CN114504647A - 一种水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种水凝胶及其制备方法和应用，属于高分子材料技术与生物医用材料技术领域。在本发明中，所述水凝胶以聚多巴胺和透明质酸为凝胶基质，负载有抗菌肽和光催化材料。本发明利用凝胶基质中聚多巴胺的光热性能及由感染部位细菌分泌特有的透明质酸酶和过氧化氢来触发的抑菌过程，相辅相成，实现了功能和抗菌周期的配合，可以实现组织表面细菌的快速杀灭和深层次组织的细菌的长效彻底杀灭。
Description
技术领域
本发明属于高分子材料技术与生物医用材料技术领域，具体涉及一种水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
细菌感染是致病菌或条件致病菌侵入血循环中生长繁殖，产生毒素和其他代谢产物所引起的急性全身性感染，临床上以寒战、高热、皮疹、关节痛及肝脾肿大为特征，部分会有感染性休克和迁徙性病灶。临床上部分患者还会出现烦躁、四肢厥冷及紫绀、脉细速、呼吸增快、血压下降等。尤其是老人、儿童、有慢性病或免疫功能低下者、治疗不及时及有并发症者，可发展为败血症或者脓毒血症。目前，传统用于治疗细菌感染的药物主要是抗生素和重金属离子。抗生素、重金属离子等传统疗法虽然可以抑制细菌和炎症，但也存在明显的弊端：比如抗生素导致“超级细菌”、药物过量、溶解性差等问题；重金属离子不会对感染组织选择性杀伤，对正常组织也会有杀伤作用。因此，有必要建立高效的靶向灭菌给药系统。
水凝胶是一种具有多孔的三维网络结构的聚合物，具有孔径可调、含水量高、生物相容性好、易修饰、药物释放灵活等优点，可广泛应用于生物医学领域，可作为生物大分子或纳米颗粒或纳米颗粒的载体，通过合理的设计，其本身也可作为一种很好的抗菌材料。然而，现有负载药物的水凝胶在细菌清除的过程中不能针对细菌感染部位进行特异性和长效性杀菌。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种水凝胶及其制备方法和应用，本发明的水凝胶具有良好的光热性能，在红外光辐照下可以在短时间内快速杀灭组织表层的大量细菌，同时通过透明质酸酶和过氧化氢双重响应性，由感染部位细菌分泌的透明质酸酶和过氧化氢触发抗菌过程，抗菌过程具有特异性，并且能够实现长效杀菌。
本发明提供了一种水凝胶，包括凝胶基质和包裹在所述凝胶基质中的抗菌组分，所述凝胶基质包括聚多巴胺和透明质酸；所述抗菌组分包括抗菌肽和光催化材料。
优选的，所述光催化材料包括类石墨相氮化碳纳米粒子。
优选的，所述抗菌肽和光催化材料的质量比为(0.1～0.2)：10。
优选的，所述透明质酸的分子量为10～100wDa。
本发明还提供了上述方案所述的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
1)将抗菌肽、部分多巴胺和第一部分水混合，进行缩合反应，得到抗菌肽修饰的多巴胺；
2)将光催化材料、透明质酸、剩余多巴胺和第二部分水混合，进行缩合反应，得到由多巴胺和透明质酸包裹的光催化材料；
3)将高碘酸钠、第三部分水、抗菌肽修饰的多巴胺以及由多巴胺和透明质酸包裹的光催化材料混合，静置反应，得到水凝胶；
所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序关系。
优选的，所述混合包括搅拌混合；所述搅拌混合的转速为300～500rpm；所述搅拌混合的时间为3～8min。
优选的，所述静置的时间为6～12h。
本发明还提供了上述方案所述的水凝胶或者所述的制备方法制备得到的水凝胶在制备抗菌产品中的应用。
优选的，所述抗菌包括细菌感染引起的皮肤损伤修复。
优选的，所述抗菌产品包括抗菌LB琼脂。
本发明提供了一种水凝胶，以聚多巴胺和透明质酸为凝胶基质，负载有抗菌肽和光催化材料。本发明的水凝胶的凝胶基质中含有黑色的聚多巴胺，水凝胶的颜色表现为黑色。当凝胶置于感染部位时，聚多巴胺在808nm(功率为1W/cm2)红外光的辐照下，产生光热作用，可以在短时间内利用局部高温杀灭组织中的大量细菌。此时，光催化材料包被在黑色的水凝胶中时不吸收可见光，也就不发挥作用。细菌感染部位的透明质酸酶含量远高于正常组织，透明质酸酶能够分解所述水凝胶中的透明质酸，由于光催化材料与水凝胶主体的连接是通过透明质酸完成的，当透明质酸被透明质酸酶分解后，凝胶基质结构被破坏，光催化材料失去束缚，从凝胶体系中缓慢释放出来，在释放过程中光催化材料暴露在可见光下，光催化材料的光催化性能被触发，释放大量的ROS，ROS可以渗透入组织内部从而杀灭更深层的细菌，进而能够实现长效、深层次杀菌。同时，ROS通过直接破坏细菌的蛋白质和核酸，导致细菌死亡，这种杀菌方式不会影响细菌代谢，也就可以避免出现耐药性。另外，细菌感染部位的过氧化氢含量也远高于正常组织。过氧化氢作为强氧化性物质可以降解聚水凝胶中的聚多巴胺，聚多巴胺被降解为小分子后，凝胶基质结构被破坏，抗菌肽从凝胶体系中缓慢释放出来，释放的抗菌肽通过扩散作用被组织逐步吸收，对组织深处的细菌进行杀灭。并且，本发明的水凝胶负载有抗菌肽，可以防止细菌的二次感染，能够创造一个长期稳定的无菌环境。本发明利用由光热性能、感染部位细菌分泌特有的透明质酸酶和过氧化氢来触发抑菌过程，相辅相成，实现了功能和抗菌周期的配合，可以实现深层次组织的细菌的彻底杀灭。再者，本发明采用的凝胶基质是透明质酸(HA)和聚多巴胺(PDA)，两者均生物相容性良好，可实现生物降解，降解物无毒性。
