CN104645363A - 一种叶酸靶向99mTc标记的锰基螯合物MR/SPECT双模态探针的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种叶酸靶向99mTc标记的锰基螯合物MR/SPECT双模态探针的制备方法，将螯合试剂DOTA-NHS修饰到G5表面；将靶向分子FA连接到G5表面；将FI标记到G5上；利用DOTA配位螯合锰离子；利用乙酰化反应将G5表面氨基转化为乙酰基；最后，将放射核素99mTc标记到剩余的DOTA上，即得。本发明制备得到的分子影像探针在细胞水平和动物水平实现了MR/SPECT双模态成像，并且由于FA的介导，本发明制备得到的探针对FA受体高表达癌细胞株系Hela细胞肿瘤模型具有显著的靶向作用，可望实现癌症的双模态靶向诊断。
Description
技术领域
本发明属于双模态分子影像探针的制备领域，特别涉及一种叶酸靶向99mTc标记的锰基螯合物MR/SPECT双模态探针的制备方法。
背景技术
癌症(cancer)，医学术语亦称恶性肿瘤，现在已直接或间接的影响许多人的生活，成为威胁人类健康的头号杀手。因此，早期的诊断和治疗成为治愈癌症的关键。在肿瘤的早期诊断方面，传统的影像技术只能了解肿瘤体积大小和解剖定位，而分子影像学技术可以获得更多的检测参数，如肿瘤生长动力学评估，恶变前的分子异常检测，肿瘤细胞标记物等，且活体分子成像可以实现在无损生物体微环境的状况下进行发病机制的研究，并帮助破译复杂的分子运动轨迹。目前应用于临床的分子影像学技术主要包括超声成像、SPECT成像、CT成像和核磁共振成像(MRI)等。
作为分子影像学的重要组成部分，造影剂的适当选择可以大大地提高成像诊断的灵敏性、特异性。而作为理想的且能应用于临床癌症早期靶向诊断的纳米材料体系，在生物安全性得以保障的同时，更要兼顾能同时携带靶向分子、成像试剂分子、制备方法简便、原材料价廉易得几个主要因素。目前应用于临床的造影剂，如应用于CT成像的Omnipaque，用于MRI的六种钆基小分子造影剂都存在不可克服的缺陷，而应用于SPECT成像的DTPA-99mTc造影剂主要是肾脏显影，上述的分子影像剂均存在不足之处如：血液循环时间过短、无组织特应性，尤其是钆基造影剂一定浓度下还存在肾毒性。因此，临床医学界更加期望能开发出兼具两种或者多种成像模式的分子影像探针，进而弥补单一分子影像成像的不足之处。
纳米技术的发展使越来越多的科研工作者开始研发双模态甚至多模态造影剂以满足临床的需求。前期工作中，Shi和其合作者首先通过共沉淀法制备得到四氧化三铁纳米颗粒，然后再在其表面层层静电自组装上聚谷氨酸和聚赖氨酸，最后将包裹有金纳米颗粒的第五代聚酰胺-胺树状大分子在EDC作用下修饰到氧化铁表面，实现了T2加权MR成像和CT成像双模态造影(J.Mater.Chem.,2012,22,15110-15120)；随后，Shi等人利用第五代聚酰胺-胺树状大分子为平台，将螯合试剂DOTA-NHS连接到树状大分子表面用于螯合钆离子用于MR成像，同时利用树状大分子特殊的空腔结构，包裹金纳米颗粒用于CT成像，实现了T1加权MR增强和CT增强的MR/CT双模态成像功能(Biomaterials，34，(2013)，1570-1580)。正是基于前人以及本课题组的前期研究工作基础之上，本发明将靶向试剂叶酸、螯合试剂DOTA结合到树状大分子上，然后将放射核素99mTc成功地标记到DOTA上，从而制备出可实现MR/SPECT双模态成像的分子影像探针。
检索国内外文献，尚没有发现关于叶酸靶向放射核素99mTc标记的树状大分子基锰螯合物MR/SPECT双模态分子影像探针的制备及其用于体内肿瘤模型靶向MR/SPECT双模态成像应用研究的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种叶酸靶向99mTc标记的锰基螯合物MR/SPECT双模态探针的制备方法，本发明的合成工艺简单，反应条件温和可控，易于操作；制备得到的MR/SPECT双模态分子影像探针具有良好是生物相容性和血液相容性，并且在细胞水平和动物水平能实现良好的靶向MR/SPECT双模态显影功能；最终造影剂会随代谢排出体外，不会在体内长时间蓄积。
本发明的一种叶酸靶向99mTc标记的锰基螯合物MR/SPECT双模态探针的制备方法，包括：
(1)分别将第五代聚酰胺-胺树状大分子G5、螯合试剂DOTA-NHS溶解在溶剂中，待分别完全溶解后，搅拌条件下将DOTA-NHS溶液逐滴加入到G5溶液中，持续搅拌反应20-24h，得到G5.NH2-DOTA；其中G5和DOTA-NHS二者之间的摩尔比为1：35～40；
(2)将叶酸FA和EDC各自溶解在溶剂中，完全溶解后，将EDC溶液逐滴加入到FA溶液中，避光搅拌20-30min，得到FA和EDC溶液；将NHS溶解在溶剂中，然后滴加到FA和EDC溶液中，避光搅拌2-3h，得到活化后的FA溶液中，然后边搅拌边滴加入步骤(1)所得G5.NH2-DOTA中，避光持续反应60-72h，得到G5.NH2-FA-DOTA；
(3)将异硫氰酸荧光素FI溶解在溶剂中，边搅拌边滴加到步骤(2)的G5.NH2-FA-DOTA中，避光持续反应20-24h，得到G5.NH2-FI-FA-DOTA；
(4)将MnSO4.H2O溶解在超纯水中，边搅拌边滴加入步骤(3)体系中，避光持续搅拌20-24h，得到G5.NH2-FI-FA-DOTA-Mn；
(5)将三乙胺加入到步骤(4)反应体系中，避光持续搅拌反应20-30min，然后再加入乙酸酐，避光持续搅拌反应20-24h，透析，冷冻干燥，得到G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn；
(6)将G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn溶解在缓冲液中，然后加入99mTc淋洗液、还原剂，将 99mTc与DOTA螯合，分离纯化，得到G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc，即为叶酸靶向99mTc标记的锰基螯合物MR/SPECT双模态探针。
所述步骤(1)中G5、DOTA-NHS分别溶解的溶剂的体积比为10-12:2-3。
所述步骤(1)中第五代聚酰胺-胺树状大分子G5的分子量为26010。
所述步骤(2)中FA、EDC和NHS的比例为8.8-10mg:19.2～21.4mg：11.5～12.1mg，FA和G5的摩尔比为8.83～9：13；FA溶解在溶剂中的浓度为1-2.5mg/ml；EDC溶解在溶剂中的浓 度为2-5mg/ml；NHS溶解在溶剂中的浓度为1-4mg/ml。
所述步骤(3)中FI与G5的比例为0.97～1.56mg：13mg；FI溶解在溶剂中的浓度为0.5mg/mL～1.5mg/mL。
所述步骤(4)中MnSO4.H2O与DOTA的比例为7.6～9.2mg：23mg；MnSO4.H2O溶解在超纯水中后的浓度为1mg/mL～2.5mg/mL。
所述步骤(5)中三乙胺和乙酸酐与G5的比例为46～50.5μL：26～31.2μL：13mg。
所述步骤(6)中缓冲液为PBS缓冲液；G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn溶于缓冲液后的浓度为1～1.2mg/mL；还原剂为氯化亚锡SnCl2。
所述步骤(6)中G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn、99mTc淋洗液、还原剂的比例为3-5mg：0.5-1mL：50-100μg。
所述步骤(1)-(3)中的溶剂均为二甲基亚砜DMSO；步骤(5)中透析为用截留分子量为8000～14000的透析袋透析三天；步骤(6)中分离纯化为用凝胶过滤柱分离纯化。
所述叶酸靶向放射核素99mTc标记的树状大分子基锰螯合物作为MR/SPECT双模态分子影像探针的应用。
