CN106806906B - 一种集荧光成像与载药一体化的稀土上转换纳米药物载体的制备方法 - Google Patents

一种集荧光成像与载药一体化的稀土上转换纳米药物载体的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106806906B
CN106806906B CN201710002330.8A CN201710002330A CN106806906B CN 106806906 B CN106806906 B CN 106806906B CN 201710002330 A CN201710002330 A CN 201710002330A CN 106806906 B CN106806906 B CN 106806906B
Authority
CN
China
Prior art keywords
drug
rare earth
nanoparticles
nano
ucnps
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201710002330.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106806906A (zh
Inventor
王杭祥
袁莹莹
王敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN201710002330.8A priority Critical patent/CN106806906B/zh
Publication of CN106806906A publication Critical patent/CN106806906A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106806906B publication Critical patent/CN106806906B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0065—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the luminescent/fluorescent agent having itself a special physical form, e.g. gold nanoparticle
    • A61K49/0067—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the luminescent/fluorescent agent having itself a special physical form, e.g. gold nanoparticle quantum dots, fluorescent nanocrystals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5115—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种集荧光成像与载药一体化的稀土上转换纳米药物载体的制备方法，包括：(1)利用稀土氯化物为原料，油酸为配体，油酸/1‑十八烯为混合溶剂，采用高温溶剂热法合成油酸包裹的稀土上转换纳米粒子(OA‑UCNPs)；(2)将所述上转换纳米粒子、DSPE‑PEG2000、抗肿瘤药物分散在同一介质中，使用原位搅拌法使三者充分混合，彼此之间发生疏水相互作用；(3)通过纳米沉淀法将所述混合物在超声下滴加到水溶液中，在扩散进入水相时合成载药纳米颗粒；(4)对上述载药纳米粒子进行分离纯化，干燥备用。

Description

一种集荧光成像与载药一体化的稀土上转换纳米药物载体的 制备方法
技术领域
本发明涉及一种纳米药物载体的制备方法，具体涉及一种能同时进行荧光成像和包载抗肿瘤药物的稀土上转换纳米药物载体的简易制备方法，属于纳米生物医学领域。
背景技术
恶性肿瘤是影响人类健康的主要疾病之一，目前，化疗、手术、放疗是治疗癌症的三大手段。化疗具体指用化学药物治疗恶性肿瘤，进入人体后迅速分布到全身，是一种全身治疗。由于传统的化疗药物不具有明显的靶向性，因此杀死肿瘤细胞的同时，也会损伤人体正常细胞、组织、器官，产生明显的毒副作用，使人体免疫力下降。同时，传统的化疗药物还存在代谢快、易产生耐药性等问题。
随着纳米技术的快速发展，纳米药物载体由于尺寸小、毒性低、比表面积大、物理化学稳定性好等优点在肿瘤诊断和治疗方面逐渐受到关注。纳米药物载体可以延长药物半衰期、增加血液循环时间、提高吸收率、增加特异性和靶向性，利用实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR效应)使药物富集在肿瘤部位并实现药物可控释放，有助于提高药效，降低毒副作用。目前被用作纳米药物载体的材料主要有脂质体、树枝状纳米材料、聚合物纳米材料、高分子胶束、碳纳米管、介孔二氧化硅等，但这些药物载体只能用于肿瘤治疗，而不具有诊断功能，只有利用共价结合或物理吸附等方式将荧光标记物或造影剂修饰到其表面形成复合型纳米材料，才能实现成像介导的诊断与治疗一体化，精确定位肿瘤、及早实施高效治疗。