附图说明
图1是实施例10提供的多孔结构的水凝胶微观形貌图；
图2是实施例10提供的多孔结构的水凝胶的能量色散X射线光谱法测得的元素分布图；
图3是实施例10提供的多孔结构的水凝胶成凝胶前(a)和后(b)的照片；
图4是实施例10、实施例12和实施例13中提供的水凝胶的光热性能图；
图5是实施例11、实施例14和实施例15中提供的水凝胶在过量过氧化氢环境下的FITC-ε-PL的释放曲线；
图6是实施例11、实施例16和实施例17中提供的水凝胶在透明质酸酶环境下的Rhb-g-C3N4的释放曲线；
图7是实施例11、实施例18中提供的水凝胶在透明质酸酶环境下的Rhb-g-C3N4释放后的活性氧产生情况；
图8是实施例10中水凝胶对金黄色葡萄球菌的抑菌环实验效果图，其中a为仅光热抗菌效果、b为光热和光催化双重效果、c为三重效果叠加的效果；
图9是实施例10中水凝胶对感染小鼠皮肤组织治疗3d后的细菌抑制效果图；
图10是实施例10中水凝胶对感染小鼠皮肤组织治疗3d后的细菌抑制统计图；
图11是实施例10中水凝胶对感染小鼠皮肤组织治疗7d后的细菌抑制效果图；
图12是实施例10中水凝胶对感染小鼠皮肤组织治疗7d后的细菌抑制统计图；
图13是实施例10提供的组织H&E染色的效果图；
图14是实施例10提供的组织Masson染色的效果图；
图15是实施例10提供的毛囊分布的数量统计图；
图16是实施例10提供的免疫相关Ki-67的分布图；
图17是实施例10提供的免疫相关CK14的分布图；
图18是实施例10提供的免疫相关iNOS的分布图；
图19是实施例10提供的免疫相关因子Ki-67的表达对比图；
图20是实施例10提供的免疫相关因子CK14的表达对比图；
图21是实施例10提供的免疫相关因子iNOS的表达对比图；
图22是实施例10提供的免疫相关因子CD206的表达对比图。
具体实施方式
本发明提供了一种水凝胶，一种水凝胶，包括凝胶基质和包裹在所述凝胶基质中的抗菌组分，所述凝胶基质包括聚多巴胺和透明质酸；所述抗菌组分包括抗菌肽和光催化材料。
在本发明中，所述抗菌肽和光催化材料的质量比为优选为(0.1～0.2)：10，更优选为0.15:10。
在本发明中，所述水凝胶的直径优选为25～35μm，更优选为30μm。在本发明中，所述水凝胶为多孔结构，孔洞分布均匀。
在本发明中，以聚多巴胺和透明质酸作为凝胶基质；聚多巴胺和透明质酸均生物相容性良好，可实现生物降解，降解物无毒性。在本发明中，所述透明质酸的分子量优选为10～100wDa。
在本发明中，聚多巴胺(PDA)作为优秀地光热材料具有较强的近红外吸收能力和光热转换效率，当有波长为808nm的近红外光照射时，由于温差，大部分细菌在短时间内被杀死。
在本发明中，本发明的水凝胶的凝胶基质中含有黑色的聚多巴胺，水凝胶的颜色表现为黑色，当光催化材料包被在黑色的水凝胶中时不吸收可见光，也就不发挥作用。细菌感染部位的透明质酸酶含量远高于正常组织，透明质酸酶能够分解所述水凝胶中的透明质酸，由于光催化材料与水凝胶主体的连接是通过透明质酸完成的，当透明质酸被透明质酸酶分解后，凝胶基质结构被破坏，光催化材料失去束缚，从凝胶体系中缓慢释放出来，在释放过程中光催化材料暴露在可见光下，光催化材料的光催化性能被触发，释放大量的ROS，ROS可以渗透入组织内部从而杀灭更深层的细菌，进而能够实现长效、深层次杀菌。同时，ROS通过直接破坏细菌的蛋白质和核酸，导致细菌死亡，这种杀菌方式不会影响细菌代谢，也就可以避免出现耐药性。
在本发明中，所述抗菌肽优选为具有广谱性抗菌功能的抗菌肽；所述抗菌肽优选的包括ε-PL；细菌感染部位的过氧化氢含量也远高于正常组织。过氧化氢作为强氧化性物质可以降解聚水凝胶中的聚多巴胺，聚多巴胺被降解为小分子后，凝胶基质结构被破坏，抗菌肽从凝胶体系中缓慢释放出来，释放的抗菌肽通过扩散作用被组织逐步吸收，对组织深处的细菌进行杀灭。并且，本发明的水凝胶负载有抗菌肽，可以防止细菌的二次感染，能够创造一个长期稳定的无菌环境。
本发明利用高碘酸钠对多巴胺的强氧化作用，使其形成聚多巴胺凝胶。
本发明还提供了上述发囊所述的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
1)将抗菌肽、部分多巴胺和第一部分水混合，进行缩合反应，得到抗菌肽修饰的多巴胺；
2)将光催化材料、透明质酸、剩余多巴胺和第二部分水混合，进行缩合反应，得到由多巴胺和透明质酸包裹的光催化材料；
3)将高碘酸钠、第三部分水、抗菌肽修饰的多巴胺以及由多巴胺和透明质酸包裹的光催化材料混合，静置反应，得到水凝胶；
所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序关系。
本发明首先将抗菌肽、部分多巴胺和第一部分水混合，进行缩合反应，得到抗菌肽修饰的多巴胺。在本发明中，所述抗菌肽、部分多巴胺和第一部分水的混合顺序优选为先将部分多巴胺和第一部分水混合，得到部分多巴胺水分散液，所述部分多巴胺水分散液再和抗菌肽混合，进行缩合反应。在本发明中，所述部分多巴胺和第一部分水的质量比优选为(5～8)：1。在本发明中，所述缩合反应的时间优选为24～48h，更优选为36h。
