CN102863026A - 一种水分散的锰掺杂磁性纳米簇及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种水分散的锰掺杂磁性纳米簇,以MnxFe(1-x)Fe2O4为内核,表面修饰硅烷化试剂,表达式为TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4,x<1;式中:TETT为硅烷化试剂。本发明的制备方法是采用高温分解法制备具有较高磁性的油酸包被的超顺磁性MnxFe(1-x)Fe2O4纳米粒,然后通过配体交换法用硅烷羧酸替换纳米粒表面油酸获得水分散微量锰掺杂磁性纳米簇(TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4)。本发明可以用于体内外组织或细胞的标记和MRI造影。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料领域,具体涉及一种水分散的锰掺杂磁性纳米簇。
本发明还涉及上述水分散的锰掺杂磁性纳米簇的制备方法和表征。
本发明还涉及上述水分散的锰掺杂磁性纳米簇作为MRI造影剂在体内外的应用。
背景技术
磁共振成像(MRI)作为目前临床上最重要的无创诊断手段,能提供高分辨率的解剖信息、功能信息及更好的软组织对比度,而造影剂的使用能帮助更好的区分病理组织与正常组织。目前一些可用于MRI的T2造影剂例如菲立磁(氧化铁纳米粒)磁性较低,导致弛豫率低和敏感性不足的问题,从而限制了其在临床的应用。因此,研制一种高弛豫率的造影剂对于疾病诊断具有重大意义。
将金属M掺杂到氧化铁纳米粒中(MFe2O4,M=Co、Mn、Ni、Cu、Zn)可明显提高造影剂的弛豫率。与其它金属相比,Mn的参杂(MnFe2O4)表现出更高的磁性和更好的MRI造影效果,极具潜力成为一种新型MRI探针。最新研究表明,将MnFe2O4造影剂做成簇,会进一步提高磁性和弛豫率。许多研究将MnFe2O4(Mn∶Fe=1∶2)用不同配体通过自组装方法制备而成的水分散的纳米簇,弛豫率增加至270、345,甚至470(Mn+Fe)mM-1s-1,远高于非簇纳米粒的弛豫率。然而,由于锰与铁的摩尔比(Mn∶Fe=1∶2)相对较高,易导致潜在的神经性毒性,故降低锰的含量但同时保持较高的弛豫性能是研发高敏感性造影剂急需解决的难题之一。迄今为止,微量锰参杂的磁性纳米粒MnFe2O4用于造影剂的研究未见文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水分散的锰掺杂磁性纳米簇。
本发明的又一目的在于提供制备上述水分散的锰掺杂磁性纳米的方法。
为实现上述目的,本发明提供的水分散的锰掺杂磁性纳米簇,以MnxFe(1-x)Fe2O4为内核,表面修饰硅烷化试剂,表达式为
TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4,x<1;
式中:
TETT为硅烷化试剂;
本发明提供的制备上述水分散的锰掺杂磁性纳米簇的方法,采用高温分解法制备油酸包被的超顺磁性MxFe(1-x)Fe2O4(x<1)纳米粒,然后通过配体交换法用硅烷化试剂替换纳米粒表面油酸获得水分散的锰掺杂磁性纳米簇,表达式为TETT-MxFe(1-x)Fe2O4(x<1)。
本发明的水分散的锰掺杂磁性纳米簇中,内核的粒径为4纳米至20纳米。
本发明的水分散的锰掺杂磁性纳米簇中,硅烷化试剂包括:硅烷羧酸、硅烷氨基、硅烷巯基或硅烷聚乙二醇(硅烷PEG)。
本发明的水分散的锰掺杂磁性纳米簇可以应用在作为药物载体及基因转染中、作为细胞示踪药物中以及作为磁共振造影剂中。
本发明首次将硅烷羧酸键合到锰掺杂磁性纳米粒表面,制备出一系列水分散的锰掺杂磁性纳米簇。其本身具备高弛豫性能,可作为MRI造影剂。该纳米簇表面由于覆盖硅烷羧酸,具有大量可供修饰的官能团,可用于连接荧光分子或螯合剂,从而作为多模式造影剂的载体,也可用于负载药物或基因而具有成为药物和基因转染载体的潜力。研究结果表明:微量锰掺杂磁性纳米簇[TETT-Mn0.05Fe(3-0.05)O4]弛豫率高达528.48mM-1s-1,高于未掺杂的纯铁纳米簇(TETT-Fe3O4)。其在高达200μg mL-1的浓度下仍然具有很低的细胞杀伤力,体内HE染色以表明此纳米簇在体内具有良好的生物相容性。小鼠肝脏造影结果显示此纳米簇具备极好的MRI造影增强效果。
附图说明
图1是本发明实施例1水分散的微量锰掺杂磁性纳米簇[TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0、0.05、0.09、0.16、0.40)]透射电子显微镜(TEM)图;其中:
A是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0);
B是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0.05);
C是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0.09);
