CN110812495B - 一种基于中空介孔硅载药纳米颗粒及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于中空介孔硅载药纳米颗粒及其制备和应用。该纳米颗粒包括中空介孔二氧化硅、壳聚糖、药物和CuS量子点。该制备方法包括：HMSNs‑SH的合成，CS‑SH的合成，HMSNs‑CS‑DOX的合成，HMSNs‑CS‑DOX@CuS的合成。该制备方法操作简单、实验条件易控制；得到的载药纳米颗粒具有光热和化疗协同治疗的效果，具有长效缓释，且具有谷胱甘肽(GSH)敏感和近红外光药物释放，适合肿瘤组织的微环境，具有应用其做后续相关实验分析的潜力。

Description

一种基于中空介孔硅载药纳米颗粒及其制备和应用
技术领域
本发明属于载药纳米材料及其制备和应用领域，特别涉及一种基于中空介孔硅载药纳米颗粒及其制备和应用。
背景技术
癌症是全球范围内对人类健康最大的威胁，已成为全球最严重的健康问题之一。在传统的治疗方法中，尽管化疗由于其副作用和多药耐药性(MDR)导致治疗效果有限，但是仍然是最切实有效的治疗癌症的策略之一。近年来，随着纳米科学和纳米技术的发展，科学家开发了一系列新的抗肿瘤治疗策略，包括药物/基因传递系统、光热疗法(PTT)、光动力疗法(PDT)和免疫疗法等，以达到最佳肿瘤治疗效果。然而，传统的单一模式治疗仍存在生物利用度差、靶向性差和不可预知的系统毒性等问题，限制了其进一步应用。
一般认为，将两种或两种以上的治疗模式整合到一个纳米平台中，以“协同治疗”的模式进行肿瘤治疗，可以显著提高治疗效果。其中，将化疗和PTT协同作为一种新兴的治疗方式，可以显著地提高治疗效果和减少副作用，因而获得了极大的关注。PTT作为一种微创治疗方式，不仅可以产生过高热杀死肿瘤细胞，还可以提高化疗的治疗效率。
在众多的纳米结构中，具有中空结构的纳米材料以其稳定性高、比表面积大、渗透性好、刺激响应性能优异、易表面改性等独特的性能，在纳米领域尤其是纳米医学方面受到了极大的关注。其中，中空介孔二氧化硅纳米颗粒(HMSNs)作为一种具有代表性的中空结构材料，已被广泛地证明可以用作一种良好的药物载体。与传统的MSNs相比，HMSNs具有巨大的中空内腔，能够负载大量的化疗药物，从而减少了治疗时的药物用量同时提高化疗的疗效。此外，由于HMSs外部和内部都有足够的位点来修饰大量官能团，因此目前已经报道了许多基于HMSNs和光热转换试剂构建的协同治疗纳米平台。
过去几十年，诊疗一体化纳米平台的开发已经成为目前纳米医学领域一大热点。在各种纳米诊疗剂中，半导体金属硫化物纳米粒子如CuS、Ag2S纳米量子点等由于其近红外吸收强、摩尔消光系数高的优点，已被广泛地探索用于肿瘤的成像和治疗。因此将HMSNs与CuS的结合制备具有高载药量、多重刺激响应性药物释放和肿瘤协同治疗能力的纳米平台，并负载上模型药物DOX，应用于乳腺癌治疗中具有良好的研究前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于中空介孔硅载药纳米颗粒及其制备和应用，以填补现有技术的空白。
本发明提供一种基于中空介孔硅载药纳米颗粒，包括中空介孔二氧化硅、壳聚糖、药物和CuS量子点，所述中空介孔二氧化硅作为药物载体，所述壳聚糖作为中空介孔二氧化硅与药物之间的连接剂，所述CuS量子点封装中空介孔二氧化硅中的介孔。
所述中空介孔二氧化硅、壳聚糖、药物和CuS量子点的质量比为1.5～3：1.5～3：0.5～1：0.5～1，优选3：3：1：1。
所述药物为DOX。
本发明还提供一种基于中空介孔硅载药纳米颗粒的制备方法，包括：
(1)将中空介孔二氧化硅HMSNs溶于溶剂中，加入MPTMs，N2下搅拌反应，离心，得到HMSNs-SH，其中，HMSNs、溶剂和MPTMs的比例为45～55mg:55～65mL:110～130μL；