本发明首先分别将螯合试剂(DOTA-NHS)和靶向分子叶酸(FA)修饰到第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5)表面，然后利用配位化学方法将锰离子螯合到DOTA上，最终标记放射核素99mTc。其制备方法：第一步，经表面共价修饰将螯合试剂DOTA-NHS修饰到G5表面；第二步，将靶向分子FA连接到G5表面；第三步，将示踪分子异硫氰酸荧光素(FI)标记到G5上；第四步，利用DOTA配位螯合锰离子；第五步，利用乙酰化反应将G5表面氨基转化为乙酰基；最后，将放射核素99mTc标记到剩余的DOTA上。本发明以G5为平台，将靶向分子FA、MR成像造影剂(DOTA-Mn螯合物)和SPECT成像放射核素99mTc三者有机结合，得到功能化的树状大分子基MR/SPECT双模态分子影像探针。
本发明利用树状大分子表面存在大量氨基从而可实现多功能化修饰这一特性，首先采用化学键合法将螯合试剂DOTA连接到G5表面氨基上，进一步将靶向分子叶酸(FA)、荧光分子(FI)修饰到G5表面。FA可以实现对叶酸受体高表达细胞株系或者肿瘤模型特异靶向性，FI分子为在细胞水平研究叶酸的靶向能力起到了分子探针的作用，而DOTA的存在不仅仅可以起到螯合金属离子锰的作用，同时还可标记放射核素99mTc。
本发明采用的合成工艺简单，反应条件温和可控，易于操作。制备得到的MR/SPECT双模态分子影像探针具有良好是生物相容性和血液相容性，并且在细胞水平和动物水平能实现良好的靶向MR/SPECT双模态显影功能，最终造影剂会随代谢排出体外，不会在体内长时间蓄积。该方法制备的FA靶向的MR/SPECT双模态分子影像探针在分子影像诊断领域有着潜 在的应用。
本发明使用紫外可见吸收光谱(UV-Vis)、电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)、Zeta电势、水合粒径等方法表征制备得到的分子探针的物理化学性质，并通过核磁共振成像仪分析分子探针的T1成像性能和r1弛豫率，然后通过溶血实验、MTT法评价该探针的血液相容性和细胞毒性，再利用流式细胞术、体外和体内核磁共振成像实验检测FA修饰的分子探针对肿瘤细胞的靶向成像效果。具体测试结果如下：
(1)紫外吸收(UV-Vis)测试结果
通过分析G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn分子影像探针的紫外图谱(图1)发现在500nm处有一个明显的FI的紫外特征吸收峰，由此可以说明已经成功地将FI修饰到G5表面上。
(2)Zeta电势及水合粒径测试结果
本发明制备得到的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn分子影像探针表面有大量的伯氨基存在而具有较高的正电荷，较高的正电荷会制约该材料在生物医学领域的应用。因此本发明对修饰后的实验组材料和对照组材料进行了完全乙酰化处理，以期降低分子影像探针的表面电势，从而提高其生物相容性。表面电势和水合粒径测定结果如表1所示：合成得到的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn探针表面电势和水合粒径分别为-0.463mV和863.6nm，而对照组材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn的表面电势和水合粒径分别为+0.693mV和549.5nm。从实验结果得出，完全乙酰化成功地降低了材料的表面电势。
(3)r1弛豫率测量结果
r1弛豫率反映G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn分子影像探针作为MRI造影剂的效率，为单位摩尔浓度锰的纵向弛豫时间，可通过不同浓度下的T1弛豫时间的倒数拟合计算得到。图2为本发明制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn分子影像探针和对照组材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn的T1弛豫时间倒数与Mn浓度的线性拟合图，可以看出这两种材料的弛豫时间倒数随着锰浓度的增加(在0-0.8mM浓度范围内)具有很好的线性关系。并且通过计算可得本发明制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn分子影像探针和对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn的r1弛豫率分别为3.10mM-1s-1和3.22mM-1s-1。因此，本发明所制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn均可作为MRI分子影像诊断中的优良T1信号增强造影剂。
(4)T1加权MR成像测量结果
图3是本发明制备得到的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和对照组材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn的T1加权MR成像性能测试，从图中可以看出随着锰浓度(0.075-1.2mM)的提高，MRI信号逐渐增强，并且呈良好的梯度关系。结果说明制备得到的两组材料都具有良好的MRI信号增强造影剂应用潜质。
(5)血液相容性
由于造影剂的给药途径多数情况下是经由静脉注射方式进入人体内的。因此，造影剂势必会与血液直接接触。本发明通过溶血试验评估了制备得到的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和对照组材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn的血液相容性。图4中显示了G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(a)和G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn(b)在不同锰浓度(10、25、50、75、100μg/mL)下经过2个小时孵育之后离心观察溶血结果，结果显示阳性对照组(水)完全溶血，阴性对照组(PBS缓冲液)、实验组以及对照组并未出现溶血现象。此外，还通过测定上层清液中血红蛋白在541nm的吸光值来定量分析本发明制备材料的溶血率。如图4中柱状图所示，即使在锰浓度达到100μg/mL时，G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和对照组G5.NHAc-FI-DOTA-Mn的溶血率均小于5％，说明制备得到的纳米颗粒具有良好的血液相容性，能够安全用于生物体内MRI成像。
(6)MTT细胞存活率测试结果
通过MTT比色法测定Hela细胞的存活率来检测本发明制备得到的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和对照组材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn的细胞毒性(如图5)。Hela细胞分别与G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(锰浓度为10、25、50、75、100μg/mL)在37℃下共培养24小时。然后，经MTT处理后在570nm处测量吸光值，以PBS缓冲液组的吸收值为基准，不同浓度的材料处理后的吸收值与之相比计算得到Hela细胞的存活率。实验结果显示G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn在锰浓度10到75μg/mL范围内对Hela细胞的存活率没有显著性差异，细胞存活率均在85％以上，当浓度增加到100μg/mL时细胞的存活率略微下降，但依然保持在80％(如图5)。这说明G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn具有良好的细胞相容性。