本发明将光催化材料、透明质酸、剩余多巴胺和第二部分水混合，进行缩合反应，得到由多巴胺和透明质酸包裹的光催化材料。在本发明中，所述光催化材料、透明质酸、剩余多巴胺和第二部分水的混合顺序优选为：光催化材料和透明质酸溶于水，得到透明质酸溶液；剩多巴胺溶于水，得到剩余多巴胺溶液；将透明质酸溶液和剩余多巴胺溶液混合进行缩合反应；所述透明质酸溶液中透明质酸的质量浓度优选为10～30mg/mL，更优选为20mg/mL；所述剩余多巴胺溶液中多巴胺的质量浓度优选为30～50mg/mL，更优选为40mg/mL。
在本发明中，所述缩合反应的时间优选为12～24h，更优选为16～20h。
得到抗菌肽修饰的多巴胺以及由多巴胺和透明质酸包裹的光催化材料后，本发明将高碘酸钠(NaIO4)、第三部分水、抗菌肽修饰的多巴胺以及由多巴胺和透明质酸包裹的光催化材料混合，静置，得到水凝胶。在本发明中，所述高碘酸钠、第三部分水、抗菌肽修饰的多巴胺以及由多巴胺和透明质酸包裹的光催化材料的混合顺序优选为：先将高碘酸钠溶于第三部分水，得到高碘酸钠水分散液；所述高碘酸钠水分散液的质量浓度为5～8mg/mL。在本发明中，所述混合的方式优选的包括搅拌混合；所述搅拌混合的温度优选为20～30℃，更优选为25℃；所述搅拌混合的转速优选为300～500rpm，更优选为400rpm；所述搅拌混合的时间优选为3～8min，更优选为5min。在本发明中，所述静置的时间优选为6～12h，更优选为8～10h。
在本发明中，所述部分多巴胺和剩余多巴胺的总质量和所述透明质酸的质量比优选为(10～12)：20。
本发明的制备方法简单易于操作，产率高、反应周期短、原料利用率高且易于操作。本发明在操作过程中不产生有机废液/物，符合绿色环保的制备条件。本发明无需用到大型昂贵的仪器设备，生产成本低。
本发明还提供了上述方案所述的水凝胶或者所述的制备方法制备得到的水凝胶在制备抗菌药品或抗菌试剂中的应用。
在本发明中，所述抗菌药品优选的包括用于细菌感染引起的皮肤损伤修复的药品。
在本发明中，所述抗菌试剂优选的包括抗菌LB琼脂板。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
称取1mg的抗菌肽(ε-PL)溶于2mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入1mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，搅拌10min后，称取100mg多巴胺(DA)溶于2mL去离子水中，加入0.5mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和2mL DA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到聚赖氨酸修饰的多巴胺(DA-ε-PL)。
称取20mg透明质酸(HA)溶于1mL去离子水中，并将溶液在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，然后加入4mg EDC，搅拌10min后加入2.2mgNHS和10mg光催化粒子(g-C3N4)纳米颗粒，搅拌12h后冻干得透明质酸包被的光催化粒(g-C3N4@HA)。之后，称取5mg的g-C3N4@HA溶于1mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入2mg EDC，搅拌10min后，称取10mg的DA溶于1mL去离子水中，加入1mg NHS和2mL DA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到透明质酸和多巴胺包被的光催化粒(g-C3N4@HA-DA)。
称取30mg的DA-ε-PL溶于1mL去离子水中，称取10mg g-C3N4@HA-DA分散于1mL去离子水中，称取8mg高碘酸钠分散于1mL去离子水中。取400uL 30mg/mL的DA-ε-PL溶液与200uL5mg/mL的g-C3N4@HA-DA分散液在100-300r/min下搅拌3min，混合均匀后；用1％的氢氧化钠溶液将pH值调至8-9之间后，加入100uL的高碘酸钠(NaIO4)，分散液在100-300r/min下搅拌5min，混合均匀后，静置6h后变得到水凝胶。
此条件下得到的水凝胶成胶效果较差，凝胶强度低且结构不稳定。
实施例2
称取1mg的ε-PL溶于2mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入1mg EDC，搅拌10min后，称取100mg DA溶于2mL去离子水中，加入0.5mg NHS和2mL DA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到DA-ε-PL。
