CN113134096A - 一种兼具反向对比磁共振成像与药物控释功能的中空介孔有机硅复合纳米材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种兼具反向对比磁共振成像与药物控释功能的中空介孔有机硅复合纳米材料及其制备方法,所述中空介孔有机硅复合纳米材料包含中空介孔有机硅纳米粒子(HMON)、药物和磁共振成像(MRI)对比剂,所述药物载于所述HMON的空腔内,所述MRI对比剂封堵于所述HMON的孔道中。本发明的中空介孔有机硅复合纳米材料能很好地避免化疗药物提前释放,并进一步提高载药率。本发明的中空介孔有机硅复合纳米材料在肿瘤微环境中经GSH响应诱导生物降解释放装载在空腔内的药物,从而实现化疗药物在肿瘤微环境中缓释和控释,在充分发挥理想抗肿瘤作用的同时对于正常组织细胞的毒副作用甚微。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域,尤其涉及一种兼具反向对比磁共振成像与药物控释功能的中空介孔有机硅复合纳米材料及其制备方法。
背景技术
肿瘤是一种发病率高、致死率高的疾病,尽管已经发展出了各种各样抗肿瘤生长的方法,但化疗仍然是目前肿瘤治疗应用最为广泛使用的治疗手段。常规的癌症化疗,通常在高毒性的药物作用下导致严重的全身毒性的同时,肿瘤药的疗效也随之大幅降低。事实上,强毒副作用与低化疗效果成为了癌症病人的主要死亡原因之一。因此,构建理想的载药系统必须满足能在全身循环过程中传递治疗药物而不会过早泄漏,并且其被肿瘤细胞吸收后能迅速释放化疗药物。
另一方面,肿瘤的高效治疗也离不开其精准诊断,这是因为在治疗过程中若无法实时有效监测肿瘤的动态变化情况,将导致疗效评估失真、时间滞后。因此,开发诊疗一体化的新型多功能平台逐渐成为科学研究的重点方向之一。磁共振成像(Magnetic resonaceimaging,MRI)是一种利用生物体不同组织在外磁场作用下产生不同的共振信号来成像的技术,质子密度及翻转时间的不同会对弛豫率产生影响,从而导致不同组织器官具有特有的MRI对比。此成像技术具有非侵入性诊断、高分辨解剖学成像和定量评估发病机理等优点。传统的MRI造影剂仅影响T1和T2其中一种成像模式,而具有T1-T2对比MRI为造影剂的临床应用带来了新的突破,这类造影剂将GSH响应的成像和T1-T2双模态成像结合,能为病灶部位和正常组织部位提供更佳精准的MRI成像信息,进一步提高MRI成像时间和安全性。
在众多的纳米载药体系中,中空介孔有机硅纳米粒子(HMON)具有大的比表面积、良好的生物相容性、可调的孔径、易表面改性等独特的性能,在生物医学领域尤其是纳米医学方面吸引了广泛的关注。尤其,HMON在肿瘤微环境中展现良好的生物降解能力,相对于传统介孔硅纳米粒子还具有一个大的中空内腔,从而能提高纳米粒子的载药量及治疗效果。但同时,HMON由于大空腔的存在,大多数化疗药物无法稳定装载在HMON中,很容易在制备过程中被洗脱,导致抗肿瘤药物装载量的降低,并且在血液循环过程中容易释放,对正常组织和细胞产生不必要的毒副作用。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明提出一种兼具反向对比MRI成像与药物控释功能的中空介孔有机硅复合纳米材料,能够克服现有技术中因介孔空腔导致的药物负载率降低且药物容易在血液循环中提早泄露的不足,能够提高药物负载率并对药物进行控释;该中空介孔有机硅复合纳米材料还具有良好的对比MRI成像功能,具有更高效的肿瘤治疗效率,可以实时监控,并有效的提高化疗药物利用率及降低对正常组织细胞的毒副作用。
同时,本发明还提供所述中空介孔有机硅复合纳米材料的制备方法和应用。
具体地,本发明采取的技术方案如下:
本发明的第一方面是提供一种中空介孔有机硅复合纳米材料,所述中空介孔有机硅复合纳米材料包含HMON、药物和MRI对比剂,所述药物载于所述HMON的空腔内,所述MRI对比剂封堵于所述HMON的孔道中。
根据本发明第一方面的中空介孔有机硅复合纳米材料,至少具有如下有益效果:
本发明将药物载于HMON的空腔内,并使用MRI对比剂对HMON表面的孔道进行封堵,可避免药物提前释放,提高载药率。同时,在肿瘤微环境中,可通过GSH响应诱导MRI对比剂生物降解,释放装载在空腔内的药物,从而实现药物在肿瘤微环境中缓控释放,在充分发挥理想治疗作用的同时对于正常组织细胞的毒副作用甚微;另外,用于封堵的MRI对比剂可用于MRI成像,实现对治疗过程的实施监测,提高治疗效果。
在本发明的一些实施方式中,所述HMON的粒径为30~150nm,优选40~50nm,更优选约45nm。
在本发明的一些实施方式中,所述HMON的空腔大小为10~50nm,优选20~30nm,更优选约28nm。
在本发明的一些实施方式中,所述HMON表面的孔道大小为3~10nm,优选4~6nm,更优选约4.8nm。
在本发明的一些实施方式中,所述MRI对比剂的粒径为3~6nm,优选4~5nm,更优选约4.7nm。
在本发明的一些实施方式中,所述MRI对比剂包括铁基MRI对比剂、钆基MRI对比剂、铁钆复合MRI对比剂中的任意一种或多种。其中铁基MRI对比剂包括磁性氧化铁纳米粒子(如粒径小于5nm的超小磁性氧化铁纳米粒子ES-MIONs),钆基MRI对比剂包括氧化钆纳米粒子(如ES-GON),铁钆复合MRI对比剂包括核壳型Fe3O4/Gd2O3复合纳米颗粒(如FeGd-HN)中的任意一种或多种。优选地,所述MRI对比剂为FeGd-HN。
在本发明的一些实施方式中,所述MRI对比剂含有金属元素,所述金属元素的质量为HMON质量的0.05%~15%;优选0.1%~15%。
在本发明的一些实施方式中,所述药物包括抗肿瘤药物,优选亲水性抗肿瘤药物,例如阿霉素(DOX)、紫杉醇、顺铂等,优选阿霉素。
在本发明的一些实施方式中,所述药物质量为HMON质量的0.5%~45%。
在本发明的一些实施方式中,所述中空介孔有机硅复合纳米材料还包含生物靶分子,所述生物靶分子与所述HMON表面偶联。通过在表面偶联生物靶分子,可使中空介孔有机硅复合纳米材料具有肿瘤主动靶向能力。
在本发明的一些实施方式中,所述生物靶分子包括RGD单体、RGD二聚体(RGD2,Glu-{Cyclo[Arg-Gly-Asp-(D-Phe)-Lys]}2)等。
在本发明的一些实施方式中,所述生物靶分子在中空介孔有机硅复合纳米材料中的含量为5%~65%。