近年来发展的稀土上转换纳米材料(UCNPs)由于具有生物毒性低、穿透深度大、光损伤小、荧光背景低、信噪比高等优点，是具有良好应用前景的生物标记材料，即一种新型的荧光探针，可以克服传统荧光染料易光漂白、不稳定、背景荧光干扰大等固有缺点，和细胞毒性较大的量子点相比，上转换纳米粒子生物毒性更低。同时，上转换纳米材料还可以包载抗肿瘤药物用于药物载体，包载方式主要有形成疏水口袋结构包载药物、表面修饰介孔二氧化硅包载药物、形成中空孔道结构包载药物等。文献(Kang,X.；Cheng,Z.；Li,C.；Yang,D.；Shang,M.；Ma,P.；Li,G.；Liu,N.；Lin,J.Core–shell structured up-conversionluminescent and mesoporous NaYF4:Yb3+/Er3+@nSiO2@mSiO2nanospheres as carriersfor drug delivery.J.Phys.Chem.C 2011,115,15801-15811.)通过两步溶胶-凝胶法制备出介孔二氧化硅包覆的UCNPs，将消炎药布洛芬包载在介孔结构中，进行药物包载和释放。文献(Zhang,F.；Braun,G.B.；Pallaoro,A.；Zhang,Y.；Shi,Y.；Cui,D.；Moskovits,M.；Zhao,D.；Stucky,G.D.Mesoporous multifunctional upconversion luminescent andmagnetic"nanorattle"materials for targeted chemotherapy.Nano Lett.2012,12,61-67.)通过表面保护的刻蚀和离子交换过程制备了一种纳米环状的核壳结构，外面是介孔结构，中间为中空结构，内部是实心核层，药物可以被包限在中空结构中。通常表面介孔结构对药物的固定性较差，药物容易从孔中泄露，需要在表面再修饰一层聚合物保护层(Lai,J.P.；Shah,B.P.；Zhang,Y.X.；Yang,L.T.；Lee,K.B.Real-time monitoring of ATP-responsive drug release using mesoporous-silica-coated multicolorupconversion nanoparticles.ACS Nano 2015,9,5234-5245.)。
但上述载药方法都需要多步反应和严格的条件控制，操作过程相对繁琐且耗时。此外，上转换纳米粒子经过多次处理增加了猝灭的几率，导致上转换发光效率降低。为了实现纳米载体在生物医学领域更广泛的应用，希望通过简单的合成方法制备基于上转换纳米材料的纳米药物载体，并应用于肿瘤诊断与治疗。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，一种集荧光成像与载药的稀土上转换纳米药物载体，主要包括：具有荧光成像功能的稀土上转换纳米粒子(UCNPs)，负载在上转换纳米粒子表面的抗肿瘤药物以及包覆在纳米粒子表面的两亲性聚合物分子二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)。
作为优选，所述稀土上转换纳米粒子的化学组成为NaYF4:Yb,Ln，Ln是Er或Tm，更优选为结晶度高、形貌均匀的六方相纳米晶。
作为优选，所述抗肿瘤药物为修饰了长链基团的药物前体，其中药物前体选自7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN38)和卡巴他赛药物(CTX)。单纯的药物前体不能和UCNPs的疏水层进行组装，可能和其自身的刚性平面结构有关，而修饰了长链后，具有高弹性可自由旋转，增强和油酸分子之间的疏水作用实现组装。另一方面，这些药物前体能溶解于水中。
其中，所述长链基团优选为长链烷基脂肪酸，所述脂肪酸可选择饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸，优选为不饱和脂肪酸，更优选为油酸、亚油酸或亚麻酸，最优选为亚油酸或亚麻酸。
所述前体药物结构式为(I-1)至(I-2)所述化合物之一：
Figure BDA0001202005560000021
Figure BDA0001202005560000031
所述两亲性聚合物分子二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)的分子量有750、2000、5000、10000等，优选为分子量2000，即DSPE-PEG2000。
选择两亲性分子DSPE-PEG来进行包覆，主要有以下优点：(1)DSPE-PEG是PEG化的磷脂分子，具有良好的水溶性和生物相容性，已被FDA批准用于人体；(2)DSPE-PEG的脂肪链和UCNPs表面的油酸分子、抗肿瘤药物的不饱和脂肪酸结构极为相似，易于通过疏水作用发生超分子组装，进行吸附；(3)纳米粒子表面修饰DSPE-PEG后形成一层亲水层，避免疏水纳米粒子表面和网状内皮系统(RES)细胞通过非特异性疏水作用而被RES细胞摄取、清除，进而延长了在血液循环中的半衰期和提高稳定性，有利于通过EPR效应实现药物被动靶向。
另一方面，本发明提供了一种集荧光成像与载药一体化的稀土上转换纳米药物载体的简易制备方法，该制备方法操作工艺简单易行，成本低。
所述方法包括：
(1)利用稀土氯化物为原料，油酸为配体，油酸/1-十八烯为混合溶剂，采用高温溶剂热法合成油酸包裹的稀土上转换纳米粒子(OA-UCNPs)；
稀土氯化物优选为YCl3、YbCl3和ErCl3/TmCl3或其水合物。
(2)将所述上转换纳米粒子、DSPE-PEG2000、抗肿瘤药物分散在同一介质中，使用原位搅拌法使三者充分混合，彼此之间发生疏水相互作用；