(7)流式细胞术检测结果
通过流式细胞术检测Hela细胞对本发明制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn分子影像探针和对照组材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn在不同浓度下处理细胞后的流式细胞分析图(图6)平均荧光强度(图7)来检测FA的靶向效果。Hela细胞分别与G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和对照组材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(Mn浓度为0、10、25、50、75和100μg/mL)在37℃下共培养4小时，并且以PBS缓冲液处理的细胞作为对照组。然后通过流式细胞术检测细胞的平均荧光强度。在图7中，随着Mn浓度的提高，G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn处理后细胞的平均荧光强度显著增加，同时对照组材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn处理后细胞的平均荧光强度也呈递增的关系。值得注意的是，在比较G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和对照组材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn在相同锰浓度下处理Hela细胞后，尤其是锰浓度在25μg/mL以后，G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn组表现出更高的荧光强度，分析其原因可能是叶酸的介导，使得 Hela细胞吞噬更多的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn，从而出现高荧光值的现象。这一结果说明修饰FA赋予了G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn对Hela细胞的特异靶向能力。
(8)体外细胞MR成像结果
在进行体内实验之前，评价了本发明制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn的细胞MR成像效果(如图8所示)。Hela细胞分别与G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(Mn浓度为0.1、0.2、0.4、0.8和1mM)在37℃下共培养4小时，并且以PBS缓冲液处理的细胞作为对照组。如图8所示，随着Mn浓度的提高，G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn处理后的细胞均表现出MR信号增强的趋势，说明随着Mn浓度的增加，细胞对探针材料的吞噬量也增加。需要指出的是，在相同的Mn浓度下，G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn处理后的细胞比对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn处理后细胞的MR信号增强更明显，说明靶向分子FA的存在使得细胞对G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn的吞噬量要大大高于非靶向材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn。图9是细胞经过不同浓度的分子影像探针处理后的MR成像信号值，从图中明显看出，随着Mn浓度的提高，细胞的MR信号值均逐渐增加，而且在相同的Mn浓度下，G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn处理后细胞的MR信号值要明显高于对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn处理后的细胞。这些结果不仅说明制备的分子影像探针具有很好的细胞MR成像效果，而且证明了FA介导的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn分子影像探针对Hela细胞的特异靶向性。
(9)体外细胞SPECT成像结果
在进行体内SPECT成像之前，研究了制备得到的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn-99mTc探针材料在细胞水平的成像能力(图10)。Hela细胞分别与99mTc活度为0、10、50、100、200、500μCi的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn-99mTc共培养2小时。如图10所示，随着99mTc活度的提高，G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn-99mTc处理后的细胞均表现出SPECT信号增强的趋势，说明随着99mTc活度的增加，更多的探针材料进入Hela细胞使得99mTc活度增加，因此SPECT信号增强。需要指出的是，在相同的99mTc活度下，G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc分子影像探针处理后的细胞比对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn-99mTc处理后细胞的SPECT信号增强更明显，说明靶向分子FA的存在使得细胞对G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc的吞噬量要大大高于G5.NHAc-FI-DOTA-Mn-99mTc。体外细胞水平的SPECT结果说明制备得到的探针不仅仅能在细胞水平实现成像目的，同时FA的介导使得G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc探针对于Hela 细胞具有靶向SPECT显影能力，为后续的体内动物SPECT成像提供了理论指导依据。
(10)体内肿瘤MR成像结果和组织分布
通过尾静脉注射本发明制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn来评价肿瘤部位的MR成像效果(如图11)。与注射前的对照组相比较，在注射后30分钟到4小时内，注射对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(Mn：500μg，200μL PBS)的裸鼠肿瘤部位明暗程度变化并不明显，而注射G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn(Mn：500μg，200μL PBS)的裸鼠肿瘤明显变亮，展示出FA修饰的分子影像探针具有明显的MRI肿瘤诊断效果。图12是相应注射时间点的肿瘤MR信号值变化，在注射后30分钟到4小时，注射G5.NHAc-FI-DOTA-Mn的裸鼠肿瘤MR信号值变化不明显，而注射G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn的裸鼠肿瘤MRI信号值明显，这与图11的结果一致。以上结果说明本发明制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn分子探针具有很好的肿瘤靶向能力，能成功应用于体内靶向MR肿瘤成像诊断。
