CN107375241A - 一种用于肿瘤靶向传递的磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯药物载体的制备方法 - Google Patents

一种用于肿瘤靶向传递的磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯药物载体的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种用于肿瘤靶向传递的磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯药物载体的制备方法，属于纳米医药技术领域。首先盐酸阿霉素负载到纳米氧化石墨烯的表面上，形成纳米氧化石墨烯阿霉素复合物；其次通过大豆卵磷脂和叶酸聚乙二醇磷脂的自组装，包裹于纳米氧化石墨烯阿霉素复合物的表面上；最终得到具有靶向性的磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯阿霉素复合物。本发明采用磷脂膜对GO进行修饰，提高GO的生物相容性，降低细胞毒性，并且对其进行靶向修饰，用于药物的肿瘤靶向传递，不需要化学合成，制备方法简单，靶向修饰多样，药物载体载药量高达100wt％，具有广阔的应用前景。

Description

一种用于肿瘤靶向传递的磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯药物 载体的制备方法
技术领域
本发明涉及纳米氧化石墨烯Nano-Graphene Oxide(NGO)作为一种药物载体用于肿瘤靶向传递，属于纳米医药技术领域。
背景技术
癌症是最常见的威胁人类健康和生命的恶性疾病之一，患者平均年龄52.2岁，主要分布在30-35岁和50-55岁。化疗是目前癌症主要治疗手段之一。阿霉素(Doxorubicin,DOX)是目前临床常用的蒽环类抗肿瘤药物，然而该类药物毒性较大，长期应用可发生剂量依赖性的不可逆的心肌病变，骨髓抑制等，使其在临床的应用受到一定限制。叶酸受体FR是一种被锚定在细胞膜中甘油磷脂酰肌醇上的单链糖蛋白。FR在许多上皮源性和非上皮源性恶性肿瘤细胞显著高表达，例如宫颈癌细胞，卵巢癌细胞等，其表达水平大大高于正常细胞，具有组织特异性，这为靶向治疗提供了理论可能。
石墨烯(graphene)作为单原子层厚的二维纳米材料，自从2004年被发现以来引起了人们的广泛兴趣。氧化石墨烯(graphene oxide,GO)是石墨烯的氧化物，GO不仅具有石墨烯比表面积大、对不溶性的芳香类药物分子吸附能力强的优点，同时还表现出一些独特的性质，其富含羧基、羟基、环氧基等活性基团，因而在水中具有较好的分散性，也易于进一步化学修饰。因此，GO具有发展成为优良的生物医用材料的潜力。但是GO的生物相容性差，直接作为药物载体会产生明显的细胞毒性。目前，常用PEG对GO进行化学修饰，但是其过程繁琐，需要进行化学反应，并且效果也不尽如人意。
大豆卵磷脂SPC具有优越的生物相容性、生物可降解性、低毒性等特点。这些优良的生物特性使其被广泛地应用于脂质体等药物载体的制备，生物膜模拟等领域。其作为天然的由磷脂双分子层包裹而成的球形囊泡，具有低的免疫原性，因而构建磷脂膜功能化的纳米复合物具有广阔的应用前景。
本发明采用的一种抗肿瘤药物阿霉素(DOX)通过π-π堆垛的作用被装载于纳米尺度的氧化石墨烯(NGO)上，形成NGO/DOX复合物；利用大豆卵磷脂(SPC)和氧化石墨烯之间的相互作用，将SPC包裹于NGO的表面，然后用修饰有叶酸的聚乙二醇磷脂(FA-PEG2000-DSPE)对SPC@NGO/DOX表面进行修饰。由此获得的磷脂膜修饰的纳米药物FA-SPC@NGO/DOX，其在生理环境下具有很好的稳定性，并且具有特异性识别肿瘤细胞的功能，因此可以用于许多叶酸受体超表达的恶性肿瘤细胞，例如宫颈癌，卵巢癌等的靶向治疗。