具体地，先将三者分别分散在DMSO溶剂中，制备成母液，浓度分别为12mg/mL，100mg/mL，20mg/mL。按照一定比例混合，三者质量比OA-UCNPs：DSPE-PEG2000：抗肿瘤药物为10：(10～20)：(1～10)，进一步优选为10：20：1。混合后在室温下搅拌反应4h。
(3)通过纳米沉淀法将所述混合物在超声下滴加到水溶液中，在扩散进入水相时合成载药纳米颗粒；
(4)对上述载药纳米粒子进行分离纯化，干燥或分散在超纯水中。
作为优选，选择高速离心法进行分离提纯，转速15000g，时间10min。分离纯化步骤用于除去未和UCNPs作用包载的DSPE-PEG2000和抗肿瘤药物。
本发明还提供了一种集荧光成像与载药的稀土上转换纳米药物载体在制备抗癌药物及荧光成像方面的应用。本发明的纳米药物载体可以有效包载药物，并通过上转换荧光成像进行肿瘤诊断，利用被动靶向在肿瘤部位进行药物缓释和给药，同时实现对肿瘤的上转换荧光成像诊断和化疗治疗，解决单一纳米载体多功能化的问题。其中所述肿瘤包括乳腺癌、肠癌、肺癌、胃癌或宫颈癌。
作为优选，荧光成像选择外接的功率可调的980nm光纤偶合二极管激光器作为激发光源。
本发明的有益效果：通过单步合成法即可获得表面PEG化的稀土上转换纳米药物载体，合成工艺简单、成本低廉、效率高、适于大批量生产；本发明的稀土上转换纳米药物载体在水中具有良好的分散性，稳定性好；本发明将荧光探针和抗肿瘤药物实现一体化装载，在荧光成像指导下进行药物缓释和靶向给药，减小毒副作用，提高治疗的准确性。
附图说明
图1从左到右分别为实施例2中OA-UCNPs+DSPE-PEG2000+SN38前体药物1，OA-UCNPs+DSPE-PEG2000+SN38，SN38的DMSO溶液充分振摇后于超声下滴加入水中后的照片。
图2为实施例2制备的稀土上转换纳米药物载体(1@pUCNPs)(灰色实线)和不含药物的纳米颗粒(pUCNPs)(黑色虚线)以及DSPE-PEG2000包载SN38前体药物1(PEGylated 1)(黑色实线)的紫外-可见吸收曲线。
图3为UCNPs载药率与不同UCNPs/药物反应质量比的关系图，其中(a)中药物是SN38前体药物1，(b)中药物是CTX前体药物2。
图4为纳米粒子的透射电镜(TEM)照片(上)和高分辨透射电镜(HRTEM)照片(下)，(a)：实施例1制备的NaYF4:Yb,Er上转换纳米颗粒(OA-UCNPs)；(b)：DSPE-PEG2000包覆的NaYF4:Yb,Er上转换纳米颗粒(pUCNPs)；(c)：实施例2制备的稀土上转换纳米药物载体(1@pUCNPs)。黑色和白色比例尺分别表示100nm和5nm。
图5为实施例1制备的稀土上转换纳米颗粒(OA-UCNPs)和实施例2制备的稀土上转换纳米药物载体(1@pUCNPs)以及不含药物的纳米颗粒(pUCNPs)的动态光散射粒径分布图(a)和zeta电位图(b)，图中，dh表示粒子在溶剂中的动态光散射粒径，PDI为多分散指数。
图6为实施例1制备的稀土上转换纳米颗粒(OA-UCNPs)和实施例2制备的稀土上转换纳米药物载体(1@pUCNPs)以及不含药物的纳米颗粒(pUCNPs)在980nm光源激发下的上转换荧光光谱比较，其中UCNPs的浓度均为1.5mg/mL，OA-UCNPs分散在环己烷中，后两者分散在水中。
图7为实施例2制备的稀土上转换纳米药物载体(1@pUCNPs)在37℃，0.2％Tween80释放介质中的药物累积释放曲线。
图8为实施例2制备的稀土上转换纳米药物载体(1@pUCNPs)和Bcap-37细胞孵育共培养4h后的共聚焦成像照片。(a)中绿色荧光和红色荧光通道均为UCNPs的荧光；(b)中UCNPs通道选择的是红色波段的上转换荧光。
图9为实施例2制备的稀土上转换纳米药物载体(1@pUCNPs)在活体水平上的抗肿瘤效果评价，(a)：乳腺癌Bcap37细胞荷瘤裸鼠经不同药物处理后的肿瘤体积变化曲线；(b)：荷瘤裸鼠经不同药物处理后第24天的肿瘤质量。
图10为不同药物处理对乳腺癌Bcap-37细胞荷瘤裸鼠体重变化影响图。
图中，1表示修饰了亚麻酸的7-乙基-10-羟基喜树碱，2表示修饰了亚麻酸的卡巴他赛，Saline表示生理盐水，SN38表示7-乙基-10-羟基喜树碱，CPT-11表示伊立替康。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明不限于此。
实施例1稀土上转换纳米粒子(UCNPs)的合成
准确称取六水合氯化钇(YCl3·6H2O)(0.2366g，0.78mmol)，六水合氯化镱(YbCl3·6H2O)(0.0775g，0.20mmol)和无水氯化铒(ErCl3)(0.0055g，0.02mmol)加入至100mL圆底烧瓶中，再加入6mL OA和15mL 1-ODE，充分混合搅拌。N2保护下升温至100℃除O2和H2O，继续升温至160℃反应40min至反应物完全溶解，得到浅黄色透明澄清溶液，冷却至室温。另称取NH4F 0.1482g(4mmol)和NaOH 0.1g(2.5mmol)溶于10mL甲醇中，超声分散，剧烈搅拌下逐滴加入到之前冷却溶液中。升温至50℃，搅拌1h，然后升温至100℃，除甲醇和水。待甲醇挥发完全后，N2保护下加热至300℃反应1.5h。冷却至室温，加入大量乙醇，4320g离心8min。沉淀用环己烷分散后，加乙醇离心，如此用环己烷与乙醇反复洗涤三次，抽真空干燥。
