CN103495186A

CN103495186A - 一种对脑胶质瘤特异靶向的氧化锰纳米粒造影剂

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Publication number: CN103495186A
Application number: CN201310447503.9A
Authority: CN
Inventors: 顾微; 肖宁; 陈宁; 李帅; 郑婷婷; 于春江; 叶玲
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2013-09-27
Filing date: 2013-09-27
Publication date: 2014-01-08
Anticipated expiration: 2033-09-27
Also published as: CN103495186B

Abstract

一种对脑胶质瘤特异靶向的氧化锰纳米粒造影剂，通过下述方法得到：将无机锰化合物、油酸钠分散于乙醇、水、正己烷的混合液中，50-70℃反应制得前驱体油酸锰；将油酸锰前驱体溶于1-十八烯中，氮气保护下于80-100℃搅拌；再于氮气保护下，升温至280-320℃，回流，得到油酸包裹的氧化锰纳米粒；将油酸包裹的氧化锰纳米粒分散于甲苯中，加入少量醋酸，超声，加入硅烷化试剂反应，得到硅烷化的氧化锰纳米粒；将氧化锰纳米粒分散于去离子水中，键合脑胶质瘤特异性靶向分子，得到对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒。本发明的氧化锰纳米粒可作为脑胶质瘤早期诊断及边界界定的一类新型的核磁共振成像（MRI）造影剂。

Description

一种对脑胶质瘤特异靶向的氧化锰纳米粒造影剂

技术领域

本发明涉及一种水分散，对脑胶质瘤特异性靶向的氧化锰纳米粒。

本发明还涉及上述氧化锰纳米粒的制备方法。

本发明还涉及上述氧化锰纳米粒作为一类新型的MRI T₁造影剂在脑胶质瘤早期诊断和边界界定中的应用。

背景技术

脑胶质瘤是最常见的颅内原发性恶性肿瘤。脑胶质瘤早期诊断和边界界定的困难是导致胶质瘤病人高致死率的主要原因。造影剂增强的核磁共振成像（MRI）可更清晰的区分病理组织与正常组织。如阴性（T₂）造影剂使造影区域变暗，从而提高肿瘤组织与正常组织对比度。然而，出血、钙化及磁敏感性伪影均会使组织区域变暗，导致肿瘤与正常组织的区域混淆，在肿瘤早期诊断中此问题更为明显。与此相反，阳性（T₁）造影剂使造影区域变亮，有利于肿瘤的诊断。但目前广泛使用的钆基螯合物T₁造影剂可能会导致肾纤维化。因此，有必要开发新型低毒的非钆基的T₁造影剂。

锰(II)离子具有5个不成对电子，可通过缩短水质子的纵向弛豫时间到达增强MRI的成像对比效果，且锰元素与钆相比毒性较低。研究表明氧化锰纳米粒可在脑造影中显示出良好的解剖学特性。相比于钆基造影剂，目前所报道的氧化锰纳米粒造影剂弛豫率都较低（0.1-2mM^-1s^-1），并且对脑胶质瘤细胞无特异靶向性，不能清晰的界定肿瘤边界。因此，丞待开发一种能对脑胶质瘤特异性靶向，且具有较高弛豫率的氧化锰纳米粒造影剂，以满足脑胶质瘤早期诊断和边界界定的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水分散，对脑胶质瘤特异性靶向的氧化锰纳米粒作为MRI T₁造影剂。

本发明的又一目的在于提供一种制备上述水分散，对脑胶质瘤特异性靶向的氧化锰纳米粒的方法。

为实现上述目的，本发明提供的对脑胶质瘤特异靶向的氧化锰纳米粒造影剂，可以通过下述方法得到：

1）将无机锰化合物、油酸钠分散于乙醇、水、正己烷的混合液中，50-70℃反应制得前驱体油酸锰；

2）将油酸锰前驱体溶于1-十八烯中，氮气保护下于80-100℃搅拌；再于氮气保护下，升温至280-320℃，回流，得到油酸包裹的氧化锰纳米粒；

3）将油酸包裹的氧化锰纳米粒分散于甲苯中，加入少量醋酸，超声，加入硅烷化试剂反应，得到硅烷化的氧化锰纳米粒；

4）将硅烷化氧化锰纳米粒分散于去离子水中，键合脑胶质瘤特异性靶向分子，得到对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒。

所述的氧化锰纳米粒造影剂的粒径为10-20纳米。

本发明提供的制备对脑胶质瘤特异靶向的氧化锰纳米粒造影剂的方法，采用高温分解法制备油酸包裹的氧化锰纳米粒，然后通过硅烷化试剂替换油酸，获得水分散的氧化锰纳米粒，再键合脑胶质瘤特异性靶向分子，获得对脑胶质瘤特异性靶向的氧化锰纳米粒。

具体地，其主要步骤为：

1）将无机锰化合物、油酸钠分散于乙醇、水、正己烷的混合液中，50-70℃反应制得前驱体油酸锰；无机锰化合物与油酸钠的摩尔比为0.8-1.2∶2，乙醇、水、正己烷的体积比为4∶3∶7；

3）将油酸包裹的氧化锰纳米粒分散于甲苯中，加入少量醋酸，超声，加入硅烷化试剂反应，得到硅烷化的氧化锰纳米粒；油酸包裹的氧化锰米粒与醋酸的质量比10000∶6-8；

本发明的水分散，对脑胶质瘤特异性靶向的氧化锰纳米粒中，硅烷化试剂包括但不限于：硅烷羧酸、硅烷氨基、硅烷巯基或硅烷聚乙二醇（硅烷PEG）。

本发明的水分散，对脑胶质瘤特异性靶向的氧化锰纳米粒中，脑胶质瘤特异性靶向分子包括但不限于：叶酸、CTX、RGD、TAT或ANG。

本发明的水分散，对脑胶质瘤特异性靶向的氧化锰纳米粒可作为一类新型MRI T₁造影剂用于脑胶质瘤的早期诊断和边界界定。

本发明采用硅烷化试剂替换油酸，并键合脑胶质瘤特异性靶向分子，制备出水分散，对脑胶质瘤特异性靶向的氧化锰纳米粒。体外毒性实验（MTT）及体内毒性实验（HE染色）表明此类造影剂具有良好的生物相容性。将其应用于小鼠脑胶质瘤造影，结果显示此造影剂对于早期脑胶质瘤有明显的对比增强效果并可清晰呈现瘤体边界。

附图说明

图1是本发明中水分散，对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒的透射电镜（TEM）图。

图2是本发明中水分散，对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒的粒径分布图。

图3是本发明中水分散，对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒的X射线衍射（XRD）图。

图4是本发明中水分散，对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒的傅里叶红外（FTIR）谱图。

图5是本发明中水分散，对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒在7T核磁共振仪上所测定的弛豫率值。

图中的横坐标是Mn（II）的浓度，纵坐标为横向弛豫时间（T₁）的倒数，线性拟合后的斜率则为弛豫率（r₁）。

图6是本发明中水分散，对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒在不同浓度下与C6胶质瘤细胞共同孵育24小时后的细胞生存率。

图7A是对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒(8mg/kg)前的脑部的T₁加权成像扫描图，图7B是对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒(8mg/kg)120分钟后的脑部的T₁加权成像扫描图。

图8是ICR正常小鼠与尾静脉注射水分散，对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒(5mg/kg)5天后小鼠的脑，心，肝，脾，肺，肾切片HE染色得到的病理组织分析结果。

具体实施方式

本发明的水分散，对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒，由于硅烷化试剂的修饰使得纳米粒显现出良好的水分散性和稳定性，靶向分子的修饰使得纳米粒对脑胶质瘤具有特异靶向性。此外，该纳米粒具有优良的弛豫性能。因此，可作为一类新型的MRI T₁造影剂用于脑胶质瘤的早期诊断和瘤体边界界定。

本发明首先采用高温分解法制备出油酸包裹的氧化锰纳米粒，然后用硅烷化试剂替换纳米粒表面油酸，再键合脑胶质瘤特异性靶向分子，获得水分散的，对脑胶质瘤特异性靶向的氧化锰纳米粒作为一类新型MRI T₁造影剂。

以下结合附图和具体实施例对本发明作详细说明。

实施例1

1）油酸包裹氧化锰纳米粒的制备：

采用高温分解法合成油酸包裹的氧化锰纳米粒：将四水合氯化锰（3.96g，20mmol）、油酸钠（12.17g，40mmol）分散于乙醇（40ml）、水（30ml）、正己烷（70ml）的混合液中，70℃下搅拌4小时，取有机相并用少量水洗涤，去除溶剂得到油酸锰前驱体。将制得的油酸锰前驱体（2.468g，4mmol）溶于1-十八烯（50ml），100℃真空搅拌30-60min。在氮气保护下，升温至300℃回流15min，冷却至室温。加入无水乙醇后离心，将所得黑色沉淀分散于正己烷，并用少量无水乙醇洗涤，得到油酸包裹的氧化锰纳米粒。

2）硅烷化氧化锰纳米粒的制备：

将50mg步骤1）制备的油酸包裹的氧化锰纳米粒分散于100ml无水甲苯中，加入30μl醋酸，超声15min。加入0.6ml硅烷羧酸，70℃下搅拌48小时。将所得固体分离，分别用甲苯和无水甲醇洗两次，再分散于去离子水中，透析24小时，冷冻干燥得到硅烷化氧化锰纳米粒。

3)对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒的制备：

将步骤2）制备的硅烷化修饰的水分散的氧化锰纳米粒分散于10ml去离子水中，加入EDC和NHS，搅拌30min。然后，加入氨基聚乙二醇-叶酸（NH₂-PEG₂₀₀₀-FA），室温反应24h。透析，冷冻干燥得到水分散，对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒。

本发明制备的水分散，对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒的透射电镜，X射线衍射，粒径分布，傅里叶红外的表征见图1、2、3、4。