在注射G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn分子影像探针12小时后，处死荷瘤裸鼠，解剖取出心、肝、脾、肺、肾和肿瘤并称重，然后用王水消化48小时以上，取消化液用于ICP-AES分析金属元素锰的含量，从而确定在注射G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn分子影像探针12小时后在荷瘤鼠体内各个脏器的分布情况(如图13)。从图中可以看出在注射G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn后，肝、脾、肺、肾中锰元素含量显著提高，而在其他器官如心脏虽然也略有增加但是幅度小。同时需要指出的是，注射G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn分子探针的荷瘤裸鼠肿瘤部位锰的含量明显高于注射G5.NHAc-FI-DOTA-Mn材料的荷瘤裸鼠。这些结果不仅证明了G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn对肿瘤部位具有很好的靶向性，而且说明本发明制备的分子影像探针能在小鼠体内正常的代谢清除。
(11)体内肿瘤SPECT成像结果和组织分布
将本发明制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn探针进行放射核素99mTc标记，通过尾静脉注射G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc分子影像探针来评价肿瘤部位的SPECT成像效果(如图14)。观察了在荷瘤裸鼠在注射后6小时内肿瘤部位和各脏器的SPECT成像变化。如图14所示注射后5分钟，裸鼠肝脏部位信号开始增强，而肿瘤部位没有明显的信号变化，当注射30分钟后，肿瘤部位对G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc分子探针能够产生富集，肿瘤信号开始增强，6小时候后肿瘤部位信号显著提高，肿瘤清晰可见。结果说明该制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc分子探针能实现肿瘤的SPECT成像，能应用于体内肿瘤SPECT成像诊断。为了更加直观和清楚地观察G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc分子探针的SPECT成像性能，在注射后6小时处死荷瘤裸鼠，解剖取出各脏器和组织用于SPECT成像。 从图14中，可以看到信号最强的组织是肝脏，其次是脾脏和肾脏，肿瘤部位的信号与肺相当，这与6小时时间点荷瘤裸鼠体内成像情况一致。随后，通过勾画感兴趣区分析了各组织中残留的放射核素99mTc的相对含量(图15)，经分析发现99mTc主要分布在肝脏中，其残留量为88.4％；肾脏和脾脏中残留量分别为6.03％和3.64％，肿瘤中的残留量为0.61％与肺的残留量0.78％相当，而在正常的肌肉组织和骨组织中的含量仅为0.013％和0.044％，因此计算出在肿瘤中的含量是正常肌肉和骨组织中的46.9倍和13.9倍。结果表明制备得到的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc分子探针能实现肿瘤部位成像，并且可以正常被肝脏、脾脏和肾脏代谢。
有益效果
(1)本发明利用树状大分子表面大量氨基从而可实现多功能化修饰这一特性，首先利用化学键合法将螯合试剂DOTA连接到G5表面氨基上，进一步将靶向分子叶酸、荧光分子FI修饰到G5树状大分子表面，FA可以实现对叶酸受体高表达细胞株系或者肿瘤模型特异靶向性，FI分子为在细胞水平研究叶酸的靶向能力起到了示踪作用，而DOTA的存在不仅仅可以起到螯合金属离子锰的作用，同时还可标记放射核素99mTc；
(2)本发明采用的合成工艺简单，反应条件温和可控，易于操作；制备得到的MR/SPECT双模态分子影像探针具有良好是生物相容性和血液相容性，并且在细胞水平和动物水平能实现良好的靶向MR/SPECT双模态显影功能；该方法制备的FA靶向的MR/SPECT双模态分子影像探针在分子影像诊断领域有着潜在的应用价值。
附图说明
图1是本发明制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn的紫外光谱图；
图2是本发明制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和对照组材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn的T1弛豫时间倒数与Mn浓度的线性关系图；
图3是本发明制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和对照组材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn在锰浓度为0.075-1.2mM的T1加权MR成像；
图4是本发明制备的对照组材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(a)和G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn(b)在锰浓度为10-100μg/mL下溶血实验结果；
图5是MTT法测得Hela细胞经过PBS缓冲液(对照)、G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和对照组材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn在不同锰浓度(10μg/mL，25μg/mL，50μg/mL，75μg/mL，100μg/mL)下处理24小时后的细胞存活率；
图6是Hela细胞经过PBS缓冲液(对照，a，l)、对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(Mn浓度 范围b：10，c：25，d：50，e：75，f：100μg/mL)和本发明制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn(Mn浓度范围g：10，h：25，i：50，j：75，k：100μg/mL)处理4小时后流式细胞分析图；
图7是Hela细胞经过PBS缓冲液、G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和对照组材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(Mn浓度范围在10-100μg/mL)处理4小时后细胞的平均荧光强度；图8是Hela细胞经过PBS缓冲液、G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn在锰浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.8和1mM时处理4小时后的T1加权MR成像图；
图9是Hela细胞经过PBS缓冲液、G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn在不同锰浓度下处理4小时后的T1加权MR成像信号值柱状图；
图10是Hela细胞经过PBS缓冲液、G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc(a)和对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn-99mTc(b)在不同活度下处理2小时后的SPECT成像图；