本发明的有益效果为：FA-SPC@NGO/DOX药物载体载药量高达100wt％，远远高于其他传统药物载体，在磷脂膜的包被下，其生理稳定性和低免疫原性大大改善，并且载体通过靶向性修饰，提高药效，降低副作用。采用磷脂膜对GO进行修饰，提高GO的生物相容性，降低细胞毒性，并且对其进行靶向修饰，用于药物的肿瘤靶向传递，所采用的方法不需要化学合成，操作简单，靶向修饰多样，更适应临床运用。
发明内容
为了解决现有技术中没有兼备良好的生物相容性和生理稳定性的基于纳米氧化石墨烯药物递送系统，本发明提供了一种采用磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯用于药物的肿瘤靶向传递及其制备方法。
为了达到上述目的，本发明的技术方案：
一种用于肿瘤靶向传递的磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯药物载体，该药物载体的结构如下：首先盐酸阿霉素(DOX)负载到纳米氧化石墨烯(NGO)的表面上，形成纳米氧化石墨烯阿霉素复合物(NGO/DOX)；其次通过大豆卵磷脂(SPC)和叶酸聚乙二醇磷脂(FA-PEG-DSPE)的自组装，包裹于纳米氧化石墨烯阿霉素复合物的表面上；最终得到具有靶向性的磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯阿霉素复合物(FA-SPC@NGO/DOX)。
上述纳米氧化石墨烯药物载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)通过改进的Hummer’s方法制备纳米氧化石墨烯(NGO)
称取多层氧化石墨烯，将其分散于浓硫酸中，并于室温下充分搅拌后，加入高锰酸钾固体，继续搅拌20～40min；第一次加入去离子水后，将反应体系移入温度为90～105℃油浴中，反应0.5～1小时；第二次加入去离子水，待温度恒定后，加入质量分数为25～30％过氧化氢溶液，充分搅拌，在25～30℃下反应20～30min后，加入质量分数为10～12mol/LNaOH溶液调节pH，至溶液pH为7～8；最后采用透析方法纯化样品得到纳米氧化石墨烯。
所述的多层氧化石墨烯与浓硫酸的比例关系为：每10ml浓硫酸中加入0.4～0.5g的多层氧化石墨烯。所述的浓硫酸的质量百分数为95％～98％。
所述的多层氧化石墨烯与高锰酸钾的质量比为1:(3～4)，高锰酸钾固体添加过程中控制溶液的温度为10～20℃。
所述的第一次和第二次加入的去离子水与浓硫酸的体积关系为：每10ml浓硫酸对应的第二次加入的去离子水为15～20ml，第一次加入的去离子水为60～65ml。所述的过氧化氢溶液与高锰酸钾固体粉末的比例关系为：每1g高锰酸钾对应加入0.8～0.85ml过氧化氢溶液。
(2)负载阿霉素的纳米氧化石墨烯复合物(NGO/DOX)
室温下，将盐酸阿霉素与纳米氧化石墨烯以质量比3:1进行混合，搅拌10-15h后，进行离心水洗，除去游离的盐酸阿霉素，得到负载阿霉素的纳米氧化石墨烯复合物待用。根据预先绘制的阿霉素标准曲线，确定载药率为100％。
(3)将大豆卵磷脂和叶酸聚乙二醇磷脂同时包覆于步骤(2)得到的纳米氧化石墨烯复合物的表面上，制备得到磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯阿霉素复合物(FA-SPC@NGO/DOX)
将大豆卵磷脂和叶酸聚乙二醇磷脂按质量比(4～6)：1加入氯仿中，其中叶酸聚乙二醇磷脂的浓度为0.2～0.32mg/ml；加入步骤(2)得到的纳米氧化石墨烯复合物，使油相与水相的体积比达(3～4):1，22～26℃，进行超声及涡旋震荡后；将氯仿用氮气吹走，至形成稳定均匀的且有乳光的红色溶液，即得到产品磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯阿霉素复合物，产品保存于4℃，备用。
单独将大豆卵磷脂包覆于步骤(2)得到的纳米氧化石墨烯复合物的表面上；将大豆卵磷脂加入氯仿中，其中大豆卵磷脂的浓度为0.8～1.92mg/ml；再将其加入步骤(2)得到的纳米氧化石墨烯复合物，使油相与水相的体积比达(3～4):1，室温下22～26℃，进行超声及涡旋震荡后；将氯仿用氮气吹走，至形成稳定均匀的且有乳光的红色溶液，即得到产品磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯阿霉素复合物(SPC@NGO/DOX)作为后续实验的对照组，保存于4℃，备用。
本发明的有益效果为：增强了肿瘤细胞对阿霉素药物的摄取，并与此同时，降低了非肿瘤细胞对阿霉素药物的摄取，使得靶向性递送药物至肿瘤细胞得以实现。
附图说明
图1为NGO，DOX，NGO/DOX的红外光谱图。
图2为NGO/DOX，SPC@NGO/DOX，FA-SPC@NGO/DOX的红外光谱图。
图3为DOX，NGO/DOX，SPC@NGO/DOX，FA-SPC@NGO/DOX的荧光光谱图。
图4为NGO，SPC@NGO，FA-SPC@NGO在水中的粒径及电位图。
图5为FA-SPC@NGO在完全培养基中不同时间点的粒径及电位图。
图6为FA-SPC@NGO/DOX在完全培养基中的粒径分布图。
图7为FA-SPC@NGO/DOX的透射电镜图。
图8为FA-SPC@NGO/DOX的体外药物释放图。
图9为FA-SPC@NGO/DOX的叶酸受体靶向实验图。
图10为FA-SPC@NGO/DOX和SPC@NGO/DOX的细胞摄取实验图。
图11为NGO，SPC@NGO和FA-SPC@NGO对293T细胞毒性图。
图12为NGO，SPC@NGO和FA-SPC@NGO对Hela细胞毒性图。
图13为NGO，DOX，NGO/DOX，FA-SPC@NGO/DOX对Hela细胞毒性图。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
本发明使用的主要细胞和试剂：人宫颈癌细胞株Hela，胎牛血清、双抗(青霉素/链霉素)，RPMI 1640培养基，大豆卵磷脂，叶酸聚乙二醇磷脂，氧化石墨烯，盐酸阿霉素。
实施例1
(1)通过改进的Hummer’s方法制备纳米氧化石墨烯(NGO)
首先称取1g多层氧化石墨烯，将其分散于23mL质量分数为98％的浓硫酸中并于室温下，充分搅拌；然后将其置于冰浴中，分步向其中加入3g高锰酸钾固体，并保证整个添加过程中溶液的温度不超过20℃，并继续搅拌30min。向其中加入45mL去离子水后体系温度迅速升高，将反应体系移入90℃油浴中，反应0.5h再向其中加入140mL去离子水，恒温后再加入2.5mL 30％的过氧化氢溶液并室温25℃搅拌30min，在反应结束后加入10mol/L NaOH溶液调节pH到7。最后采用透析方法纯化样品。
(2)负载阿霉素的纳米氧化石墨烯复合物(NGO/DOX)
取1mg的氧化石墨烯分散在3mL去离子水中，加入1.5mg/ml的盐酸阿霉素2mL，避光搅拌10h，反复离心水洗，除去游离的阿霉素。取一定体积上层清液，测定其吸光度，利用标准曲线计算上清液中药物的浓度，离心后的下层物质重新分散在水中。
(3)将大豆卵磷脂和叶酸聚乙二醇磷脂同时包覆于步骤(2)得到的纳米氧化石墨烯复合物的表面上，制备得到磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯阿霉素复合物(FA-SPC@NGO/DOX)及其对照组(SPC@NGO/DOX)。
取3.2mg的大豆卵磷脂，0.64mg的叶酸聚乙二醇磷脂溶于2.4mL的氯仿中(MSPC：MFA-PEG-DSPE＝5:1)，加入800ul载药率为100％的NGO/DOX复合物，使油相与水相比达3:1，反复进行超声处理及涡旋震荡处理，使体系成为均一的橘红色乳状液。然后向反应体系内通入氮气，将氯仿吹走，直至形成稳定均匀的且有乳光的红色溶液。从图1-7的检测结果显示，清楚地表明成功制备了FA-SPC@NGO/DOX，以及得到的纳米药物具有良好的粒径和生理环境稳定性。游离的DOX和未结合氧化石墨烯的大豆卵磷脂使用Amicon离心超滤管(MWCO 100kDa)除去，得到的FA-SPC@NGO/DOX保存于4℃，备用。
对比例1
(1)通过改进的Hummer’s方法制备纳米氧化石墨烯(NGO)，具体步骤与实施例1相同。
(2)负载阿霉素的纳米氧化石墨烯复合物(NGO/DOX)，具体步骤与实施例1相同。
(3)单独将大豆卵磷脂包裹于NGO/DOX产品的表面上作为对照组，仍然采用上述所述方法。游离的DOX和未结合氧化石墨烯的大豆卵磷脂使用Amicon离心超滤管(MWCO100kDa)除去，得到的SPC@NGO/DOX保存于4℃，备用。
实施例1制备得到的产品的性能测试
(1)FA-SPC@NGO/DOX的体外药物释放实验
通过模拟体内微环境来研究构建的纳米药物控释体系在不同的生理环境下，其对药物的负载稳定性及释放情况。将载药纳米颗粒(FA-SPC@NGO/DOX)分散在不同pH值(pH＝5.3，6.5，7.4)下的4mL磷酸盐缓冲液中，于37℃恒温震荡箱中进行药物释放。每隔一段时间取10uL释放液，测其吸光度，并补充相同体积相同温度的缓冲溶液。并使用紫外-可见分光光度计测量其在490nm处的吸光值。根据事先绘制的药物浓度-吸光度标准曲线，计算该时刻的累积释放率。图8清楚地表明FA-SPC@NGO/DOX具有良好的pH依赖性的药物释放能力，以及持续给药的能力。
(2)FA-SPC@NGO/DOX的叶酸受体靶向实验
FA-SPC@NGO/DOX的叶酸受体靶向实验的具体步骤如下：将293T和Hela细胞(1×105个细胞/孔)接种在6孔板中。培养24h后，细胞与FA(5mg/mL)在4℃预培养2h，然后与FA-SPC@NGO/DOX(10μg/mL)继续孵育2小时。然后，取出培养基，用冷的PBS洗涤细胞2次。接下来，在37℃下用胰蛋白酶收集每个孔细胞，随后在RIPA裂解缓冲液中将细胞在超声波下裂解。将细胞裂解物以10000rpm离心15分钟。最后，使用酶标仪测定上清液中DOX的浓度。在595nm处测量上清液中的DOX的荧光强度，激发波长为480nm。通过减去空白细胞的背景信号将结果归一化。图9清楚地表明FA-SPC@NGO/DOX显示出叶酸配体特异性识别肿瘤细胞的能力，对于叶酸单体处理过的Hela细胞，其对FA-SPC@NGO/DOX的摄取明显的下降。
(3)FA-SPC@NGO/DOX的细胞摄取实验
FA-SPC@NGO/DOX的细胞摄取实验的具体步骤如下：将293T和Hela细胞(1×105个细胞/孔)接种在6孔板中并培养24小时。细胞与FA-SPC@NGO/DOX和SPC@NGO/DOX(10μg/mLDOX)在37℃孵育24小时。我们使用DOX(10μg/mL DOX)分别处理的细胞作为对照组。然后，除去培养基，用冷的PBS洗涤两次后，使用RIPA裂解缓冲液在室温下将细胞裂解25分钟。随后，在RIPA裂解缓冲液中，在超声波下将细胞裂解。将细胞裂解物以10000rpm离心15分钟。通过酶标仪在480/595nm的激发/发射波长下测定上清液中DOX的荧光强度。通过减去空白细胞的背景信号将结果归一化。图10清楚地表明FA-SPC@NGO/DOX较SPC@NGO/DOX具有更好的细胞摄取能力，其表面的叶酸配体对于纳米药物进入细胞发挥了重要作用。
(4)检测细胞增殖抑制率
检测细胞增殖抑制率：将处于对数生长期的细胞用胰酶消化，细胞计数后，稀释细胞密度为3×104～5×104个/mL，吹打混匀，将细胞接种于96孔板中，每孔接种100μL人宫颈癌细胞株Hela，待细胞贴壁后置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育48h，每组实验各4个复孔；采用MTT比色法进行检测，每孔细胞悬液中加20μL MTT溶液和80μL 1640培养基，置于37℃，CO2培养箱中孵育4h，测定490nm处各组细胞的吸光度，记录数据。图11，12，13表明NGO，SPC@NGO和FA-SPC@NGO无论是对于肿瘤细胞还是非肿瘤细胞基本上都是无毒的，而FA-SPC@NGO/DOX的细胞毒性明显强于未经叶酸修饰的纳米药物。
实施例2
(1)通过改进的Hummer’s方法制备纳米氧化石墨烯(NGO)
首先称取1g多层氧化石墨烯，将其分散于23mL质量分数为95％的浓硫酸中并于室温下，充分搅拌；然后将其置于冰浴中，分步向其中加入3g高锰酸钾固体，并保证整个添加过程中溶液的温度不超过20℃，并继续搅拌20min。向其中加入35mL去离子水后体系温度迅速升高，将反应体系移入105℃油浴中，反应1h再向其中加入140mL去离子水，恒温后再加入2.4mL 30％的过氧化氢溶液并室温25℃搅拌20min，在反应结束后加入12mol/L NaOH溶液调节pH到8。最后采用透析方法纯化样品。
(2)负载阿霉素的纳米氧化石墨烯复合物(NGO/DOX)
取0.5mg的氧化石墨烯分散在1.5mL去离子水中，加入1.5mg/ml的盐酸阿霉素1mL，避光搅拌11h，反复离心水洗，除去游离的阿霉素。取一定体积上层清液，测定其吸光度，利用标准曲线计算上清液中药物的浓度，离心后的下层物质重新分散在水中。
(3)制备磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯阿霉素复合物
将大豆卵磷脂和叶酸聚乙二醇磷脂同时包覆于步骤(2)得到的纳米氧化石墨烯复合物的表面上，制备得到磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯阿霉素复合物(FA-SPC@NGO/DOX)及其对照组(SPC@NGO/DOX)。
取2.56mg的大豆卵磷脂，0.64mg的叶酸聚乙二醇磷脂溶于3.2mL的氯仿中(MSPC：MFA-PEG-DSPE＝4:1)，加入800ul载药率为100％的NGO/DOX复合物，使油相与水相比达4:1，反复进行超声处理及涡旋震荡处理，使体系成为均一的橘红色乳状液。然后向反应体系内通入氮气，将氯仿吹走，直至形成稳定均匀的且有乳光的红色溶液。游离的DOX和未结合氧化石墨烯的大豆卵磷脂使用Amicon离心超滤管(MWCO 100kDa)除去，得到的FA-SPC@NGO/DOX保存于4℃，备用。
实施例3
(1)通过改进的Hummer’s方法制备纳米氧化石墨烯(NGO)
首先称取0.4g多层氧化石墨烯，将其分散于10mL浓硫酸(质量分数为95％)中并于室温下，充分搅拌；然后将其置于冰浴中，分步向其中加入1.6g高锰酸钾固体，并保证整个添加过程中溶液的温度不超过10℃，并继续搅拌25min。向其中加入15mL去离子水后体系温度迅速升高，将反应体系移入102℃油浴中，反应1h再向其中加入65mL去离子水，恒温后再加入1.28mL 25％的过氧化氢溶液并室温27℃搅拌30min，在反应结束后加入11mol/L NaOH溶液调节pH到7。最后采用透析方法纯化样品。
(2)负载阿霉素的纳米氧化石墨烯复合物(NGO/DOX)
取2mg的氧化石墨烯分散在6mL去离子水中，加入1.5mg/ml的盐酸阿霉素4mL，避光搅拌15h，反复离心水洗，除去游离的阿霉素。取一定体积上层清液，测定其吸光度，利用标准曲线计算上清液中药物的浓度，离心后的下层物质重新分散在水中。
(3)制备磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯阿霉素复合物
将大豆卵磷脂和叶酸聚乙二醇磷脂同时包覆于步骤(2)得到的纳米氧化石墨烯复合物的表面上，制备得到磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯阿霉素复合物(FA-SPC@NGO/DOX)及其对照组(SPC@NGO/DOX)。
取6mg的大豆卵磷脂，1mg的叶酸聚乙二醇磷脂溶于3.2mL的氯仿中(MSPC：MFA-PEG-DSPE＝6:1)，加入1000ul载药率为100％的NGO/DOX复合物，使油相与水相比达3.2:1，反复进行超声处理及涡旋震荡处理，使体系成为均一的橘红色乳状液。然后向反应体系内通入氮气，将氯仿吹走，直至形成稳定均匀的且有乳光的红色溶液。游离的DOX和未结合氧化石墨烯的大豆卵磷脂使用Amicon离心超滤管(MWCO 100kDa)除去，得到的FA-SPC@NGO/DOX保存于4℃，备用。
实施例4
(1)通过改进的Hummer’s方法制备纳米氧化石墨烯(NGO)
首先称取0.5g多层氧化石墨烯，将其分散于10mL质量分数为97％的浓硫酸中并于室温下，充分搅拌；然后将其置于冰浴中，分步向其中加入1.5g高锰酸钾固体，并保证整个添加过程中溶液的温度不超过15℃，并继续搅拌36min。向其中加入20mL去离子水后体系温度迅速升高，将反应体系移入95℃油浴中，反应1h再向其中加入60mL去离子水，恒温后再加入1.3mL 30％的过氧化氢溶液并室温27℃搅拌30min，在反应结束后加入10mol/L NaOH溶液调节pH到8。最后采用透析方法纯化样品。
(2)负载阿霉素的纳米氧化石墨烯复合物(NGO/DOX)
取0.75mg的氧化石墨烯分散在3mL去离子水中，加入1.125mg/ml的盐酸阿霉素2mL，避光搅拌15h，反复离心水洗，除去游离的阿霉素。取一定体积上层清液，测定其吸光度，利用标准曲线计算上清液中药物的浓度，离心后的下层物质重新分散在水中。
(3)制备磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯阿霉素复合物
将大豆卵磷脂和叶酸聚乙二醇磷脂同时包覆于步骤(2)得到的纳米氧化石墨烯复合物的表面上，制备得到磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯阿霉素复合物(FA-SPC@NGO/DOX)及其对照组(SPC@NGO/DOX)。
取3.84mg的大豆卵磷脂，0.64mg的叶酸聚乙二醇磷脂溶于2.56mL的氯仿中(MSPC：MFA-PEG-DSPE＝6:1)，加入730ul载药率为100％的NGO/DOX复合物，使油相与水相比达3.5:1，反复进行超声处理及涡旋震荡处理，使体系成为均一的橘红色乳状液。然后向反应体系内通入氮气，将氯仿吹走，直至形成稳定均匀的且有乳光的红色溶液。游离的DOX和未结合氧化石墨烯的大豆卵磷脂使用Amicon离心超滤管(MWCO 100kDa)除去，得到的FA-SPC@NGO/DOX保存于4℃，备用。

Claims (10)

1.一种用于肿瘤靶向传递的磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯药物载体的制备方法，其特征在于以下步骤：
(1)制备纳米氧化石墨烯NGO
室温下，将多层氧化石墨烯分散于浓硫酸中，充分搅拌后，加入高锰酸钾固体，高锰酸钾固体添加过程中控制溶液的温度为10～20℃，继续搅拌；第一次加入去离子水后，将反应体系移入温度为90～105℃油浴中，反应0.5～1小时；再第二次加入去离子水，待温度恒定后，加入过氧化氢溶液，充分搅拌，在25～30℃下反应20～30min后，加入NaOH溶液调节pH，至溶液pH为7～8；最后采用透析方法纯化样品得到纳米氧化石墨烯；
其中，每10ml浓硫酸中加入0.4～0.5g的多层氧化石墨烯；多层氧化石墨烯与高锰酸钾的质量比为1:3～4；
(2)制备负载阿霉素的纳米氧化石墨烯复合物NGO/DOX
室温下，将盐酸阿霉素与纳米氧化石墨烯以质量比3:1的比例混合，搅拌10-15h后，离心水洗，除去游离的盐酸阿霉素，得到负载阿霉素的纳米氧化石墨烯复合物待用；
(3)制备磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯阿霉素复合物FA-SPC@NGO/DOX
将大豆卵磷脂和叶酸聚乙二醇磷脂按质量比4～6：1加入氯仿中；加入步骤(2)得到的纳米氧化石墨烯复合物，使油相与水相的体积比达3～4:1，室温下进行超声及涡旋震荡后；将氯仿用氮气吹走，至形成稳定均匀的且有乳光的红色溶液，即得到产品磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯阿霉素复合物，产品的药物载体载药量高达100wt％。
2.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤靶向传递的磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯药物载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中叶酸聚乙二醇磷脂的浓度为0.2～0.32mg/ml。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于肿瘤靶向传递的磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯药物载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)每10ml浓硫酸对应的第一次加入的去离子水为15～20ml，第二次加入的去离子水为60～65ml。
4.根据权利要求1或2所述的一种用于肿瘤靶向传递的磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯药物载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)每1g高锰酸钾对应加入0.8～0.85ml过氧化氢溶液。
5.根据权利要求3所述的一种用于肿瘤靶向传递的磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯药物载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)每1g高锰酸钾对应加入0.8～0.85ml过氧化氢溶液。
6.根据权利要求1或2或5所述的一种用于肿瘤靶向传递的磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯药物载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中加入高锰酸钾固体后的搅拌时间为20～40min。
7.根据权利要求3所述的一种用于肿瘤靶向传递的磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯药物载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中加入高锰酸钾固体后的搅拌时间为20～40min。
8.根据权利要求1或2或5或7所述的一种用于肿瘤靶向传递的磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯药物载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中浓硫酸的质量百分数为95％～98％；所述的步骤(1)中过氧化氢溶液的质量分数为25～30％；所述的步骤(1)中NaOH的浓度为10～12mol/L。
9.根据权利要求3所述的一种用于肿瘤靶向传递的磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯药物载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中浓硫酸的质量百分数为95％～98％；所述的步骤(1)中过氧化氢溶液的质量分数为25～30％；所述的步骤(1)中NaOH的浓度为10～12mol/L。
10.根据权利要求6所述的一种用于肿瘤靶向传递的磷脂膜修饰的纳米氧化石墨烯药物载体的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中浓硫酸的质量百分数为95％～98％；所述的步骤(1)中过氧化氢溶液的质量分数为25～30％；所述的步骤(1)中NaOH的浓度为10～12mol/L。
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