称取20mg HA溶于1mL去离子水中，并将溶液在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，然后加入4mg EDC，搅拌10min后加入2.2mg NHS和10mg g-C3N4纳米颗粒，搅拌12h后冻干得g-C3N4@HA。之后，称取5mg的g-C3N4@HA溶于1mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入2mg EDC，搅拌10min后，称取10mg的DA溶于1mL去离子水中，加入1mg NHS和2mLDA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到g-C3N4@HA-DA。
称取30mg的DA-ε-PL溶于1mL去离子水中，称取10mg g-C3N4@HA-DA分散于1mL去离子水中，称取8mg高碘酸钠分散于1mL去离子水中。取400uL 30mg/mL的DA-ε-PL溶液与200uL5mg/mL的g-C3N4@HA-DA分散液在100-300r/min下搅拌3min，混合均匀后；用1％的氢氧化钠溶液将pH值调至8-9之间后，加入100uL的NaIO4，分散液在100-300r/min下搅拌5min，混合均匀后，静置12h后变得到水凝胶。
此条件下得到的水凝胶成胶效果较好，凝胶结构变强。
实施例3
称取1mg的ε-PL溶于2mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入1mg EDC，搅拌10min后，称取100mg DA溶于2mL去离子水中，加入0.5mg NHS和2mL DA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到DA-ε-PL。
称取20mg HA溶于1mL去离子水中，并将溶液在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，然后加入4mg EDC，搅拌10min后加入2.2mg NHS和10mg g-C3N4纳米颗粒，搅拌12h后冻干得g-C3N4@HA。之后，称取5mg的g-C3N4@HA溶于1mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入2mg EDC，搅拌10min后，称取10mg的DA溶于1mL去离子水中，加入1mg NHS和2mLDA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到g-C3N4@HA-DA。
称取30mg的DA-ε-PL溶于1mL去离子水中，称取10mg C3N4@HA-DA分散于1mL去离子水中，称取8mg高碘酸钠分散于1mL去离子水中。取400uL 30mg/mL的DA-ε-PL溶液与200uL5mg/mL的C3N4@HA-DA分散液在100-300r/min下搅拌3min，混合均匀后；用1％的氢氧化钠溶液将pH值调至8-9之间后，加入100uL的NaIO4，分散液在300-500r/min下搅拌5min，混合均匀后，静置6h后变得到水凝胶。
此条件下得到的水凝胶成胶效果好，孔洞结构明显，但是孔分布不均匀。
实施例4
称取1mg的ε-PL溶于2mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入1mg EDC，搅拌10min后，称取100mg DA溶于2mL去离子水中，加入0.5mg NHS和2mL DA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到DA-ε-PL。
称取20mg HA溶于1mL去离子水中，并将溶液在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，然后加入4mg EDC，搅拌10min后加入2.2mg NHS和10mg g-C3N4纳米颗粒，搅拌12h后冻干得g-C3N4@HA。之后，称取5mg的g-C3N4@HA溶于1mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入2mg EDC，搅拌10min后，称取10mg的DA溶于1mL去离子水中，加入1mg NHS和2mLDA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到g-C3N4@HA-DA。
称取30mg的DA-ε-PL溶于1mL去离子水中，称取10mg C3N4@HA-DA分散于1mL去离子水中，称取8mg高碘酸钠分散于1mL去离子水中。取400uL 30mg/mL的DA-ε-PL溶液与200uL5mg/mL的C3N4@HA-DA分散液在100-300r/min下搅拌3min，混合均匀后；用1％的氢氧化钠溶液将pH值调至8-9之间后，加入100uL的NaIO4，分散液在300-500r/min下搅拌5min，混合均匀后，静置12h后变得到水凝胶。
此条件下得到的水凝胶成胶效果好，孔洞结构明显，但是孔分布依然不均匀。
实施例5
称取1mg的ε-PL溶于2mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入1mg EDC，搅拌10min后，称取100mg DA溶于2mL去离子水中，加入0.5mg NHS和2mL DA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到DA-ε-PL。