图11是尾静脉注射本发明制备得到的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn(a)和对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(b)(Mn：500μg)后不同时间点裸鼠肿瘤的T1加权MR成像图片(白色小星指示肿瘤位置)；
图12是尾静脉注射本发明制备得到的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(Mn：500μg)后不同时间点裸鼠肿瘤的MR信号值变化柱状图；
图13是尾静脉注射本发明制备得到的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn在荷瘤裸鼠体内12小时后各组织中的分布；
图14是尾静脉注射本发明制备得到的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc在不同时间点裸鼠肿瘤的SPECT成像图(箭头指示肿瘤位置)；
图15是尾静脉注射本发明制备得到的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc在6小时后各组织中的分布。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
首先，分别称量13mg的G5和11.5mg的DOTA-NHS溶解在10mL和3mL的二甲亚砜(DMSO)溶剂中，待各自完全溶解后，边搅拌的情况下将DOTA-NHS溶液逐滴加入到G5溶液中，持续搅拌反应24小时得到中间产物G5.NH2-DOTA。然后，分别称取2.5mg的 FA和5mg的EDC各自溶解在1.5mL DMSO溶剂中，完全溶解后，将EDC溶液逐滴加入到FA溶液中避光持续搅拌30分钟，然后称取3.2mg的NHS溶解在1.5mL DMSO溶剂中，完全溶解后逐滴加入到FA和EDC溶液中，避光搅拌持续活化3小时，将活化后的FA溶液边搅拌情况下逐滴加入到G5.NH2-DOTA反应体系中，避光持续反应72小时，得到粗产物G5.NH2-FA-DOTA。其次，将1.5mg异硫氰酸荧光素(FI)溶解于2mL DMSO中，边搅拌情况逐滴加入到G5.NH2-FA-DOTA溶液中避光持续反应24小时，得到粗产品G5.NH2-FI-FA-DOTA。再次，称取2.5mg的MnSO4.H2O粉末溶解在2mL超纯水中，边搅拌情况下逐滴加入到G5.NH2-FI-FA-DOTA溶液体系中，避光持续搅拌24小时得到粗产品G5.NH2-FI-FA-DOTA-Mn。最后，取25μL三乙胺加入到G5.NH2-FI-FA-DOTA-Mn反应体系中避光持续搅拌反30分钟，然后再取15μL乙酸酐溶液加入到反应体系中，避光持续搅拌反应24小时得到粗产物G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn，将粗产物用截留分子量为8000～14000的透析袋透析三天(PBS缓冲液中透析一天，换液3次；蒸馏水中透析2天，换水6次)后冷冻干燥即得产品G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn；
称取3mg的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn干粉溶解在PBS缓冲液中，得到浓度为1mg/mL的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn溶液，然后加入1mL新鲜99mTc淋洗液，以氯化亚锡(SnCl2)为还原剂(50～100μg)，将99mTc与DOTA螯合，最后用凝胶过滤柱分离纯化得到最终产物G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc。
实施例2
取实施例1制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn材料2mg溶解在超纯水中，超声溶解得到溶液，测紫外吸收图谱(见图1)。紫外可见光谱测试结果表明，G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn在500nm处有一个明显的紫外吸收峰，从而说明FI成功修饰到G5表面。
称取实施例1制备得到的材料G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和对比例1得到的对照组材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn约2-4mg溶解于超纯水中进行表面电势和水合粒径测试(如表1所示)。合成得到的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn的表面电势和水合粒径分别为-0.463mV和863.6nm，而对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn的表面电势和水合粒径分别为+0.693mV和549.5nm。从实验结果得出，完全乙酰化成功地降低了探针材料的表面电势。
将本发明制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn(实施例1)和对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(对比例1)通过ICP-AES测试法测得溶液中Mn元素的浓度，再用超纯水配制Mn浓度依次为0.05、0.1、0.2、0.4和0.8mM的水溶液2mL，测定不同Mn浓度下的T1弛豫时间(如图2所示)和T1加权成像(如图3所示)。弛豫率测试结果表明G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn的T1弛豫时间倒数在Mn浓度为 0.05-0.8mM范围内随着锰浓度的增加具有很好的线性关系。并且通过计算可知G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn的r1弛豫率为3.10mM-1s-1，G5.NHAc-FI-DOTA-Mn的r1弛豫率为3.22mM-1s-1，都具有良好的r1弛豫率。同时T1加权成像也显示两种材料随锰浓度的提高，信号强度增强。因此，本发明所制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn均可作为MRI分子影像诊断中的优良T1信号增强造影剂。
实施例3
为了确保本发明制备的分子影像探针能安全地用于体内生物成像诊断，我们评价了制备得到的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn(实施例1)和对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(对比例1)的血液相容性。根据实施例2中测定的两种材料的锰浓度计算称量出G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn(实施例1)和对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(对比例1)中锰元素总量各1mg的两种干粉，分别分散于PBS缓冲液中配制成1mg/mL的浓度并作为母液，然后用PBS缓冲液依次配制浓度为10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL和100μg/mL的溶液。取适量的人新鲜血液，首先离心(2000rpm，5分钟)去上清液，然后将血红细胞用PBS洗涤5次，收集健康的红细胞并用PBS缓冲液稀释10倍。再将G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(10-100μg/mL)与红细胞混合静置2小时后，10000rpm离心1分钟，拍照并测上清液的紫外吸收值。该过程以超纯水作为阳性对照，PBS缓冲液作为阴性对照。图3中显示了G5.NHAc-FI-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn在浓度10、25、50、75和100μg/mL下的溶血率测试结果。通过测量上层清液的吸光度值定量评价分子影像探针的溶血性。如图3下方柱状图显示，在浓度达到100μg/mL时，G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn的溶血率都小于5％，说明制备的这两种材料具有很好的血液相容性，因而可以安全地用于生物体内MR成像。