(2)将CS、巯基乙酸和溶剂以质量比为1～1.5g:0.7～0.8g:10～15mL混合，加入EDC和NHS，搅拌反应，得到CS-SH，其中，EDC和NHS的质量比为1.5～2：0.75～1(优选2：1)；
(3)将步骤(1)中HMSNs-SH与步骤(2)中CS-SH以质量比为0.98～1.1:0.98～1.1溶于超纯水，搅拌反应，将得到的HMSNs-CS溶解于溶剂中，超声，加入DOX溶液，避光搅拌，离心，干燥，得到HMSNs-CS-DOX，其中HMSNs-CS与DOX的质量比为2.5～3.5:1；
(4)将步骤(3)中HMSNs-CS-DOX溶解于溶剂中，加入CuS量子点，搅拌反应，离心并洗涤，干燥，得到HMSNs-CS-DOX@CuS，其中HMSNs-CS-DOX、溶剂和CuS量子点的28～32mg:10～15mL:8～12mg。
所述步骤(1)中HMSNs的制备方法包括：将无水乙醇、超纯水和NH3 .H2O以体积比为70～72:9～11:3～4混合，搅拌15～25min，迅速加入与无水乙醇体积比为5～7:70～72的正硅酸四乙酯，搅拌0.8～1.2h，得到实心的二氧化硅微球；迅速加入体积比为4～6:1～3的TEOs和Y-巯丙基三乙氧基硅烷C18TMs的混合液，搅拌0.8～1.2h，离心；将得到的沉淀物加入体积比为8～11:1乙醇和盐酸混合液，80℃搅拌10～15h，离心，然后重复此操作一次；然后分散在NaCO3溶液中，在80℃搅拌4～8h，离心并洗涤，干燥后，在550℃下煅烧6h，即得。
所述NaCO3溶液的浓度为0.6M，离心的速率为8000-10000rpm。
所述分散在NaCO3溶液中是将产品分成8份，各自分散在NaCO3溶液中。
所述步骤(1)中溶剂为异丙醇。
所述步骤(1)中搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为12～14h。
所述步骤(2)中溶剂为DMF。
所述步骤(2)中搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为22～26h。
所述步骤(3)中溶剂为PBS。
所述步骤(3)中搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为10～14h。
所述步骤(3)中避光搅拌温度为室温，避光搅拌时间为20～26h。
所述步骤(3)中DOX溶液的溶剂为PBS。
所述步骤(4)中CuS量子点的制备方法包括：将L-Cys溶于纯水中，加入CuS溶液，调节pH至10-11，60-140℃反应2-12h，向得到的CuS量子点胶体中加入丙酮聚沉，离心洗涤，干燥，即得，其中L-Cys、纯水和CuS的比例为22～26mg:15～20mL:0.1～0.3mmol。
所述CuS溶液的浓度为0.1～0.2mol/L。
所述调节pH至10-11是采用氢氧化钠溶液。
所述干燥为：40-60℃下真空干燥8-14h。
所述步骤(4)中搅拌反应温度为室温，搅拌时间为10～14h。
本发明还提供一种基于中空介孔硅载药纳米颗粒在制备治疗肿瘤(例如乳腺癌)药物中的应用。
有益效果
(1)本发明将光热治疗与化疗手段相结合，可以显著地提高治疗效果和减少副作用，并且光热治疗作为一种微创的治疗手段，通过近红外光照射将光能转化为热能而杀死肿瘤细胞，又进一步提高治疗效果，克服了化疗手段中存在的副作用和多药耐药性等缺陷；
(2)本发明制备的纳米颗粒HMSNs-CS-DOX@CuS纳米颗粒粒径约150nm，与现有纳米颗粒相比，本发明制备的纳米颗粒大小更为合适，能最大程度的通过EPR效应将药物递送到肿瘤部位；