称取20mg HA溶于1mL去离子水中，并将溶液在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，然后加入4mg EDC，搅拌10min后加入2.2mg NHS和10mg g-C3N4纳米颗粒，搅拌12h后冻干得g-C3N4@HA。之后，称取5mg的g-C3N4@HA溶于1mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入2mg EDC，搅拌10min后，称取10mg的DA溶于1mL去离子水中，加入1mg NHS和2mLDA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到g-C3N4@HA-DA。
称取30mg的DA-ε-PL溶于1mL去离子水中，称取10mg C3N4@HA-DA分散于1mL去离子水中，称取8mg高碘酸钠分散于1mL去离子水中。取400uL 30mg/mL的DA-ε-PL溶液与200uL5mg/mL的C3N4@HA-DA分散液在100-300r/min下搅拌3min，混合均匀后；用1％的氢氧化钠溶液将pH值调至8-9之间后，加入200uL的NaIO4，分散液在100-300r/min下搅拌5min，混合均匀后，静置12h后变得到水凝胶。
此条件下得到的水凝胶成胶效果好，孔洞结构明显，孔分布均匀，但是直径太小。
实施例6
称取1mg的ε-PL溶于2mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入1mg EDC，搅拌10min后，称取100mg DA溶于2mL去离子水中，加入0.5mg NHS和2mL DA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到DA-ε-PL。
称取20mg HA溶于1mL去离子水中，并将溶液在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，然后加入4mg EDC，搅拌10min后加入2.2mg NHS和10mg g-C3N4纳米颗粒，搅拌12h后冻干得g-C3N4@HA。之后，称取5mg的g-C3N4@HA溶于1mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入2mg EDC，搅拌10min后，称取10mg的DA溶于1mL去离子水中，加入1mg NHS和2mLDA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到g-C3N4@HA-DA。
称取30mg的DA-ε-PL溶于1mL去离子水中，称取10mg C3N4@HA-DA分散于1mL去离子水中，称取8mg高碘酸钠分散于1mL去离子水中。取400uL 30mg/mL的DA-ε-PL溶液与200uL5mg/mL的C3N4@HA-DA分散液在100-300r/min下搅拌3min，混合均匀后；用1％的氢氧化钠溶液将pH值调至8-9之间后，加入200uL的NaIO4，分散液在300-500r/min下搅拌5min，混合均匀后，静置12h后变得到水凝胶。
实施例7
称取1mg的ε-PL溶于2mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入1mg EDC，搅拌10min后，称取100mg DA溶于2mL去离子水中，加入0.5mg NHS和2mL DA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到DA-ε-PL。
称取20mg HA溶于1mL去离子水中，并将溶液在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，然后加入4mg EDC，搅拌10min后加入2.2mg NHS和10mg g-C3N4纳米颗粒，搅拌12h后冻干得g-C3N4@HA。之后，称取5mg的g-C3N4@HA溶于1mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入2mg EDC，搅拌10min后，称取10mg的DA溶于1mL去离子水中，加入1mg NHS和2mLDA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到g-C3N4@HA-DA。
称取30mg的DA-ε-PL溶于1mL去离子水中，称取10mg C3N4@HA-DA分散于1mL去离子水中，称取8mg高碘酸钠分散于1mL去离子水中。取500uL 30mg/mL的DA-ε-PL溶液与100uL5mg/mL的C3N4@HA-DA分散液在100-300r/min下搅拌3min，混合均匀后；用1％的氢氧化钠溶液将pH值调至8-9之间后，加入100uL的NaIO4，分散液在100-300r/min下搅拌5min，混合均匀后，静置12h后变得到水凝胶。
此条件下得到的水凝胶成胶效果好，孔洞结构明显，孔分布均匀，但凝胶机械强度较低。
实施例8