实施例4
以Hela细胞为模型细胞评价本发明制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn对细胞存活的影响。称取相应重量的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn(实施例1)和对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(对比例1)干粉(两种材料锰元素的含量为1mg)，分散在无菌PBS缓冲中配制成1mg/mL的PBS缓冲液，并用紫外照射过夜杀菌。然后在超净工作台中用无菌PBS缓冲配制浓度为10、25、50、75和100μg/mL的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn溶液。Hela细胞种植于96孔板后分别与G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(浓度为10、25、50、75和100μg/mL)在37℃下共培养24小时。然后，向培养板孔中加入20μL MTT，继续在37℃下培养4小时后，弃去培养液，并加入100μL DMSO，振荡20分钟后在570nm处测量吸光值，并根据此 值计算细胞的活力(如图4)。与对照组(PBS缓冲液组)相比，G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn在实验浓度0到100μg/mL范围内对Hela细胞的存活率没有显著性差异，细胞存活率都在80％以上。这充分说明合成的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn均具有良好的细胞相容性，可以应用到生物体内MRI成像检测。
实施例5
通过流式细胞术检测不同浓度的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(0、10、25、50、、75、100μg/mL)与Hela细胞共培养4小时后，Hela细胞的平均荧光强度(如图5)来评价Hela细胞对探针材料的吞噬情况从而检测叶酸的靶向效果。采用实施例2中和对比例1中按照锰元素含量配置成相应浓度为0、10、25、50、、75、100μg/mL的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn(实施例1)和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(对比例1)溶液。Hela细胞以2×105/孔种植于12孔板，过夜培养后再分别与G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(Mn浓度为0、10、25、50、、75、100μg/mL)在37℃下共培养4小时，并且以PBS缓冲液处理的细胞作为对照组。共培养后细胞用PBS缓冲液洗三次，再用胰酶消化并离心，弃上清液，将细胞悬浮于1mL PBS缓冲液中。通过流式细胞仪检测处理后细胞的平均荧光强度。在图5中随着Mn浓度的增加，G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn处理后细胞的平均荧光强度显著增加，而对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn处理后细胞的平均荧光强度增加不明显。这说明叶酸修饰后赋予了分子影像探针对FA受体高表达的Hela细胞具有较好的特异靶向能力。
实施例6
在体内成像实验之前，我们评价了分子影像探针的细胞MR成像效果，通过ICP-AES测定实施例1中G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和对比例1中和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn中的锰元素含量。用无菌PBS缓冲液分别配制成Mn浓度为0.1、0.2、0.4、0.8和1mM的两种材料溶液。Hela细胞以1×106/孔种植于25cm2细胞培养瓶中，培养过夜后，分别与PBS、G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn在37℃下共培养4小时。培养结束后细胞用PBS缓冲液洗3次，再胰酶消化、离心、过滤，最后分散在1mL PBS缓冲液中。用核磁共振成像仪测试各细胞样品的T1加权成像(如图6)。如图所示，随着Mn浓度的增加，G5.NHAc-FI-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn处理后的细胞均表现出MR信号增强的趋势，说明随着Mn浓度的增加，细胞对材料的吞噬量也增加。需要指出的是，在同样Mn浓度下，G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn探针处理后的细胞比G5.NHAc-FI-DOTA-Mn处理后细胞的MR信号增强更明显，说明Hela细胞对G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn探针的吞噬量要大大高于对照的非靶向材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn。图7是Hela细胞被不同浓度的探针处理后的 MR成像信号值，从图中明显看出，随着Mn浓度的增加，细胞样品的MR信号值均逐渐增加，而且在相同的Mn浓度下，G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn处理后细胞的MR信号值要明显高于G5.NHAc-FI-DOTA-Mn处理后的细胞。这些结果不仅说明制备的两种材料具有很好的细胞MR成像效果，而且证明了G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn探针对Hela细胞的特异靶向性。
同时，我们还评价了G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc和对比例1中G5.NHAc-FI-DOTA-Mn-99mTc的SPECT细胞水平成像性能。Hela细胞以1×106/孔种植于25cm2细胞培养瓶中，培养过夜后，分别与PBS缓冲液、不同标记99mTc活度的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc和G5.NHAc-FI-DOTA-Mn-99mTc(0、10、50、100、200、500μCi)在37℃下共培养2小时。培养结束后细胞用PBS缓冲液洗3次，再胰酶消化、离心、过滤，最后分散在1mL PBS缓冲液中测试SPECT成像(图7)。如图7所示，随着标记放射核素99mTc活度的递增(0-500μCi)，SPECT信号呈现明显的梯度增强，对比两种材料的SPECT细胞成像发现，在相同活度放射核素99mTc标记情况下，G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc的信号强度要高于G5.NHAc-FI-DOTA-Mn-99mTc，尤其在活度为100μCi时。SPECT细胞成像结果说明我们成功地获得了G5.NHAc-FI-DOTA-Mn-99mTc和G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc探针材料，并且由于叶酸的介导能对Hela细胞实现靶向SPECT成像的目的。
