CN114984303B - 一种可原位产氧的喷雾式水凝胶敷料、制备方法及应用 - Google Patents

一种可原位产氧的喷雾式水凝胶敷料、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可原位产氧的喷雾式水凝胶敷料、制备方法及应用，具体涉及生物医用材料技术领域，其中水凝胶包括至少两种可分别形成喷雾的成凝胶试剂，成凝胶试剂混合后能够交联形成水凝胶；在至少一种成凝胶试剂中分散有活性微生物，在至少一种成凝胶试剂中分散有能够缓释光敏剂或/和一氧化氮供体的复合纳米颗粒。这种水凝胶能够通过喷雾方式在伤口原位形成，并在光照下持续产氧，增强光动力疗法的效果，促进创面愈合，并可以杀伤肿瘤切除术后的残余肿瘤细胞，有望成为一种可同时实现抑制术后肿瘤复发和促进创面愈合的新型多功能创面敷料，在皮肤癌的临床治疗中有着很好的应用前景。

Description

一种可原位产氧的喷雾式水凝胶敷料、制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，涉及创面修复敷料，具体涉及一种可原位产氧的喷雾式水凝胶敷料、制备方法及应用。
背景技术
皮肤癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，每年有100多万人被确诊，在西方国家发病率较高。目前，临床上皮肤癌的治疗最常用的方法仍是手术切除。手术治疗必须彻底切除所有肿瘤组织，以避免癌症复发，但肿瘤组织难以完全切除，局部残留的肿瘤细胞常导致肿瘤复发。另外，由于手术切除不可避免地会造成皮肤缺损，因此及时修复受损组织对长期愈合是至关重要的。
现阶段，预防术后残余肿瘤复发的治疗方式仍然主要是：放疗和全身性化疗。然而，这些治疗方式存在着一些固有的缺陷，如放疗会对正常组织有害，且不能完全破坏所有癌细胞；全身性化疗可造成肿瘤多药耐药和全身毒性。因此，需要发展精准、安全的治疗方式来预防术后肿瘤复发。光动力疗法和一氧化氮气体疗法等治疗方式引起了医学界和科学界的广泛关注。联合使用两种治疗方法，产生的活性氧与一氧化氮结合生成更具活性和毒性的活性氮，如过氧亚硝酸阴离子，能够进一步抑制残余肿瘤复发。但手术切除皮肤肿瘤后，皮肤微血管受到损伤，不仅残余肿瘤微环境是乏氧的，术后空腔区也处于乏氧环境中。乏氧微环境提高了肿瘤细胞抵靠治疗的能力，降低肿瘤治疗效果；同时，乏氧微环境也抑制创面修复。因此，需要提高局部组织氧浓度来改善乏氧的环境。
近年来，许多氧载体和氧发生器被用来克服缺氧问题。这些策略虽然有一定的应用前景，但仍存在氧负荷率低、氧泄漏快、过氧化氢过表达有限等缺点。因此，迫切需要开发新的供氧方式来克服氧的限制。
贴覆伤口敷料是创面修复治疗的一种常规手段，然而临床上使用的和处于实验室阶段的常规敷料如绷带、泡沫、薄膜、纳米凝胶/微凝胶、纳米/微纤维及水凝胶不能满足为创面持续供氧的要求。
针对创面修复特别是皮肤肿瘤术后创面的需求，开发新的创面修复用功能敷料具有重要意义。
发明内容
基于此，本发明的目的之一是提供一种可原位产氧的喷雾式水凝胶敷料，通过同时喷出两种或以上成凝胶试剂后交联形成，同时装载有复合纳米颗粒和活性微生物，该可原位产氧的喷雾式水凝胶敷料不仅能够用于抑制术后残余肿瘤的复发，同时能够通过改善术后空腔中的缺氧环境而促进伤口愈合，这种双功能的水凝胶在肿瘤术后防复发和促进伤口愈合的领域中具有极好的应用前景。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种可原位产氧的喷雾式水凝胶敷料，其关键在于，包括至少两种可分别形成喷雾的成凝胶试剂，其中在一种所述成凝胶试剂中溶解有第一组分，在另一种所述成凝胶试剂中溶解有第二组分，两种所述成凝胶试剂能够在混合后依靠所述第一组分与所述第二组分的交联反应形成水凝胶；
在至少一种所述成凝胶试剂中分散有活性微生物，该活性微生物能够在光照下通过光合作用产氧；