D是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0.16);
E是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0.40)。
图2是本发明实施例1中水分散的微量锰掺杂磁性纳米簇[TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0,0.05,0.09,0.16,0.40)]X射线衍射(XRD)图;其中:
A是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0);
B是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0.05);
C是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0.09);
D是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0.16);
E是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0.40)。
图3是本发明实施例1中水分散的微量锰掺杂磁性纳米簇[TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0,0.05,0.09,0.16,0.40)]粒径分布(DLS)图。
图4是本发明实施例1中水分散的微量锰掺杂磁性纳米簇[TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0,0.05,0.09,0.16,0.40)]傅里叶红外(FTRI)图;其中:
a是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0);
b是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0.05);
c是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0.09);
d是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0.16);
e是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0.40)。
图5是本发明实施例1中微量锰掺杂磁性纳米裸核[MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0,0.05,0.09,0.16,0.40)]饱和磁化强度(VSM)曲线图。
图6是本发明实施例1中水分散的微量锰掺杂磁性纳米簇[TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0,0.05,0.09,0.16,0.40)]在7T核磁共振仪上所测定的弛豫率值;其中:
a是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0.05);
b是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0.09);
c是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0);
d是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0.16);
e是本发明实施例1中TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0.40);
图中的横坐标是TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4的浓度,纵坐标为横向弛豫时间(T2)的倒数,线性拟合后的斜率则为弛豫率(r2)。
图7是C6胶质瘤细胞与本发明实施例1中TETT-Mn0.05Fe(0.05)Fe2O4在0、25、50、100、200μg/mL浓度下共同孵育24小时和48小时后,细胞生存率的柱状图。
图8是ICR小鼠尾静脉注射前,与注射TETT-Mn0.05Fe(0.05)Fe2O4(2.5mg/kg)30分钟与120分钟后肝部的T2加权成像扫描图。
图9是ICR正常小鼠与尾静脉注射TETT-Mn0.05Fe(0.05)Fe2O4(5mg/kg)5天后小鼠的心脏、肝脏、脾、肺、肾组织切片通过HE染色得到的病理组织分析结果。
具体实施方式
本发明提供的水分散的锰掺杂磁性纳米簇,以粒径约为4纳米至20纳米的TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x<1)为内核,表面修饰硅烷化试剂。为叙述上的方便,将本发明的水分散的微量锰掺杂磁性纳米簇表示为
TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x<1);
TETT是指硅烷化试剂,包括:硅烷羧酸、硅烷氨基、硅烷巯基或硅烷PEG。
