CN112957527A - 一种导电神经导管及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种导电神经导管，包括载药纤维海绵和中空的载药神经导管，其中：所述载药纤维海绵由丝素蛋白和血管内皮生长因子组成，所述血管内皮生长因子均匀分散于丝素蛋白中；所述载药神经导管由丝素蛋白和含有氧化石墨烯与天麻素的脂质体组成，所述脂质体均匀分散于丝素蛋白中；所述载药纤维海绵填充于所述载药神经导管的空腔内。本发明具备优异的生物相容性、机械性能、抗炎性能和导电性能，有望在未来的周围神经修复中发挥重要作用。

Description

一种导电神经导管及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种导电神经导管及其制备方法。
背景技术
周围神经损伤的修复是一个具有挑战性的医学问题，自体神经移植由于具有非免疫原性作用，因此仍是周围神经修复中的“金标准”，但也存在供体组织的供应有限，神经瘤形成风险，大小不匹配以及供体神经与损伤部位之间的轴突分布等问题。神经导管是人工制成的组织工程管状物，作为自体神经移植的替代治疗方法用于桥接神经断端。然而，缺乏有效的生物相容性和生物活性是大多数人工神经导管的主要缺点。
材料的选择是组织工程学中的重要考虑因素，适用于组织工程支架的材料必须具备生物相容性、生物可降解性和适当的机械性能。丝素蛋白(SF)及其衍生物因其合适的性能生物相容性，生物降解性，优异的机械性能，吸水能力和低免疫原性而被广泛用于生物材料。
电刺激(ES)是促进动物体内神经突生长和神经再生的常用手段，可通过将导电高分子材料与生物活性材料相结合制备导电神经导管，结合电刺激应用于神经组织工程上。石墨烯具有优异的物理化学性能，是重要的碳纳米材料，而氧化石墨烯(GO)有高导电率且可与多种蛋白质、多肽、核酸等生物分子相互作用，在再生医学中有巨大潜力，同时氧化石墨烯其二维结构由一层多官能团组成，由于环氧化合物、羟基和羧酸官能团在同一平面上，因此表现出良好的两亲性。
周围神经的主要结构有神经纤维束，以及包括血管在内的结缔组织，因此早期血管化对周围神经损伤修复有重要意义，血管内皮生长因子(VEGF)具有促进血管增殖和血管形成等作用，早期血管化可为各种细胞提供营养，进而促进轴突生成，并且可募集吞噬细胞生长因子，从而使神经导管在血管和神经生成方面发挥更好的作用。
在周围神经缺损修复的过程中，炎症反应在神经修复的早期有利于髓鞘清理，而在中后期则会引起神经瘤的形成、神经性疼痛等严重后果。天麻素(GAS)是一种存在于兰科植物天麻的糖苷，化学名为4-羟甲基苯基-β_D吡喃葡萄糖苷，由于侧链存在极性羟基因此具有亲水性。大量文献报道天麻素具有抗炎抗氧化，诱导和促进施旺细胞分泌神经营养因子等作用。因此，鉴于天麻素的化学性质和生物功能，其在神经导管中对于调控细胞发挥了重要作用。
脂质体由一层或多层包裹着离散水空间的双层磷脂囊泡组成，作为药物载体，脂质体能改善药物吸收和代谢、延长药物半衰期、降低毒性，同时，脂质体还具有很高的生物相容性，无毒且可生物降解，能改善药物的稳定性，目前脂质体已被广泛用于提高药物生物利用度，制备靶向药物等领域。
发明内容
本发明的目的是提供一种搭载天麻素和血管内皮生长因子的导电神经导管，该导管具有促血管生成和抗炎作用，能更好地引导神经生长，促使损伤神经的修复，从而弥补传统神经导管的不足。
为达到上述目的，本发明使用了如下技术方案：
一种导电神经导管，包括载药纤维海绵和中空的载药神经导管，其中：
所述载药纤维海绵由丝素蛋白和血管内皮生长因子组成，所述血管内皮生长因子均匀分散于丝素蛋白中，所述血管内皮生长因子占丝素蛋白重量的0.005-0.05‰；
所述载药神经导管由丝素蛋白和含有氧化石墨烯与天麻素的脂质体组成，所述脂质体均匀分散于丝素蛋白中，所述脂质体占丝素蛋白重量的3-15％，所述脂质体中，氧化石墨烯与天麻素的重量比为1-3：1；
所述载药纤维海绵填充于所述载药神经导管的空腔内。
优选地，所述载药纤维海绵中，血管内皮生长因子占丝素蛋白重量的0.01‰。
优选地，所述载药神经导管中，脂质体占丝素蛋白重量的10％。
优选地，所述脂质体中，氧化石墨烯与所述天麻素的重量比为1：1。
优选地，所述载药神经导管的内径为2-3.5mm，外径为2.5-4.5mm。
一种制备所述导电神经导管的方法，包括以下步骤：
1)脂质体的制备
将氧化石墨烯、天麻素与卵磷脂用乙醇超声溶解，然后逐滴加入到60℃PBS缓冲液中，滴加完成后旋转蒸发，用PBS冲洗后离心，将沉淀真空冷冻干燥，制成含有氧化石墨烯与天麻素的脂质体；
2)载药神经导管的制备
将丝素蛋白和步骤1)所得的脂质体粉末溶于六氟异丙醇中，作为纺丝液，使用静电纺丝法制备载药神经导管；
3)载药纤维海绵的制备
将丝素蛋白和血管内皮生长因子溶于水中，液氮冷冻后进行真空干燥，制成载药纤维海绵；
4)导电神经导管的制备
将步骤3)所得的载药纤维海绵裁剪后填充于步骤2)所得的载药神经导管中，即得到双载药导电神经导管。
优选地，所述卵磷脂与氧化石墨烯的重量比为10-40：1。
优选地，步骤1)中，所述旋转蒸发的温度为40-50℃。
优选地，步骤2)中，所述静电纺丝法的参数为：纺丝液的流出速度为0.1-0.3mm/min，针管与接收板之间的电压为8-25KV，接收距离为6-15cm，环境温度为20-25℃，相对湿度为25-40％。
优选地，步骤3)中，所述真空干燥的温度为35-45℃，时间20-30小时。
相对于现有效果，本发明的有益效果如下：
1.本发明提供的周围神经修复系统具有填充结构，包括内部的载药纤维海绵和外部的载药神经导管。外部管状结构为神经再生提供了稳定的三维立体结构，氧化石墨烯/天麻素脂质体均匀分散在丝素蛋白中，导电性和分散性好，既能缓释药物，又保证了导管适宜的导电性和生物相容性。内部的载药纤维海绵利于细胞的粘附及生长，并引导轴突沿着纤维方向生长，为神经再生提供营养。血管内皮生长因子和天麻素的缓慢释放，可在神经再生初期加速微血管的生长，为神经再生提供足够的物质支持，而在后期则抑制炎症，抑制神经瘤的形成，实现了两种药物的协同作用，大大促进神经损伤的修复。
2.该神经导管具有以下特点：第一，采用组织工程系统和生物电刺激治疗神经修复，通过导电高分子材料生物电刺激，活性因子和支架材料多种手段组合协同治疗神经损伤，比单纯的神经导管效果更好。第二，选用了两种药物，除组织工程系统神经再生常用的神经生长因子外，还选用了适用于神经修复后期具有抗炎抗氧化作用的药物，加强了修复效果；第三，通过脂质体修饰，使所载药物天麻素具有缓释效果，使两种药物达到梯度释放的效果；第四，体系的毒性小、安全性高，氧化石墨烯降解后易聚集，氧化石墨烯经过脂质体修饰也改善了其生物相容性。
附图说明
图1为实施例1制备的氧化石墨烯/天麻素脂质体粒径分布图。
图2为实施例1制备的载药神经导管的横视图与纵视图。
图3为实施例1制备的载药纤维海绵显微图。
图4为载药神经导管的天麻素累计释放率。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
一种导电神经导管，其制备方法如下：
1)氧化石墨烯/天麻素脂质体的制备
称取0.1g卵磷脂，0.007g氧化石墨烯、0.007g天麻素溶于10ml乙醇中，搅拌超声以分散均匀，然后逐滴加入到剧烈搅拌的60℃PBS缓冲液中，滴加完成后继续搅拌30min，然后40℃旋转蒸发至干，用PBS超声冲洗后离心(13000r，30min)，最后将沉淀真空冷冻干燥，即得氧化石墨烯/天麻素脂质体。
从图1的粒径分布图可以看出，步骤1)制备的氧化石墨烯/天麻素脂质体粒径在100-500nm之间，且呈正态分布，平均粒径在250nm左右。
2)载药神经导管的制备
取0.3g丝素蛋白和0.03g步骤1)所得的氧化石墨烯/天麻素脂质体粉末，溶于10mL六氟异丙醇中，作为纺丝液。将纺丝液置于5mL一次性注射器中，连接好静电纺丝实验装置后，设置纺丝液以0.2mm/min的速度推出，针管与接收装置之间电压为12KV，接收距离为10cm，环境温度为25℃，相对湿度为30％，进行静电纺丝，即得载药神经导管。
从图2的载药神经导管外观照片可以看出，所制得的导管为白色，长度约为1cm，内径2-3mm，外径为4-5mm。
3)载药纤维海绵的制备
将0.1g丝素蛋白和0.001mg血管内皮生长因子(VEGF)粉末溶于10ml纯水中，放入液氮罐内冷冻24h，然后40℃真空干燥24h，即得载药纤维海绵。
从图3的显微照片可以看出，制得的产物为疏松的海绵状结构，海绵体的管径约为4μm。
4)导电神经导管的制备
将步骤3)所得的载药纤维海绵按载药神经导管的内径和长度裁剪，然后将其充满于载药神经导管中，即得。
实施例2
一种导电神经导管，其制备方法如下：
1)氧化石墨烯/天麻素脂质体的制备
称取0.2g卵磷脂，0.005g氧化石墨烯、0.005g天麻素溶于10ml乙醇中，搅拌超声以分散均匀，然后逐滴加入到剧烈搅拌的60℃PBS缓冲液中，滴加完成后继续搅拌30min，然后50℃旋转蒸发至干，用PBS超声冲洗后离心，最后将沉淀真空冷冻干燥，即得氧化石墨烯/天麻素脂质体。
2)载药神经导管的制备
将0.5g丝素蛋白和0.02g步骤1)所得的氧化石墨烯/天麻素脂质体粉末溶于10mL六氟异丙醇中，作为纺丝液，进行静电纺丝，即得载药神经导管。
3)载药纤维海绵的制备
将0.1g丝素蛋白和0.005mg血管内皮生长因子粉末溶于10ml纯水中，放入液氮罐内冷冻24h，然后40℃真空干燥24h，即得载药纤维海绵。
4)导电神经导管的制备
将步骤3)所得的载药纤维海绵按载药神经导管的内径和长度裁剪，然后将其填充于载药神经导管中，即得。
实施例3
一种导电神经导管，其制备方法如下：
1)氧化石墨烯/天麻素脂质体的制备
称取0.2g卵磷脂，0.02g氧化石墨烯、0.01g天麻素溶于10ml乙醇中，搅拌超声以分散均匀，然后逐滴加入到剧烈搅拌的60℃PBS缓冲液中，滴加完成后继续搅拌30min，然后40℃旋转蒸发至干，用PBS超声冲洗后离心，最后将沉淀真空冷冻干燥，即得氧化石墨烯/天麻素脂质体。
2)载药神经导管的制备
将0.8g丝素蛋白和0.1g步骤1)所得的氧化石墨烯/天麻素脂质体粉末溶于10mL六氟异丙醇中，作为纺丝液，进行静电纺丝，即得载药神经导管。
3)载药纤维海绵的制备
将0.2g丝素蛋白和0.001mg血管内皮生长因子粉末溶于10ml纯水中，放入液氮罐内冷冻24h，然后40℃真空干燥24h，即得载药纤维海绵。
4)导电神经导管的制备
将步骤3)所得的载药纤维海绵按载药神经导管的内径和长度裁剪，然后将其填充于载药神经导管中，即得。
试验例
(1)载药神经导管的释放度检测
将实施例1步骤2)制备的载药神经导管浸入PBS中，放在摇床中(37℃，100pm)，在给定的时间间隔内，取1mL的释放介质，用220nm的紫外分光光度计进行检测，根据吸光值计算介质中的天麻素含量，然后用新鲜PBS溶液补偿试管，得到载药神经导管在56天内的药物累计释放率。
同时按以下方法制备对照载药神经导管，按上述方法进行同样的检测。
对照载药神经导管的制备方法：取0.3g丝素蛋白、0.002g氧化石墨烯、0.002g天麻素，溶于10mL六氟异丙醇中，作为纺丝液，进行静电纺丝，即得。
试验结果如图4示，结果表明：由于脂质体的包裹作用，天麻素在神经导管中的释放速度变慢，累计释放率在28天左右达到峰值，而未经脂质体处理的天麻素累计释放率在14天左右接近峰值，缓慢释放的天麻素更有利于在神经修复的后期发挥抗炎、诱导神经营养因子分泌等作用。
(2)导电神经导管对RSC96细胞生长的影响
将本发明制备的导电神经导管与RSC96细胞共培养，培养后的第5天进行CCK-8细胞增殖活力检测，具体方法如下：
将各实施例制备的神经导管打孔至96孔板大小，置于超净工作台紫外光照射12小时灭菌，用生理盐水浸泡10分钟，然后将培养至2-3代的细胞用胰酶消化，稀释细胞浓度为1×104/mL，向各孔加入100μL细胞悬液，每组设6个复孔，培养5天，隔天换一次新鲜培养液。
于第5天进行检测，先在倒置荧光显微镜下观察细胞生长状态，然后向每孔加入10μL CCK-8，轻轻晃动使其混合均匀，在细胞培养箱培养4小时，取出培养板，弃去上清液，酶标仪上检测其OD值，通过观察各时间点各组的OD值可以初步判断神经导管对细胞产生的毒性，OD值越高，说明其对细胞伤害越小。
同时设置空白组和以下对照组：
对照组1：取0.3g丝素蛋白、0.002g氧化石墨烯，用六氟异丙醇溶解后进行静电纺丝，然后填充不含血管内皮生长因子的丝素蛋白纤维海绵。
对照组2：取0.3g丝素蛋白、0.002g氧化石墨烯、0.002g天麻素，用六氟异丙醇溶解后进行静电纺丝，然后填充不含血管内皮生长因子的丝素蛋白纤维海绵。
对照组3：将氧化石墨烯和天麻素(1：1)先制成脂质体，将丝素蛋白与脂质体(10：1)用六氟异丙醇溶解后进行静电纺丝，然后填充不含血管内皮生长因子的丝素蛋白纤维海绵。
表1导电神经导管对RSC96细胞生长的影响
分组 OD(450nm)
空白组 1.453
实施例1 1.923
实施例2 1.891
实施例3 1.725
对照组1 1.364
对照组2 1.411
对照组3 1.663
从试验结果中可以看出，不含天麻素和血管内皮生长因子的对照组1OD值最小，细胞增殖最少；对照组2由于加入了天麻素，OD值有所增加；对照组3由于加入了天麻素脂质体，能够延长药物释放时间，导致第5天的细胞增殖进一步增加；实施例1-3由于加入了天麻素脂质体和血管内皮生长因子，二者发挥协同作用，导致细胞增殖进一步增加。以上结果说明本发明制备的导电神经导管不会对细胞产生毒性，具有很好的生物相容性。

Claims (10)

1.一种导电神经导管，其特征在于，包括载药纤维海绵和中空的载药神经导管，其中：
所述载药纤维海绵由丝素蛋白和血管内皮生长因子组成，所述血管内皮生长因子均匀分散于丝素蛋白中，所述血管内皮生长因子占丝素蛋白重量的0.005-0.05‰；
所述载药神经导管由丝素蛋白和含有氧化石墨烯与天麻素的脂质体组成，所述脂质体均匀分散于丝素蛋白中，所述脂质体占丝素蛋白重量的3-15％，所述脂质体中，氧化石墨烯与天麻素的重量比为1-3：1；
所述载药纤维海绵填充于所述载药神经导管的空腔内。
2.如权利要求1所述的导电神经导管，其特征在于：所述载药纤维海绵中，所述血管内皮生长因子占丝素蛋白重量的0.01‰。
3.如权利要求1所述的导电神经导管，其特征在于：所述载药神经导管中，所述脂质体占丝素蛋白重量的10％。
4.如权利要求1所述的导电神经导管，其特征在于：所述脂质体中，氧化石墨烯与所述天麻素的重量比为1：1。
5.如权利要求1所述的导电神经导管，其特征在于：所述载药神经导管的内径为2-3.5mm，外径为2.5-4.5mm。
6.一种制备权利要求1-5任一项所述导电神经导管的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)脂质体的制备
将氧化石墨烯、天麻素与卵磷脂用乙醇超声溶解，然后逐滴加入到60℃PBS缓冲液中，滴加完成后旋转蒸发，用PBS冲洗后离心，将沉淀真空冷冻干燥，制成含有氧化石墨烯与天麻素的脂质体；
2)载药神经导管的制备
将丝素蛋白和步骤1)所得的脂质体粉末溶于六氟异丙醇中，作为纺丝液，使用静电纺丝法制备载药神经导管；
3)载药纤维海绵的制备
将丝素蛋白和血管内皮生长因子溶于水中，液氮冷冻后进行真空干燥，制成载药纤维海绵；
4)导电神经导管的制备
将步骤3)所得的载药纤维海绵裁剪后填充于步骤2)所得的载药神经导管中，即得到双载药导电神经导管。
7.如权利要求6所述导电神经导管的制备方法，其特征在于：所述卵磷脂与氧化石墨烯的重量比为10-40：1。
8.如权利要求6所述导电神经导管的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述旋转蒸发的温度为40-50℃。
9.如权利要求6所述导电神经导管的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述静电纺丝法的参数为：纺丝液的流出速度为0.1-0.3mm/min，针管与接收板之间的电压为8-25KV，接收距离为6-15cm，环境温度为20-25℃，相对湿度为25-40％。
10.如权利要求6所述导电神经导管的制备方法，其特征在于：步骤3)中，所述真空干燥的温度为35-45℃，时间20-30小时。
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