从图1中可以看出，氧化锰纳米粒的粒径在10-20纳米之间。

从图2中可以看出，氧化锰纳米粒水合粒径在100纳米以下。

从图3中可以看出，氧化锰纳米粒为立方体晶型。

从图4中可以看出，PEG-叶酸被成功键合到纳米粒表面。

实施例2

弛豫率的测定：

将实施例1中氧化锰纳米粒配制成系列浓度悬浮液，7T核磁共振仪上采用RARE-T₁+T₂-map序列测定弛豫率。各项参数设置如下：TR=800ms，TE=11ms，33ms，55ms，77ms，99ms，matrix size=256×256，FOV=4.0×4.0cm²，flip angle(FA)=180°及slice thickness=1mm，对所配系列溶液进行T₁加权成像扫描，将所得横向弛豫时间（T₁）的倒数与浓度进行线性拟合，所得直线斜率即为弛豫率。其拟合曲线见图5。从图5中可以看出，随着锰浓度升高，其弛豫时间明显减小。由线性拟合得到实施例1中氧化锰纳米粒r₁弛豫率为4.8mM^-1s^-1

实施例3

细胞毒性：

1）细胞培养：C6胶质瘤细胞采用DMEM培养基（含10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素），在37℃含5%CO₂的保湿培养箱中培养24小时。

2）细胞毒性：将C6胶质瘤细胞以1×10⁵的细胞密度接种于96孔板，孵育24小时。将实施例1中的氧化锰纳米粒用培养基配制成锰浓度为0、6.125、12.5和25μg/mL的溶液后分别加入到96孔板中，共同孵育24小时和48小时后，弃掉含纳米粒的培养基，用PBS洗两次，加入MTT（100μl，0.5mg/ml），再孵育4小时，弃掉MTT，加入150μl DMSO，避光震荡5分钟，用酶标仪测定570nm波长下每孔的OD值。计算得到不同氧化锰纳米粒浓度下的细胞存活率见图6。

从图6中可以看出，在所测试氧化锰纳米粒浓度范围，孵育24小时后，细胞均有较高的存活率，表明本发明中的水分散，对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒具有较低的胞毒性。

实施例4

动物实验：

1）磁共振成像：选取脑胶质瘤模型鼠（20g），以6%水合氯醛0.1ml/20g，腹腔注射麻醉。用7T核磁共振仪对小鼠脑部进行T₁加权成像扫描。各项参数设置如下：TR=3000.0ms，TE=45.0ms，matrix size=256×256，field ofview=3.0×3.0cm²，flip angle=180°，slice thickness=1mm及number ofaverages=10。

将实施例1中水分散，对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒（8mg/kg）以尾静脉注射方式注入小鼠体内，分别在注射前和注射后120分钟对小鼠脑部进行MRI扫描。所得T₁加权图像见图7A和图7B。

图7B显示实施例1中的氧化锰纳米粒可增强早期脑胶质瘤与正常组织的对比度，瘤体边界清晰。

2）取脏器组织及后固定：选取ICR小鼠（20g），将实施例1中水分散，对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒通过尾静脉以5mg/kg的剂量注入小鼠体内。6天后，处死小鼠，并将小鼠仰卧固定，沿胸廓下沿打开胸腔，取出心脏，肝脏，脾，肺，肾内脏置于10%甲醛溶液中，放置四天至组织沉于瓶底。

3）石蜡包埋切片：将组织从10%甲醛溶液中取出，蒸馏水洗净，脱水后嵌入石蜡，快速冷冻，进行石蜡切片，切片厚度为5μm，展于载玻片上。

4）切片组织的HE染色：将组织切片入蒸馏水后，放入Harris苏木精染液中染色15min，自来水冲洗20min返蓝，后置于盐酸酒精分色液中10秒进行分色，自来水冲洗5min后如蒸馏水，然后置于1%伊红染色10秒，自来水冲去浮色，依次入70%、95%、100%酒精上行脱水1min，后置入二甲苯中透明2min，以中性树胶封片。

5）于倒置显微镜下观察各脏器组织切片，见图8。从图8中可以看出，本发明中水分散，对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒不具有明显的组织毒性，其生物相容性良好。

Claims

1.一种对脑胶质瘤特异靶向的氧化锰纳米粒造影剂，通过下述方法得到：

4）将氧化锰纳米粒分散于去离子水中，键合脑胶质瘤特异性靶向分子，得到对脑胶质瘤特异性靶向氧化锰纳米粒。

2.根据权利要求1所述的氧化锰纳米粒造影剂，其中，氧化锰纳米粒的粒径为10-20纳米。

3.一种制备对脑胶质瘤特异靶向的氧化锰纳米粒造影剂的方法：

4.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤1中无机锰化合物∶油酸钠的摩尔比为0.8-1.2∶2，乙醇∶水∶正己烷的体积比为4∶3∶7。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤3中油酸包裹的氧化锰米粒∶醋酸的质量比10000∶6-8。

6.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤3的硅烷化试剂为硅烷羧酸、硅烷氨基、硅烷巯基或硅烷聚乙二醇。

7.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤4的脑胶质瘤特异性靶向分子为叶酸、CTX、RGD、TAT或ANG。

8.权利要求1所述的对脑胶质瘤特异靶向的氧化锰纳米粒作为MRIT₁造影剂在脑胶质瘤早期诊断和边界界定的应用。