称取1mg的ε-PL溶于2mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入1mg EDC，搅拌10min后，称取100mg DA溶于2mL去离子水中，加入0.5mg NHS和2mL DA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到DA-ε-PL。
称取20mg HA溶于1mL去离子水中，并将溶液在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，然后加入4mg EDC，搅拌10min后加入2.2mg NHS和10mg g-C3N4纳米颗粒，搅拌12h后冻干得g-C3N4@HA。之后，称取5mg的g-C3N4@HA溶于1mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入2mg EDC，搅拌10min后，称取10mg的DA溶于1mL去离子水中，加入1mg NHS和2mLDA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到g-C3N4@HA-DA。
称取30mg的DA-ε-PL溶于1mL去离子水中，称取10mg C3N4@HA-DA分散于1mL去离子水中，称取8mg高碘酸钠分散于1mL去离子水中。取500uL 30mg/mL的DA-ε-PL溶液与100uL5mg/mL的C3N4@HA-DA分散液在100-300r/min下搅拌3min，混合均匀后；用1％的氢氧化钠溶液将pH值调至8-9之间后，加入100uL的NaIO4，分散液在300-500r/min下搅拌5min，混合均匀后，静置12h后变得到水凝胶。
实施例9
称取1mg的ε-PL溶于2mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入1mg EDC，搅拌10min后，称取100mg DA溶于2mL去离子水中，加入0.5mg NHS和2mL DA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到DA-ε-PL。
称取20mg HA溶于1mL去离子水中，并将溶液在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，然后加入4mg EDC，搅拌10min后加入2.2mg NHS和10mg g-C3N4纳米颗粒，搅拌12h后冻干得g-C3N4@HA。之后，称取5mg的g-C3N4@HA溶于1mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入2mg EDC，搅拌10min后，称取10mg的DA溶于1mL去离子水中，加入1mg NHS和2mLDA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到g-C3N4@HA-DA。
称取30mg的DA-ε-PL溶于1mL去离子水中，称取10mg C3N4@HA-DA分散于1mL去离子水中，称取8mg高碘酸钠分散于1mL去离子水中。取500uL 30mg/mL的DA-ε-PL溶液与100uL5mg/mL的C3N4@HA-DA分散液在100-300r/min下搅拌3min，混合均匀后；用1％的氢氧化钠溶液将pH值调至8-9之间后，加入200uL的NaIO4，分散液在300-500r/min下搅拌5min，混合均匀后，静置12h后变得到水凝胶。
此条件下得到的水凝胶成胶，孔洞结构明显，孔径分布较不均匀，强度较好。
实施例10
称取1mg的ε-PL溶于2mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入1mg EDC，搅拌10min后，称取100mg DA溶于2mL去离子水中，加入0.5mg NHS和2mL DA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到DA-ε-PL。
称取20mg HA溶于1mL去离子水中，并将溶液在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，然后加入4mg EDC，搅拌10min后加入2.2mg NHS和10mg g-C3N4纳米颗粒，搅拌12h后冻干得g-C3N4@HA。之后，称取5mg的g-C3N4@HA溶于1mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入2mg EDC，搅拌10min后，称取10mg的DA溶于1mL去离子水中，加入1mg NHS和2mLDA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到g-C3N4@HA-DA。
称取30mg的DA-ε-PL溶于1mL去离子水中，称取10mg C3N4@HA-DA分散于1mL去离子水中，称取8mg高碘酸钠分散于1mL去离子水中。取500uL 30mg/mL的DA-ε-PL溶液与100uL5mg/mL的C3N4@HA-DA分散液在100-300r/min下搅拌3min，混合均匀后；用1％的氢氧化钠溶液将pH值调至8-9之间后，加入100uL的NaIO4，分散液在300-500r/min下搅拌5min，混合均匀后，静置12h后变得到水凝胶。