将适量制备的稀土上转换纳米粒子NaYF4:Yb,Er分散在环己烷溶液中，球状滴加到铜网上，分别在透射电镜(TEM)和高分辨透射电镜(HRTEM)下观察。由图4(a)可见，制备的上转换纳米粒子尺寸均一，粒径为44.0±1.7nm。HRTEM图中可以看到清晰的晶格条纹，表明纳米粒子具有良好的结晶度，图中标示的间距0.518nm的晶面对应六方晶型NaYF4:Yb,Er的(100)晶面。
实施例2纳米沉淀法制备稀土上转换纳米药物载体
将上转换纳米粒子(OA-UCNPs)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)、亚麻酸修饰的SN38前体药物1分别超声分散在DMSO溶液中，浓度分别为12mg/mL、100mg/mL、20mg/mL。将三种分散液充分混合，室温下缓慢振荡4h，然后在超声下逐滴加入超纯水中，继续振摇30min。离心(15000g，10min)，弃去上清液。沉淀经洗涤离心两次后，冷冻干燥过夜。作为对照，将OA-UCNPs、DSPE-PEG2000、单纯SN38分子的DMSO溶液混合振荡，超声下滴加到超纯水中。用同样的方法制备亚麻酸修饰的卡巴他赛前体药物2的稀土上转换纳米载体。负载两种药物的纳米载体分别表示为1@pUCNPs和2@pUCNPs。
如图1所示，OA-UCNPs+DSPE-PEG2000+1混合制备纳米药物得到澄清的胶体溶液，而OA-UCNPs+DSPE-PEG2000+SN38混合滴入水中出现白色浑浊，和单纯SN38滴入水中现象一致，表明SN38未被包载，说明单纯不修饰长链烷基的药物前体不能和UCNPs的疏水层进行组装，可能和其自身的刚性平面结构有关，而修饰了长链后，具有高弹性可自由旋转，增强和油酸分子之间的疏水作用实现组装。
包载前药1的上转换纳米药物载体的紫外-可见吸收光谱如图2所示，在367nm处有明显的SN38特征吸收峰，与只有DSPE-PEG2000包覆前药1形成的纳米粒子(PEGylated 1)的吸收峰基本重叠，表明UCNPs不会对SN38吸收峰造成影响，可以用此特征吸收峰来定量1@pUCNPs中的活性SN38含量。
实施例3实施例2中稀土上转换纳米药物载体药物包载率测定
固定OA-UCNPs和DSPE-PEG2000的量(质量比1：2)，加入不同质量的前药1，进行充分包载后，通过紫外可见吸收光谱(367nm吸收峰)测定装载到UCNPs上的药物1的量，计算载药率。用相似的方法测定前药2的载药量。由于卡巴他赛的摩尔吸光系数较小，UCNPs吸收峰会影响其测定，因此收集离心上清液和洗液，测定未被包载的2来间接测定药物包载，其中紫外特征吸收峰是274nm，同时扣除相同波长处DSPE-PEG2000的吸收。平行测定三次。
图2是药物包载率测定结果，当药物/UCNPs的投料质量比为1时，达到SN38前药1的饱和载药率，约为12.3％。而卡巴他赛前药2载药率为18.9％。为了确保前药能被完全包载如UCNPs中，以下实施例中使用的OA-UCNP/DSPE-PEG2000/1的投料质量比固定为10：20：1。
实施例4实施例2中稀土上转换纳米药物载体的表征
采用透射电镜(TEM)和高分辨透射电镜(HRTEM)分别表征纳米粒子的形貌，制样时将纳米粒子分散在H2O中，液滴以球状滴加到铜网上，干燥后再电镜下观察，在视野范围内随机选取200个粒子进行粒径统计分析。粒子的动态光散射(DLS)粒径和zeta电位使用马尔文粒度分析仪测定。荧光光谱表征采用外接980nm固体激光器的荧光光谱仪表征。
pUCNPs、1@pUCNPs的TEM和HRTEM表征结果如图4所示。粒径分别为49.5±1.5nm和50.3±1.5nm，和OA-UCNPs相比，粒径增加了约5nm，表明成功包载了DSPE-PEG2000。DLS粒径分析结果和zeta电位表征结果如图5所示。OA-UCNPs在环己烷中的动力学直径为91.94nm，pUCNPs和1@pUCNPs在水中的动力学直径分别为113.0nm和119.7nm，DLS峰形尖锐，表明没有明显的团聚，增加的粒径与DSPE-PEG2000的水化层尺寸相符合。pUCNPs和1@pUCNPs的zeta电位分别为-6.28mV和-5.79mV，由于DSPE-PEG2000中存在PO4 -，电位稍微偏负，但数值小，表面电荷对载体运输过程影响较小。
图6比较了上述纳米药物载体(1@pUCNPs)和实施例1制备的稀土上转换纳米颗粒(OA-UCNPs)以及不含药物的纳米颗粒(pUCNPs)在980nm光源激发下的上转换荧光光谱，相较于相同浓度OA-UCNPs环己烷分散液的荧光光谱，1@pUCNPs在水中的荧光光谱弱了一半，这是因为水对980nm的激发光有吸收，另外水分子的高能振动会加强Er3+的非辐射弛豫过程从而导致荧光猝灭，但是上述纳米药物载体的荧光强度仍然能够满足成像的需求。
实施例5实施例2中稀土上转换纳米药物载体药物释放速率测定
将实施例2中制备的含0.2mg/mL前药1的纳米载体装入透析袋中(截留分子量3500Da)，密封后放入一定体积0.2％吐温80溶液中，置于恒温摇床，37℃下缓慢振摇。在预先设定的时间点，取出1mL透析袋外部的释放液，并补充等量的0.2％吐温80溶液。采用紫外吸收法测定367nm的特征吸收来定量释放的活性SN38，计算释放效率，平行测定三次。
图7显示制备的稀土上转换纳米药物载体(1@pUCNPs)在37℃，0.2％Tween 80释放介质中的药物累积释放结果，曲线表明药物释放速率较慢，96h时累计释放效率约为36％，有利于持续释放保持药效。
实施例6实施例2中稀土上转换纳米药物载体体外细胞毒性评价