(3)本发明制备的HMSNs-CS-DOX@CuS纳米颗粒，能够长效缓释，具有GSH和NIR的双重刺激响应药物释放行为，在较高浓度GSH环境下释放率高，适合肿瘤组织的微环境，且外部激光触发药物进一步释放，具有应用其做后续相关实验分析的潜力。
附图说明
图1为本发明实施例1中HMSNs(A)、CuS量子点(C)和HMSNs-CS-DOX@CuS(D)的TEM图以及HMSNs(B)的SEM图。
图2为本发明实施例1中HMSNs(A)和HMSNs-CS@CuS(B)的XRD图谱，HMSNs(C)和HMSNs-CS@CuS(D)的XPS图谱，HMSNs-CS-DOX@CuS的DLS水动力学粒径分布(E)，以及为不同纳米颗粒的表面Zeta电势(F)。
图3为本发明实施例2中HMSNs-CS-DOX@CuS的药物释放图(A)，HMSNs-CS-DOX@CuS纳米颗粒的MTT图(B)；以及细胞经不同治疗方式处理12h后活死染色的荧光图片(C)，其中箭头所指为死细胞。
图4为本发明实施例3中Free DOX和HMSNs-CS-DOX@CuS纳米颗粒的对MBA-MD-231细胞的激光共聚焦显微镜结果(A)，以及流式细胞术分析MDA-MB-231细胞经不同治疗方式处理12h后采用Annexin V-FITC/PI染色的凋亡情况(B)，其中，(Ⅰ)Controal，(Ⅱ)FreeDOX，(Ⅲ)HMSNs-CS@CuS+NIR，(Ⅳ)HMSNs-CS-DOX@CuS，(Ⅴ)HMSNs-CS-DOX@CuS+NIR。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
主要试剂来源：
正硅酸四乙酯(TEOs)，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，Y-巯丙基三乙氧基硅烷(MPTMs)，阿霉素(DOX)购自阿拉丁公司(上海，中国)；3-(4,5-二甲基噻唑-yl)-2,5-二苯基四唑溴化铵(MTT)，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基二亚胺盐酸盐(EDC·HC)，N-羟基琥珀酰胺(NHS)，calcein-AM和碘化丙啶(PI)购自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，美国)；4’，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)，购自鼎国昌盛生物技术有限公司(北京，中国)；氯化铜(CuCl2·2H2O)和L-半胱氨酸购自北京化学试剂有限公司(北京，中国)。
实施例1
HMSNs-CS-DOX@CuS的制备方法：
(1)首先制备HMSNs，取71.4mL无水乙醇，10mL超纯水，3.14mL氨水在30℃磁力搅拌20min，随后迅速加入正硅酸四乙酯(TEOs)6mL，磁力搅拌1h，得到实心的二氧化硅微球；接着迅速加入5mL TEOs和2mL Y-巯丙基三乙氧基硅烷(C18TMs)的混合液，磁力搅拌1h后8500r/15min离心收集沉淀；将沉淀物加入乙醇和盐酸(v:v，10:1)混合液45mL，80℃油浴磁力搅拌12h后离心，然后重复此操作一次；将产品分成8份，各分散在40mL 0.6M NaCO3溶液中，混合液在80℃下搅拌6h，离心水洗三次，100℃干燥后，在550℃下煅烧6h，得HMSNs。
(2)将50mg HMSNs溶于60mL异丙醇中，超声分散，逐滴加入120μL MPTMs(Y-巯丙基三乙氧基硅烷)，N2保护，搅拌过夜12h后离心8500r离心15min得到HMSNs-SH。
(3)在烧杯中将1.232g CS(壳聚糖)和0.737g巯基乙酸溶于15mL DMF中，在EDC(30mg)和NHS(15mg)存在的条件下磁力搅拌24h。得到巯基化的CS即CS-SH。