在至少一种所述成凝胶试剂中分散有复合纳米颗粒，该复合纳米颗粒携载有光敏剂或/和一氧化氮供体，所述复合纳米颗粒能够缓释所述光敏剂或/和一氧化氮供体。
作为优选，上述活性微生物为细长聚球藻(Synechococcuselongatus)。
作为优选，上述光敏剂为吲哚菁绿(ICG)，所述一氧化氮供体为精氨酸(L-Arg)。
作为优选，上述复合纳米颗粒的基体为沸石咪唑骨架(ZIF-8)，并用透明质酸(HA)修饰使其具有靶向性。
作为优选，上述第一组分为海藻酸钠或其多羧基衍生物，所述第二组分为可溶性钙盐。
作为优选，上述第一组分为海藻酸钠，所述第二组分为氯化钙；
其中一种所述成凝胶试剂含有质量体积浓度为1％的海藻酸钠，另一种所述成凝胶试剂含有质量体积浓度为2％的氯化钙。
作为优选，上述成凝胶试剂有两种，分别为溶解有海藻酸钠的第一试剂和溶解有氯化钙的第二试剂，其中所述第一试剂中分散有所述复合纳米颗粒和细长聚球藻，所述复合纳米颗粒为携载有吲哚菁绿和精氨酸(L-Arg)的沸石咪唑骨架纳米颗粒。
本发明的目的之二在于提供一种制备如上所述水凝胶的方法。其技术方案为：
一种制备如上所述水凝胶的方法，其关键在于，先制备包载有吲哚菁绿和精氨酸(L-Arg)的所述复合纳米颗粒，然后将所述复合纳米颗粒与细长聚球藻分散于海藻酸钠溶液中以形成所述第一试剂；
将氯化钙溶解于去离子水中以形成所述第二试剂。
本发明的目的之三在于提供一种制备如上所述水凝胶的用途。其技术方案为：
如上任意一项所述水凝胶在制备创面修复凝胶制剂中的应用。
作为优选，上述创面修复凝胶制剂用作皮肤肿瘤切除术后的创面敷贴或组织缺损填充物。
附图说明
本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：
图1为本发明实施例中制备的空白水凝胶(Hydrogel)的扫描电镜图；
图2为本发明实施例中制备的载入复合纳米颗粒和细长聚球藻水凝胶(HIL@Z/Phydrogel)的扫描电镜图；
图3为本发明实施例中制备的空白水凝胶(Hydrogel)和载细长聚球藻水凝胶(PCChydrogel)在光照条件下的产氧情况；
图4为将细胞与不同水凝胶孵育和光照处理后的细胞生存率，其中：(A)血管内皮细胞，(B)黑色素瘤细胞；
图5为使用不同水凝胶覆盖和光照处理后小鼠伤口愈合情况，其中：(A)伤口愈合照片，(B)第12天的剩余伤口比例。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明。
一种可原位产氧的喷雾式水凝胶敷料，包括至少两种可形成喷雾的成凝胶试剂，其中在一种所述成凝胶试剂中溶解有第一组分，在另一种所述成凝胶试剂中溶解有第二组分，两种所述成凝胶试剂能够在混合后依靠所述第一组分与所述第二组分的交联反应形成水凝胶。在至少一种所述成凝胶试剂中分散有活性微生物，该活性微生物能够在光照下通过光合作用产氧。在至少一种所述成凝胶试剂中分散有复合纳米颗粒，该复合纳米颗粒携载有光敏剂或/和一氧化氮供体，所述复合纳米颗粒能够缓释所述光敏剂或/和一氧化氮供体。
成凝胶试剂均为水基试液，其具有较小的粘度，从而能够从喷雾装置中喷出而形成喷雾。两种或两种以上的成凝胶试剂的喷雾混合后相互反应从而形成水凝胶，在成凝胶试剂中分散的活性微生物和复合纳米颗粒被包被在水凝胶中。当喷雾施用于伤口时，生成的水凝胶覆盖创面，活性微生物在光照下于原位持续产氧，从而升高创面氧浓度。同时，复合纳米颗粒缓释出光敏剂或/和一氧化氮供体，以增强光动力疗法的效果，或者实现光动力疗法与一氧化氮疗法的结合。
能够形成水凝胶的物质组合较多。一种较为常见而具有生物相容性的组合为海藻酸钠或其衍生物与Ca2+的组合，依靠海藻酸钠分子上大量游离的羧酸根离子与Ca2+的交联反应生成凝胶。在一种实施方式中，所述第一组分为海藻酸钠或其多羧基衍生物，所述第二组分为可溶性钙盐。本领域技术人员容易理解，如果需要在成型的水凝胶中加入其他功能物质如抗炎症药物或抗生素等，可以将其混入其中一种水溶液中，或者单独配置水溶液以形成一种成凝胶试剂，使用时几种成凝胶试剂同步喷洒。