实施例7
将本发明制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn(实施例1)和对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(对比例1)按照ICP-AES测定的锰浓度配置成1mg/mL的0.5mL PBS缓冲液。3×106个Hela细胞接种到裸鼠体内，三到四周后待肿瘤直径达到0.6-1cm时，通过尾静脉注射G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn或者G5.NHAc-FI-DOTA-Mn的PBS溶液来评价肿瘤部位的MR成像效果(如图8)。与注射前相比较，在注射后30分钟到4小时内，注射0.5mL对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn(Mn：500μg)的裸鼠肿瘤部位稍微变亮，而注射0.5mLG5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn(Mn：500μg)的裸鼠肿瘤明显变亮，展示出FA修饰的分子影像探针具有明显的MRI肿瘤诊断效果。图9是相应注射时间的肿瘤MR信号值变化，在注射后30分钟到4小时，注射对照材料G5.NHAc-FI-DOTA-Mn的裸鼠肿瘤MR信号值变化不明显，而注射G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn的裸鼠肿瘤MR信号值明显增强。这些结果说明该制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn分子影像探针具有很好的肿瘤靶向能力，能成功应用于体内肿瘤靶向MR成像诊断。
实施例8
将本发明制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc(实施例1)用于肿瘤模型SPECT成像。 3×106个Hela细胞接种到裸鼠体内，三到四周后待肿瘤直径达到0.6-1cm时，通过尾静脉注射G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc探针来评价肿瘤部位的SPECT成像效果(如图10)。观察了在荷瘤裸鼠在注射后6小时内肿瘤部位和各脏器的SPECT成像变化。如图10所示注射后5分钟，裸鼠肝脏部位信号开始增强，而肿瘤部位没有明显的信号变化，当注射30分钟后，肿瘤部位由于G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc探针的富集，信号开始增强，6小时候后肿瘤部位信号显著提高，肿瘤清晰可见。结果说明该制备的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc能实现肿瘤的SPECT成像，具有应用于体内肿瘤SPECT成像诊断造影剂的潜在应用价值。为了更加直观和清楚地观察G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc探针的SPECT成像性能，在注射后6小时处死荷瘤裸鼠，解剖取出各脏器组织用于SPECT成像。从图10中，我们可以看到信号最强的组织是肝脏，其次是脾脏和肾脏，肿瘤部位的信号与肺相当，这与6小时时间点荷瘤裸鼠体内成像情况一致。随后，通过勾画感兴趣区分析了各组织中残留的放射核素99mTc的相对含量，经分析发现99mTc主要分布在肝脏中，其残留量为88.4％；肾脏和脾脏中残留量分别为6.03％和3.64％，肿瘤中的残留量为0.61％与肺的残留量0.78％相当，而在正常的肌肉组织和骨组织中的含量仅为0.013％和0.044％，因此计算出在肿瘤中的含量是正常肌肉和骨组织中的46.9倍和13.9倍。结果表明制备得到的G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc分子影像探针能实现肿瘤部位成像，并且可以能通过正常的肝脏、脾脏和肾脏进行代谢。
对比例1
为了比较FA的靶向性，本发明按照实施例1中的方法和步骤合成得到G5.NH2-DOTA。然后，将1.5mg异硫氰酸荧光素(FI)溶解于mL DMSO中，溶解完全后，边搅拌情况逐滴加入到G5.NH2-FA-DOTA溶液中避光持续反应24小时，得到粗产品G5.NH2-FI-DOTA。再次，称取2.5mg的MnSO4.H2O粉末溶解在2mL超纯水中，边搅拌情况下逐滴加入到G5.NH2-FI-DOTA溶液体系中，避光持续搅拌24小时得到粗产品G5.NH2-FI-DOTA-Mn。最后，取25μL三乙胺加入到G5.NH2-FI-DOTA-Mn反应体系中避光持续搅拌反30分钟，然后再取15μL乙酸酐溶液加入到反应体系中，避光持续搅拌反应24小时得到粗产物G5.NHAc-FI-DOTA-Mn，将粗产物用截留分子量为8000～14000的透析袋透析三天(PBS溶液中透析一天，换液4次；蒸馏水中透析2天，换水6次)后冷冻干燥即得产品G5.NHAc-FI-DOTA-Mn；
称取3mg的G5.NHAc-FI-DOTA-Mn干粉溶解在PBS溶液中，得到浓度为1mg/mL的G5.NHAc-FI-DOTA-Mn溶液，然后加入1mL新鲜99mTc淋洗液，以氯化亚锡(SnCl2)为还原剂(50～100μg)，将99mTc与DOTA螯合，最后用凝胶过滤柱分离纯化得到最终产物 G5.NHAc-FI-DOTA-Mn-99mTc。产物G5.NHAc-FI-DOTA-Mn的表征详见实施例2-8。
表1：G5.NHAc-FI-DOTA-Mn和G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn的表面电势和水动力学直径。
Claims (10)
1.一种叶酸靶向99mTc标记的锰基螯合物MR/SPECT双模态探针的制备方法，包括：
(1)分别将第五代聚酰胺-胺树状大分子G5、螯合试剂DOTA-NHS溶解在溶剂中，待分别完全溶解后，搅拌条件下将DOTA-NHS溶液逐滴加入到G5溶液中，持续搅拌反应20-24h，得到G5.NH2-DOTA；其中G5和DOTA-NHS二者之间的摩尔比为1：35～40；
(2)将叶酸FA和EDC各自溶解在溶剂中，完全溶解后，将EDC溶液逐滴加入到FA溶液中，避光搅拌20-30min，得到FA和EDC溶液；将NHS溶解在溶剂中，然后滴加到FA和EDC溶液中，避光搅拌2-3h，得到活化后的FA溶液中，然后边搅拌边滴加入步骤(1)所得G5.NH2-DOTA中，避光持续反应60-72h，得到G5.NH2-FA-DOTA；
(3)将异硫氰酸荧光素FI溶解在溶剂中，边搅拌边滴加到步骤(2)的G5.NH2-FA-DOTA中，避光持续反应20-24h，得到G5.NH2-FI-FA-DOTA；
(4)将MnSO4.H2O溶解在超纯水中，边搅拌边滴加入步骤(3)体系中，避光持续搅拌20-24h，得到G5.NH2-FI-FA-DOTA-Mn；
(5)将三乙胺加入到步骤(4)反应体系中，避光持续搅拌反应20-30min，然后再加入乙酸酐，避光持续搅拌反应20-24h，透析，冷冻干燥，得到G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn；