(4)将24.2mg L-Cys溶于20mL纯水中，加入2mL 0.1mol/L CuS溶液，混匀后用浓度为1mol/L的NaOH溶液调节pH至10。然后将所得溶液转移至聚四氟乙烯反应釜中，反应釜内填充量为70％-85％，置于120℃反应6h，反应结束后向CuS量子点胶体中加入40mL丙酮使其聚沉，经过离心洗涤将所得沉淀放入50℃的真空干燥箱中干燥12h后得到CuS量子点。
(5)将100mg HMSNs和100mg CS-SH溶于超纯水(10mL)中，磁力搅拌12h，冷冻干燥后的HMSNs-CS。然后取45mg HMSNs-CS于15mL PBS中超声30min后加入溶解的DOX(15mg)，避光搅拌24h离心后干燥得到HMSNs-CS-DOX。
(6)最后将30mg HMSNs-CS-DOX溶解在10mL PBS中，和10mg CuS量子点搅拌12h。反应结束后将产物11000r离心15min并用水洗涤3次后在60℃下干燥最终得到HMSNs-CS-DOX@CuS。
图1A和1B可以看出，HMSNs有明显的球型结构，且粒径大小均一在150nm左右，能够很好的发挥肿瘤靶向治疗的EPR效应，适合体内静脉注射；图1C可知，制备的CuS量子点分散良好，粒径为5-10nm；图1D可知，粒径与HMSNs相比没太大变化，图中箭头所指代表CuS分布，证明HMSNs-CS-DOX@CuS成功制备。
图2为了进一步证明各部分的成功制备，图2A和2C证明了HMSNs的成功制备；图2B和2D证明了HMSNs-CS-DOX@CuS成功制备；图2E为HMSNs-CS-DOX@CuS的DLS水动力学粒径分布，并且图1D可知TEM所示HMSNs-CS-DOX@CuS纳米颗粒的粒径略小于DLS测出的值，是因为TEM检测样本在制备过程中会脱水，使粒径减小；图2F可知，从HMSNs到HMSNs-CS-DOX@CuS每一步后电势逐渐增大，且相对稳定。
实施例2
体外GSH药物释放行为在以下不同的条件下测定(i)含2mM谷胱甘肽(GSH)的PBS(100mM)两组；(ii)含10mM谷胱甘肽的PBS缓冲溶液(100mM)两组。具体的，将1mg实施例1中HMSNs-CS-DOX@CuS分散在上述不同介质(1mL)中并置入透析袋(MWCO：3500Da)。将各组透析袋分别放入相应的缓冲介质中避光搅拌。在一定的时间间隔内，取出1.0mL释放介质，采用UV-vis光谱测定在490nm处的吸光度，同时将相同体积的新鲜缓冲液补充原释放介质中。其中在含2mM谷胱甘肽和含10mM谷胱甘肽组中各有一组用来研究近红外光引发DOX的释放。将不同的样品进行808nm激光直接辐照(1.0W/cm2)5min，随后在相应的缓冲介质中在37℃下避光透析，如上所述测定不同时间DOX释放量。所有释放实验均重复三次。
如图3A所示，在2mM GSH和近红外条件下，HMSNs-CS-DOX@CuS在48h内累积释放度约为33％，当GSH浓度增加时，DOX累积释放率提高到71％左右。还可以看到，在没有近红外光条件下和不同浓度GSH存在的情况下，DOX的累积释放速率仍然不同。造成这一现象的原因如下，如上所述，作为看门人的CuS由二硫键连接，在高浓度GSH的作用下容易被裂解，导致DOX的释放。从图中可以看出，在808nm激光照射下，材料有快速的释放，说明材料的DOX释放具有激光响应效应。有可能是激光辐照引起温度升高，增加了DOX和HMSNs的振动，破坏了它们之间的稳定性。
在96孔板中种入MDA-MB-231细胞，每孔的细胞个数大约为10000个，每孔补足200μL的DMEM全培养基，在37℃和5％CO2恒温培养箱中培养24h。之后去掉旧的培养基，用PBS缓冲液清洗后每孔加入20μL含有不同浓度的溶有DOX，HMSNs-CS@CuS(除了没有与DOX反应，其余均与实施例1相同，得到HMSNs-CS@CuS)和HMSNs-CS-DOX@CuS的PBS溶液，并补足180μL新鲜培养基，继续放入恒温培养箱培养24h之后加入20μL的5mg/ml的MTT溶液，在培养箱中孵育4h，去除孔内培养液，并添加200μL DMSO，置摇床上避光低速振荡15min，使用酶联免疫检测仪检测490nm处各孔的紫外吸收值。各组药物的细胞MTT实验结果如图3B所示，可知HMSNs-CS@CuS未载药的纳米颗粒几乎没有毒性，证明此材料的有很好的生物相容性；随着DOX浓度的增加，对MDA-MB-231细胞的抑制作用增强。与其他组相比，HMSNs-CS-DOX@CuS纳米颗粒加NIR组对MDA-MB-231细胞的增殖抑制最明显，且在实验药物浓度范围内，药物浓度越大效果越明显。
此外，通过活死染色实验进一步评价各种模式的治疗效果。分别将细胞经过与MTT一样的治疗模式处理后，进行钙黄绿素-AM(活细胞，绿色荧光)和碘化丙啶(PI，死细胞，红色荧光)共染色，结果如图3C所示。结果证实，与单纯治疗组(化疗组或PTT组)相比，协同治疗组(HMSNs-CS-DOX@CuS+NIR)显示出了大量的红色荧光信号(箭头所指)，证明其具有显著的化疗与PTT联合治疗效果。综上所述，细胞在激光照射下经HMSNs-CS-DOX@CuS处理的治疗策略能够实现肿瘤细胞体外协同治疗和靶向药物递送。
实施例3
在24孔细胞培养板中放入18mm盖玻片，种入MBA-MD-231细胞，每孔细胞密度大约为～1.0×104个，并补足每孔2mL的培养液，在5％CO2，37℃的条件下于培养箱中培养24h。倒掉旧培养基，加入HMSNs-CS-DOX@CuS载药纳米颗粒的PBS溶液200μL(1mg/mL)用相同浓度的Free DOX作为对照组，并补足1.5mL的新鲜培养基，孵育4h或24h。吸去含材料的培养液，并用PBS冲洗，加入1ml 2.5％的戊二醛固定15min。吸去戊二醛，并用PBS冲洗，加入1ml DAPI染色15min。吸去DAPI，并用PBS冲洗，将盖玻片取出，滴一滴荧光封闭剂，置于载玻片上，进行激光共聚焦显微镜检测。
激光共聚焦显微镜检测结果如图4A所示，HMSNs-CS-DOX@CuS的荧光明显强于FreeDOX，在24h时效果更明显。此外，HMSNs-CS-DOX@CuS处理组的红色荧光比Free DOX组的红色荧光更趋向于MDA-MB-231细胞的细胞核。主要原因是HMSNs-CS-DOX@CuS纳米颗粒拥有适当的尺寸，能通过EPR效应更好进入癌细胞。
MDA-MB-231细胞以密度为5×105个细胞/孔接种在6孔板中培养24h。在长势良好的6孔细胞培养板中分别加入PBS，HMSNs-CS-DOX+NIR，Free DOX，HMSNs-CS-DOX@CuS，HMSNs-CS-DOX@CuS+NIR，保证DOX的浓度为5μg/mL，共孵育4h，然后用胰蛋白酶将细胞消化下来，用PBS连续离心清洗三次，最后将细胞悬浮于预冷的结合缓冲液中重悬细胞，细胞浓度为1×105/mL。接着加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI于上述制备好的细胞悬浮液中。立即将试管放入冰中，避光10min，然后使用Accuri C6流式细胞仪进行检测分析，避光染色15min后，所有样品采用流式细胞术分析早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞数量。未进行任何处理的细胞和仅进行激光照射的细胞作为空白对照。
结果如图4B所示，图中四个象限分别代表细胞凋亡的不同情况，其中右上限代表细胞晚凋，右下象限代表细胞早凋，所以选择这量两个象限的细胞数总和计为凋亡细胞。可以看出，HMSNs-CS-DOX@CuS组细胞凋亡情况较Free DOX组明显增加(分别为6.85％和12.74％)，进一步验证了合适粒径的纳米颗粒的修饰可以明显增强细胞对纳米颗粒的摄取，从而产生更好的化疗效果。重要的是，在NIR激光照射下，HMSNs-CS@CuS和HMSNs-CS-DOX@CuS组凋亡细胞分别为7.6％和24.8％，说明协同化疗-光热治疗模式处理可以促进细胞凋亡，提高细胞毒性。凋亡实验结果进一步证明了HMSNs-CS-DOX@CuS在激光照射下对癌细胞具有协同治疗作用。
对比例1
吴等人设计的功能化的二硫化钼纳米薄片修饰的周期性介孔有机硅作为协同靶向化光热治疗的多功能平台，在巯基修饰的介孔硅的制备方法与本发明有许多相似之处。采用表面活性剂定向溶胶凝胶法制备了硫醚桥接PMOs。首先CTAB(0.12g)溶于浓氨水(1mL,25％wt％)、乙醇(30mL)和水(75mL)的混合物中。将溶液加热至35℃1h，然后在剧烈搅拌下迅速加入0.1mL的TESPTS和0.22mL的TEOS。上述混合物搅拌24h在35℃，白色的产品是通过离心收集在10000rpm 10min，洗了三次与乙醇和悬浮在乙醇(250mL)和浓盐酸(0.6mL)60℃3h去除CTAB表面活性剂。为了合成PMOs-SH，将制备好的PMOs(50mg)分散在乙醇(150mL)中。然后，MPTMS(0.15mL)和25wt％氨水(0.2mL)搅拌过夜，用去离子水洗涤三次，离心收集PMOs-SH。(Jianrong Wua,David H.Bremnerb,Shiwei Niua,Huanling Wua,Junzi Wua,Haijun Wanga,Heyu Lia,Li-Min Zhua,Functionalized MoS2 nanosheet-cappedperiodic mesoporous organosilicasas a multifunctional platform forsynergistic targeted chemo-photothermal therapy.Chemical Engineering Journal,342(2018)90-102.)与此方法相比本发明设置的反应温度不同，并且本发明反应时不需要剧烈搅拌，基本很多操作都是在室温下反应，操作更简单更安全。

Claims (10)

1.一种基于中空介孔硅载药纳米颗粒，其特征在于，包括中空介孔二氧化硅、壳聚糖、药物和CuS量子点，所述中空介孔二氧化硅作为药物载体，所述CuS量子点封装中空介孔二氧化硅中的介孔；
所述基于中空介孔硅载药纳米颗粒的制备方法，包括：
(1)将中空介孔二氧化硅HMSNs溶于溶剂中，加入MPTMs，N2下搅拌反应，离心，得到HMSNs-SH，其中，HMSNs、溶剂和MPTMs的比例为45～55mg:55～65mL:110～130μL；
(2)将CS、巯基乙酸和溶剂以质量比为1～1.5g:0.7～0.8g:10～15mL混合，加入EDC和NHS，搅拌反应，得到CS-SH，其中，EDC和NHS的质量比为1.5～2：0.75～1；
(3)将步骤(1)中HMSNs-SH与步骤(2)中CS-SH以质量比为0.98～1.1:0.98～1.1溶于超纯水，搅拌反应，将得到的HMSNs-CS溶解于溶剂中，超声，加入DOX溶液，避光搅拌，离心，干燥，得到HMSNs-CS-DOX，其中HMSNs-CS与DOX的质量比为2.5～3.5:1；
(4)将步骤(3)中HMSNs-CS-DOX溶解于溶剂中，加入CuS量子点，搅拌反应，离心并洗涤，干燥，得到HMSNs-CS-DOX@CuS，其中HMSNs-CS-DOX、溶剂和CuS量子点的比例为28～32mg:10～15mL:8～12mg。
2.根据权利要求1所述纳米颗粒，其特征在于，所述中空介孔二氧化硅、壳聚糖、药物和CuS量子点的质量比为1.5～3：1.5～3：0.5～1：0.5～1。
3.一种基于中空介孔硅载药纳米颗粒的制备方法，包括：
(1)将中空介孔二氧化硅HMSNs溶于溶剂中，加入MPTMs，N2下搅拌反应，离心，得到HMSNs-SH，其中，HMSNs、溶剂和MPTMs的比例为45～55mg:55～65mL:110～130μL；
(2)将CS、巯基乙酸和溶剂以质量比为1～1.5g:0.7～0.8g:10～15mL混合，加入EDC和NHS，搅拌反应，得到CS-SH，其中，EDC和NHS的质量比为1.5～2：0.75～1；
(3)将步骤(1)中HMSNs-SH与步骤(2)中CS-SH以质量比为0.98～1.1:0.98～1.1溶于超纯水，搅拌反应，将得到的HMSNs-CS溶解于溶剂中，超声，加入DOX溶液，避光搅拌，离心，干燥，得到HMSNs-CS-DOX，其中HMSNs-CS与DOX的质量比为2.5～3.5:1；
(4)将步骤(3)中HMSNs-CS-DOX溶解于溶剂中，加入CuS量子点，搅拌反应，离心并洗涤，干燥，得到HMSNs-CS-DOX@CuS，其中HMSNs-CS-DOX、溶剂和CuS量子点的比例为28～32mg:10～15mL:8～12mg。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中HMSNs的制备方法包括：将无水乙醇、超纯水和NH3 .H2O以体积比为70～72:9～11:3～4混合，搅拌15～25min，迅速加入与无水乙醇体积比为5～7:70～72的正硅酸四乙酯，搅拌0.8～1.2h，得到实心的二氧化硅微球，迅速加入体积比为4～6:1～3的TEOs和十八烷基三甲基硅烷C18TMs的混合液，搅拌0.8～1.2h，离心；将得到的沉淀物加入体积比为8～11:1乙醇和盐酸混合液，80℃搅拌10～15h，离心，然后重复此操作一次；然后分散在NaCO3溶液中，在80℃搅拌4～8h，离心并洗涤，干燥，在550℃下煅烧6h即得。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中溶剂为异丙醇；搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为12～14h。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中溶剂为DMF；搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为22～26h。
7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(3)中溶剂为PBS；搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为10～14h；避光搅拌温度为室温，避光搅拌时间为20～26h。
8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(4)中CuS量子点的制备方法包括：将L-Cys溶于纯水中，加入CuS溶液，调节pH值至10-11，60-140℃反应2-12h，向得到的CuS量子点胶体中加入丙酮聚沉，离心洗涤，干燥，即得，其中L-Cys、纯水和CuS的比例为22～26mg:15～20mL:0.1～0.3mmol。
9.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述步骤(4)中搅拌反应温度为室温，搅拌时间为10～14h。
10.一种如权利要求1所述纳米颗粒在制备治疗肿瘤药物中的应用。
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