现有技术已报道了一些能够在水凝胶中保持较长光合作用活性的活性微生物，例如细长聚球藻(Synechococcuselongatus)。
在一种实施方式中，所述光敏剂为吲哚菁绿(ICG)，所述一氧化氮供体为精氨酸(L-Arg)。所述复合纳米颗粒的基体为沸石咪唑骨架(ZIF-8)，并用透明质酸(HA)修饰使其对肿瘤细胞具有靶向性。沸石咪唑骨架是一种易于合成且安全性较高的药物载体，并且在制备过程中通过一锅法即可将药物包载到复合纳米颗粒内。纳米颗粒的基体沸石咪唑骨架能够在生理条件下缓慢降解，从而实现药物的缓慢释放。
吲哚菁绿能够在光照激发下产生活性氧。精氨酸在生理条件下，能够促进局部组织一氧化氮浓度的升高。活性氧与一氧化氮反应可以产生更具杀伤力的活性氮，从而提高对肿瘤细胞的杀伤效果。细长聚球藻可利用光分解水进行产氧，因其产氧具有可持续产生、可控性高的优势，常被用于增加局部产氧量，以改善所在部位的缺氧微环境。
以吲哚菁绿为光敏剂，精氨酸为一氧化氮供体，以沸石咪唑骨架作为载体，以细长聚球藻作为产氧的活性微生物，具体说明水凝胶的制备过程。
本发明实施方案中所进行的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述的药品均在阿拉丁购买，细长聚球藻在中国科学院水生生物研究所购买。
实施例一：制备载复合纳米颗粒和细长聚球藻的水凝胶
一种可原位产氧的喷雾式水凝胶敷料的制备方法，具体步骤为：
步骤S1：称取5mg吲哚菁绿(ICG)溶于2mL水中，称取5mg精氨酸(L-Arg)溶于1mL水中，分别得到两种药物的储备液；
步骤S2：称取1.0g2-甲基咪唑溶解于3mL水中，称取0.1g六水合硝酸锌溶解于0.4mL水中，在搅拌下，将2mLICG储备液滴加至六水合硝酸锌溶液中，同时将2mLL-Arg储备液滴加至2-甲基咪唑溶液中，随后将得到的六水合硝酸锌与ICG的混合溶液在搅拌条件下逐滴滴加至2-甲基咪唑与L-Arg的混合溶液中，室温1200rpm搅拌10分钟，分离得到纳米颗粒；
步骤S3：将步骤S2中合成的纳米颗粒均匀分散于2mg/mL透明质酸(HA)的水溶液中，超声10分钟后得到均匀的混合液，600rpm室温搅拌24小时，分离得到复合纳米颗粒；
步骤S4：配置细长聚球藻培养基，灭菌，接入细长聚球藻藻种，静态培养，计数，浓缩，得细长聚球藻浓缩液；
步骤S5：分别配置1％(w/v)海藻酸钠溶液10mL和2％(w/v)氯化钙溶液5mL，灭菌，备用；
步骤S6：将步骤S3制得的复合纳米颗粒(1mg)和细长聚球藻浓缩液(1x109)均匀分散于步骤S5制得的海藻酸钠溶液中，形成第一种成凝胶试剂；步骤S5制得的氯化钙溶液作为第二种成凝胶试剂，两种成凝胶试剂均备用。
使用时，分别将两种成凝胶试剂盛装到喷雾装置中，向同一区域同时喷出两种成凝胶试剂，或者两种成凝胶试剂在喷出过程中混合并通过统一喷嘴喷出，两种成凝胶试剂按照海藻酸钠与氯化钙的摩尔比为2:1喷出，发现可以快速交联形成可原位产氧的多功能水凝胶(HIL@Z/Phydrogel)。
实施例二：制备载细长聚球藻水凝胶
参照实施例一的方法进行制备，不同之处在于，海藻酸钠溶液中不加入复合纳米颗粒，得到仅分散有细长聚球藻的成凝胶试剂，最终制备的水凝胶仅包被有细长聚球藻，记为载细长聚球藻水凝胶(PCChydrogel)。
参照实施例一的方法制备得到空白水凝胶(Hydrogel)，将空白水凝胶和载复合纳米颗粒和细长聚球藻水凝胶干燥后，按照常规方法制样，使用扫描电子显微镜(SEM)观察其形貌。如图1和图2所示，Hydrogel和HIL@Z/Phydrogel都具有多孔网络结构，两者对比发现，复合纳米颗粒和细长聚球藻的加入对水凝胶的形貌没有影响。高倍率扫描电镜图像显示，如图2，复合纳米颗粒和细长聚球藻大部分分布在水凝胶的孔壁内部。
实例三：载细长聚球藻水凝胶的产氧性能测试
首先，取实施例二制备的水凝胶PCChydrogel，并取空白水凝胶Hydrogel，利用微电极测试水中溶解氧含量，比较其光照条件下的产氧能力。
分别取同样大小的待测凝胶，浸入密闭三颈瓶中的去离子水中，微电极从三颈瓶上方伸入瓶中并固定，保证微电极探头在水面以下。开始测试前通氮气除去瓶中氧气，待示数稳定后开始测试。测试过程中利用635nm波长的激光(0.75W/cm2)对瓶中水凝胶进行50min照射，每隔5min对溶氧量进行三次读数，取平均值进行记录。
对两种水凝胶在光照条件下的产氧情况进行分析，如图3所示，在635nm激光照射(0.75W/cm2)下，PCChydrogel组可持续产生氧气，而Hydrogel组几乎没有氧气产生。PCChydrogel组持续产生的氧气可应用于改善局部缺氧的微环境。
实例四：基于水凝胶的光动力-一氧化氮联合疗法对细胞的杀伤作用
取实施例一中制备的成凝胶试剂，混合交联后得到载复合纳米颗粒和细长聚球藻水凝胶(HIL@Z/P/H)与小鼠皮肤黑色素瘤细胞(B16F10)或血管内皮细胞(EC细胞)共孵育，来检测细胞的生存率。将传代后的细胞用血细胞计数板计数，用含10％血清和1％双抗的1640培养基稀释至1×105个细胞/mL，接种于48孔板，在37℃5％CO2培养箱中培养24h。然后，实验组将HIL@Z/P/H水凝胶(100μL)与细胞孵育4小时后，光照10分钟后继续培养12小时，用AlamarBlue(AB)法检测细胞存活率。对照组使用同体积的空白水凝胶Hydrogel进行同样的孵育和光照处理。
结果如图4所示，经孵育和光照处理后，对于血管内皮细胞来说，实验组和对照组的细胞存活率均接近100％，表明两种水凝胶对于血管内皮细胞均无毒性；然而对于黑色素瘤细胞来说，实验组的细胞存活率约20％，显著低于对照组，表明基于HIL@Z/P/H水凝胶的光动力-一氧化氮联合疗法对黑色素瘤细胞有显著杀伤效果。
实例五：基于HIL@Z/P/H水凝胶原位产氧用于促进伤口愈合的动物实验
动物模型建立：将C57小鼠随机分为两组，每组至少六只。将小鼠的部分表皮层与真皮层在第1天完整切除，形成一个直径10mm的圆形缺口，露出粉色的筋膜层，建立皮肤缺损创面模型。
实验组(HIL@Z/P/H)处理方式为，分别将实施例一步骤S6制得的两种成凝胶试剂盛装于两个喷雾容器中，同时向皮肤缺口喷出两种试剂的喷雾，从而在手术后形成的空腔中形成可原位产氧的喷雾式水凝胶敷料。对照组(Control)处理方式为，分别将海藻酸钠溶液和氯化钙溶液同时喷到皮肤缺口上，形成空白水凝胶。术后前三天每天进行635nm激光照射(0.75W/cm2)半个小时，拍照记录伤口情况，并测量剩余创面尺寸，计算伤口剩余面积相对于原始伤口面积的比例，比较不同处理组小鼠伤口剩余面积。
对比发现，如图5所示，实验组的剩余伤口面积较对照组迅速降低，到第12天时，创面几乎全部愈合，而对照组剩余伤口面积比例约为20％。分析可知，可原位产氧的喷雾式水凝胶敷料中的细长聚球藻可持续产生氧气，缓解局部缺氧而促进伤口愈合。
以上实验结果表明，本发明的一种可原位产氧的喷雾式水凝胶敷料具有可喷雾性，通过同时喷出含复合纳米颗粒和细长聚球藻的海藻酸钠溶液与氯化钙溶液后进行交联，得到可原位产氧的多功能水凝胶。该水凝胶中的细长聚球藻在光照射下可持续产氧，从而缓解局部缺氧微环境。细胞实验和动物实验表明，基于该可原位产氧的喷雾式水凝胶敷料的光动力-一氧化氮气体联合治疗对肿瘤细胞有强烈杀伤作用，同时能够促进伤口愈合，具有用作创面愈合敷料的潜在用途，尤其适用于皮肤肿瘤切除术后的创面治疗。
本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一种可原位产氧的喷雾式水凝胶敷料的制备方法，通过同时喷出含复合纳米颗粒和细长聚球藻的两种或以上成凝胶试剂后，通过交联反应得到可原位产氧的多功能水凝胶，该水凝胶中的活性微生物在光照下可持续产氧，从而改善局部缺氧微环境，与复合纳米颗粒释放的光敏剂或/和一氧化氮供体结合，提高光动力疗法和一氧化氮气体疗法的联合治疗效果，对黑色素瘤细胞具有强的杀伤作用，同时能够促进伤口愈合；
(2)由于复合纳米颗粒持续缓慢释放光敏剂/一氧化氮供体，同时活性微生物在光照下可持续产氧，能够延长联合治疗的时间；
(3)本发明提供的可原位产氧的喷雾式水凝胶敷料具有可喷雾性能，通过灌装后进行喷雾混合，可以原位形成水凝胶，使用方便，并且可以通过控制用量来控制形成凝胶的厚度，对于复杂形貌创面具有良好的适应性；
(4)本发明提供的可原位产氧的喷雾式水凝胶敷料非常适用于皮肤癌手术切除后的辅助治疗，在手术后形成的空腔中原位喷洒的方式将该可原位产氧的多功能水凝胶埋植于肿瘤周边，缓解肿瘤周边组织缺氧状态，在杀伤残留肿瘤细胞的同时促进伤口愈合，避免全身用药引起的毒副作用，有望成为一种可同时实现抑制术后肿瘤复发和促进创面愈合的新型多功能创面敷料，在皮肤癌的临床治疗中有着很好的应用前景。
以上所述仅仅是本发明的优选实施方式，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。在不脱离本发明设计精神的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些变形和改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种原位可产氧的喷雾式水凝胶敷料在制备创面修复凝胶制剂中的应用，其特征在于：所述创面修复凝胶制剂用作皮肤肿瘤切除术后的创面敷贴或组织缺损填充物；
所述水凝胶敷料包括两种可分别形成喷雾的成凝胶试剂，其中在一种所述成凝胶试剂中溶解有第一组分，在另一种所述成凝胶试剂中溶解有第二组分，两种所述成凝胶试剂能够在混合后依靠所述第一组分与所述第二组分的交联反应形成水凝胶；
在至少一种所述成凝胶试剂中分散有活性微生物，该活性微生物能够在光照下通过光合作用产氧；
在至少一种所述成凝胶试剂中分散有复合纳米颗粒，该复合纳米颗粒携载有光敏剂和一氧化氮供体，所述复合纳米颗粒能够缓释所述光敏剂和一氧化氮供体；
所述活性微生物为细长聚球藻(Synechococcus elongatus)；
所述光敏剂为吲哚菁绿(ICG)，所述一氧化氮供体为精氨酸(L-Arg)；
所述复合纳米颗粒的基体为沸石咪唑骨架ZIF-8，并用透明质酸(HA)修饰使其具有靶向性；
所述水凝胶敷料的制备过程为：
步骤S1：称取5mg吲哚菁绿(ICG)溶于2mL水中，称取5mg精氨酸(L-Arg)溶于1mL水中，分别得到两种药物的储备液；
步骤S2：称取1.0g 2-甲基咪唑溶解于3mL水中，称取0.1g六水合硝酸锌溶解于0.4mL水中，在搅拌下，将2mLICG储备液滴加至六水合硝酸锌溶液中，同时将2mLL-Arg储备液滴加至2-甲基咪唑溶液中，随后将得到的六水合硝酸锌与ICG的混合溶液在搅拌条件下逐滴滴加至2-甲基咪唑与L-Arg的混合溶液中，室温1200rpm搅拌10分钟，分离得到纳米颗粒；
步骤S3：将步骤S2中合成的纳米颗粒均匀分散于2mg/mL透明质酸(HA)的水溶液中，超声10分钟后得到均匀的混合液，600rpm室温搅拌24小时，分离得到复合纳米颗粒；
步骤S4：配置细长聚球藻培养基，灭菌，接入细长聚球藻藻种，静态培养，计数，浓缩，得细长聚球藻浓缩液；
步骤S5：分别配置1％(w/v)海藻酸钠溶液10mL和2％(w/v)氯化钙溶液5mL，灭菌，备用；
步骤S6：将步骤S3制得的复合纳米颗粒(1mg)和细长聚球藻浓缩液(1x109)均匀分散于步骤S5制得的海藻酸钠溶液中，形成第一种成凝胶试剂；步骤S5制得的氯化钙溶液作为第二种成凝胶试剂，两种成凝胶试剂均备用。
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