此条件下得到的水凝胶成胶，孔洞结构明显，孔径分布均匀，强度良好。
实施例11
称取1mg的ε-PL溶于1mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入1mg EDC，搅拌10min后，称取0.1mg罗丹明(Rhb)溶于1mL去离子水中，加入0.5mg NHS和1mL的罗丹明溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到Rhb-ε-PL。
称取1mg的Rhb-ε-PL溶于2mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入1mg EDC，搅拌10min后，称取100mg DA溶于2mL去离子水中，加入0.5mg NHS和2mL DA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到DA-Rhb-ε-PL。
称取10mg的g-C3N4分散于1mL去离子水中，称取1mg的异硫氰酸荧光素(FITC)溶于1mL去离子水中，将两者混合后，搅拌24h，进一步离心洗涤冻干得到FITC-g-C3N4。
称取20mg HA溶于1mL去离子水中，并将溶液在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，然后加入4mg EDC，搅拌10min后加入2.2mg NHS和10mg FITC-g-C3N4纳米颗粒，搅拌12h后冻干得FITC-g-C3N4@HA。之后，称取5mg的FITC-C3N4@HA分散于1mL去离子水中，在氮气气氛中搅拌20min以去除氧气，后加入2mg EDC，搅拌10min后，称取10mg的DA溶于1mL去离子水中，加入1mgNHS和2mL DA溶液，搅拌12h后，进一步透析冻干得到FITC-g-C3N4@HA-DA。
称取30mg的DA-Rhb-ε-PL溶于1mL去离子水中，称取10mg FITC-C3N4@HA-DA分散于1mL去离子水中，称取8mg高碘酸钠分散于1mL去离子水中。取500uL 30mg/mL的DA-Rhb-ε-PL溶液与100uL 5mg/mL的FITC-C3N4@HA-DA分散液在100-300r/min下搅拌3min，混合均匀后；用1％的氢氧化钠溶液将pH值调至8-9之间后，加入100uL的NaIO4，分散液在300-500r/min下搅拌5min，混合均匀后，静置12h后变得到水凝胶。
实施例12水凝胶光热性能测试：
取1mLpH＝7.4的的磷酸盐缓冲液(PBS)，用功率为1.252W/cm-2的波长为808nm的红外激光照射600s，每隔60s取点并记录温度。
实施例13水凝胶光热性能测试：
取实施例10中的水凝胶浸泡在1mLpH＝7.4的的磷酸盐缓冲液(PBS)中，用功率为1.252W/cm-2的波长为808nm的红外激光照射600s，每隔60s取点并记录温度。结果如图4，可以看出，相比于纯PBS组温度升高3℃，凝胶组可以提高约25℃，说明凝胶提供了优异的光热性能。
实施例14水凝胶的抗菌肽释放能力测试：
取实施例11中的水凝胶浸泡在10mLpH＝7.4的不含过氧化氢的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在第0，1，3……125h，取出1mL上清液，用荧光分光光度计测试上清液中Rhb-ε-PL的释放量。这说明此法制备的水凝胶具有抗菌肽长效释放能力。
实施例15水凝胶的抗菌肽释放能力测试：
取实施例11中的水凝胶浸泡在10mLpH＝7.4的含0.1％过氧化氢的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在第0，1，3……125h，取出1mL上清液，用荧光分光光度计测试上清液中Rhb-ε-PL的释放量。这说明此法制备的水凝胶具有抗菌肽长效释放能力。结果详见图5，测试结果表明，在125h时，在过氧化氢存在的条件下，抗菌肽的释放量达到95％以上；而没有过氧化氢时，抗菌肽的释放量仅有5％左右。这说明37℃pH＝7.4且有过氧化氢存在的条件下，抗菌肽可以实现长效释放。
实施例16水凝胶的光催化粒子的释放能力测试：
取实施例11中的水凝胶浸泡在10mL pH＝7.4的不含透明质酸酶(HAase)的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在第0，1，3……55h，取出1mL混合液，用荧光分光光度计测试上清液中FITC-g-C3N4的释放量，说明此法制备的水凝胶具有有效释放光催化粒子的能力。
实施例17水凝胶的光催化粒子的释放能力测试：
取实施例11中的水凝胶浸泡在10mLpH＝7.4的含0.003mg的HAase的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在第0，1，3……55h，取出1mL混合液，用荧光分光光度计测试上清液中FITC-g-C3N4的释放量，说明此法制备的水凝胶具有有效释放光催化粒子从而产生大量活性氧的能力。结果详见图6，测试结果表明，在55h时，在加入0.03mg透明质酸酶(HAase)的条件下，FITC-g-C3N4的释放量达到90％以上；而没有HAase时，抗菌肽的释放量仅有5％左右。这说明37℃pH＝6.8且有HAase存在的条件下，水凝胶具有有效释放光催化粒子的能力。