本发明的水分散的锰掺杂磁性纳米簇,由于在MnxFe(1-x)Fe2O4纳米粒外面修饰了硅烷羧酸,这类纳米粒在水溶液中具有好的分散性、稳定性和生物相容性,由于外部羧基可以共价或物理结合药物、DNA等,因此可用作基因和药物载体,而且由于去具有高磁性和良好的弛豫性能,能够实现高效、稳定的体内外组织或细胞的标记和MRI造影。
本发明的水分散的锰掺杂磁性纳米簇,是在Fe3O4内核中掺杂了不同比例的二价锰离子,由这些二价锰离子取代部分二价铁离子。不同比例的锰掺杂量用来评估对成簇程度、磁化强度、弛豫性能的影响。
本发明制备上述水分散的锰掺杂磁性纳米簇的方法,是采用公知的高温分解法先制备得到油酸包被的超顺磁性MnxFe(1-x)Fe2O4(x<1)纳米粒,然后通过配体交换法用硅烷化试剂替换纳米粒表面油酸获得水分散的微量锰掺杂磁性纳米簇。
以下结合附图和具体实施例对本发明作详细说明。
实施例1
1)OA-MnxFe(1-x)Fe2O4的制备:
采用Sun et al法合成油酸包被的微量锰掺杂的磁性纳米粒(OA-MnxFe(1-x)Fe2O4):将2mmolFe(acac)3、6mmol油酸、6mmol油胺、10mmol 1,2-十六烷二醇分别与0、0.05、0.1、0.5、1mmolMn(acac)2混合,溶于20ml二甲苯醚中,氮气保护,机械搅拌条件下升温至100℃后进行抽真空30min,充氮气,升温至200℃维持2h,升温至300℃回流反应1h,冷却至室温,加入40ml无水乙醇,离心,所得黑色沉淀重新溶于正己烷,加入0.05ml油酸和油胺,离心(6000rpm,10min),取上清液,加入40ml无水乙醇,离心(6000rpm,10min),弃上清液,将所得固体重新分散在正己烷中保存备用。
2)TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4的制备:
采用配体交换法合成水分散的微量锰掺杂的磁性纳米粒(TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4):将50mg步骤1制备的OA-MnxFe(1-x)Fe2O4溶于100ml无水甲苯中,加入30μl醋酸,超声15min,加入0.6ml硅烷羧酸,70℃下磁力搅拌48小时。用永磁铁从反应液中分离出TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4固体,采用倾注法将所得固体用甲苯洗两次,无水甲醇洗两次,再分散于微量去离子水中,透析24小时,冷冻干燥得到纯净TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4固体。
本发明制备的TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4(x=0、0.05、0.09、0.16、0.40)的透射电镜,X射线衍射,粒径分布,傅里叶红外及饱和磁化强度的表征见图1、2、3、4、5。
从图1中可以看出,随着锰含量的增加,TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4纳米粒的成簇程度逐步降低。
从图2中可以看出,微量锰掺杂并未改变磁性纳米粒的尖晶石结构,另外,在19℃至29℃的宽峰是硅烷羧酸的不定形峰,证明了硅烷羧酸的成功键和。
从图3中可以看出,随着锰掺杂含量的增加,TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4纳米簇的水合粒径逐渐减小。
从图4中可以看出,Si-O-Si键(1102cm-1)和N-C键(919cm-1)的出现表明了硅烷羧酸成功键和到MnxFe(1-x)Fe2O4纳米粒的表面。
从图5中可以看出,随着锰掺杂量的增加,裸核MnxFe(1-x)Fe2O4的磁性呈现先升高后降低的趋势,表明微量锰掺杂(x=0.05)时有助于提高纳米粒的磁性。
实施例2
将实施例1中的硅烷羧酸分别换成硅烷氨基、硅烷巯基和硅烷聚乙二醇,其余条件同实施例1,制备得到的同实施例1的TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4纳米簇。
本发明提供的一系列微量锰掺杂磁性纳米簇(TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4),由于在磁性纳米粒表面共价键合了一层硅烷羧酸,有效提高了MnxFe(3-x)O4在水溶液中的分散性及稳定性并且成簇,同时微量的金属掺杂,较之MnFe2O4降低了猛毒性,保持了良好的生物相容性,更提高了纳米粒的磁性,增强了其弛豫性能。
本发明提供的掺杂磁性纳米簇,在进行尾静脉注射后,能有效地提高MRI信号强度,增强小鼠肝脏的组织对比度,有潜力成为一种新型的T2造影剂。
实施例3
弛豫率的测定实验:
称取实施例1中任意一种的锰掺杂磁性纳米簇(x=0、0.05、0.09、0.16、0.40),溶于1%的琼脂糖凝胶,分别配制成浓度为0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625毫摩尔(Fe+Mn)/升的溶液。使用7T核磁共振仪,选定RARE-T1+T2-map序列,各项参数设置如下:TR=800ms,TE=11ms,33ms,55ms,77ms,99ms,matrix size=256×256,FOV=4.0×4.0cm2,flip angle(FA)=180℃及slice thickness=1mm,对所配溶液进行T2加权成像扫描,将所得横向弛豫时间(T2)的倒数与浓度进行线性拟合,所得斜率即为弛豫率。其拟合曲线见图6。
从图6中可以看出,随着锰掺杂含量的增加,r2值呈现先升高后降低的趋势,这与其磁性趋势相符合,此外,纳米粒成簇程度的减小亦是导致r2值骤然下降的原因。这表明,微量锰掺杂(x=0.05)有助于获得高弛豫性能的纳米造影剂。
实施例4
细胞实验:
1)细胞培养实验:C6胶质瘤细胞采用DMEM培养基(含10%胎牛血清,100U/ml青霉素,100U/ml链霉素),在37℃含有5%CO2的保湿培养箱中培养24小时。
2)细胞毒性实验:首先将C6胶质瘤细胞以1×105的细胞密度接种于96孔板孵育24小时。而后将实施例1中锰掺杂磁性纳米簇TETT-Mn0.05Fe(1-0.05)Fe2O4用培养基配制成浓度为25、50、100、150和200μg/mL的溶液,分别向96孔板不同孔内加入含纳米粒的培养基,共同孵育,24小时和48小时后,弃掉含纳米粒的培养基,用PBS洗两次,加入MTT(100μl,0.5mg/ml),孵育4小时,弃掉MTT,加入150μl DMSO,避光震荡5分钟,用酶标仪测定490nm波长下每孔的OD值。不同浓度下的细胞存活率见图7。
从图7中可以看出,即使在高达200μg mL-1的浓度下孵育48小时候仍然具有很低的细胞杀伤力,表明此纳米簇具有良好的生物相容性。
实施例5
动物实验:
1)磁共振成像实验:选取ICR小鼠(20g),以6%水合氯醛0.1ml/20g,腹腔注射麻醉。使用7T核磁共振仪,选定TurboRARE-T2序列,各项参数设置如下:TR=3000.0ms,TE=45.0ms,matrix size=256×256,field ofview=3.0×3.0cm2,flip angle=180°,slice thickness=1mm及number ofaverages=10,对小鼠肝脏部位进行T2加权成像扫描。
将实施例1中锰掺杂磁性纳米簇TETT-Mn0.05Fe(1-0.05)Fe2O4通过尾静脉以2.5mg/kg的剂量注入小鼠内,分别在注射30分钟及120分钟后,以同样序列对小鼠进行MRI扫描。所得T2加权图像见图8。
2)取脏器组织及后固定:选取ICR小鼠(20g),将实施例1中锰掺杂磁性纳米簇TETT-Mn0.05Fe(1-0.05)Fe2O4通过尾静脉以5mg/kg的剂量注入小鼠内,6天后,处死,仰卧固定,沿胸廓下沿打开胸腔,取出心脏,肝脏,脾,肺,肾内脏置于10%甲醛溶液中,放置四天至组织沉于瓶底。
3)石蜡包埋切片:将组织从10%甲醛溶液中取出,蒸馏水洗净,脱水后嵌入石蜡,快速冷冻,进行石蜡切片,切片厚度为5μm,展于载玻片上。
4)切片组织的HE染色:将组织切片入蒸馏水后,放入Harris苏木精染液中染色15min,自来水冲洗20min返蓝,后置于盐酸酒精分色液中10秒进行分色,自来水冲洗5min后如蒸馏水,然后置于1%伊红染色10秒,自来水冲去浮色,依次入70%,95%,100%酒精上行脱水1min,后置入二甲苯中透明2min,以中性树胶封片。
5)分析:于倒置显微镜下观察各脏器组织切片,见图9。从图9中可以看出,本发明的锰掺杂磁性纳米簇TET T-Mn0.05Fe(1-0.05)Fe2O4不具有明显的组织毒性,表明其生物相容性良好。
Claims (9)
1.一种水分散的锰掺杂磁性纳米簇,以MnxFe(1-x)Fe2O4为内核,表面修饰硅烷化试剂,表达式为
TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4,x<1;
式中:
TETT为硅烷化试剂。
2.如权利要求1所述水分散的锰掺杂磁性纳米簇,其中,内核的粒径为4纳米至20纳米。
3.如权利要求1所述水分散的掺杂磁性纳米簇,其中,硅烷化试剂包括:硅烷羧酸、硅烷氨基、硅烷巯基或硅烷聚乙二醇。
4.一种制备权利要求1所述水分散的锰掺杂磁性纳米簇的方法,采用高温分解法制备油酸包被的超顺磁性MnxFe(1-x)Fe2O4(x<1)纳米粒,然后通过配体交换法用硅烷化试剂替换纳米粒表面油酸获得水分散的微量锰掺杂磁性纳米簇,表达式为
TETT-MnxFe(1-x)Fe2O4,x<1;
式中:
TETT为硅烷化试剂。
5.如权利要求4所述的制备方法,其中,内核的粒径为4纳米至20纳米。
6.如权利要求4所述的制备方法,其中,硅烷化试剂包括:硅烷羧酸、硅烷氨基、硅烷巯基或硅烷聚乙二醇。
7.权利要求1所述水分散的锰掺杂磁性纳米簇在作为药物载体及基因转染中的应用。
8.权利要求1所述水分散的锰掺杂磁性纳米簇在制备作为细胞示踪药物中的应用。
9.权利要求1所述水分散的锰掺杂磁性纳米簇在制备作为磁共振造影剂中的应用。
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