本发明的第二方面是提供上述中空介孔有机硅复合材料的制备方法,包括如下步骤:
(1)将HMON和药物分散到第一溶剂中,搅拌,得到载药中间材料;
(2)将所述载药中间材料与MRI对比剂分散到第二溶剂中,搅拌,得到中空介孔有机硅复合材料。
在本发明的一些实施方式中,在步骤(2)将所述载药中间材料与MRI对比剂分散到第二溶剂中,搅拌结束后还包括步骤(3):加入生物靶分子分散液和催化剂,搅拌下反应,得到中空介孔有机硅复合材料。
在本发明的一些实施方式中,步骤(1)更具体为,将HMON分散液和药物分散液混合,搅拌,得到载药中间体材料。通过将HMON和药物分别预先进行分散,有利于提高载药率。
在本发明的一些实施方式中,所述HMON分散液的浓度为1~30mg/mL,优选5~15mg/mL,更优选约10.6mg/mL。
在本发明的一些实施方式中,所述药物分散液的浓度为0.1~10mg/mL,优选0.1~1.6mg/mL。
在本发明的一些实施方式中,所述药物分散液与HMON分散液的体积比为0.1~40:1。
在本发明的一些实施方式中,所述载药中间体材料中,所述药物质量为HMON质量的1.5%~45%;在制备所述载药中间体材料过程中,所述药物的包封率为20~98%。
在本发明的一些实施方式中,所述HMON分散液由HMON分散于第一溶剂中得到,在分散过程中可辅以超声,超声时间为7~15min。
在本发明的一些实施方式中,步骤(1)中,搅拌时间为10~36h,优选约24h。搅拌结束后通过离心洗涤收集得到载药中间体材料。所述离心机转速可以设置为15000~20000rpm,离心时间10~30min,洗涤为采用超纯水洗涤3~5次。
在本发明的一些实施方式中,所述药物分散液由药物分散于缓冲液中得到,其中缓冲液可采用PBS缓冲液,pH为6~8,优选7~7.5。
在本发明的一些实施方式中,步骤(1)在避光条件下进行。
在本发明的一些实施方式中,所述第一溶剂包括水、乙醇中的任意一种。
在本发明的一些实施方式中,步骤(2)更具体为,将载药中间体材料分散液与MRI对比剂分散液混合,搅拌,得到中空介孔有机硅复合材料。
在本发明的一些实施方式中,所述MRI对比剂含有金属元素,所述MRI对比剂分散液中金属元素的浓度为0.2~20mM,优选约5.0mM。
在本发明的一些实施方式中,所述载药中间体材料分散液的浓度为9.6mg/mL~20.2mg/mL。
在本发明的一些实施方式中,所述载药中间体材料分散液与MRI对比剂分散液的体积比为0.1~7.5:1,优选0.5:1。
在本发明的一些实施方式中,所述MRI对比剂含有金属元素,所述中空介孔有机硅复合材料中,所述金属元素的质量为HMON质量的0.05%~15%,优选0.1%~15%;在步骤(2)中,所述金属元素的包封率范围为1.0%~10%。
在本发明的一些实施方式中,所述第二溶剂包括水、乙醇中的任意一种。
在本发明的一些实施方式中,步骤(2)中,所述搅拌的温度为10~40℃,优选20~30℃,更优选室温。所述搅拌时间为1~24小时,优选1~7小时,更优选3小时。所述搅拌既可是磁力搅拌也可机械搅拌。搅拌结束后通过离心洗涤收集得到载药中间体材料。所述离心机转速可以设置为15000~20000rpm,离心时间10~30min,洗涤为采用超纯水洗涤3~5次。
在本发明的一些实施方式中,本发明所用的HMON可由Stoeber水解法以及热氨刻蚀合成,介孔模板和硅源通过Stoeber水解法形成介孔有机硅,然后经热氨刻蚀形成中空结构,其中介孔模板可以采用十六烷基三甲基氯化铵(CTAC),有机硅源采用双-[3-(三乙氧基硅)丙基]-四硫化物(BTES),热氨浓度为28%左右。
在本发明的一些实施方式中,所述MRI对比剂可采用水相法制得。
在本发明的一些实施方式中,所述MRI对比剂为超小磁性氧化铁纳米粒子ES-MIONs,其制备方法可以为,将聚合物溶液、铁前驱体溶液和碱溶液混合,搅拌得到ES-MIONs纳米粒子。
制备ES-MIONs纳米粒子的方法中,所述聚合物溶液包括聚丙烯酸溶液,其浓度为0.5~50mg/mL,优选4mg/mL;
所述聚合物溶液经过除氧处理(如通氮除氧);
所述前驱体溶液为铁盐溶液和/或亚铁盐溶液,优选为FeCl3和FeSO4的混合溶液;
所述FeCl3的浓度分别为100~1500mM,优选500mM;
所述FeSO4的浓度为50~750mM,优选250mM;
所述聚合物溶液与铁前驱体溶液的体积比为1~120:1,优选20~60:1,更优选50:1;
所述碱溶液优选氨水,氨水的浓度为2%~28%,优选20%~28%,更优选28%;
所述搅拌时间在30分钟及以上,优选30~120分钟,更优选60分钟;
所述搅拌可以是磁力搅拌或机械搅拌。
在本发明的一些实施方式中,所述MRI对比剂为超小氧化钆纳米粒子ES-GON,其制备方法可以为,将聚合物溶液、含钆离子溶液和碱溶液混合,搅拌得到ES-GON纳米粒子。
制备ES-GON纳米粒子的方法中,所述聚合物溶液包括聚丙烯酸溶液,其浓度为0.5~50mg/mL,优选4mg/mL;
所述聚合物溶液经过除氧处理(如通氮除氧);
所述含钆离子溶液中的钆离子浓度为80~800mM,优选为500mM;
所述含钆离子溶液包括氯化钆、硝酸钆、氟化钆、溴化钆等中的任意一种或多种的混合溶液,优选硝酸钆溶液;
所述聚合物溶液与含钆离子溶液的体积比为1~120:1,优选20~60:1,更优选50:1;
所述碱溶液优选氨水,氨水的浓度为2%~28%,优选20%~28%,更优选28%;
所述搅拌时间在30分钟及以上,优选30~120分钟,更优选60分钟;
所述搅拌可以是磁力搅拌或机械搅拌。
在本发明的一些实施方式中,所述MRI为核壳型Fe3O4/Gd2O3复合纳米颗粒(FeGd-HN),其制备方法可以为,将聚合物溶液、铁前驱体溶液和第一碱溶液混合,搅拌得到中间体材料;然后加入含钆离子溶液和第二碱溶液,搅拌得到核壳型Fe3O4/Gd2O3复合纳米颗粒。
制备核壳型Fe3O4/Gd2O3复合纳米颗粒的方法中,所述聚合物溶液包括聚丙烯酸溶液,其浓度为0.5~50mg/mL,优选4mg/mL;
所述聚合物溶液经过除氧处理(如通氮除氧);
所述前驱体溶液为铁盐溶液和/或亚铁盐溶液,优选为FeCl3和FeSO4的混合溶液;
所述FeCl3的浓度分别为100~1500mM,优选500mM;
所述FeSO4的浓度为50~750mM,优选250mM;
所述聚合物溶液与铁前驱体溶液的体积比为1~120:1,优选20~60:1,更优选50:1;
所述含钆离子溶液中的钆离子浓度为80~800mM,优选为500mM;
所述含钆离子溶液包括氯化钆、硝酸钆、氟化钆、溴化钆等中的任意一种或多种的混合溶液,优选硝酸钆溶液;
所述聚合物溶液与含钆离子溶液的体积比为1~120:1,优选20~60:1,更优选50:1;
所述第一碱溶液和第二碱溶液优选氨水,氨水的浓度独立地为2%~28%,优选20%~28%,更优选28%;
第一次搅拌时间在30分钟及以上,优选30~120分钟,更优选60分钟;
第一次搅拌时间在30分钟及以上,优选30~120分钟,更优选90分钟;
所述搅拌可以是磁力搅拌或机械搅拌;
第二次搅拌后,经过纯化得到核壳型Fe3O4/Gd2O3复合纳米颗粒;所述纯化方法可以是透析、过滤、离心或层析中的任意一种或几种。
在本发明的一些实施方式中,步骤(3)中,所述生物靶分子分散液的浓度为1~10mg/mL;所述生物靶分子与步骤(2)搅拌得到的材料的质量比为1:(20~30)。
在本发明的一些实施方式中,步骤(3)中,所述催化剂包括EDC、NHS中的任意一种或两种的组合,优选为EDC、NHS的组合物。所述EDC、NHS和生物靶分子的比例可根据需要进行调整。作为示例,所述EDC、NHS和生物靶分子的比例为1μL:(0.5~1)mg:(0.01~0.1)mg。
本发明的第三方面是提供上述中空介孔有机硅复合材料在制备肿瘤纳米诊疗剂中的应用。
相对于现有技术,本发明具有如下有益效果:
1.本发明选用MRI对比剂作为HMON的“阀门”材料,MRI对比剂具有合适的尺寸,例如FeGd-HN具有4.7nm的尺寸,刚好适合用于封堵HMON表面的孔道,能很好地避免化疗药物提前释放,并进一步提高载药率。本发明的中空介孔有机硅复合纳米材料在肿瘤微环境中经GSH响应诱导生物降解释放装载在空腔内的药物,从而实现化疗药物在肿瘤微环境中缓控释放,在充分发挥理想抗肿瘤作用的同时对于正常组织细胞的毒副作用甚微,为肿瘤的化疗药物限制性毒性问题提供一种全新的研究理念。
2.本发明通过对介孔封堵而富集在HMON表面的MRI对比剂可用于肿瘤的MRI的T2加权成像,同时进一步因GSH诱导HMON框架生物降解释放出的MRI对比剂能用于T1成像,集成反向对比T1/T2双模态MR成像能对药物疗效进行实时定量在体监测,将赋予复合该纳米材料高效的化疗效果。
3.本发明制备的中空介孔有机硅复合纳米材料的粒径<50nm,与传统的介孔硅纳米颗粒相比,本发明制备的纳米颗粒粒径大小更具优势,能最大程度的通过EPR效应将药物递送到肿瘤部位,并且具有优异水相分散性和稳定性,良好的生物相容性与安全性,在临床及基础医学研究中拥有巨大的应用转化潜力。
4.本发明将MRI成像与化疗结合起来,成功构建出诊疗于一体的多功能载药纳米体系,实现肿瘤全面、灵敏、靶向性成像,在分子水平为肿瘤的精准诊疗开辟了新的研究思路。
附图说明
图1为MSN@MON(a)、HMON1(b)、HMON2(c)和HMON3(d)的TEM图;
图2为HMON1@DOX1、HMON2@DOX1和HMON3@DOX1的孔径分布图;
图3的(a)~(d)依次为实施例1的HMON2@DOX1、HMON2@DOX2、HMON2@DOX3、HMON2@DOX4的TEM图,(e)~(h)依次为HMON2@DOX1@FeGd-HN1、HMON2@DOX1@FeGd-HN2、HMON2@DOX1@FeGd-HN3和HMON2@DOX1@FeGd-HN4的TEM图;
图4为FeGd-HN的TEM图(a、b)以及粒径分布图(c);
图5为(a)HMON2@DOX1,(b)HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2的能谱图,以及(c)HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2的TEM图;
图6为HMON2,HMON2@DOX1和HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2的(a)分散液实物图,(b)动力学光散射粒径分布(DLS)图和(c)Zeta电位分布图;
图7为HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2和FeGd-HN在无谷胱甘肽(GSH)条件下的T1(a),T2(b)弛豫率曲线;
图8为HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2和FeGd-HN的T1(a),T2(b)MRI图;
图9为HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2在GSH(5mM)影响下体外降解0、1、3、5和7天后的TEM图[(a)~(e)],和对应的HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2粒子在含谷胱甘肽(GSH)条件下降解后的T1,T2弛豫率曲线[(f)和(g)],以及r1或r2/r1值随孵育时间的变化曲线(h);
图10为HMON2@DOX1和HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2在有无GSH条件下的释放曲线;
图11为HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2在GSH影响下的细胞毒性MTT测试柱状图;
图12为HMON2@DOX1@FeGd-HN3、HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2与U-87MG或HBEC-5i细胞共孵育后的CLSM图;
图13为U-87MG与有(b)无(a)HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2共孵育后的TEM图;
图14为HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2被细胞定性摄取的CLSM图;
图15的(a)~(d)分别为U-87MG荷瘤鼠尾静脉注射Gd-DOTA前、10、20和30分钟后的MRI成像图,(e)~(h)分别代表注射HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2前、24、48和72小时后的MRI结果;(i)和(j)分别为为注射Gd-DOTA和HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2的信噪比定量分析结果;
图16为尾静脉注射HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2前及24、48和72小时后U-87MG荷瘤裸鼠的体内MRI成像:(a)~(d)对肿瘤部位的T1加权成像,(e)~(h)对肝部位的MR成像,其扫描切片方向为轴向;(i)和(j)分别为肿瘤与肝的信噪比定量分析图;
图17为HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2动物实验疗效图:用不同方式处理后(a)肿瘤体积的变化;(b)体重变化;(c)存活率对比图;(d)~(f)分别为尾静脉注射游离的DOX、HMON2@FeGd-HN3@RGD2和HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2 10天后肿瘤的H&E染色图;
图18为尾静脉注射生理盐水、HMON2@FeGd-HN3@RGD2或HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2后荷瘤裸鼠心、肝、脾、肺和肾的H&E染色分析结果。
具体实施方式
以下结合具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
本实施提供一种中空介孔有机硅复合纳米材料,采用FeGd-HN对比剂封堵载阿霉素(DOX)的HMON,得到HMON@DOX@FeGd-HN,然后偶联RGD2多肽。
中空介孔有机硅复合纳米材料的具体制备方法包括如下步骤:
(1)制备HMON
本发明采用的HMON是根据文献“Fan W,Lu N,Shen Z,et al.Generic synthesisof small-sized hollow mesoporous organosilica nanoparticles for oxygen-independent X-ray-activated synergistic therapy[J].Nature communications,2019,10(1):1-14.”中公开的方法制备所得,所用介孔模板为十六烷基三甲基氯化铵(CTAC),有机硅源为双-[3-(三乙氧基硅)丙基]-四硫化物(BTES)。
具体地,将2g CTAC、0.1g三乙醇胺溶解于20mL水中,剧烈搅拌0.5小时后转移到80℃的油浴中。然后将1mL TEOS滴加到上述体系中反应1小时,接着加入由BTES和0.5mL TEOS混合成的硅前驱体,继续反应3小时。反应结束后通过离心、清洗得到MSN@MON。采用30mL氯化钠(1wt%)甲醇溶液对MSN@MON进行提取,以去除其中的模板CTAC。
将提取后得到的MSN@MON分散到30mL水中,然后转移到95℃的油浴中。然后加入NH4OH反应3小时以刻蚀掉MSN@MON内部的核。反应结束后经离心、洗涤后得到HMON。在上述制备过程中,分别调整BTES的投料用量为0.5,1.0和2.0mL,对应得到三种不同介孔大小的HMON,依次标记为HMON1、HMON2和HMON3。
MSN@MON、HMON1、HMON2和HMON3的TEM图依次如图1的(a)~(d)所示。由图1可知,制备的HMON1、HMON2和HMON3的粒径<50nm,尺寸分布均匀,分散性好。
(2)制备HMON装载化疗药物阿霉素材料(HMON@DOX)
将0.2mL HMON1(或HMON2、HMON3)溶液(10.6mg/mL)按表1的体积比在超声条件下分别与0.8、0.4、0.2和0.1mL DOX(1.16mg/mL)溶液混合,并加入水保持最终总反应溶液体积为1mL,避光搅拌24小时进行DOX的装载,离心,纯水洗涤5次,收集得到HMON1@DOX1、HMON2@DOX1、HMON2@DOX2、HMON2@DOX3、HMON2@DOX4和HMON3@DOX1,6种材料的表征结果如表1和图2、图3所示。
其中,图2为HMON1@DOX1、HMON2@DOX1和HMON3@DOX1的BET测试得到的孔径结果。由图2的BET测试可知,HMON1@DOX1、HMON2@DOX1和HMON3@DOX1的平均介孔孔径依次为3.5、4.8和5.7nm。
载药量表征结果显示经去纯水洗涤5次后,HMON1@DOX1,HMON2@DOX1,HMON3@DOX1的DOX负载量为9.1%~10.9%。同时,根据表1中HMON2@DOX1、HMON2@DOX2、HMON2@DOX3、HMON2@DOX4的结果可知HMON与DOX按投料质量比为2.28:1具有最佳的载药量(9.8%)。图3的(a)~(d)为HMON2@DOX1、HMON2@DOX2、HMON2@DOX3、HMON2@DOX4的TEM图,证实了载有DOX的HMON仍具有良好的分散效果。
表1.HMON@DOX纳米粒子的制备条件及其表征结果
aHMON1(或HOMN2、HMON3)溶液与DOX溶液的浓度分别为10.6mg/mL,1.16mg/mL;
b载入的DOX与HMON1(或HMON2、HMON3)质量百分比;
c载入的DOX与起始所加入DOX的质量百分比。
(3)制备FeGd-HN
配制浓度为4mg/mL的聚丙烯酸(PAA)溶液,通氮气除氧;然后升温至100℃,快速将0.8mL混合的铁前驱液(500mM FeCl3和250mM FeSO4)注入至加热的聚合物溶液中,并添加12mL(28%)氨水,反应30分钟后再向上述反应液中加入0.8mL Gd(NO3)3(500mM)与另外6.0mL(28%)的氨水,并继续反应90分钟;反应后冷却至室温,经透析(分子量截留6~8kDa)纯化、超滤(分子量截留3kDa)浓缩,即可得到FeGd-HN。
FeGd-HN的TEM图见图4。从图4可以看出制备的FeGd-HN在水相中具有良好的分散效果,粒径大小为4.7nm,与表1中HMON2@DOX1的介孔孔径大小4.8nm相近。
(4)制备HMON@DOX@FeGd-HN
将表1中的HMON2@DOX1(或HMON3@DOX1)在超声条件分别分散至Gd浓度和Fe浓度如表2所示的FeGd-HN溶液中,然后磁力搅拌反应3小时,然后将纳米颗粒在20000rpm转速下离心20分钟,再用纯水洗涤5次,即得一系列HMON@DOX@FeGd-HN样品。
对应的相关制备条件及其表征结果如表2和图3所示。
表2.HMON@DOX@FeGd-HN纳米粒子的制备条件及其表征结果
aFeGd-HN溶液中含Gd或Fe的摩尔浓度;
b载入的DOX与HMON2(或HMON3)质量百分比;
c载入的DOX与起始所加入DOX的质量百分比;
d负载的Gd与HMON2的质量百分比;
e负载Gd与质量百分比起始加入Gd的质量百分比。
HMON2@DOX1@FeGd-HN1、HMON2@DOX1@FeGd-HN2、HMON2@DOX1@FeGd-HN3和HMON2@DOX1@FeGd-HN4的TEM如图3的(e)~(h)。与对比剂封堵前图3的(a)HMON2@DOX1相比,对比剂封堵后的HMON2@DOX1@FeGd-HN1、HMON2@DOX1@FeGd-HN2、HMON2@DOX1@FeGd-HN3和HMON2@DOX1@FeGd-HN4的纳米颗粒看起来较暗,中空的结构几乎被完全覆盖,证实了FeGd-HN优异的封堵效果。
同时,从表2可以看出,由于FeGd-HN对介孔的封堵作用,HMON@DOX@FeGd-HN的载药率相较表1中对应FeGd-HN封堵前的HMON@DOX有明显的提高,而且载药量伴随FeGd-HN浓度的增加而增加。
其中,相较于HMON3@DOX1@FeGd-HN1~HMON3@DOX1@FeGd-HN4,所得HMON2@DOX1@FeGd-HN1~HMON2@DOX1@FeGd-HN4表现出更高的DOX负载量(15.8%~20.4%),这应该得益于HMON2@DOX1具有更适合被FeGd-HN封堵的介孔大小(4.8nm);HMON2@DOX1@FeGd-HN1~HMON2@DOX1@FeGd-HN4同时具有较高的Gd负载率,可达1.62%~8.77%。
最终综合DOX的负载率及Gd的负载率HMON2@DOX1@FeGd-HN3被选为最优组进行下一实验。
(5)制备HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2
将10μL EDC(56.5μmol),100μL NHS(65mg/mL)和100μL RGD2(5.0mg/mL)依次分别加入上述步骤所得的HMON2@DOX1@FeGd-HN3纳米粒子浓度为13.8mg/mL的分散液中(1mL),将混合物在室温下搅拌反应8小时;然后将获得的混合溶液离心,纯水洗涤3次后得到HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2复合纳米粒子,并重新分散至1mL超纯水中。
另外,按照与制备HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2类似的方法,仅省去其中负载DOX的步骤,制得HMON2@FeGd-HN3@RGD2作为对照组。
经检测,HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2中的DOX载药量为19.0±0.4%,Gd负载量为2.13±0.12%。
通过图5的(a)HMON2@DOX1,(b)HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2的能谱(EDS)分析可以证明FeGd-HN的存在;从图5的(c)HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2的TEM图可看出该复合纳米粒子很暗,几乎看不到可见的空腔,这也进一步证明FeGd-HN未在RGD2偶联过程中脱落,稳定存在于HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2中。
图6的(a)中,从左到右有依次为HMON2,HMON2@DOX1和HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2的分散液实物图,(b)为三者的DLS图,可以看出,相较于HMON2@DOX1(多分散性指数PDI=0.854),FeGd-HN封堵的HMON2@DOX1(PDI=0.146)能提高纳米粒子的分散性及稳定性;图6的(c)反映了三种粒子Zeta电位从-68.6mV、3.9mV、-50.4mV的变化,表明HMON2@DOX1团聚与表面电位相关。
另外,对HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2以及其他材料的体外MRI成像性能、药物释放性能、生物活性,以及体内MRI成像、肿瘤治疗效果等进行研究,具体如下:
(一)体外MRI成像性能和药物释放性能
(1)取本实施例制备的样品FeGd-HN和HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2分别作为MRI造影剂测量T1弛豫率(1/T1)和T2弛豫率(1/T2),并分别取相同条件下三批次合成的产品测量;测量所用磁场为7T。依据T1弛豫率和T2弛豫率随钆浓度(CGd)的变化得到拟合直线的斜率,即为r1和r2值。图7结果显示,本实施例制备的样品FeGd-HN和HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2的r1值分别为20.1,13.3mM-1s-1,r2/r1比值分别为7.01,19.3。
图8的(a)为FeGd-HN和HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2 T1加权MRI图像(磁场为7.0T,TR=250ms;TE=10ms;(b)为对应的T2加权MRI图像(TR=80ms;TE=2000ms)。结果显示,FeGd-HN具有比HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2更佳的T1成像,但HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2表现了更优的T2加权MRI效果。
(2)将4mL HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2溶液(CGd=396μM,CDOX=736μg/mL)与1.0mLGSH(50mM)混合,并置于37℃的振荡培养箱(Excella E24,New Brunswick Scientific),分别在在预定的0、1、3和5天时间点取1.0mL溶液用于TEM观察和MRI测量,其中MR成像研究均在MRI扫描仪上进行(7.0T,B-C 70/16,Bruker,US)得到HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2在含GSH(5mM)条件下体外降解后的T1和T2弛豫值。
同时,将具有与上述相同浓度的4mL HMON2@DOX1@FeGd-HN3或HMON2@DOX1(CDOX=736μg/mL)分别与1.0mL GSH(50mM)或纯水混合后,置于透析袋中,随后置于摇床中振荡,在预定的时间点取样(0.6mL)荧光检测,得到GSH响应DOX释放曲线。
如图9的(a)~(e)所示,HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2在含GSH条件下表现出良好的可生物降解性能,随着在含GSH溶液中孵育时间的推移,这种复合纳米粒子逐渐显现出中空结构,表明了封堵介孔的FeGd-HN被释放出来,孵育3天后,越来越多的HMON主链被降解。图9的(f)~(h)MRI测试结果同样揭示了FeGd-HN在降解过程从孔道中成功释放。随着孵育时间从0天增加到7天,r1值从13.0mM-1s-1增加到19.3mM-1s-1,而r2/r1比率从19.01降低到6.99。HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2在与GSH孵育前后,r1值和r2/r1比率的巨大变化能使HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2作为造影剂使正常组织变暗并增亮肿瘤(高GSH条件),从而有助于反向对比肿瘤的MRI成像。
DOX在有无GSH条件下的释放曲线如图10所示,GSH对药物的释放存在显著的影响,且GSH可显著提高药物的释放,肿瘤组织较正常组织细胞相比其GSH要高,该载药复合纳米体系的释放正好符合这一特性,说明其是一种可以用于肿瘤治疗GSH刺激响应型药物载体。其次,由于FeGd-HN封堵了孔道,HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2的DOX释放比HMON2@DOX慢。但是,在GSH的影响下,HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2由于拥有更高的载药量,而因此释放的DOX量也远高于HMON2@DOX1(*P<0.05)。
(二)生物活性
(1)为了评估实施例1中制得的HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2复合纳米粒子的细胞活性,对人胶质母细胞瘤细胞(U-87MG)的实验分为:HMON2@FeGd-HN3@RGD2组、HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2组、HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2+5mM GSH组与free DOX组(即游离DOX组),通过使用MTT法检测细胞的存活率,从而反映所得纳米粒子的体外治疗效果。
从图11可以看出未载DOX的HMON2@FeGd-HN3@RGD2组在任何测试浓度下,细胞活力都高达100%左右,这表明HMON2@FeGd-HN3@RGD2在没有DOX负载的情况下具有良好的生物相容性。而HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2+5mM GSH组的细胞毒性显著高于HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2组(**P<0.01,***P<0.001),这进一步表明HMON2在高GSH条件下降解导致DOX有效释放以杀死癌细胞。
(2)体外细胞摄取:以U-87MG或人脑微血管内皮细胞(HBEC-5i)为模型,将细胞以5.0×105cells/mL密度接种于8孔板上置于37℃培养箱培养24小时,用含有HMON2@DOX1@FeGd-HN3或HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2(CGd=10μM)的新鲜培养基(0.5mL,无FBS)替换生长培养基。再孵育2小时后,用PBS洗涤三次,然后用鬼笔环肽-FITC、Hoechst 33258分别对细胞骨架和细胞核进行染色(细胞骨架用鬼笔环肽-FITC染为绿色,细胞核核被Hoechst33258染为蓝色),并用运用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察并拍摄出摄取纳米粒子后的细胞荧光图片。
另外使用含HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2(CGd=10μM)的新鲜培养基(0.5mL,无FBS)替换生长培养基,同时加入200倍游离的RGD2,然后进行相应的孵育,即HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2+Blocking组。
如图12CLSM结果定性观察显示HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2容易被U-87MG细胞摄取,未偶联RGD2的纳米颗粒HMON2@DOX1@FeGd-HN3很难被U-87MG和阴性HBEC-5i细胞摄取。另外,HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2+200倍游离的RGD2组(图12中的HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2+Blocking组)由于封堵作用的存在抑制了U-87MG细胞对HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2的内吞。
从图13中(b)的HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2纳米粒子与U-87MG细胞共孵育后的TEM图可知,偶联RGD2的纳米颗粒由于RGD2-αvβ3的作用能提高阳性细胞摄取,起到靶向抗肿瘤细胞的作用。进一步地,如图14所示的细胞核内体和溶酶体染色(绿色)后的CLSM分析结果同样也证明了装载有DOX的纳米颗粒是通过整联蛋白受体介导的内吞作用被内化到核内体中,其中一部分从核内体和溶酶体中逃逸,其释放的DOX再进入细胞核。
(三)HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2在体内的MRI研究
将U-87MG荷瘤裸鼠在含氧条件下使用异氟烷(1.0-2.0%)进行麻醉,并置于动物专用的身体线圈中进行MRI数据采集。通过尾静脉注射CGd=4mg/kg的HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2,并且注射相同剂量的市售Gd-DOTA作为对照,在不同时间点进行扫描。用于图像采集的T1序列参数如下:TR=1000ms,TE=30ms,α=180°,视野=40×40mm2,切片=16,切片厚度=1mm,所得图像再使用Image J软件进行肿瘤信号增强定量分析。SNR值为信噪比(signal-to-noise ratio),ΔSNR为信号增强百分比,计算公式如下:
图15体现了市售Gd-DOTA(a~d)和本发明所得的HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2纳米颗粒(e~f)通过尾静脉注射到荷瘤小鼠前后的T1-MR成像效果图。由图可知,注射HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2组具有比Gd-DOTA组更长的体内循环半衰期及更优的MRI效果,其肿瘤信号增强定量分析结果(i)、(j)进一步证实了HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2是比Gd-DOTA更加优良的T1造影剂。
图16展现了HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2纳米颗粒为造影剂(4.0mg/kg)对U-87MG荷瘤小鼠的肿瘤(a~d)和肝(e~f)部位的MRI图像。静脉注射本发明所得的纳米颗粒后,肿瘤MRI信号随着时间的延长逐渐增强,并在注射48小时后达到峰值(图16的c),但肝脏MRI信号与之相反,呈现逐渐减弱趋势。其相对应的图16的(i)、(j)定量分析结果显示,肿瘤的最高ΔSNR为283±33%,肝脏的最低ΔSNR为-176±26%,远高于目前报道的肿瘤MRI的对比度,再次说明上述纳米颗粒在活体水平具有高效的MRI造影成像性能。
(四)HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2对肿瘤的治疗效果
将100μL U-87MG细胞悬液(4×107cells/mL)通过1mL注射器接种到小鼠的右肩(雌性,5周)以带有U-87MG肿瘤的裸鼠。当肿瘤体积约为120mm3时,在麻醉状态下分别向小鼠静脉注射100μL生理盐水、游离DOX、HMON2@FeGd-HN3@RGD2或HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2,每组5只。其中,DOX的剂量为5mg/kg,并在第4天再次静脉注射上述同等剂量的药物。从第一次给药开始,每隔一天监测小鼠的肿瘤尺寸和体重,绘制肿瘤肿瘤体积、小鼠体重随时间变化的生长曲线。10天后处死裸鼠,收集其心、肝、脾、肺、肾等重要器官,经甲醛固定、石蜡包埋、遵循标准H&E染色检测,分析相应器官组织有无病理改变。
肿瘤治疗效果如图17所示,(a)为不同处理组小鼠的肿瘤平均体积随时间的变化曲线;(b)为每组小鼠的体重随时间的变化曲线;(c)代表处理20天各组的存活率;由图可知,HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2纳米粒子能有效抑制肿瘤的生长,肿瘤区域平均体积最小,相较于游离DOX治疗组,HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2的毒副作用低得多,20天后仍具有良好的存活率,从注射后第10天U-87MG荷瘤裸鼠的H&E染色结果,相较于游离的DOX(d)和HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2治疗组,(f)显示了HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2纳米颗粒对癌细胞持续有效的抑制作用。这是因为被FeGd-HN封堵住孔道的HMON防止了DOX在血液中循环时释放,并能够在肿瘤区域高GHS响应性缓释和控制,从而达到持续高效的化疗效果。
另外,主要器官的组织学分析(图18)结果表明心、肝、脾、肺和肾切片均未出现明显的病理改变,揭示HMON2@DOX1@FeGd-HN3@RGD2在体内的良好的生物相容性。
实施例2
本实施提供一种中空介孔有机硅复合纳米材料,采用FeGd-HN对比剂封堵载紫杉醇(TAX)的HMON,得到HMON@TAX@FeGd-HN,具体的制备方法如下:
将0.2mL实施例1制得的HMON2溶液(10.6mg/mL)在超声条件下与0.4mL紫杉醇TAX溶液(1.16mg/mL)混合,并加入水保持最终总反应溶液体积为1mL,避光搅拌24小时进行TAX的装载,离心,纯水洗涤5次,收集得到HMON2@TAX;接着再将其在超声条件分散至1mL CGd为5mM,CFe=为10.2mM的FeGd-HN溶液中,然后磁力搅拌反应3小时,然后将纳米颗粒在20000rpm转速下离心20分钟,再用纯水洗涤5次,即所得FeGd-HN封堵的中空介孔硅药物控缓释复合纳米粒子(HMON2@TAX@FeGd-HN3)。
实施例3
本实施提供一种中空介孔有机硅复合纳米材料,采用FeGd-HN对比剂封堵载顺铂(DDP)的HMON,得到HMON@DDP@FeGd-HN,具体的制备方法如下:
将0.2mL实施例1制得的HMON2溶液(10.6mg/mL)在超声条件下与0.4mL顺铂DDP溶液(1.16mg/mL)混合,并加入水保持最终总反应溶液体积为1mL,避光搅拌24小时进行DDP的装载,离心,纯水洗涤5次,收集得到HMON2@TAX,再将其在超声条件分散至1mL CGd为5mM,CFe=为10.2mM的FeGd-HN溶液中,然后磁力搅拌反应3小时,然后将纳米颗粒在20000rpm转速下离心20分钟,再用纯水洗涤5次,即所得FeGd-HN封堵的中空介孔硅药物控缓释复合纳米粒子(HMON2@DDP@FeGd-HN3)。
实施例4
本实施提供一种中空介孔有机硅复合纳米材料,采用ES-MIONs对比剂封堵载阿霉素(DOX)的HMON,得到HMON@DOX@ES-MIONs,具体的制备方法如下:
(1)ES-MIONs纳米粒子的制备
配制40mL的PAA溶液(分子量为1800),浓度为4.0mg/mL。通氮气50分钟以完全除氧,并将溶液升温至100℃,再注入0.8mL FeCl3(500mM)和FeSO4(250mM)铁前驱体混合溶液,并立即加入12mL氨水溶液(28%),磁力搅拌下持续反应60分钟。冷却至室温后,使用透析(分子量截留6~8kDa)纯化、再经超滤(分子量截留3kDa)浓缩,即可得到ES-MIONs。
(2)将0.2mL实施例1制得的HMON2溶液(10.6mg/mL)在超声条件下与0.4mL DOX溶液(1.16mg/mL)混合,并加入水保持最终总反应溶液体积为1mL,避光搅拌24小时进行DOX的装载,离心,纯水洗涤5次,收集得到HMON2@DOX1。再将其在超声条件分别分散至1mL CFe为10.2mM的ES-MIONs溶液中,然后磁力搅拌反应3小时,然后将纳米颗粒在20000rpm转速下离心20分钟,再用纯水洗涤5次,即所得ES-MIONs封堵的中空介孔硅药物控缓释复合纳米粒子(HMON2@DOX1@ES-MIONs)。
实施例5
本实施提供一种中空介孔有机硅复合纳米材料,采用ES-GONs对比剂封堵载阿霉素(DOX)的HMON有机硅,得到HMON@DOX@ES-GONs,具体的制备方法如下:
(1)ES-GONs纳米粒子的制备
配制40mL的PAA溶液(分子量为1800),浓度为4.0mg/mL。通氮气50分钟以完全除氧,并将溶液升温至100℃,再加入0.8mL Gd(NO)3(500mM溶液,并立即加入6mL氨水溶液(28%),磁力搅拌下持续反应60分钟。冷却至室温后,使用透析(分子量截留6-8kDa)纯化、再经超滤(分子量截留3kDa)浓缩,即可得到ES-GONs。
(2)将0.2mL实施例1制得的HMON2溶液(10.6mg/mL)在超声条件下与0.4mL DOX溶液(1.16mg/mL)混合,并加入水保持最终总反应溶液体积为1mL,避光搅拌24小时进行DOX的装载,离心,纯水洗涤5次,收集得到HMON2@DOX1。再将其在超声条件分别分散至1mL CGd为5mM的ES-GONs溶液中,然后磁力搅拌反应3小时,然后将纳米颗粒在20000rpm转速下离心20分钟,再用纯水洗涤5次,即所得ES-GONs对比剂封堵的中空介孔硅药物控缓释复合纳米粒子(HMON2@DOX1@ES-GONs)。
实施例2~5制备得到的纳米粒子具有与实施例1的类似的性能,在此不再赘述。
综上所述,采用水相法合成MRI对比剂FeGd-HN,并利用其封堵载有抗肿瘤药物的HMON的孔道,可以避免抗肿瘤药物在清洗和血液循环过程中泄露。MRI对比剂对HMON孔道的封堵作用,不仅增加了药物的装载率,而且聚集的MRI对比剂显T2成像性能,能使正常组织变暗。另外,复合纳米材料中的有机硅框架能在肿瘤区域富含谷胱甘肽(GSH)环境下降解,从而能够智能型地实现GSH响应性药物控释和缓释的目的,达到对正常组织最低的毒性作用及对肿瘤组织高效化疗效果;而因此释放出的MRI对比剂能进一步用于肿瘤的T1加权成像,使肿瘤组织变亮。本发明实现了反向对比T1-T2造影功能与高效化疗的集成,同时兼具有良好的生物相容性,在肿瘤的MRI成像及治疗方面具有良好的应用前景。
Claims (10)
1.一种中空介孔有机硅复合纳米材料,其特征在于:所述中空介孔有机硅复合纳米材料包含中空介孔有机硅纳米粒子、药物和磁共振成像对比剂,所述药物载于所述中空介孔有机硅的空腔内,所述磁共振成像对比剂封堵于所述中空介孔有机硅纳米粒子的孔道中。
2.根据权利要求1所述中空介孔有机硅复合纳米材料,其特征在于:所述中空介孔有机硅纳米粒子的粒径为30~150nm,优选40~50nm;优选地,所述中空介孔有机硅纳米粒子的空腔大小为10~50nm,优选20~30nm;优选地,所述中空介孔有机硅纳米粒子表面的孔道大小为3~10nm,优选4~6nm。
3.根据权利要求2所述中空介孔有机硅复合纳米材料,其特征在于:所述磁共振成像对比剂的粒径为3~6nm,优选4~5nm。
4.根据权利要求1~3任一项所述中空介孔有机硅复合纳米材料,其特征在于:所述磁共振成像对比剂包括铁基磁共振成像对比剂、钆基磁共振成像对比剂、铁钆复合磁共振成像对比剂中的任意一种或多种;优选地,所述磁共振成像对比剂包括磁性氧化铁纳米粒子、氧化钆纳米粒子和核壳型Fe3O4/Gd2O3复合纳米颗粒中的任意一种或多种。
5.根据权利要求4所述中空介孔有机硅复合纳米材料,其特征在于:所述磁共振成像对比剂含有金属元素,所述金属元素的质量为中空介孔有机硅纳米粒子质量的0.05%~15%;优选0.1%~15%。
6.根据权利要求5所述中空介孔有机硅复合纳米材料,其特征在于:所述中空介孔有机硅复合纳米材料还包含生物靶分子,所述生物靶分子与所述中空介孔有机硅纳米粒子表面偶联。
7.权利要求1~6任意一项所述中空介孔有机硅复合材料的制备方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)将中空介孔有机硅纳米粒子和药物分散到第一溶剂中,搅拌,得到载药中间材料;
(2)将所述载药中间材料与磁共振成像对比剂分散到第二溶剂中,搅拌,得到中空介孔有机硅复合材料。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于:步骤(1)中,所述药物与中空介孔有机硅纳米粒子的质量比为3.5%~55.3%,优选5.0%~45.1%。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法,其特征在于:在步骤(2)将所述载药中间材料与磁共振成像对比剂分散到第二溶剂中,搅拌结束后还包括步骤(3):加入生物靶分子分散液和催化剂,搅拌下反应,得到中空介孔有机硅复合材料。
10.权利要求1~6任意一项中空介孔有机硅复合材料在制备肿瘤纳米诊疗剂中的应用。
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