CN104740653B - 基于空心介孔硅‑dna复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于空心介孔硅‑DNA复合材料及其制备方法和应用，属于纳米生物医学领域。该方法是在Fe3O4纳米粒子上包覆硅壳，得到Fe3O4@nSiO2纳米粒子，将Fe3O4@nSiO2纳米粒子溶于混合溶剂中，然后加入正硅酸乙酯搅拌，得到反应产物，将反应产物溶解于丙酮溶液中脱去CTAB模板，然后用盐酸溶液刻蚀除去Fe3O4内核，得到空心介孔硅；将富C茎环结构DNA水溶液、盐酸胍溶液和乙醇溶液混合，得到混合溶液，将上述得到的空心介孔硅加入混合溶液中，在室温下反应1‑2h，得到空心介孔硅‑DNA复合材料。该制备方法简单，得到的空心介孔硅‑DNA复合材料具有高的生物相容性，并且可以作为药物载体使用。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物医学领域，具体涉及一种基于空心介孔硅-DNA复合材料及其制备方法和应用。
背景技术
至今为止，癌症依然是世界上最难攻克的重大疾病之一。尽管全世界对癌症的研究投入了大量精力及科研资金，癌症仍然是引起死亡的主要原因之一，并给社会经济带来巨大损失。近年来，多功能纳米治疗系统因为具有多重优异的性能而备受关注。它可以集成像，靶向，定位，可控药物释放等于一身，从而提高治疗效果。目前，多功能治疗体系成为癌症治疗和成像的热门。众多多功能体系被发明和报道，这些报道多集中于无机纳米粒子，如基于磁性纳米粒子、上转换纳米粒子、碲化镉量子点、金纳米粒子等，对其进行修饰，使其具有多功能化。
虽然在构建此系统方面取得了一定的进展，但大部分都是将具有不同功能的材料生硬的堆积在一起，复杂繁琐，并可能导致毒性问题。到目前为止，如何构建一个简单安全的多功能治疗系统依然是一个挑战。作为具有独特结构和多重性质的智能生物大分子，近年来，DNA已超出其自然角色，被应用于众多生物领域中。例如，它被开发应用于微型生物传感器，显微外科，纳米机器人，药物输送，动态的纳米材料等各种新型器件中。同时，其众多优异的性质还为应用于治疗领域提供了可能性：1)许多药物小分子可以与它结合，并具有序列选择性。2)它具有多种构象，且通过设计一定的序列，其能在某些刺激，如温度，质子浓度，金属离子，光或者磁场等控制下在两种或两种以上的构型之间变换。这为实现智能的结合和释放药物提供了可能性。3)通过“指数富集配体系统进化(SELEX)”法筛选出来的适配体DNA可以对特定的小分子，蛋白，细胞甚至器官具有靶向性，因而可用于靶向药物运载。4)许多荧光金属纳米簇可以DNA为模板合成，从而可用于生物成像。由于DNA拥有以上多种治疗相关的功能于一身，且本身具有优异的生物相容性，其有望被构建成一个简单，智能，安全的多功能治疗器件。
现有技术有报道过用介孔硅-DNA复合材料(The packaging of siRNA withinthe mesoporous structure of silica nanoparticles)，该文献中将DNA装载入介孔硅的孔道里，并用于基因治疗，但是目前为止还没有报道过将有功能的DNA纳米机器装载入空心介孔硅的空腔里，并将这一复合材料用于多功能药物载体。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种基于空心介孔硅-DNA复合材料及其制备方法和应用，该空心介孔硅-DNA复合材料能用于多功能药物载体及成像体系，实现癌症的治疗和成像。
本发明首先提供一种空心介孔硅-DNA复合材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：在Fe3O4纳米粒子上包覆硅壳，得到Fe3O4@nSiO2纳米粒子，将Fe3O4@nSiO2纳米粒子溶于混合溶剂中，然后加入正硅酸乙酯搅拌，得到反应产物，将反应产物溶解于丙酮溶液中，然后用盐酸溶液刻蚀除去Fe3O4内核，得到空心介孔硅；
步骤二：将富C茎环结构DNA水溶液、盐酸胍溶液和乙醇溶液混合，得到混合溶液，将步骤一得到的空心介孔硅加入混合溶液中，在室温下反应1-2h，得到空心介孔硅-DNA复合材料。
优选的是，所述的步骤一中混合溶剂为十六烷基三甲基溴化铵和乙醇的混合液。
优选的是，所述的步骤一中刻蚀温度为70-90℃，刻蚀时间为8-12h。
优选的是，所述的步骤二中富C茎环结构DNA水溶液、盐酸胍溶液和乙醇溶液的体积比为1：1：4。
优选的是，所述的步骤二中混合溶液的体积(μL)：空心介孔硅的质量(mg)为60：0.3。
本发明还提供上述制备方法得到的空心介孔硅-DNA复合材料。
本发明还提供空心介孔硅-DNA复合材料作为多功能药物载体的应用。
优选的是，所述的空心介孔硅-DNA复合材料作为多功能药物载体的方法为：将空心介孔硅-DNA复合材料与AgNO3溶液在0℃，黑暗环境下孵育2-3h，然后加入NaBH4，剧烈震荡2-4min，将得到的混合液在4℃静置24-48h，得到空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇，然后将药物加入空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇中，得到空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇-药物复合物。
优选的是，所述的空心介孔硅-DNA复合材料、AgNO3、NaBH4的质量比为1000:4.5:1。
本发明的有益效果
本发明首先提供一种空心介孔硅-DNA复合材料的制备方法，该制备方法是将富C茎环结构DNA引入空心介孔硅中，该制备方法简单，操作方便。
本发明还提供上述制备方法得到的空心介孔硅-DNA复合材料，该复合材料具有高的生物相容性，并且可以作为药物载体使用。
本发明还提供空心介孔硅-DNA复合材料的应用，该复合材料由于具有高的生物相容性，并且集中药物运载，pH控制的细胞成像以及药物释放监测过程到一个简单的DNA器件中，利用Ag纳米簇荧光的变化及药物荧光的叠加检测药物释放过程和进行细胞微环境成像，用于癌症的治疗及成像。
附图说明
图1为实施例1所用的富C茎环结构DNA在中性/酸性条件下药物的结合与释放的示意图；
图2为实施例1所用的富C茎环结构DNA在pH7.4或者pH5.0的UV热变性曲线图；
图3为实施例1所用的富C茎环结构DNA在pH7.4或者pH5.0的CD曲线图；
图4为当pH从7.4变到5.0时富C茎环结构DNA对Hoechst的结合与释放时的荧光变化图；
图5为在中性/酸性条件下DNA-Ag纳米簇荧光变化示意图；
图6为DNA-Ag纳米簇的透射电镜图；
图7为DNA-Ag纳米簇不同pH条件下的紫外-可见吸收光谱；
图8为DNA-Ag纳米簇在紫外平板下的荧光照片；
图9为实施例1得到的空心介孔硅的透射电镜图；
图10为空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇的透射电镜图；
图11为实施例4得到的空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇-药物复合物在pH7.4时的发射光谱；
图12为实施例4得到的空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇-药物复合物在pH5.0时的发射光谱；
图13为空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇-Hoechst和空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇-Hoechst与A549细胞孵育后的荧光显微镜成像图。
具体实施方式
本发明首先提供一种空心介孔硅-DNA复合材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤一：在Fe3O4纳米粒子上包覆硅壳，得到Fe3O4@nSiO2纳米粒子，将Fe3O4@nSiO2纳米粒子溶于混合溶剂中，然后加入正硅酸乙酯搅拌，得到反应产物，将反应产物溶解于丙酮溶液中，然后用盐酸溶液刻蚀除去Fe3O4内核，得到空心介孔硅；
步骤二：将富C茎环结构DNA水溶液、盐酸胍溶液和乙醇溶液混合，得到混合溶液，将步骤一得到的空心介孔硅加入混合溶液中，在室温下反应1-2h，得到空心介孔硅-DNA复合材料。
按照本发明，首先在Fe3O4纳米粒子上包覆硅壳，得到Fe3O4@nSiO2纳米粒子，所述的Fe3O4纳米粒子的直径优选为150-300nm，更优选为200nm，所述的Fe3O4纳米粒子的制备为本领域常用的制备方法，优选为水热法；所述的在Fe3O4纳米粒子上包覆硅壳优选通过碱性水解TEOS的方法，具体为将Fe3O4纳米粒子超声溶解于乙醇-水混合液中，所述的混合液中乙醇(ml):水(ml)为4:1，然后加入TEOS，Fe3O4纳米粒子与TEOS的质量比为1:60，最后加入氨水，氨水与混合液的体积比为1:10，超声2小时，得到产物Fe3O4@nSiO2纳米粒子。
按照本发明，将上述Fe3O4@nSiO2纳米粒子溶于混合溶剂中，然后加入正硅酸乙酯搅拌，得到反应产物，所述的混合溶剂优选为十六烷基三甲基溴化铵、乙醇和超纯水的混合液，所述的混合液中十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的质量(g)：乙醇的体积(ml)：超纯水的体积(ml)为0.3：60：80。所述的搅拌温度优选为室温，搅拌时间优选为5-7h，更优选为6h，所述的Fe3O4纳米粒子与正硅酸乙酯(TEOS)的质量比为1：60；得到的反应产物经分离、水洗干燥，将干燥的产物溶于丙酮溶液中脱去CTAB模板，然后用盐酸溶液刻蚀除去Fe3O4内核，得到空心介孔硅；所述的刻蚀温度优选为70-90℃，刻蚀时间优选为8-12h；所述的盐酸的浓度优选为2M。
按照本发明，将富C茎环结构DNA水溶液、盐酸胍溶液和乙醇溶液混合，得到混合溶液，将上述得到的空心介孔硅加入混合溶液中，在室温下反应1-2h，将得到的溶液离心，所述的离心转速优选为5000-6000rpm，离心后经沉淀、洗涤，得到空心介孔硅-DNA复合材料。
按照本发明，所述的富C茎环结构DNA序列为5’-CGT ATA TCC CTA ACC CTA ACCCTA ACC CTA TAT ACG，所述的富C茎环结构DNA水溶液、盐酸胍溶液和乙醇溶液的体积比优选为1：1：4。所述的混合溶液的体积(μL)：空心介孔硅的质量(mg)优选为60：0.3。
本发明还提供上述制备方法得到的空心介孔硅-DNA复合材料。
本发明还提供空心介孔硅-DNA复合材料作为多功能药物载体的应用，所述的空心介孔硅-DNA复合材料作为多功能药物载体的方法为：将空心介孔硅-DNA复合材料与AgNO3溶液在0℃，黑暗环境下孵育2-3h，然后加入NaBH4，剧烈震荡2-4min，将得到的混合液在4℃静置24-48h，得到空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇，然后将药物加入空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇中，得到空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇-药物复合物。所述的空心介孔硅-DNA复合材料、AgNO3溶液、NaBH4的质量比优选为1000:4.5:1。所述的药物与空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇的质量比优选为1：5000；所述的药物优选为可以结合在双链DNA上的潜在抗癌试剂，所述的潜在抗癌试剂优选为Hoechst33258(Hoechst)。
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明。
实施例1
在Fe3O4纳米粒子(直径200nm)通过碱性水解TEOS的方法包上一层薄的硅壳，得到Fe3O4@nSiO2，将Fe3O4@nSiO2纳米粒子分散在含有0.3gCTAB,60mL乙醇,以及80mL超纯水的混合液中，然后在剧烈搅拌的条件下加入0.2mLTEOS，在室温下保持剧烈搅拌，反应5h，通过磁分离收集产品，用乙醇洗3次，然后在60℃真空干燥箱中干燥，干燥后的产品在丙酮溶液中脱去CTAB模板，最后，Fe3O4内核用2M的HCl溶液在70℃下回流12h刻蚀除去，得到空心介孔硅；
将10μL的富C茎环结构DNA(序列为5’-CGT ATA TCC CTA ACC CTA ACC CTA ACCCTA TAT ACG)水溶液，10μL4M盐酸胍溶液以及40μL的乙醇溶液混合，向其中加入0.3mg空心介孔硅，混合液在25℃，振荡反应1h，最终得到的溶液在5000rpm的转速下离心，经沉淀、洗涤，得到空心介孔硅-DNA复合材料。
实施例1得到的空心介孔硅的透射电镜图如图9所示，其中图A是200nm标尺下的透射电镜照片，图B是50nm标尺下的透射电镜照片。
实施例1所用的富C茎环结构DNA在中性/酸性条件下药物的结合与释放的示意图如图1所示，富C茎环结构DNA在pH7.4或者pH5.0的UV热变性曲线如图2所示，富C茎环结构DNA在pH7.4或者pH5.0的CD曲线如图3所示，从图1-3可以看出，该富C茎环结构DNA在中性条件下是双链构象，而在酸性条件下构象发生转变，变成四链构象，茎环结构打开，这为药物可控释放提供了基础。
将实施例1所用的富C茎环结构DNA在pH7.4的10-25mM磷酸缓冲液中将潜在抗癌药物Hoechst加入其中，使其结合在DNA上，随后将溶液pH值调到酸性，考察药物的释放情况，图4为当pH从7.4变到5.0时富C茎环结构DNA对Hoechst的结合与释放时的荧光变化图，从图4可以看出，荧光的变化可以看出药物的释放。
将实施例1所用的富C茎环结构DNA与AgNO3溶液在0℃，黑暗环境下孵育2-3h，然后加入NaBH4，剧烈震荡2-4min，将得到的混合液在4℃静置24-48h，得到DNA-Ag纳米簇。对于茎环结构DNA保护的Ag纳米簇，环区碱基数/Ag+为1.8，而NaBH4/Ag+为1；对于以非茎环结构DNA为模板合成Ag纳米簇，其碱基数/Ag+为2，NaBH4/Ag+为1。实验在磷酸盐-醋酸(PBS-HAc)缓冲液中进行。图6为DNA-Ag纳米簇的透射电镜图，图6可以看出，Ag纳米簇可以被成功合成，大小为1-2nm。图5为在中性/酸性条件下DNA-Ag纳米簇荧光变化示意图，图7为DNA-Ag纳米簇不同pH条件下的紫外-可见吸收光谱；图8为DNA-Ag纳米簇在紫外平板下的荧光照片，从图5、7、8可以看出，当溶液从中性变到酸性时，Ag纳米簇的荧光有增强的现象。
实施例2
在Fe3O4纳米粒子(直径200nm)通过碱性水解TEOS的方法包上一层薄的硅壳，得到Fe3O4@nSiO2，将Fe3O4@nSiO2纳米粒子分散在含有0.3gCTAB,60mL乙醇,以及80mL超纯水的混合液中，然后在剧烈搅拌的条件下加入0.2mLTEOS，在室温下保持剧烈搅拌，反应6h，通过磁分离收集产品，用乙醇洗4次，然后在60℃真空干燥箱中干燥，干燥后的产品在丙酮溶液中脱去CTAB模板，最后，Fe3O4内核用2M的HCl溶液在80℃下回流10h刻蚀除去，得到空心介孔硅；
将10μL的富C茎环结构DNA(序列为5’-CGT ATA TCC CTA ACC CTA ACC CTA ACCCTA TAT ACG)水溶液，10μL4M盐酸胍溶液以及40μL的乙醇溶液混合，向其中加入0.3mg空心介孔硅，混合液在25℃，振荡反应1h，最终得到的溶液在6000rpm的转速下离心，经沉淀、洗涤，得到空心介孔硅-DNA复合材料。
实施例3
在Fe3O4纳米粒子(直径200nm)通过碱性水解TEOS的方法包上一层薄的硅壳，得到Fe3O4@nSiO2，将Fe3O4@nSiO2纳米粒子分散在含有0.3gCTAB,60mL乙醇,以及80mL超纯水的混合液中，然后在剧烈搅拌的条件下加入0.2mLTEOS，在室温下保持剧烈搅拌，反应7h，通过磁分离收集产品，用乙醇洗5次，然后在60℃真空干燥箱中干燥，干燥后的产品在丙酮溶液中脱去CTAB模板，最后，Fe3O4内核用2M的HCl溶液在90℃下回流8h刻蚀除去，得到空心介孔硅；
将10μL的富C茎环结构DNA(序列为5’-CGT ATA TCC CTA ACC CTA ACC CTA ACCCTA TAT ACG)水溶液，10μL4M盐酸胍溶液以及40μL的乙醇溶液混合，向其中加入0.3mg空心介孔硅，混合液在25℃，振荡反应2h，最终得到的溶液在5000rpm的转速下离心，经沉淀、洗涤，得到空心介孔硅-DNA复合材料。
实施例4
将实施例1得到的1000g空心介孔硅-DNA复合材料与4.5gAgNO3溶液在0℃，黑暗环境下孵育2-3h，然后加入1gNaBH4，剧烈震荡2-4min，将得到的混合液在4℃静置24-48h，得到空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇，然后在中性磷酸缓冲液中将0.2g潜在抗癌药物Hoechst加入其中，使其结合在DNA上，得到的复合物离心清洗，得到空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇-药物复合物；
图10为空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇的透射电镜图，其中图A是50nm标尺下的透射电镜照片，图B是5nm标尺下的透射电镜照片。从图10可以看出，Ag纳米簇成功的生长在空心介孔硅的空腔里。
图11为实施例4得到的空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇-药物复合物在pH7.4时的发射光谱，图12为实施例4得到的空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇-药物复合物在pH5.0时的发射光谱。从图11和12可以看出，在酸性条件下体系荧光有明显的变化，这一变化为用于检测药物释放过程及细胞内成像奠定了基础。
实施例5
细胞培养：将人肺腺癌细胞(A549)在Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中培养，用10％(v/v)胎牛血清(Gibco)做补充液。将细胞保持在37℃下，含有5％CO2的湿润空气气氛中孵育备用。将实施例1得到的空心介孔硅-DNA复合材料或实施例4得到的空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇-药物复合物分别加入加入细胞培养液中，与细胞一同孵育3-4h，用PBS洗涤细胞，进行荧光成像。通过体系荧光的变化进行细胞微环境成像及监测药物释放过程。
图13为空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇-Hoechst和空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇-Hoechst与A549细胞孵育后的荧光显微镜成像图，其中图A为空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇-Hoechst的荧光显微镜成像图，图B为空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇-Hoechst与A549细胞孵育后的荧光显微镜成像图，其中图A和B中，图a为Ag纳米簇，图b为Hoechst，图c为绿色荧光溶酶体追踪剂，图d为重叠图，从图13可以看出，由于材料荧光与溶酶体追踪剂荧光重叠，因此可以推断该复合材料是通过溶酶体途径进入细胞，而与单独的Ag纳米簇的荧光比，该材料的荧光明显增强，说明溶酶体的酸性环境确实能对其荧光有增强的效果。与此同时，药物荧光明显的转移到细胞核内，因此可以说明，该体系可以成功的释放出来药物。
Claims (7)
1.一种空心介孔硅-DNA复合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：在Fe3O4纳米粒子上包覆硅壳，得到Fe3O4@nSiO2纳米粒子，将Fe3O4@nSiO2纳米粒子溶于混合溶剂中，然后加入正硅酸乙酯搅拌，得到反应产物，将反应产物溶解于丙酮溶液中，然后用盐酸溶液刻蚀除去Fe3O4内核，得到空心介孔硅；
步骤二：将富C茎环结构DNA水溶液、盐酸胍溶液和乙醇溶液混合，得到混合溶液，将步骤一得到的空心介孔硅加入混合溶液中，在室温下反应1-2h，得到空心介孔硅-DNA复合材料；
所述的步骤二中富C茎环结构DNA水溶液、盐酸胍溶液和乙醇溶液的体积比为1：1：4；
所述的步骤二中混合溶液的体积(μL)：空心介孔硅的质量(mg)为60：0.3。
2.根据权利要求1所述的一种空心介孔硅-DNA复合材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤一中混合溶剂为十六烷基三甲基溴化铵和乙醇的混合液。
3.根据权利要求1所述的一种空心介孔硅-DNA复合材料的制备方法，其特征在于，所述的步骤一中刻蚀温度为70-90℃，刻蚀时间为8-12h。
4.权利要求1-3任何一项所述的制备方法得到的空心介孔硅-DNA复合材料。
5.权利要求4所述的空心介孔硅-DNA复合材料作为多功能药物载体的应用。
6.根据权利要求4所述的空心介孔硅-DNA复合材料作为多功能药物载体的应用，其特征在于，所述的空心介孔硅-DNA复合材料作为多功能药物载体的方法为：将空心介孔硅-DNA复合材料与AgNO3溶液在0℃，黑暗环境下孵育2-3h，然后加入NaBH4，剧烈震荡2-4min，将得到的混合液在4℃静置24-48h，得到空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇，然后将药物加入空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇中，得到空心介孔硅-DNA-Ag纳米簇-药物复合物。
7.根据权利要求6所述的空心介孔硅-DNA复合材料作为多功能药物载体的应用，其特征在于，所述的空心介孔硅-DNA复合材料、AgNO3、NaBH4的质量比为1000:4.5:1。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |