照组Fe3O4-PEG处理后细胞深。这些结果说明修饰的RGD赋予了纳米颗粒对U87MG细胞的特异靶向能力。
(11)电感耦合等离子体原子发射光谱法定量检测U87MG细胞对纳米颗粒的吞噬结果
RGD的靶向性能同样通过电感耦合等离子体原子发射光谱法来验证(如图11)，U87MG细胞分别与PBS、本发明制备的Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照组材料Fe3O4-PEG纳米颗粒(Fe浓度为20、40、60、80、100μg/mL)在37℃下共培养4小时，用PBS清洗三次，再用胰酶消化后悬浮细胞，之后用细胞计数器计数细胞的数量，最后用王水消化细胞，用ICP测定铁元素含量，最终算出每个细胞吞噬的铁含量。在图11中，经过PBS处理的细胞内几乎没有铁元素，Fe3O4-PEG-RGD处理的细胞内随着浓度提高，铁元素的含量明显上升。当铁浓度为100μg/mL时，单个U87MG细胞吞噬Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒铁元素达到9.45pg/cell；而Fe3O4-PEG处理的细胞内随铁浓度的增加吞噬量增加程度不明显，当铁浓度为100μg/mL时，单个U87MG细胞吞噬Fe3O4-PEG纳米颗粒铁元素仅仅为4.37pg/cell。并且在比较两组材料在相同铁浓度下的吞噬量可以看出，修饰RGD的Fe3O4-PEG纳米颗粒被U87MG细胞的吞噬要明显高于没有修饰RGD的纳米颗粒，这进一步说明RGD修饰的纳米颗粒对U87MG细胞有更好的靶向性，从而为该材料高效地应用于体内MRI提供了可靠的依据。
(12)体外细胞MRI成像结果
在进行体内实验之前，对本发明制备的Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照组材料Fe3O4-PEG纳米颗粒的细胞MR成像效果进行评价(如图12所示)。U87MG细胞分别与Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG纳米颗粒(Fe浓度为5，10，25，50和100μg/mL)在37℃下共培养4小时。如图12所示，随着Fe浓度的提高，Fe3O4-PEG或者Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒处理后的细胞均表现出MRI信号增强的趋势，说明随着Fe浓度的增加，细胞对纳米颗粒的吞噬量也增加。需要指出的是，在相同的Fe浓度下，Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒处理后的细胞比对照材料Fe3O4-PEG处理后的MRI信号增强更明显，说明靶向分子RGD的存在使得细胞对Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒的吞噬量要大大高于Fe3O4-PEG纳米颗粒。
(13)体内肿瘤MR成像结果
通过尾静脉注射本发明制备的Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照组材料Fe3O4-PEG来评价肿瘤部位的MRI成像效果(如图13)，与注射前的对照组相比较，在注射后15分钟到3小时内，注射对照材料Fe3O4-PEG(Fe：450μg)的裸鼠肿瘤部位明暗程度变化并不明显，而注射Fe3O4-PEG-RGD(Fe：450μg)的裸鼠肿瘤明显变亮，展示出RGD修饰的纳米颗粒具有明显的MRI肿瘤诊断效果。图14是相应注射时间点的肿瘤MRI信噪比值变化，在注射后30分钟到4小时，注射Fe3O4-PEG的裸鼠肿瘤MRI信号值变化不明显，而注射Fe3O4-PEG-RGD的裸鼠肿瘤MRI信号值明显，这与图13的结果一致。这些结果说明本发明制备的Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒具有很好的肿瘤靶向能力，能成功应用于体内靶向MRI肿瘤诊断。
(14)体内组织分布结果
为了研究纳米颗粒的生物组织分布情况，ICP-OES用来测量在注射后12小时各个重要器官中铁的含量(图15)。从图中可看出在注射对照材料Fe3O4-PEG和本发明制备的Fe3O4-PEG-RGD(Fe：450μg)纳米颗粒后，肝、脾中铁的含量较注射前均明显增加，而在其他的器官，比如：心、肺、肾和肿瘤，铁的含量较少。同时需要指出的是，注射Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒的小鼠肿瘤部位铁的含量明显高于注射Fe3O4-PEG纳米颗粒的情况。这些结果不仅证明了Fe3O4-PEG-RGD对肿瘤部位具有很好的靶向性，而且说明本发明制备的纳米颗粒能在小鼠体内正常的代谢清除。
有益效果
(1)本发明采用简单的一步溶剂热法制备水溶性良好的柠檬酸钠稳定的超小Fe3O4纳米颗粒，然后在纳米颗粒表面修饰PEG-RGD，得到的Fe3O4-PEG-RGD纳米探针应用于MRI阳性增强造影剂；操作工艺简单，反应条件温和环境友好，易于操作分离，具有实施商业化的前景；
(2)本发明制备的Fe3O4纳米颗粒能够长时间地稳定分散于水中不会出现团聚或者沉淀现象；柠檬酸钠增加了Fe3O4纳米颗粒的稳定性，PEG-RGD的表面修饰不仅增加了Fe3O4纳米颗粒的生物相容性和亲水性，而且赋予纳米颗粒对肿瘤细胞或者肿瘤部位的靶向特异性；这些优点使制备的RGD靶向性Fe3O4纳米颗粒可以有效地用作体内MR成像的阳性纳米探针。
附图说明
图1是实施例1中制备的RGD-PEG-NH2的核磁共振氢谱图；
图2是实施例2中得到的Fe3O4(a)、Fe3O4-PEG(b)、Fe3O4-PEG-RGD(c)的红外光谱图；
图3是实施例2中得到的Fe3O4(a)、Fe3O4-PEG(b)、Fe3O4-PEG-RGD(c)的热重分析图；
图4是实施例2中得到的Fe3O4-PEG(a)和Fe3O4-PEG-RGD(b)的透射电镜图及粒径分布图；
图5是实施例2中得到的Fe3O4-PEG、Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒的T1弛豫时间倒数与Fe浓度的线性关系图；
图6是实施例2中得到的Fe3O4-PEG-RGD(a)和对照组材料Fe3O4-PEG(b)纳米颗粒在铁浓度为0.05-0.8mM的T1加权MR成像；
图7是实施例3中得到的Fe3O4-PEG-RGD和对照组材料Fe3O4-PEG在铁浓度为10-80μg/mL下溶血实验结果；
图8是实施例4中得到的MTT法测得U87MG细胞经过PBS缓冲液(对照)、Fe3O4-PEG-RGD和对照组材料Fe3O4-PEG在铁浓度为(5μg/mL，10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，100μg/mL)处理24小时后的细胞活力；
图9是实施例4中得到的U87MG细胞经过PBS缓冲液((a)、(l))、Fe3O4-PEG(b-f，铁浓度分别为5、10、25、50和100μg/mL)和对照组材料Fe3O4-PEG-RGD(g-k，铁浓度分别为5、10、25、50和100μg/mL)处理24小时后的相差显微镜细胞形貌图；
图10是实施例5中得到的U87MG细胞经过PBS缓冲液(a，f)、Fe3O4-PEG(b，c，Fe浓度分别在50和100μg/mL)和Fe3O4-PEG-RGD(d，e，Fe浓度分别在50和100μg/mL)纳米颗粒处理4小时后经普鲁士蓝染色后的结果；
图11是实施例5中得到的U87MG细胞经过PBS缓冲液、对照组材料Fe3O4-PEG和实验组Fe3O4-PEG-RGD在Fe浓度为20-100μg/mL时处理4小时后收集细胞，经王水消化后利用ICP-OES测定得到每个细胞内的铁含量结果；
图12是实施例6中得到的U87MG细胞经Fe3O4-PEG-RGD和对照组材料Fe3O4-PEG在铁浓度为5、10、25、50、和100μg/mL时处理4小时后的T1加权MRI图；
图13是实施例7中得到的尾静脉注射实施例1中得到的Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照组材料Fe3O4-PEG(450μg Fe/mouse)后不同时间点裸鼠肿瘤的T1加权MR成像图片；
图14是实施例7中得到的尾静脉注射实施例1中得到的Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照组材料Fe3O4-PEG(450μg Fe/mouse)后不同时间点裸鼠肿瘤的MRI信噪比值变化；
图15是实施例7中得到的尾静脉注射实施例1中得到的Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照组材料Fe3O4-PEG(450μg Fe/mouse)后12小时，纳米颗粒在裸鼠体内各脏器中的分布结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
将1.09g六水合氯化铁溶解在40mL一缩二乙二醇(又名二甘醇，DEG)中，然后将0.47g柠檬酸钠(Na3Cit)溶解在上述溶液，并于空气气氛下80℃搅拌1小时，待柠檬酸钠完全溶解后再将1.312g的无水醋酸钠加入到上述溶液中，持续搅拌至醋酸钠粉末完全溶解，然后将溶液转移至50mL的高压反应釜中，于200℃反应4小时；反应结束后，自然冷却至室温，将产物转移至50mL离心管中8500rpm离心15分钟，弃上清液，用无水乙醇回溶，8500rpm离心15分钟，重复操作3次，然后将沉淀物在60℃烘干得到超小四氧化三铁纳米颗粒；从表面电势和水合粒径数据中(表1)可以看出，用溶剂热法合成得到的表面柠檬酸钠稳定的超小四氧化三铁纳米颗粒的表面电势为-39.7mV，水合粒径为14.6nm。
分别将Mal-PEG-NH2和RGD溶解于DMSO中，然后将RGD逐滴加入到Mal-PEG-NH2的DMSO溶液中，持续搅拌反应72小时，反应结束后用截留分子量为2000的透析袋透析3天(每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次)，然后真空冷冻干燥，即得RGD-PEG-NH2；从核磁共振氢谱数据可以看得(如图1所示)，RGD已经成功的偶联在Mal-PEG-NH2上，并且通过积峰计算出每个PEG连接了0.47个RGD。
将制备得到的Fe3O4纳米颗粒分散DMSO溶剂中并超声10分钟使其完全分散，分别将EDC和NHS的DMSO溶液加入到上述Fe3O4(DMSO溶液)中，搅拌反应3小时，将活化后的Fe3O4溶液逐滴加入到得到RGD-PEG-NH2(DMSO溶液)中反应72小时，得到产物Fe3O4-PEG-RGD，反应结束后用截留分子量为8000-14000的透析袋透析3天(每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次)，然后真空冷冻干燥，即得Fe3O4-PEG-RGD。
表1.Fe3O4、Fe3O4-PEG和Fe3O4-PEG-RGD的电势和水动力直径
| 样品 | 电势(mV) | 水动力直径(nm) | 多分散系数 |
| Fe3O4 | -39.7 | 14.6 | 0.129 |
| Fe3O4-PEG | -8.8 | 168.7 | 0.153 |
| Fe3O4-PEG-RGD | -10.01 | 212.5 | 0.359 |
实施例2
分别取实施例1制备的Fe3O4、Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对比例1制备得到的Fe3O4-PEG纳米颗粒2mg溶解在超纯水中，得到纳米颗粒悬液，超声均匀，测表面电势和水合粒径。实验结果表明，制备得到的Fe3O4、Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG纳米颗粒的表面电势分别为-39.7、-10.1和-8.8mV；水合粒径分别为14.6、212.5和168.7nm。从表面电势和水合粒径的变化可以得出PEG或者PEG-RGD已经成功地修饰在四氧化三铁纳米颗粒表面。
分别称取实施例1制备得到的两种材料：Fe3O4、Fe3O4-PEG-RGD和对比例1得到的对照组材料Fe3O4-PEG 2mg进行红外光谱测试(如图2所示)和热重分析(如图3所示)。红外光谱图结果表明合成得到的超小四氧化三铁表面柠檬酸钠的存在，以及修饰靶向分子RGD和PEG的存在。此外，TGA测试结果表明，Fe3O4的失重量为65.6％(图3a)，Fe3O4-PEG和Fe3O4-PEG-RGD的失重分别是58.9％(图3b)和55.3％(图3c)，由此定量分析出PEG和RGD连接到Fe3O4纳米颗粒的表面的上载率分别为6.7％和3.6％。
为了对制备得到的纳米颗粒的尺寸和形貌进行表征，分别取本发明实施例1制备的Fe3O4-PEG-RGD和对比例1制备的Fe3O4-PEG纳米颗粒溶解在100μL超纯水中配制成纳米颗粒悬浮液。各取5μL Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG纳米颗粒悬浮液各滴在铜网表面，并在空气中晾干后用于TEM测试(如图4所示)。TEM结果显示Fe3O4-PEG-RGD(图4a)和Fe3O4-PEG(图4b)纳米颗粒的形貌均为球形或近似球形，经过统计分析后得到Fe3O4-PEG-RGD平均直径为2.72±0.17nm，Fe3O4-PEG-RGD的平均直径为2.71±0.2nm。
将本发明制备的Fe3O4-PEG-RGD(实施例1)纳米颗粒和对照材料Fe3O4-PEG(对比例1)通过ICP-OES测试法测得溶液中Fe元素的浓度，再用超纯水配制Fe浓度依次为0.1、0.2、0.4、0.8和1.6mM的水溶液2mL，测定不同Fe浓度下的T1弛豫时间(如图5所示)和T1加权成像(如图6所示，Fe3O4-PEG-RGD(6a)和对照组材料Fe3O4-PEG(6b)纳米颗粒在铁浓度为0.05-0.8mM的T1加权MR成像)。弛豫率测试结果表明Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG纳米颗粒的T1弛豫时间倒数在Fe浓度为0.1-1.6mM范围内随着铁浓度的增加具有很好的线性关系。并且通过计算可知Fe3O4-PEG-RGD的r1弛豫率1.37mM-1s-1，Fe3O4-PEG的r1弛豫率为1.15mM-1s-1，都具有良好的T1弛豫效应和r1弛豫率。同时T1加权成像也显示两种材料随铁浓度的提高，信号强度增强。因此，本发明所制备的Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG纳米颗粒可作为MRI分子影像学诊断中的优良T1信号增强造影剂。
实施例3
为了确保本发明制备的纳米颗粒能安全地用于体内生物成像诊断，对制备得到的Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照材料Fe3O4-PEG的血液相容性进行了评价。根据实施例2中测定的两种材料的铁浓度计算称量出Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒(实施例1)和对照材料Fe3O4-PEG(对比例1)中铁元素总量各1mg的两种纳米颗粒，分别分散于PBS中配制成1mg/mL的浓度为母液，然后用PBS依次配制浓度为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL和80μg/mL的纳米颗粒悬浮液。取适量的人新鲜血液，首先离心(2000rpm，5分钟)去上清液，然后将血红细胞用PBS洗涤5次，收集健康的红细胞并用PBS稀释10倍。再将Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG纳米材料(10-80μg/mL)与红细胞混合静置2小时后，10000rpm离心1分钟，拍照并测上清液的紫外吸收值。该过程以超纯水作为阳性对照，PBS作为阴性对照。图7中显示了Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG在给定铁浓度为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL和80μg/mL下的溶血性测试结果。通过测量上层清液的吸光度值定量评价纳米材料的溶血性。如图7显示，在浓度达到80μg/mL时，Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG的溶血率都小于5％，说明制备的这些纳米材料具有很好的血液相容性，因而可以安全地用于生物体内MR成像。
实施例4
以U87MG细胞为模型细胞评价本发明制备的Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒和对照材料Fe3O4-PEG对细胞存活的影响。称取Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒(实施例1)和对照材料Fe3O4-PEG(对比例1)干粉(两种材料铁元素的含量为1mg)，分散在无菌PBS中配制成1mg/mL的PBS溶液，并用紫外照射过夜杀菌。然后在超净工作台中用无菌PBS配制浓度为5、10、25、50和100μg/mL的Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG纳米颗粒悬浮液。U87MG细胞种植于96孔板后分别与Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG纳米颗粒(浓度为5、10、25、50和100μg/mL)在37℃下共培养24小时。然后，向培养板孔中加入20μL MTT，继续在37℃下培养4小时后，弃去培养液，并加入100μL DMSO，振荡20分钟后在570nm处测量吸光值，并根据此值计算细胞的活力(如图8)。与对照组相比(PBS处理细胞组)，Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG在实验浓度0到100μg/mL范围内对U87MG细胞的存活率没有显著性差异，细胞存活率都在80％以上。这充分说明合成的Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG均具有良好的细胞相容性，可以应用到生物体内MRI成像检测。通过相差显微镜观察法来验证制备得到的材料对细胞形态是否会产生影响。如图9所示，不同浓度(5、10、25、50和100μg/mL)的Fe3O4-PEG-RGD(g-k)和Fe3O4-PEG纳米材料(b-f)处理24小时后的细胞形态和PBS处理后的细胞相比，没有明显的变化，进一步说明了合成的材料的良好细胞相容性。
实施例5
通过普鲁士蓝染色法检测不同浓度的纳米颗粒(50、100μg/mL)与U87MG细胞共培养4小时后细胞的普鲁士蓝染色来评价RGD的靶向性效果，如图10，U87MG细胞经过PBS缓冲液(a，f)、Fe3O4-PEG(b，c)和Fe3O4-PEG-RGD(d，e)纳米颗粒(Fe浓度分别在50和100μg/mL)处理4小时后经普鲁士蓝染色后的结果。采用实施例2中和对比例1中按照铁元素含量配置成相应浓度为50和100μg/mL的Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG两种纳米颗粒悬液。U87MG细胞以2×105个/孔种植于12孔板，过夜培养后再分别与Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG纳米颗粒(Fe浓度为50和100μg/mL)在37℃下共培养4小时，并且以PBS处理的细胞作为对照组。共培养后细胞用PBS洗三次，再用胰酶消化并离心，弃上清液，将细胞悬浮于1mL PBS中。通过染色后用相差显微镜拍照记录细胞吞噬四氧化三铁纳米颗粒后染成蓝色的深浅来定性分析细胞吞噬纳米颗粒的多少。在图10中随着Fe浓度的增加，Fe3O4-PEG-RGD处理后细胞经染色后呈现深蓝色，而对照材料Fe3O4-PEG处理后细胞染色后呈现较弱的蓝色，并且比较两组材料在相同铁浓度下，有RGD修饰的四氧化三铁纳米颗粒处理后的细胞蓝色程度明显深于未修饰RGD的四氧化三铁纳米颗粒处理后的细胞。这说明RGD修饰后赋予了纳米颗粒对αvβ3整合素高表达的U87MG细胞具有较高的特异靶向能力。此外，采用ICP-AES技术定量分析了平均每个细胞吞噬Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG纳米颗粒的质量，细胞的处理方式与普鲁士蓝染色一致。当不同浓度的纳米颗粒与细胞共培养24小时后，用PBS洗涤细胞3次，然后胰酶消化、计数，最终用王水硝解细胞，用ICP-AES测试每孔吞噬铁元素的总量，再除以细胞数目，得出每个细胞吞噬铁含量。如图11所示，经过PBS处理的细胞内几乎没有铁元素，Fe3O4-PEG-RGD处理的细胞内随着浓度提高，铁元素的含量明显上升。当铁浓度为100μg/mL时，单个U87MG细胞吞噬Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒铁元素达到9.45pg/cell；而Fe3O4-PEG处理的细胞内随铁浓度的增加吞噬量增加程度不明显，当铁浓度为100μg/mL时，单个U87MG细胞吞噬Fe3O4-PEG纳米颗粒铁元素仅仅为4.37pg/cell。并且在比较两组材料在相同铁浓度下的吞噬量可以看出，修饰RGD的Fe3O4-PEG纳米颗粒对于U87MG细胞的吞噬要明显高于没有修饰RGD的纳米颗粒，这进一步说明RGD修饰的纳米颗粒对U87MG细胞有更好的靶向性。
实施例6
在体内成像实验之前，对纳米颗粒的细胞MR成像效果进行了评价。用无菌PBS分别配制成Fe浓度为5、10、25、50和100μg/mL的两种纳米颗粒悬浮液(实施例1中的Fe3O4-PEG-RGD和对比例1中的Fe3O4-PEG)。U87MG细胞以3×106个/孔种植于25cm2细胞培养瓶中，培养过夜后，分别与Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG纳米颗粒在37℃下共培养4小时。培养结束后细胞用PBS洗3次，再胰酶消化、离心、过滤，最后分散在1mL PBS(含0.5％琼脂糖)中。用核磁共振成像仪测试各细胞样品的T1加权成像(如图12)。如图所示，随着Fe浓度的增加，Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG纳米颗粒处理后的细胞均表现出MRI信号增强的趋势，说明随着Fe浓度的增加，细胞对纳米颗粒的吞噬量也增加。需要指出的是，在同样Fe浓度下，Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒处理后的细胞比Fe3O4-PEG处理后细胞的MRI信号增强更明显，说明细胞对Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒的吞噬量要大大高于Fe3O4-PEG纳米颗粒。这些结果不仅说明制备得到的纳米颗粒具有很好的细胞MR成像效果，而且证明了Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒对肿瘤细胞的特异靶向性。
实施例7
将本发明制备的Fe3O4-PEG-RGD(实施例1)和对照材料Fe3O4-PEG(对比例1)按照ICP-OES测定的铁浓度配置成1mg/mL的0.45mL PBS分散液。2×106个KB细胞接种到裸鼠体内，三周后待肿瘤直径达到0.6-1cm时，通过尾静脉注射Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG纳米颗粒PBS溶液来评价肿瘤部位的MR成像效果(如图13)。与注射前相比较，在注射后15分钟到3小时内，注射0.45mL对照材料Fe3O4-PEG(450μg Fe/mouse)的裸鼠肿瘤部位信号稍微增强而肿瘤稍微变亮，而注射0.45mL Fe3O4-PEG-RGD(450μg Fe/mouse)的裸鼠肿瘤部位信号明显增强，展示出RGD修饰的纳米颗粒具有明显的MRI肿瘤诊断效果。图14是相应注射时间的肿瘤部位MRI信号与噪音比值变化，在注射后15分钟到3小时，注射对照材料Fe3O4-PEG的裸鼠肿瘤MRI信号值变化不明显，而注射Fe3O4-PEG-RGD的裸鼠肿瘤MRI信号值明显增强。这些结果说明该制备的Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒具有很好的肿瘤靶向能力，能成功应用于体内肿瘤靶向MRI成像诊断的造影剂。
为了研究纳米颗粒的生物组织分布情况，将经尾静脉注射Fe3O4-PEG-RGD和Fe3O4-PEG的裸鼠处死并解剖，取出心、肝、脾、肺、肾、肿瘤称重，剪成2×2mm的碎块，然后用王水消化24小时，再用ICP-OES来测量各个样品的铁元素含量，最后计算出各个重要器官中铁的含量(图15)。从图中可看出在注射对照材料Fe3O4-PEG和本发明制备的Fe3O4-PEG-RGD(450μg Fe/mouse)纳米颗粒后，肝、脾中铁的含量较注射前均明显增加，而在其他的器官，比如：心、肺、肾和肿瘤，铁的含量较少。同时需要指出的是，注射Fe3O4-PEG-RGD纳米颗粒的小鼠肿瘤部位铁的含量明显高于注射Fe3O4-PEG纳米颗粒的情况。这些结果不仅证明了Fe3O4-PEG-RGD对肿瘤部位具有很好的靶向性，而且说明本发明制备的纳米颗粒能在小鼠体内正常的代谢清除。
对比例1
为了比较RGD的靶向性，按照实施例1中的方法和步骤合成得到Fe3O4纳米颗粒。然后将制备得到的Fe3O4纳米颗粒分散在DMSO溶剂中并超声10分钟使其完全分散，分别将EDC和NHS的DMSO溶液加入到上述Fe3O4(DMSO溶液)中，搅拌反应3小时，将活化后的Fe3O4溶液逐滴加入到得到mPEG-NH2(DMSO溶液)中反应72小时，得到产物Fe3O4-PEG，反应结束后用截留分子量为8000～14000的透析袋透析3天(前三次用PBS缓冲液透析，每次透析所用PBS缓冲液或者蒸馏水2L，共换PBS缓冲液或者水9次)，然后真空冷冻干燥，即得Fe3O4-PEG。产物Fe3O4-PEG的表征详见实施例2。
Claims (7)
1.一种RGD多肽靶向的超小四氧化三铁MRI阳性纳米探针的制备方法，包括：
(1)将六水合氯化铁溶解在一缩二乙二醇DEG中，然后加入柠檬酸钠Na3Cit，在空气气氛下60～80℃搅拌，柠檬酸钠完全溶解后加入无水醋酸钠，搅拌至醋酸钠粉末完全溶解，将溶液转移至高压釜中，180～200℃反应3～4小时；自然冷却至室温，离心，弃上清液，用无水乙醇回溶，重复操作2～3次，将沉淀物烘干，得到超小四氧化三铁纳米颗粒；其中，六水合氯化铁、一缩二乙二醇、柠檬酸钠与无水醋酸钠的配比为1.081～1.09g：38～40mL：0.47～0.50g：1.312～1.33g；
(2)分别将Mal-PEG-NH2和巯基化的RGD溶解于DMSO中，然后将溶解于DMSO中的巯基化的RGD逐滴加入到Mal-PEG-NH2的DMSO溶液中，持续搅拌反应60～72小时，反应结束后透析，真空冷冻干燥，得到RGD-PEG-NH2；其中，Mal-PEG-NH2与RGD的摩尔比为1.5～2：1～1.5；
(3)将步骤(1)中的超小四氧化三铁纳米颗粒分散在DMSO中，超声，分别将EDC和NHS的DMSO溶液加入到超小四氧化三铁纳米颗粒的DMSO的分散液中，搅拌反应2～3小时，将反应结束后的溶液逐滴加入到步骤(2)中RGD-PEG-NH2的DMSO溶液中反应60～72小时，得到Fe3O4-PEG-RGD，透析，然后真空冷冻干燥，即得Fe3O4-PEG-RGD；其中，超小四氧化三铁纳米颗粒、EDC与NHS的质量比为160～168：134～144：65～70。
2.根据权利要求1所述的一种RGD多肽靶向的超小四氧化三铁MRI阳性纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中搅拌的时间为1～2小时。
3.根据权利要求1所述的一种RGD多肽靶向的超小四氧化三铁MRI阳性纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中离心为8500rpm离心15分钟。
4.根据权利要求1所述的一种RGD多肽靶向的超小四氧化三铁MRI阳性纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中烘干温度为60℃。
5.根据权利要求1所述的一种RGD多肽靶向的超小四氧化三铁MRI阳性纳米探针的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中PEG的分子量为2000。
6.根据权利要求1所述的一种RGD多肽靶向的超小四氧化三铁MRI阳性纳米探针的制备方法，其特征如下，所述步骤(2)中透析时用截留分子量为2000的透析袋透析3天，每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次。
7.根据权利要求1所述的一种RGD多肽靶向的超小四氧化三铁MRI阳性纳米探针的制备方法，其特征如下，所述步骤(3)中透析时用截留分子量为8000～14000的透析袋透析3天，每次透析所用蒸馏水2L，共换水9次。
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