实施例18水凝胶中释放的光催化粒子的活性氧产生能力测试：
取实施例10中的水凝胶浸泡在10mLpH＝7.4的含0.003mg的HAase和0.001mg甲基紫指示剂的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在第0、0.5、1……3h，取出1mL混合液，用紫外分光光度计测试上清液中甲基紫染色剂的降解量，结果如图7所示，甲基紫在3h内的降解率达到了95％，说明此法制备的水凝胶具有有效释放光催化粒子从而产生大量活性氧的能力。
实施例19
本发明使用两种类型的细菌分别是金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，通过拍照和菌落计数法评估水凝胶的抗微生物活性。首先将细菌以109CFU mL-1的浓度悬浮于PBS中，然后各取100uL分别涂布在LB肉汤(对照组)和水凝胶覆盖的LB肉汤的表面上，12h后，将样品放入1mL PBS中，剧烈摇动分离所有细菌，接着将悬浮液涂布在覆盖一层厚度为2mm的水凝胶LB琼脂板上，将该LB琼脂平板在37℃温育24h并记录集落的数量。
实施例20
本发明使用的细菌分别是金黄色葡萄球菌，通过拍照和测量法评估水凝胶的抗微生物活性。首先将细菌以109CFU mL-1的浓度悬浮于LB肉汤中迅速铺板，滴加用过氧化氢和透明质酸酶处理过的凝胶上清液，在37℃温育12h并观察抑菌圈大小。结果如图8所示，表明水凝胶对黄色葡萄球菌表现出在深度和大范围的抑菌性能。
实施例21
取实施例10中的凝胶贴片处理小鼠的伤口，同时取小鼠组织进行细菌培养，记录菌落数量，结果如图9-12所示，在凝胶处理3d、7d后，实验组都可以有效降低细菌的数量，说明用实施例10凝胶贴片处理过的小鼠伤口愈合情况最好，即在三重抗菌的的共同作用下，小鼠伤口愈合效果最好。
在处理小鼠伤口7天后，检测其组织再生的作用，检测结果如图13-15所示，用实施例10凝胶贴片处理过的组中出现大量毛囊，其高于纯水凝胶组和未处理组的水平，说明凝胶在抑制细菌感染后有利于组织再生。
同时在处理小鼠伤口7天后，检测其对免疫的促进作用，检测结果如图16-22所示，用实施例10凝胶贴片处理过的组中免疫相关因子表达上升，明显免疫水平增高，其远高于纯水凝胶组和未处理组的水平，其更有利于组织的进一步修复。
本发明构筑的凝胶具有以下多种优异性能：1)水凝胶可以实现抗菌药物的多重释放，在短期内通过光热杀灭大量细菌，再利用光催化产生的活性氧进行更持久更深层次的剩余菌的杀灭；2)抗菌肽的长效释放保证了水凝胶在植入和作用过程中不会发生二次感染；3)该凝胶具有良好的生物相容性，并能够根据需要智能的抑制生物体的细菌感染并消除相应的炎症。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种水凝胶，包括凝胶基质和包裹在所述凝胶基质中的抗菌组分，所述凝胶基质包括聚多巴胺和透明质酸；所述抗菌组分包括抗菌肽和光催化材料。
2.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述光催化材料包括类石墨相氮化碳纳米粒子。
3.根据权利要求1或2所述的水凝胶，其特征在于，所述抗菌肽和光催化材料的质量比为(0.1～0.2)：10。
4.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述透明质酸的分子量为10～100wDa。
5.权利要求1～4任意一项所述的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
1)将抗菌肽、部分多巴胺和第一部分水混合，进行缩合反应，得到抗菌肽修饰的多巴胺；
2)将光催化材料、透明质酸、剩余多巴胺和第二部分水混合，进行缩合反应，得到由多巴胺和透明质酸包裹的光催化材料；
3)将高碘酸钠、第三部分水、抗菌肽修饰的多巴胺以及由多巴胺和透明质酸包裹的光催化材料混合，静置反应，得到水凝胶；
所述步骤1)和步骤2)之间没有时间顺序关系。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述混合包括搅拌混合；所述搅拌混合的转速为300～500rpm；所述搅拌混合的时间为3～8min。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述静置的时间为6～12h。
8.权利要求1～4任意一项所述的水凝胶或者权利要求5～7任意一项所述的制备方法制备得到的水凝胶在制备抗菌产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗菌包括细菌感染引起的皮肤损伤修复。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗菌产品包括抗菌LB琼脂。
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