将处于对数生长期的细胞接种于96孔板中(5000个细胞/孔)，37℃、5％CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养24h，吸弃培养液，每孔加入100μL含不同浓度下列物质的培养基，分别是pUCNPs、CPT-11，SN38，PEGylated 1和1@pUCNPs，以CPT-11、SN38、PEGylated1作为对照，每种药每个浓度设置4个复孔，加完药后在细胞培养箱中继续培养48或72h。弃去培养液，每孔加入100μL CCK-8溶液(母液用新鲜培养基稀释10倍)，继续培养30min至2h，用酶标仪检测450nm处各孔的吸光度，计算细胞存活率，绘制细胞存活曲线，得到药物对细胞生长的IC50(半数抑制浓度)。稀土上转换纳米药物载体1@pUCNPs对各种肿瘤细胞的体外毒性结果见表1。
表1各试验药物的体外毒性评价结果(μM)
Figure BDA0001202005560000081
由表1可见，稀土上转换纳米药物载体1@pUCNPs和细胞孵育48h后，对乳腺癌细胞系Bcap-37的IC50值为2.24±0.25μM，其抗肿瘤活性是CPT-11的26倍；对宫颈癌细胞系HeLa的IC50值为5.85±1.96μM，其抗肿瘤活性是CPT-11的9倍；对肺癌细胞系A549的IC50值为0.76±0.09μM，其抗肿瘤活性是CPT-11的45倍；对胃癌细胞系SGC-7901的IC50值为10.81±2.83μM，其抗肿瘤活性是CPT-11的16倍。1@pUCNPs和细胞孵育72h后，对四种细胞的存活率影响更明显。其中对乳腺癌细胞系Bcap-37的IC50值为0.23±0.05μM，其抗肿瘤活性是CPT-11的122倍；对宫颈癌细胞系HeLa的IC50值为1.69±0.34μM，其抗肿瘤活性是CPT-11的18倍；对肺癌细胞系A549的IC50值为0.16±0.03μM，其抗肿瘤活性是CPT-11的52倍；对胃癌细胞系SGC-7901的IC50值为1.75±0.33μM，其抗肿瘤活性是CPT-11的22倍。
细胞毒性结果表明，稀土上转换纳米药物载体1@pUCNPs具有比CPT-11更明显的诱导肿瘤细胞凋亡的能力，和单纯SN38以及SN38-PEG组装成的纳米粒有类似的抗肿瘤效果，表明1@pUCNPs可以有被细胞有效摄取，并释放活性SN38分子。
实施例7实施例2中稀土上转换纳米药物载体的成像性能和细胞摄取行为
为评价上转换纳米药物载体在细胞水平上的成像性能以及考察细胞对上述载体的摄取行为，使用共聚焦激光扫描荧光显微镜(CLSM)进行观察研究。将贴壁后的Bcap-37和含1@pUCNPs(UCNPs等效浓度100μg/mL)的培养基、FITC-dextran复合物(终浓度0.1mg/mL)一起培养4h。用PBS清洗3次除去过量的UCNPs和FITC-dextran，用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20min，再用PBS充分洗涤，细胞核用Hoechst 33258(20μg/mL)染色15min。再次用PBS充分洗涤，加入1.5mL PBS在CLSM下观察荧光成像。波长参数选择：Hoechst：405nm波长激发，425-475nm波长范围收集；FITC-dextran：488nm激发，500-600nm范围收集；UCNPs：980nm激发，分别在495-550nm和575-650nm收集绿色荧光和红色荧光。
制备的纳米药物载体和Bcap-37细胞孵育的共聚焦成像结果如图8所示。图8(a)中显示了细胞中明亮的绿色和红色上转换荧光，两者叠加为黄色，表明1@UCNPs可以被细胞有效摄取。为了进一步研究内吞方式，使用FITC-葡聚糖一起培养，溶酶体摄取FITC-葡聚糖，从而被荧光标记，图8(b)中显示1@pUCNPs的荧光(红色小点)和FITC-葡聚糖的荧光(绿色小点)部分重叠，表明1@pUCNPs通过溶酶体胞吞作用被细胞摄取，而仍有一些未重叠则是因为药物被胞吞后已从溶酶体中释放。
结果表明上述上转换纳米药物载体可以有效地被细胞胞吞，同时可借助其上转换荧光观察胞吞过程。
实施例8实施例2中稀土上转换纳米药物载体体内抗肿瘤能力
在BALB/c裸鼠的乳腺部位原位移植Bcap-37肿瘤，当肿瘤平均体积达到～70mm3时，每隔一天(以第一次注射为第0天)通过尾静脉分别注射生理盐水、pUCNPs(30mg/kg)、CPT-11(等效SN38 10mg/kg)和1@pUCNPs(等效SN38 10mg/kg)水溶液，共给药3次，每4天测量一次小鼠体重和肿瘤尺寸，计算肿瘤体积：(长度×宽度2)/2。给药后第24天处死所有小鼠，取出肿瘤，称重。
图9(a)显示了乳腺癌Bcap-37细胞荷瘤裸鼠经药物处理后肿瘤体积随时间的变化。1@pUCNPs给药组的肿瘤生长得到了明显减缓，用药后第24天，肿瘤生长抑制率达到61％，和生理盐水组相比，两者存在极显著性差异(n＝6，p<0.001)，而CPT-11给药组的肿瘤抑制效率仅为14％，和生理盐水组不存在显著性差异(n＝6,p>0.05)。图9(b)为荷瘤裸鼠自第一次给药后第24天的肿瘤质量比较，1@pUCNPs给药组肿瘤平均质量明显小于CPT-11给药组，两者存在显著性差异(n＝6，p<0.05)。
图10显示药物处理对小鼠体重的影响，给药初期1@pUCNPs组体重略有下降，但后期体重增加直至和对照组保持相同的生长趋势，表明1@pUCNPs对动物无明显毒性。
结果表明，上述稀土上转换纳米药物载体具有明显的肿瘤生长抑制效果，且无明显的毒性，有良好的抗肿瘤应用价值。

Claims (7)

1.一种集荧光成像与载药的稀土上转换纳米药物载体的制备方法，包括：
