CN109223730A - 一种多响应靶向介孔硅基智能载体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多响应靶向介孔硅基智能载体的制备方法，所述智能载体的制备方法包括：制备介孔硅纳米粒子，用硅烷偶联剂对其进行修饰使得表面生成活性双键，利用乳液聚合法，在水溶液中，以过硫酸钾为引发剂，双(丙稀酰)胱胺为交联剂，聚乙烯基己内酰胺和甲基丙烯酰化的低分子量透明质酸为单体，在介孔硅表面生成二硫键交联的凝胶壳层，制得复合载体。该复合载体能够同时响应温度、高还原性和酶的三种刺激，实现有机层的降解，打开孔道释放药物，综合其零泄漏、多响应和透明质酸靶向，该智能载体有望极大提高抗肿瘤疗效，在药物释放领域有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及一种多响应靶向介孔硅基智能载体的制备方法。
背景技术
癌症的有效治疗对于减轻患者痛苦、延长患者生存时间以及提高患者的生存质量具有十分重要的意义，而传统化疗药物，毒副作用大、在杀伤肿瘤细胞的同时对正常细胞的伤害极大。纳米控释系统由于独特的优势为纳米肿瘤学领域中的药物传输和释放提供新的技术手段。刺激响应性介孔硅纳米粒子由于独特的“智能性”，已成为当前纳米医学特别是药物释放领域研究的明星材料之一。随着生物医学研究的不断发展，刺激响应性药物传递系统可根据外界刺激或内部微环境的不同，载体自身发生物理或化学变化，再利用外界的刺激信号包括温度、电场、磁场、超声和pH等，实现药物在输送过程中的“零释放”，达到在靶向部位之后定点释放的目的。介孔硅（简称MSNs）因其具有独特的药物释放机制，可根据周围环境“时空”的刺激，实现对药物的控释。 MSNs 作为刺激响应性纳米药物载体，可在一定程度上减少给药频率，还可以通过外界条件人为调控给药量，降低药物治疗成本的同时提高疗效。
然而，只对单一刺激产生响应的MSNs载体往往难以适应复杂的体内环境，造成疗效不足甚至药物提前泄漏。而具有多响应的药物传递系统能综合利用肿瘤微环境中的各种刺激，在多种刺激同时作用下响应性地向肿瘤部位释放药物分子，可达到更为精准治疗的目的。此外，在智能载体的表面引入主动靶向性分子，显然能提高肿瘤细胞对纳米载体的识别，增强其胞内摄取，进而极大提高疗效。为此，本发明针对肿瘤部位偏高的温度、偏酸性pH以及较高的还原性，制备出由聚乙烯基己内酰胺、透明质酸通过二硫键交联的聚合物壳层修饰的MSNs，其中的聚乙烯基己内酰胺是一种温度响应性聚合物，具有低临界溶解温度，而透明质酸在其中扮演三重角色：一方面其亲水性能改善聚乙烯基己内酰胺的临界溶解温度，另一方面其分子结构中丰富的羧基具有质子化/去质子化的pH响应特性，此外，其还能够作为主动靶向分子特异性结合肿瘤细胞表面过表达的CD44受体。而二硫键能够被肿瘤细胞内高浓度的谷胱甘肽还原切断，从而打开聚合物网络，加速药物释放。因此，该复合载体是一种具有多响应和主动靶向性的智能载体。
发明内容
本发明为极大提高纳米载体的药物传递精准性和疗效，提供一种多响应靶向介孔硅基智能载体的制备方法，具体步骤包括：
步骤一，采用溶胶凝胶法制备介孔硅纳米粒子，离心洗涤后将其分散在甲苯溶液中，向其中加入硅烷偶联剂KH151，在氮气保护下80 °C搅拌反应6 h得到表面有活性双键的粒子；
步骤二，称取一定量的透明质酸溶解在去离子水中，向其中加入甲基丙烯酸酐，用稀的氢氧化钠调节pH在8~9之间，反应12~24 h后用丙酮沉淀得到产物，并将其溶解在去离子水中透析1-2天得到甲基丙烯酰化的透明质酸；
步骤三，将制备的介孔硅纳米粒子分散在去离子水中，称取一定量的乙烯基己内酰胺、甲基丙烯酰化的透明质酸、乳化剂、交联剂和引发剂并依次加入到反应体系中，反复抽真空后在氮气保护下加热聚合，聚合温度为60~80 °C，反应5~10 h后，通过离心洗涤得到表面为有机凝胶壳层的复合介孔硅纳米粒子，负载药物分子后能实现多响应的靶向药物释放。
所述透明质酸分子量在2k~20k之间，所述交联剂为双(丙稀酰)胱胺，所述引发剂为过硫酸铵或过硫酸钾中的一种。所述单体、乳化剂、交联剂、引发剂的质量比为100~200:5~10:5~10:10~20。所述药物分子包括羟基喜树碱、紫杉醇或阿霉素中的一种。
因此，本发明选用合适的高分子和交联剂，对介孔硅纳米粒子表面进行修饰，得到了一种具备多响应性和靶向功能的介孔硅基智能载体。
有益效果：
（1）本发明制备的智能载体通过一步法修饰同时赋予介孔硅多响应性和主动靶向性，在制备工艺上相对更有优势；
（2）本发明所采用的由于其多响应性，因此对肿瘤部位特定微环境更为敏感，具有更优的智能释药行为，能较大提高疗效；
（3）本发明所运用的策略可进一步拓宽应用于其他纳米载体的修饰，具有较广的应用前景。
附图说明
图1是介孔硅纳米粒子修饰前后的透射电镜图片；
图2是介孔硅纳米粒子修饰前后的热重损失图片；
图3是负载阿霉素的复合载体在不同介质中的累积药物释放曲线；
图4是负载阿霉素的复合载体在HeLa细胞摄取后的胞内荧光值，透明质酸预处理的HeLa细胞为对照组。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种多响应靶向介孔硅基智能载体的制备方法，主要步骤如下：
（1）称取0.5 g十六烷基三甲基溴化铵、0.24g氢氧化钠加入到240 mL水中，在80 °C下剧烈搅拌半小时后，向其中加入0.5 mL的正硅酸四乙酯，随后继续在80°C下反应2 h，离心并用乙醇和水洗涤白色沉淀得到介孔硅纳米粒子；
（2）取所得200 mg 的介孔硅纳米粒子分散于甲苯中，向其中加入0.1 mL的硅烷偶联剂KH151，70 °C下回流反应过夜，高速离心收集得到的表面修饰有双键的介孔硅；
（3）称取100 mg表面双键化的介孔硅分散在40 ml去离子水中，依次向水中加入12mg十二烷基硫酸钠，67 mg的聚乙烯基己内酰胺，33 mg的双键化透明质酸（Mw=31000 g/mol）、10mg双(丙稀酰)胱胺以及8 mg的过硫酸钾，反复抽真空-充氮气循环后，将反应体系在70°C下搅拌反应6 h，高速离心收集产物，反复用去离子水清洗后得到聚合物包裹的复合介孔硅纳米粒子。由图1可观察到修饰前介孔硅粒子表面光滑，孔道可见。而修饰后表面明显有厚实的有机物存在，证明修饰过程的成功。且通过图2中的热重分析可知，修饰后热重损失明显大于修饰前，这也是由于更多有机物包覆在复合载体表面。
实施例2
取20 mg复合载体分散在10 ml磷酸盐缓冲液中，向其中加入1ml阿霉素水溶液（2mg/mL），超声分散后避光搅拌过夜，离心分离得到负载阿霉素的复合载体，将清洗得到的上清液收集并用紫外可见分光光度计检测，计算出载药率为8.59%，包封率为94%。将载阿霉素的复合粒子分别分散在pH 7.4和pH 5.0的缓冲液中，分别向各对应组的缓冲液中加入20 mM的谷胱甘肽（GSH），并在37和42 °C下进行药物释放实验，按各时间点累积释放的药量与总药量的百分比作图，得到累积释放曲线。从图3的缓冲曲线中可以看出，当使用三种刺激同时触发载药粒子，得到的缓释曲线释放速率更快，释放量更高。当pH为7.4时只有约10%的药物释放，证明载体能够很好地保护药物，防止提前外泄。而使用GSH刺激能够促进药物从孔道中释放出来，该结果说明载体能够很好地响应多刺激，有望在肿瘤部位特异性地释放药物。
实施例3
将人宫颈癌细胞HeLa按30万/孔的密度种植到6孔板中，向每孔中加入阿霉素浓度为0.5，1，2，5，10μg/ml的载药粒子分散液，与细胞共培养4 h后弃除培养液，用PBS清洗后加入胰酶消化细胞，并将消化后得到的细胞悬液过滤，用于流式细胞仪检测。同时，用纯的透明质酸浓度为10 mg/ml的培养液预处理HeLa细胞，并与载药粒子共培养，作为对照组进行检测。检测波长为Ex 479 nm/Em 587 nm。从图4的结果可以看出，当阿霉素的浓度一定时，使用透明质酸预处理的细胞对载药粒子的摄取明显减少，可以推测，这是由于预处理的透明质酸将HeLa细胞表面的受体屏蔽导致其不能有效与载体特异性结合，从而减少了细胞摄取，这证明载体具有较好的癌细胞靶向性。
Claims (2)
1.一种多响应靶向介孔硅基智能载体的制备方法，其特征在于：所述介孔硅通过溶胶-凝胶法制备，具有纳米范围的尺寸，表面修饰有二硫键交联的聚合物凝胶层，得到的复合材料兼具温度、还原响应性以及主动靶向性，其具体特征如下：
步骤一，采用溶胶凝胶法制备介孔硅纳米粒子，离心洗涤后将其分散在甲苯溶液中，向其中加入硅烷偶联剂KH151，在氮气保护下80°C搅拌反应6 h得到表面有活性双键的粒子；
步骤二，称取一定量的透明质酸溶解在去离子水中，向其中加入甲基丙烯酸酐，用稀的氢氧化钠调节pH在8~9之间，反应12-24 h后用丙酮沉淀得到产物，并将其溶解在去离子水中透析1-2天得到甲基丙烯酰化的透明质酸；
步骤三，将制备的介孔硅纳米粒子分散在去离子水中，称取一定量的乙烯基己内酰胺、甲基丙烯酰化的透明质酸、乳化剂、交联剂和引发剂并依次加入到反应体系中，反复抽真空后在氮气保护下加热聚合，聚合温度为60-80 °C，反应5~10 h后得到表面为有机凝胶壳层的复合介孔硅纳米粒子，负载药物分子后能实现多响应的靶向药物释放。
2.根据权利要求1所述的一种多响应靶向介孔硅基智能载体的制备方法，其特征在于：所述步骤一的介孔硅包括不同形态和孔径的介孔硅纳米粒子，所述步骤二透明质酸的分子量在2k~20k之间。
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