(6)将G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn溶解在缓冲液中，然后加入99mTc淋洗液、还原剂，将99mTc与DOTA螯合，分离纯化，得到G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn-99mTc，即为叶酸靶向99mTc标记的锰基螯合物MR/SPECT双模态探针。
2.根据权利要求1所述的一种叶酸靶向99mTc标记的锰基螯合物MR/SPECT双模态探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中G5、DOTA-NHS分别溶解的溶剂的体积比为10-12:2-3。
3.根据权利要求1所述的一种叶酸靶向99mTc标记的锰基螯合物MR/SPECT双模态探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中第五代聚酰胺-胺树状大分子G5的分子量为26010。
4.根据权利要求1所述的一种叶酸靶向99mTc标记的锰基螯合物MR/SPECT双模态探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中FA、EDC和NHS的比例为8.8-10mg:19.2～21.4mg：11.5～12.1mg，FA和G5的摩尔比为8.83～9：13；FA溶解在溶剂中的浓度为1-2.5mg/ml；EDC溶解在溶剂中的浓度为2-5mg/ml；NHS溶解在溶剂中的浓度为1-4mg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种叶酸靶向99mTc标记的锰基螯合物MR/SPECT双模态探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中FI与G5的比例为0.97～1.56mg：13mg；FI溶解在溶剂中的浓度为0.5mg/mL～1.5mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种叶酸靶向99mTc标记的锰基螯合物MR/SPECT双模态探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中MnSO4.H2O与DOTA的比例为7.6～9.2mg：23mg；MnSO4.H2O溶解在超纯水中后的浓度为1mg/mL～2.5mg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种叶酸靶向99mTc标记的锰基螯合物MR/SPECT双模态探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中三乙胺和乙酸酐与G5的比例为46～50.5μL：26～31.2μL：13mg。
8.根据权利要求1所述的一种叶酸靶向99mTc标记的锰基螯合物MR/SPECT双模态探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中缓冲液为PBS缓冲液；G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn溶于缓冲液后的浓度为1～1.2mg/mL；还原剂为氯化亚锡SnCl2。
9.根据权利要求1所述的一种叶酸靶向99mTc标记的锰基螯合物MR/SPECT双模态探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中G5.NHAc-FI-FA-DOTA-Mn、99mTc淋洗液、还原剂的比例为3-5mg：0.5-1mL：50-100μg。
10.根据权利要求1所述的一种叶酸靶向99mTc标记的锰基螯合物MR/SPECT双模态探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)-(3)中的溶剂均为二甲基亚砜DMSO；步骤(5)中透析为用截留分子量为8000～14000的透析袋透析三天；步骤(6)中分离纯化为用凝胶过滤柱分离纯化。
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| CN (1) | CN104645363A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105412947A (zh) * | 2015-12-18 | 2016-03-23 | 复旦大学附属中山医院 | 一种ct/mr双模态纳米探针及其制备方法 |
| CN111110873A (zh) * | 2020-02-24 | 2020-05-08 | 苏州欣影生物医药技术有限公司 | 一种磁共振/核医学双模态分子影像探针的制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102302782A (zh) * | 2011-07-08 | 2012-01-04 | 东华大学 | 一种肝癌细胞靶向的聚酰胺胺树状大分子载体的制备方法 |
| CN102671217A (zh) * | 2012-06-05 | 2012-09-19 | 东华大学 | 具有叶酸靶向功能的ct/mr双模态成像纳米造影剂的制备 |
| CN102961759A (zh) * | 2012-12-04 | 2013-03-13 | 东华大学 | 一种包裹纳米金颗粒的叶酸功能化聚酰胺胺树状大分子载体的靶向基因转染方法 |
-
2014
- 2014-12-24 CN CN201410837103.3A patent/CN104645363A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102302782A (zh) * | 2011-07-08 | 2012-01-04 | 东华大学 | 一种肝癌细胞靶向的聚酰胺胺树状大分子载体的制备方法 |
| CN102671217A (zh) * | 2012-06-05 | 2012-09-19 | 东华大学 | 具有叶酸靶向功能的ct/mr双模态成像纳米造影剂的制备 |
| CN102961759A (zh) * | 2012-12-04 | 2013-03-13 | 东华大学 | 一种包裹纳米金颗粒的叶酸功能化聚酰胺胺树状大分子载体的靶向基因转染方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| MINGQIAN TAN等: ""An effective targeted nanoglobular Manganese(II) chelate conjugate for magnetic resonance molecular imaging of tumor extracellular matrix"", 《MOL PHARM》 * |
| 佘汶川等: ""肽类树状大分子及其生物医学应用"", 《中国材料进展》 * |
| 雷又鸣等: ""Tc-DOTA-hTERT ASON 甲状腺未分化癌小鼠模型SPECT显像分析"", 《中国生化药物杂志》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105412947A (zh) * | 2015-12-18 | 2016-03-23 | 复旦大学附属中山医院 | 一种ct/mr双模态纳米探针及其制备方法 |
| CN111110873A (zh) * | 2020-02-24 | 2020-05-08 | 苏州欣影生物医药技术有限公司 | 一种磁共振/核医学双模态分子影像探针的制备方法 |
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