（1）利用稀土氯化物为原料，油酸为配体，油酸/1-十八烯为混合溶剂，采用高温溶剂热法合成油酸包裹的稀土上转换纳米粒子（OA-UCNPs）；
（2）将所述上转换纳米粒子、DSPE-PEG2000、抗肿瘤药物分散在同一介质中，使用原位搅拌法使三者充分混合，彼此之间发生疏水相互作用；
（3）通过纳米沉淀法将所述混合物在超声下滴加到水溶液中，在扩散进入水相时合成载药纳米颗粒；
（4）对上述载药纳米粒子进行分离纯化，干燥备用；
其中步骤（2）所述抗肿瘤药物为修饰了长链基团的7-乙基-10-羟基-喜树碱药物前体和卡巴他赛药物前体中的一种或多种的组合，其中所述长链基团为长链烷基脂肪酸。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中所述长链基团为油酸、亚油酸或亚麻酸。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述稀土上转换纳米粒子的化学组成为NaYF4:Yb,Ln，Ln是Er或Tm。
4. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述油酸包裹稀土上转换纳米粒子是结晶度高、形貌均匀，粒径为42.3~45.6 nm的六方晶型纳米粒子。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，分散介质是DMSO，其中所述OA-UCNPs、DSPE-PEG2000、抗肿瘤药物三者混合质量比是10:20:1。
6. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述分离提纯在高速离心下进行分离，转速15000 g，时间10 min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述述长链基团为亚油酸或亚麻酸。
CN201710002330.8A 2017-01-03 2017-01-03 一种集荧光成像与载药一体化的稀土上转换纳米药物载体的制备方法 Expired - Fee Related CN106806906B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710002330.8A CN106806906B (zh) 2017-01-03 2017-01-03 一种集荧光成像与载药一体化的稀土上转换纳米药物载体的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710002330.8A CN106806906B (zh) 2017-01-03 2017-01-03 一种集荧光成像与载药一体化的稀土上转换纳米药物载体的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106806906A CN106806906A (zh) 2017-06-09
CN106806906B true CN106806906B (zh) 2020-05-19

Family

ID=59109881

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710002330.8A Expired - Fee Related CN106806906B (zh) 2017-01-03 2017-01-03 一种集荧光成像与载药一体化的稀土上转换纳米药物载体的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106806906B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111171820B (zh) * 2019-12-23 2021-12-21 华南师范大学 一种稀土氟化物上转换纳米晶体的刻蚀方法
CN113960004B (zh) * 2021-10-19 2023-04-21 福州市第二医院（福建省福州中西医结合医院、福州市职业病医院） 一种基于上转换荧光内滤效应检测Ni（Ⅱ）的方法
CN115651633A (zh) * 2022-09-27 2023-01-31 中国科学院宁波材料技术与工程研究所 一种x射线激发荧光成像的造影剂及其制备方法和应用
CN116924457B (zh) * 2023-08-15 2024-02-02 华中农业大学 改性ZnS纳米颗粒在制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102406951A (zh) * 2011-11-17 2012-04-11 苏州大学 一种巯基聚乙二醇修饰的光磁复合纳米材料及其应用
CN103804472A (zh) * 2014-01-23 2014-05-21 浙江大学 一种紫杉烷类药物前体
CN104447777A (zh) * 2014-11-26 2015-03-25 浙江大学 一种辣椒碱-喜树碱类抗癌药物偶联物及其制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102406951A (zh) * 2011-11-17 2012-04-11 苏州大学 一种巯基聚乙二醇修饰的光磁复合纳米材料及其应用
CN103804472A (zh) * 2014-01-23 2014-05-21 浙江大学 一种紫杉烷类药物前体
CN104447777A (zh) * 2014-11-26 2015-03-25 浙江大学 一种辣椒碱-喜树碱类抗癌药物偶联物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
17β-Estradiol-Loaded PEGlyated Upconversion Nanoparticles as a Bone-Targeted Drug Nanocarrier;Yan Hu et al;《ACS Appl. Mater. Interfaces》;20150702;第7卷;第15804页第2.3-2.4栏 *
A facile supramolecular approach to fabricate multifunctional upconversion nanoparticles as a versatile platform for drug loading, in vivo delivery and tumor imaging;Yingying Yuan et al;《J. Mater. Chem. B》;20170227;第25卷;第2425-2435页 *
Drug delivery with upconversion nanoparticles for multi-functional targeted cancer cell imaging and therapy;Chao Wang et al;《Biomaterials》;20101020;第32卷;第1110-1120页 *
PEG修饰NaGdF4∶Yb3+/Er3+纳米粒子合成及上转换发光性质;宣琎楠 等;《人工晶体学报》;20150831;第44卷(第8期);扉页，第2246-2249页 *
Self-Assembling Prodrugs by Precise Programming of Molecular Structures that Contribute Distinct Stability,Pharmacokinetics, and Antitumor Efficacy;Hangxiang Wang et al;《Adv. Funct. Mater.》;20150706;第25卷;摘要、图1 *
Yan Hu et al.17β-Estradiol-Loaded PEGlyated Upconversion Nanoparticles as a Bone-Targeted Drug Nanocarrier.《ACS Appl. Mater. Interfaces》.2015,第7卷 *
稀土上转换纳米颗粒制备及其在药物递送、成像及检测中的应用;袁莹莹;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》;20170815(第08期);第B020-114页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106806906A (zh) 2017-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tian et al. Engineered design of theranostic upconversion nanoparticles for tri-modal upconversion luminescence/magnetic resonance/X-ray computed tomography imaging and targeted delivery of combined anticancer drugs
Cui et al. Amphiphilic chitosan modified upconversion nanoparticles for in vivo photodynamic therapy induced by near-infrared light
Zhang et al. pH-Responsive metal–organic framework encapsulated gold nanoclusters with modulated release to enhance photodynamic therapy/chemotherapy in breast cancer
Hu et al. Real-time in vivo visualization of tumor therapy by a near-infrared-II Ag 2 S quantum dot-based theranostic nanoplatform
Xu et al. Charge convertibility and near infrared photon co-enhanced cisplatin chemotherapy based on upconversion nanoplatform
Zhou et al. Mesoporous NaYbF4@ NaGdF4 core-shell up-conversion nanoparticles for targeted drug delivery and multimodal imaging
Tian et al. TPGS-stabilized NaYbF4: Er upconversion nanoparticles for dual-modal fluorescent/CT imaging and anticancer drug delivery to overcome multi-drug resistance
Liu et al. Multifunctional NaYF 4: Yb, Er@ mSiO 2@ Fe 3 O 4-PEG nanoparticles for UCL/MR bioimaging and magnetically targeted drug delivery
CN106806906B (zh) 一种集荧光成像与载药一体化的稀土上转换纳米药物载体的制备方法
Yang et al. A core/shell/satellite anticancer platform for 808 NIR light-driven multimodal imaging and combined chemo-/photothermal therapy
CN107095859B (zh) 一种具有肿瘤细胞生物还原性微环境敏感的载药纳米胶囊及其制备方法
Gharehdaghi et al. Cu (II)-porphyrin metal–organic framework/graphene oxide: synthesis, characterization, and application as a pH-responsive drug carrier for breast cancer treatment
Liu et al. Degradable calcium phosphate-coated upconversion nanoparticles for highly efficient chemo-photodynamic therapy
Cai et al. Polypyrrole-coated UCNPs@ mSiO 2@ ZnO nanocomposite for combined photodynamic and photothermal therapy
CN112566663B (zh) 采用长波长光激发的三重态-三重态能量转移及其方法
Gao et al. AuNRs@ MIL-101-based stimuli-responsive nanoplatform with supramolecular gates for image-guided chemo-photothermal therapy
Xu et al. Bioresponsive upconversion nanostructure for combinatorial bioimaging and chemo-photothermal synergistic therapy
Wang et al. Lipid coated upconverting nanoparticles as NIR remote controlled transducer for simultaneous photodynamic therapy and cell imaging
Wang et al. One-step self-assembly of ZnPc/NaGdF 4: Yb, Er nanoclusters for simultaneous fluorescence imaging and photodynamic effects on cancer cells
Wang et al. One-pot synthesis of theranostic nanocapsules with lanthanide doped nanoparticles
Hou et al. A UCN@ mSiO 2@ cross-linked lipid with high steric stability as a NIR remote controlled-release nanocarrier for photodynamic therapy
Pu et al. Green synthesis of highly dispersed ytterbium and thulium co-doped sodium yttrium fluoride microphosphors for in situ light upconversion from near-infrared to blue in animals
Liang et al. Synthesis of NaYF4: Yb, Er upconversion nanoparticle-based optomagnetic multifunctional composite for drug delivery system
Wu et al. Efficient ROS activation by highly stabilized aqueous ICG encapsulated upconversion nanoparticles for tumor cell imaging and therapeutics
Wu et al. Tumor homing-penetrating and nanoenzyme-augmented 2D phototheranostics against hypoxic solid tumors

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20200519

Termination date: 20220103

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee